Summary
Huidige ex vivo modellen van glioblastoom (GBM) zijn niet geoptimaliseerd voor fysiologisch relevant onderzoek naar menselijke tumorinval. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en onderhouden van organotypische plakculturen uit vers menselijk GBM-weefsel. Een beschrijving van time-lapse microscopie en kwantitatieve cel migratie analyse technieken wordt verschaft.
Abstract
Glioblastoom (GBM) heeft ondanks chirurgische, chemotherapeutische en radiotherapie een extreem slechte klinische prognose. Progressieve tumorinval in het omliggende hersenparenchyma vertegenwoordigt een blijvende therapeutische uitdaging. Om anti-migratie therapieën voor GBM te ontwikkelen, zijn model systemen die een fysiologisch relevante achtergrond voor gecontroleerde experimenten verschaffen essentieel. Hier presenteren wij een protocol voor het genereren van plakculturen uit menselijk GBM-weefsel dat wordt verkregen tijdens chirurgische resectie. Deze culturen maken het mogelijk ex-vivo experimentatie zonder passeren door dierlijke xenografen of enkelcelculturen. Verder beschrijven we het gebruik van confocal microscopie met behulp van time-lapse laser scanning in combinatie met cell tracking om het migrerende gedrag van tumorcellen kwantitatief te bestuderen en de daarmee verband houdende respons op de therapeutica. Plakjes worden reproduceerbaar gegenereerd binnen 90 minuten van chirurgische weefselverwerving. Retrovirale gemedieerde fluorescerende cel laBeling, confocal imaging en tumor cell migratie analyses worden vervolgens binnen twee weken na de kultuur voltooid. We hebben deze slice culturen succesvol gebruikt om genetische factoren die verband houden met verhoogd migrerend gedrag in menselijke GBM te ontdekken. Verder hebben we het vermogen van de patiënt geconstateerd om patiëntenspecifieke variatie te detecteren in reactie op anti-migratie therapieën. Doorgaan naar voren zijn menselijke GBM-segmentculturen een aantrekkelijk platform voor snelle ex vivo beoordeling van tumorgevoeligheid voor therapeutische middelen, om gepersonaliseerde neuro-oncologische therapie te bevorderen.
Introduction
De laboratoriumstudie van glioblastoom (GBM) wordt belemmerd door een gebrek aan modellen die de vereiste pathologische kenmerken van de menselijke ziekte getrouwd herhalen, namelijk tumorcel migratie en invasie. Vergelijkende studies van 2D- en 3D- in vitro- assays, evenals 3D-knaagdier-slice-cultuurmodellen, hebben mechanistische uiteenlopende cellulaire migratieprogramma's in deze twee contexten ontdekt, waardoor de translatabiliteit van bevindingen van 2D-systemen mogelijk is voor de menselijke ziekte 1 , 2 , 3 . De hier beschreven organotypische tumorskijfcultuur en imagingparadigma maakt het mogelijk om tumorcel migratie te onderzoeken in segmenten ex vivo humaan tumorweefsel verkregen uit chirurgische resectie. Zo vormen slice culturen van chirurgisch geresecteerd tumorweefsel in samenhang met confiscale microscopie met time-lapse een platform om tumorcelmigratie in de native te bestuderenMicro-omgeving zonder weefseloplossing of cultuurpassage.
Er is uitgebreide literatuur die gebruik maakt van knaagdierbrein-slice cultuurmodellen van GBM gegenereerd uit humane tumor xenografen, retrovirale geïnduceerde tumoren en cellulaire overlays om tumorinval 1 , 2 , 3 , 4 , 5 te bestuderen. Onlangs hebben verschillende groepen de generatie van organotypische snijculturen beschreven direct van humaan GBM-weefsel 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Er is echter een duidelijke variatie tussen gepubliceerde protocollen met betrekking tot snijtechniek en cultuurmedia. Verder heeft het gebruik van organotypische snijculturen zich geconcentreerd op statische experimentele eindpunten die veranderingen in celsignaal hebben opgenomenNg, proliferatie en dood. Het hierin beschreven protocol breidt zich uit op vroegere scherpcultuurparadigma's door tijdopgenomen observatie van dynamische tumorcelgedrag in te nemen door middel van time-lapse laser scanning confocal microscopy. Recente ontdekking van inter 11 en intratumorale 12 , 13 genetische variatie in humane GBM onderstreept het belang van het verbinden van deze heterogeniteit met tumorcelgedrag en de implicaties ervan op tumorrespons op therapie. Hier rapporteren we een gestroomlijnd en reproduceerbaar protocol voor het gebruik van directe snijculturen uit een menselijk kankerweefsel om tumorcelmigratie in nabije real-time te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voordat het verzamelen van patiëntenweefselmonsters wordt gestart, moet op elke patiënt geïnformeerde toestemming worden verkregen onder een goedgekeurd Institutional Review Board (IRB) protocol. De auteurs van dit protocol hebben toestemming gekregen voor het werk dat wordt beschreven onder goedgekeurde IRB-protocollen bij het University of Colorado Hospital en Inova Fairfax Hospital. Gegevens verzameld uit deze segmentenculturen werden niet gebruikt om patiëntenzorg beslissingen te geven.
1. Pre-snijbereiding
- Zorg voor "weefselverwerking" media en "slice culture maintenance" media de dag voor de beplande tumorresectie en weefselverzameling (of gebruik eerder eerder gegenereerde media binnen 2 weken). Voeg 5 ml Penicillin-Streptomycin oplossing (10.000 U / mL) en 5 mL 1 M HEPES toe aan 500 mL van een High-Glucose DMEM om het weefselverwerkingsmedium te genereren.
- Bereid 250 ml slice culture onderhoudsmedium met behulp van een basis van neuronale medium ( bv . Neurobasal) witHout fenol rood. Aanvull dit medium met 10 mM HEPES, 1x B-27 supplement, 400 μM L-glutamine, 600 μM L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 60 U / ml penicilline, 60 μg / ml streptomycine en 6 U / ml nystatine.
- Bewaar alle media bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
2. Dag van de operatie: Weefselverwerving
- Op de dag van weefselverwerving bereiden 50 tot 100 ml 1% en 2% (gew.%) Oplossingen van agarose met lage smelttemperatuur in weefselverwerkingsmedia met behulp van geautoclaveerde glaswerk en steriele techniek in een laminaire stroomkap. Beide concentraties van agarose zijn nodig om onvoorspelbare variatie in de consistentie van tumorweefsel op te vangen.
- Verhit de agarose suspensie, met behulp van een magnetron, tot zacht kokend wordt waargenomen. Plaats de agarose oplossing in een waterbad van 37 ° C om in vloeibare toestand te houden tot het gebruik.
- Plaats 1 ml slice culture maintenance media in elke putje van een 6-putjes plaat.
- Gebruik een sterielPincet om lege PTFE cultuurinzetten in elke put te plaatsen. Plaats de plaat in een bevochtigde, watermantel, weefselkweek incubator met 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C.
- Met behulp van een steriele Pasteur pipette in een laminaire stromende kap bubble een mengsel van 95% O 2 /5% CO 2 gas in een fles met ijskoude weefselverwerkingsmedia gedurende ongeveer 15 tot 30 minuten, voorafgaand aan de verwerving van tumorweefsel. Het gebruik van supra-geoxydeerde media minimaliseert hypoxie in het bulkweefsel tijdens de verwerking.
- Bereid gelabelde 50 ml conische buizen (genoeg voor het gewenste aantal afzonderlijke tumorregio's die geïsoleerd zijn) die 20 ml porties van supra-geoxydeerde ijskoude verwerkingsmedia bevatten om weefsel tussen de operatiekamer en de snijfaciliteit te transporteren.
- In samenhang met een neurochirurg, plannen het tumorgebied voor de operatie voor de operatie vooraf. Selecteer een tumor gebied met contrastverbetering, zoals aangetoond op de klinische verbeelding van de patiëntG (T1 post-gadolinium magnetische resonantie beeldvorming (MRI) sequenties). Vorige ervaring suggereert dat dit gebied levend tumorweefsel geeft in tegenstelling tot necrotisch weefsel.
OPMERKING: De productie van plakjes uit de omringende (peritumorale) witte stof werd geprobeerd; Achtergrond autofluorescentie en verminderde tumorceldichtheid beperkte echter het experimentele nut van deze plakjes. - Verkrijg tumorweefsel tegen het begin van de tumorresectie. Vermijd het verzamelen van tumorweefsel dat wordt blootgesteld aan uitgebreide bipolaire cautery, waardoor de weefsel levensvatbaarheid kan worden onderbroken door middel van thermisch letsel. Weefselmonsters die zijn verkregen bij tussentijdse tumorresectie, tonen een verhoogde levensvatbaarheid in vergelijking met weefsel verkregen uit lange en blokresecties. Deze waarneming kan betrekking hebben op differentiële tumorweefsel-afname van bloedstroom als gevolg van chirurgische resectie en verlengde tijd tot acquisitie.
- Als u dit wenst, label en bewaar tumorweefsel in afzonderlijke conische buizen om monsters te isolerenUit verschillende tumorgebieden. ( Dwz oppervlakkig versus diep tumorweefsel). Exacte weefsellocaties kunnen worden geregistreerd als / wanneer intraoperatieve chirurgische navigatie beschikbaar is.
3. Voorbereidende kweekcultuur
OPMERKING: Dit protocol vereist het gebruik van vers ongecixeerd menselijk weefsel. Alle monsters worden aangenomen dat ze besmettelijk zijn, en moeten worden behandeld volgens universele bloedgedragen pathogeenprotocollen. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen dienen te allen tijde te worden gedronken. Knappen en scalpels moeten voorafgaand aan gebruik worden blootgesteld aan 15 minuten UV licht. Spuit gereedschap gedurende 70 minuten met 70% ethanol (EtOH), zodat de vloeistof voor gebruik kan verdampen. Het snijproces wordt op semi-steriele wijze uitgevoerd met behulp van een horizontale laminaire stroomkap met gefilterde lucht.
- Plaats tumorweefselstukken in een Petri-schotel met ijskoude verwerkingsmedia. Om het tumorweefsel te wassen en aanhechtende rode bloedcellen te minimaliseren, onsEa pipet om de media drie keer in de Petri-schotel uit te wisselen en weggooien.
- Met behulp van een scalpel snijden tumorstukken in rechthoekige doosvormen. Trim weefsel stukken ongeveer 3 mm x 3 mm x 10 mm. Verwijder eventuele bijgeleverde vaten zorgvuldig door middel van excisie of zachte trekkracht met fijne tang.
- Pipette 5 - 7 ml 37 ° C agarose in een kubusvormige (~ 2 cm 3 ) kunststof inbouwvorm. Bevestig de temperatuur van de agarose oplossing niet meer dan 37 ° C met een steriele thermometer voor gebruik.
- Laat agarose ongeveer 1 minuut zitten op een bedje ijs.
- Plaats 2 - 4 tumorweefsel "strips" in agarose met lange as georiënteerd verticaal.
OPMERKING: Weefselstrookjes zullen in de agarose "zinken" voor het stollen. Om deze complicatie te vermijden, houd de weefselstrook tijdelijk in verticale richting totdat de agarose verder wordt gestolen. - Houd de weefselbevattende agarosevorm op een bedje ijs voor 2 - 5 miN om de stolling te vergemakkelijken.
- Verwijder schimmel uit ijs en verwijder het agarose blok voorzichtig door de zijkanten van de vorm met een scalpel te snijden. Vermijd overmatige kracht op het blok, dat de agarose kan breken.
- Gebruik een royale druppel cyanoacrylaatlijm om het agaroseblok op de vibratomexemplarplaat te plaatsen. Laat de lijm ongeveer 1 - 2 min.
- Vul het vibratoomreservoir met ijskoude verwerkingsmedia om het agaroseblok op de specimenplaat te plaatsen.
- Tijdens het snijden, bel 95% O 2 /5% CO 2 gasmengsel in het vibratoomreservoir door een geperforeerde steriele plastic pipet.
- Zet de vibratome slice dikte op 300 - 350 μm.
- Pas de voorspoed snelheid en de blad amplitude volgens de weefsel consistentie. "Stijver" GBM-weefsel vereist langere blade-voorspoed en hogere amplitude. Exacte bladsnelheid en amplitude instellingen zullen variëren naargelang de vibratomeigenschappen.
- Breng weefselplakken over naar Petri-schotel met ijskoude verwerkingsmedia met behulp van een roestvrijstalen microspatel.
- Verkrijg 6-putjesplaten die PTFE-inserts bevatten en geëquilibreerde plakcultuurmedia uit incubator (zoals bereid in sectie 2, stap 4).
- Plaatweefselplakken met een roestvrijstalen microspatel. Minimaliseer direct contact en manipulatie van weefsel door gebruik te maken van een kleine fijne bristle-verfborstel om een "vloeistofgolf" te genereren om de plak van de spatel aEn op de cultuurinzet.
OPMERKING: Minimaliseer de hoeveelheid verwerkingsmedia die bovenop het weefselkweekinzet wordt geïntroduceerd. Als er overmatige hoeveelheden media worden overgedragen waardoor de plakken drijven, gebruik dan een steriele Pasteur pipette om de media te verwijderen. - Keer de 6-putjesplaten terug die snijplakken bevatten aan een incubator die bij 37 ° C wordt gehouden met een atmosfeer van 5% CO 2 .
OPMERKING: Het volledige embedding- en snijprotocol dient binnen 90 minuten te worden afgerond van de aankoop van tumorweefsel uit de operatiekamer.
4. Slice Culture Maintenance
- Vervolgens na 12 - 24 uur de plakculturen door elke inzetvelg met een steriele tang te grijpen en over te brengen naar borden met verse slice culture maintenance media. Zorg ervoor dat de slice culture maintenance media in elke bron in evenwicht gebracht in de incubator gedurende ten minste 15 minuten voor het overbrengen van inserts.
- Verplaats de inzetstukken naar nieuwe 6-putjesplaten met vers geëquilibreerde plakjesElke media elke 48 uur.
- Indien gewenst, aliquot oude plakcultuurmedia met een pipet voor direct gebruik in biochemische analyses ( bijv. ELISA) of bevriezen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
5. Tumor Cell Etikettering Via Groen Fluorescentie Proteïne Uitdrukken Retrovirus
OPMERKING: Time-lapse microscopie voor analyse van tumorcel migratie vereist stabiele, langdurige fluorescerende etikettering van cellen in de plakcultuur. Gebruik van retrovirus wordt voorgesteld omdat het selectieve cellen verdeelt selectief, waardoor fluorescente etikettering in de tumorcelpopulatie vergeleken wordt met microglia of andere celsoorten die aanwezig zijn in de plak. Standaardisatie van infectie suggereert dat een virale titer van 10 4 CFUs / μL resulteert in voldoende groene fluorescerende eiwituitdrukking voor het bijhouden en analyseren van celmigratie. Verhoogde virale titer, gebruik van niet-selectief virus ( dwz adenovirus, lentivirus), of otHaar middelen om te labelen kunnen alle cellen voorkomen tijdens het migreren van duidelijke celgrenzen tijdens de migratie, waardoor een ingewikkelde analyse mogelijk is. Het gebruik van alternatieve fluorescerende markers kan zo nodig worden geoptimaliseerd en geoptimaliseerd.
- Verkrijg retrovirus voor infectie van tumorplakken, ook via standaardprotocollen 5 , 14 of uit een in de handel verkrijgbare bron. Verdun het virale supernatant door het juiste volume toe te voegen in ongesupplementeerd neuronaal medium om een virale titer van 10 4 CFU's / μL te verkrijgen.
- Tussen 7 - 10 dagen van de cultuur infecteren de tumor snij culturen van belang met 5 - 10 μL virus (10 4 CFUs / μL). Plaats het virus zachtjes druppelsgewijs op het oppervlak van elk weefselschijfje. Verminder supernatantvolume toegevoegd als het plakje op het oppervlak van het inzetstuk drijft. Retourplaten die slice culturen bevatten aan incubator.
- Bepaal de plakjes voor gelabelde tumorcellen die beginnen om 24 uur na Virale infectie (zie rubriek 6). Deze tijdsvertraging zal variëren afhankelijk van virale integratie en fluorescentie gen expressie kinetiek. Voor de hier gebruikte virale constructen was 72 uur nodig om robuust fluorescente signaal te waarnemen met een standaard epifluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: Schijfjes tonen zelden een overwegend perifere verdeling van viraal gelabelde cellen, waardoor confocal beeldvorming kan worden gecompliceerd. Om deze complicatie te vermijden, probeer de schijfdikte en diktevariatie over de schijf te verminderen. Als de plakcultuur een dikker gebied in de buurt van het centrum heeft, kan dit voorkomen dat de penetratie van de voedingsstoffen voldoende is, waardoor de populatie van tumorcellen actief verdeeld wordt. Een kwalitatieve analyse om deze complicatie te screenen is de toevoeging van een tetrazolium-kleurstofreagens ( dwz MTT) aan de plakcultuurmedia. Gebieden van de plak die niet blauw worden na het toevoegen van het reagens geven aan dat er geen metabolische activiteit is en de gezondheid van de plakjes in gevaar is.
OPMERKING: Nadat succesvolle transductie en gezondheid van de cultuur is bevestigd, kunnen cellen onder controleomstandigheden worden afgebeeld, gevolgd door een gelijke periode van beeldvorming onder behandelingsomstandigheden. Met behulp van dit protocol werden cellen succesvol afgebeeld en bijgehouden gedurende 12 uur in elke voorwaarde. Kortere of langere perioden van beeldvorming en milieu manipulatie kunnen echter ook informatief zijn.
- De microscoop laden
- Voordat u beeldt, plaats 1 ml verse plakjes in een glasbodemschotel.
- Laat de media in de glazen bodemschaal in 15 minuten in een incubator evenwichten.
OPMERKING: Op dit punt kunnen oplosbare etiketterende middelen, zoals fluorescent geconjugeerde lectinen ( dwz Isolectin IB 4 voor microglia-etikettering) of ligand geconjugeerde kwantumstippen, worden toegevoegd aan het plakkweekmedium voor identificatie van celEle subpopulaties tijdens beeldvorming. - Breng het inzetstuk naar een glasbodemschaal af met behulp van steriele tang in een laminaire stromende afzuigkap. Verplaats het gerecht naar de microscoopfase.
- Houd plakkulturen bij 37 ° C en 5% CO 2 atmosfeer in een afgesloten microscoop stadium-top incubator. Gebruik steriele H 2 O bevochtiging van de incubatiekamer indien beschikbaar om overmatige mediaverdamping te voorkomen (vooral belangrijk voor langere beeldvormingsexperimenten).
- Gebruik een confocale microscoop met een lange werkafstand 10X luchtdoel en laser excitatie voor single-foton en / of multi-foton.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de objectieflens van de microscoop voldoende werkafstand biedt. Als gevolg van de toegevoegde hoogte van de podium-incubator, glasbodemschotel, en weefselkweekinzet, zijn lange werkafstandsdoelstellingen kritisch. - Bevestig de glazen bodemplaat, verwijder het plastic Petri-afdekplaatje en bedek met een gas-Doorlatend membraan.
- Afbeeldingen verwerving
- Gebruik de microscoop om het segment visueel te inspecteren en een geschikt veld te lokaliseren met een voldoende dichtheid van fluorescent gelabelde tumorcellen tussen de plakrand en het midden. Vermijd beeldvormende velden aan de rand van het segment, door de verhoogde gevoeligheid van weefselverschuivingen tijdens beeldvorming. Weefselknippers kunnen gebruikt worden om deze verschuiving te beperken.
- Gebruik afbeeldingssoftware in de multidimensionale analysemodus om de eerste (onderste) en laatste (bovenste) Z-stapelgrenswaarden in te stellen, zodat alle posities die worden afgebeeld, zichtbaar fluorescent cellulair signaal bevatten. Beeldvorming via 150 - 200 μm van de plak, met een constante Z-stap van 10 μm, zorgde voor een adequate resolutie voor het bijhouden van celbanen (dit kan worden aangepast aan individuele beeldbehoeften).
- Als de microscoop een gemotoriseerde fase heeft, moet u ervoor zorgen dat er voldoende tijd is voor elke Z-stack-acquisitie. Stel het tijdsinterval tussen overnames gelijkScan tijd per positie x aantal posities naar afbeelding ( dwz afgebeelde tumorgebieden).
OPMERKING: Voor gelijktijdige excitatie van de groene en rode fluoroforen, gebruik een tweeledig laser line-scan programma, met gelijktijdige 488 nm en 633 nm excitatie. De golflengte van de geselecteerde laser excitatie zal variëren afhankelijk van individuele uitgedrukte fluorescerende eiwitten. - Handhaven uniforme laservermogen en confocal pinhole instellingen tussen de afgebeelde tumor regio's. Gebruik de laagste laservermogensinstelling die nodig is om de tumorcellichamen en processen duidelijk af te schermen om de fototoxiciteit te beperken. Specifieke beeldparameter-eenheden ( dwz power- en confocal pinhole-instellingen) verschillen naar gelang de specificaties van de microscoop- en laserbron.
- Compenseer voor potentiële mediaverdamping door 2 - 3 "buffer" Z-stap-stappen in de brandpuntsvlakken toe te voegen die naar de doelstelling gaan. Dit voorkomt effectief dat het weefsel het bereik van Z-stack-overname verlaatIonen in het verticale vlak.
7. Image Post-Processing en Tumor Cell Tracking
OPMERKING: Veel confocale beeldsystemen zijn uitgerust met een eigen beeldbeheersoftware. De hieronder beschreven verwerkingsstappen omvatten een algemeen protocol, dat over softwareplatforms kan worden uitgevoerd. Specifieke instructies worden gegeven voor de open-platforms, NIH ImageJ en MTrackJ 15 .
- Open een Z-stack bestand. Klik in ImageJ op "Afbeelding → Stapels → Z Project." Kies voor de eerste en laatste Z-stack, en kies "Max Intensity" als projectie type. Het resultaat is een weergave genaamd een maximale intensiteit projectie (MIP). Maak een MIP van elke set van Z-stack beelden die zijn vastgelegd in elke afgebeelde regio.
- Converteer de MIP's van elke regio om een tijdreeks te maken. Klik op "Afbeelding → Stacks → Afbeeldingen naar Stack."
- Identificeer de locatie handmatigVan het cellichaam "centroid" door het visueel benaderde middelpunt van het tumorcellichaam te selecteren. Dit wordt bereikt door op het cellichaam te klikken met behulp van de 'add'-track functionaliteit van MTrackJ (een open-source plugin-in voor NIH ImageJ).
- Klik om de locatie van het cellichaam in elk frame van de reeks afbeeldingen te demarceren. Dit zorgt voor een unieke "track" voor elke cel. Markeer de cellocaties van de volgende cel opeenvolgend. Herhaal dit proces totdat alle celpigratiepaden worden gevolgd.
- Zodra een populatie van cellen is gevolgd in een bepaald tumor micro gebied, exporteer alle cilindercoördinaten met behulp van de "meet" functie van MTrackJ. Sla het bestand op als een .xls-formaat, zodat de rauwe gegevens kunnen worden geanalyseerd met behulp van spreadsheet of door gebruikers gegenereerde software.
- Gebruik de coördinaten die zijn opgenomen voor elk punt langs een migratiebaan van een cel, om kwantitatieve analyses uit te voeren, waaronder de afleiding van migratiesnelheid, directionaliteit en andere migratieStatistieken, zoals beschreven in Parker et al 16 .
OPMERKING: Alle berekende afstanden en snelheden zijn onder-schattingen van de werkelijke waarden. Dit is inherent aan de transformatie van driedimensionale beelden (en migratiepaden) naar tweedimensionale data door de generatie van maximale intensiteitsprognoses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze groep heeft succesvolle slice cultures opgebouwd uit meer dan 50 patiënten die de eerste GBM resectie ondergaan. Dit protocol voor slice-generatie, cultuur, retroviral-etikettering, beeldvorming en migratieanalyse is gestroomlijnd in een reproduceerbare werkstroom ( Figuur 1 ). Kritisch tonen deze organotypische GBM-snijpunten concordantie met afkomstige tumorweefsel in de gehele cultuur, inclusief het behoud van pathologische kenmerken en microglia tot 15 dagen in de cultuur ( Figuur 2 ). Daarnaast hebben we dit systeem gebruikt om functionele analyses van tumorrespons te verrichten op micro-milieuveranderingen. Als statistiek fysiologische integriteit wij onderzocht hoe GBM slice cultures reageerde op hypoxia (1% O2) door meting van de productie van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), een proces dat overvloedig in de GBM in vivo micro-omgeving 17,"> 18. We hebben aangetoond dat door het plakken van de plakculturen in hypoxische omstandigheden de snijplaten een snelle fysiologische reactie opleveren, waardoor VEGF-vrijlating in de media werd geïntroduceerd ( Figuur 3 ).
Om kwalitatieve en kwantitatieve aspecten van tumorcel migratie te evalueren, hebben we gebruik gemaakt van de time-lapse beelden om gedetailleerde migratiekaarten te genereren. Deze kaarten afbakenen alle GBM-cellen die binnen de grenzen van tumormikroregio's (1 mm 2 ) worden opgespoord, die een statische visualisatie van het dynamische migrerende gedrag van de tumorpopulatie geven. Kwantitatieve maatregelen van migratiesnelheid en -richting (celverplaatsing / totale afstand afgelegd) werden berekend voor elke cel, waardoor onderzoek werd gemaakt naar veranderingen in migratieparameters over tumorregio's, tumormonsters en in reactie op behandeling ( Figuur 4 ).
De cel etikettering en imaging protocol desHierin beschrijft ook voldoende ruimtelijke en tijdelijke resolutie om veranderingen in celmorfologie tijdens migratie door de inheemse tumor micro-omgeving te evalueren. We waargenomen de aanwezigheid van morfologisch onderscheiden motiele tumorcellen en microglial intermingled binnen de plakcultuur ( Figuur 5A ). Tumorcelbeweging werd gekenmerkt door een "search and burst" -proces, waarbij herhaalde uitsteeksels en terugtrekking van filopodie uit een statische cel betrokken waren, gevolgd door een korte periode van efficiënte beweging. Imaging segmenten regio's ongeveer elke 10 minuten zorgden ook voor een adequate tijdsoplossing voor het vastleggen van time-lapse beelden van tumorcellen die celverdeling ondergaan. Deze verdeelcellen pauzeren van migratie, voltooide mitose, en de dochtercellen herstelden onmiddellijk migratie, allemaal binnen een 3-uurs tijdstip ( Figuur 5D ). In tegenstelling hiermee migreert microglia bij een hogere en meer consistente snelheid, met lagere richting dan aangrenzende tumorcellen,Het aantonen van hun relatief ondoeltreffende migratie ( Figuur 5C, 5E-G ). Dergelijke waarnemingen kunnen belangrijk zijn om inzicht te krijgen in de biologie die onderliggende patiënt- of celspecifieke responsen op de behandeling ligt.
Tenslotte gebruikten we dit protocol om patiënt-tot-patiënt variabiliteit te demonstreren in celmigratieparameters op populatieniveau, waaronder een correlatie van epidermale groeifactorreceptor ( EGFR ) genomische versterking met verhoogd migrerend potentieel van tumorcellen 16 . Daarnaast bleek dat de time-lapse microscopie van tumorplakken vóór en na de behandeling met het anti-invasieve middel, gefitinib, een significante vermindering van migratie aantoonde, die specifiek was voor EGFR- geamplificeerde tumorplakken 16 .
Figuur 1: Human GBM Organotypic Slice Cultuurinfectie, Imaging, en Cell Migration Analysis Workflow. Tumorweefsel is gelokaliseerd naar een specifiek gebied via intraoperatieve navigatieapparatuur. Een week na het snijden wordt het ZsGreen-expressieve retrovirus toegevoegd aan de segmentenculturen om de mitotisch actieve tumorcellen te labelen. 3 dagen na infectie worden plakjes voorbereid voor confocale beeldvorming. De 3D-beeldgegevens worden na verwerkt naar 2D-beelden voor het bijhouden van cellenmigratiepaden, generatie van tumorcel migratiekaarten en berekening van migratieparameters van de tumorcel. Gedeelten van deze figuur werden oorspronkelijk gepubliceerd in Parker et al. , 2013 16 en gereproduceerd met toestemming van Oxford University Press. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Menselijke GBM Organotypische Plakjes Behouden Histologische Eigenschappen Gedurende Ex Vivo Cultuur. ( A ) T1-contrastversterkte MRI-sequenties werden gebruikt om de regio (en) van weefselverwerving (pijl) te lokaliseren en te documenteren. ( B ) H & E-kleuring van het initiële donorweefsel (OR) en plakjes op dag 8 van de cultuur uit een plakkweek die wordt gegenereerd uit weefsel dat is verkregen uit het gebied, gemarkeerd in A. ( C ) Micro-milieu-pathologische en cellulaire kenmerken van GBM in vivo worden gehandhaafd Hele slice cultuur. (I, II) Immunohistochemie voor CD68, een microglia / macrofage marker, bij lage (bovenste) en hoge (onder) vergroting, toont microgliale persistentie in plakjes na 15 dagen cultuur. H & E kleuring op dag 4 van de slice cultuur bevestigt het onderhoud van pseudopallisatie necrose, een pathoLogische kenmerken van GBM, bij zowel lage (iii) als hoge (iv) vergroting. Schaalstaven = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Human GBM Slice Cultures Secure VEGF in reactie op hypoxie. ( A ) Het experiment gebruikte afzonderlijke kweekinzetten die 3 soortgelyke tumorgroeven bevatten die gegenereerd werden uit hetzelfde tumorgebied. De plakjes werden gedurende 12 uur in normoxia gehandhaafd, gevolgd door twee 12 uur intervallen van hypoxie, waarbij nieuwe media vóór elk interval werden toegevoegd. ( B ) VEGF-afscheiding in de media gemeten door ELISA (gemiddelde ± standaardafwijking) van segmentkulturen gegenereerd uit twee representatieve tumoren, werd significant verhoogdDer hypoxie dan normoxie (p <0,05). ( C ) Een gecombineerde analyse van plakculturen uit 4 verschillende tumoren vertoonde een verhoogde VEGF secretie na sequentiële 12 uur intervallen van hypoxie in vergelijking met normoxia (p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Tumor Cell Path Track Data zorgt voor kwantitatieve bepaling van celsnelheid en directionaliteit. ( A ) Tumorcellen met een richting van 1 vertegenwoordigen perfecte efficiëntie langs een rechte vector, terwijl degenen met een lagere richting inefficiënte meanderende paden aangaan, zoals weergegeven in deze schematische 16 . Reprinted met toestemming van de Universiteit van OxfordPress. ( B ) Analyse van representatieve path track data ("low" resolutie ~ 55 minuten cel tracking intervallen) demonstreert cellulaire variabiliteit in snelheid en richting. ( C ) Richtingaliteit versus migratiesnelheid voor elk celspoor is afgebeeld om migratiegedrag over de celpopulatie te visualiseren (elke punt vertegenwoordigt een individuele cel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Microglia binnen GBM-snijculturen worden gekenmerkt door hoge migratiesnelheid en lage richting ten opzichte van tumorcellen. ( A ) Replicerende tumorcellen die selectief ZsGreen retrovirus en microglia expressie geven met een Isolectin-I B 4 -647 conjugaat bestaat in een representatief tumormicro-gebied tussen een representatieve snijcultuur. ( BC ) De paden van individueel gespeelde GBM ( B ) en microglia ( C ) in hetzelfde tumormicro-gebied tonen discordant migratiegedrag. Schaalstaven = 200 μm. ( D ) Een actieve migrerende tumorcel pauzes, trekt zijn processen terug (pijlkop), ondergaat celverdeling, en twee dochtercellen migreren in tegenovergestelde richting (pijlen). Schaalstaven = 50 μm. ( E en F ) Microglia demonstreert een verhoogde migratiesnelheid (p <0,0001) en verminderde directionaliteit (p <0,0001) in vergelijking met tumorcellen in dezelfde regio. (G) De verdeling van tumor- en microglialcellen gebaseerd op snelheid en richtheid demonstreert de unieke migrerende fenotypen van de twee celpopulaties.Et = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organotypische snijculturen uit menselijk kankerweefsel bieden een aantrekkelijk en onderbenut platform voor preklinische translatie-experimenten. Het ontbreken van een begrip van populair gedrag van tumorcellen met betrekking tot migratie, proliferatie en celdood in de micro-omgeving van de moedertaal. Critisch kan het bestuderen van tumorrespons op therapie in een dynamische, tijdopgeloste manier op het niveau van celgedrag licht werpen op nieuwe mechanismen van behandelingsweerstand. Human tumor slice culturen verschaffen een verband tussen het humane ziekteproces en de huidige ex vivo en in vivo modelleringstechnieken 19 . We hebben onlangs de techniek die hier beschreven is, gedocumenteerd als een methode om GBM-migratie te bestuderen, waarbij voor de eerste keer meetbare intertumorale variaties in celmigratiegedrag worden gerapporteerd in verband met EGFR-amplificatie en signalering 16 . In dit onderzoek werd ook het snijcultuurmodel gebruikt om de patie te testenNt-specifieke effectiviteit van de EGFR-remmer, gefitinib, als een mogelijke anti-invasieve therapie voor GBM 16 .
Verscheidene van de gemeenschappelijke valkuilen tijdens het snijden van weefsel, retrovirale infectie, beeldvorming en beeldanalyse paradigma zijn hierboven besproken. Het retrovirale infectieprotocol garandeert echter verdere aandacht. Gezien de variatie tussen patiënten en patiënten kan het moeilijk zijn om de dichtheid van virale gelabelde tumorcellen in elke segment te titreren. Als onvoldoende aantallen cellen worden gemerkt door het virale construct, voegt u dagelijks extra 5-10 μl aliquots retrovirale supernatant toe aan de oppervlakte van elke plak totdat de gewenste concentratie van gemerkte tumorcellen is bereikt. In de primaire segmentenculturen is het percentage replicerende cellen in het algemeen lager dan in getransformeerde cellijnen, waardoor de subset van cellen die permissief zijn voor retrovirale integratie op elk tijdstip, beperkt worden. Als er te veel cellen zijn gemarkeerd, voorkomt u accUrate afbakening van celmigratiepaden, verdunde de virale supernatant met neuronale media om een lagere effectieve titer te bereiken. Tumor geassocieerde microglia omvatte het fluorescerende eiwit uitdrukken retrovirus bij een frequentie van ongeveer 1% van alle gemerkte cellen. We waren in staat om deze cellen visueel te isoleren voor afzonderlijke analyse door gebruik te maken van een microglia bindend lectine voor post-imaging data analyses ( Figuur 5 ).
De tumor micro-omgeving, inclusief aspecten van voedingslevering, cel-cel interacties en extracellulaire matrix spelen allemaal een rol in de pathogenese van GBM 20 . Directe humane GBM-snijculturen elimineren de noodzaak van passeren binnen kleine dierenmodellen of gedistribueerde celcultuur, terwijl er een nauwe recapitulatie van de humane tumor micro-omgeving wordt verschaft. Voorts bieden slice culturen uniforme toegang tot voedingsstoffen over monsters, terwijl celcellen en cel-ECM-interacties behouden blijven. Door het verminderen van varIaties in cellulaire toegang tot voedingsstoffen die bekend zijn om binnen tumoren te voorkomen, stellen we voor de waargenomen verschillen in de culturen licht op intrinsieke verschillen tussen tumorcelgedrag ( dwz migratie) op het bevolkingsniveau. Het interpreteren van gegevens verzameld over segmentkulturen die voortkomen uit menselijke tumoren wordt echter gecompliceerd door inherente inter- en intra-tumorale heterogeniteit. Critisch is verdere studie nodig om de mogelijke genetische en epigenetische verschuivingen die kunnen optreden tijdens ex vivo onderhoud van humane tumor snij culturen, te karakteriseren.
Het gebruik van menselijke tumorgraakculturen in parallel met fase I / II klinische proeven is een veelbelovende strategie om segmentenparameters te correleren met de klinische resultaten van de patiënt. Validatie van deze potentiële predictieve / prognostische parameters is nodig voordat slice culturen kunnen worden gebruikt om oncologische therapie te personaliseren. Ons werk, evenals die van anderen, demonstreert de haalbaarheid van biomarker validatie <Sup class = "xref"> 21, evenals snelle ex vivo testen van therapeutische middelen in segmentkulturen uit GBM 9 , 16 . Soortgelijke humane schijfcultuurtechnieken met behulp van long 22 , colon 22 , hoofd en nek 23 , borst 24 en prostaatkanker 25 weefsels suggereren dat deze aanpak algemeen is voor humane kankers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag Dr. Lee Niswander en dr. Rada Massarwa bedanken voor hun technische expertise en bijdragen aan het hier beschreven sneeuwcultuur-confocale beeldvormingsprotocol. Verder dankzij dr. Kalen Dionne die deskundigheid verstrekt over het optimaliseren van hersen tumorweefsel snijden en kweekparameters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
- Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
- Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
- Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
- Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
- Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
- Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
- Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
- Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
- Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
- Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
- Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
- Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
- Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
