Summary
I modelli attuali ex vivo di glioblastoma (GBM) non sono ottimizzati per studi fisiologicamente rilevanti di invasione tumorale umana. Qui presentiamo un protocollo per la generazione e la manutenzione di culture organiche di fetta da tessuti freschi umani GBM. Viene fornita una descrizione della microscopia a tempo trascorso e tecniche quantitative di analisi delle migrazioni di cellule.
Abstract
Glioblastoma (GBM) continua a portare una prognosi clinica estremamente scarsa, nonostante terapia chirurgica, chemioterapica e radioterapia. L'invasione tumorale progressiva nel parenchima del cervello circostante rappresenta una dura sfida terapeutica. Per sviluppare terapie anti-migrazione per GBM, sono essenziali sistemi di modello che forniscono un background fisiologicamente rilevante per la sperimentazione controllata. Qui presentiamo un protocollo per la generazione di culture di fetta da tessuto umano GBM ottenuto durante la resezione chirurgica. Queste colture permettono la sperimentazione ex vivo senza passaggio attraverso xenograft di animali o colture di cellule singole. Inoltre, descriviamo l'uso di microscopia confocale di scansione laser a tempo intervallato in combinazione con il monitoraggio delle cellule per studiare quantitativamente il comportamento migratorio delle cellule tumorali e la risposta associata alle terapie. Le fette sono generate in modo riproducibile entro 90 minuti dall'acquisizione di tessuti chirurgici. Cellula fluorescente mediata retroviralmente laIl rilievo, l'imaging confocale e le analisi delle migrazioni delle cellule tumorali vengono successivamente completate entro due settimane dalla cultura. Abbiamo utilizzato con successo queste culture di fetta per scoprire i fattori genetici associati ad un aumento del comportamento migratorio nel GBM umano. Inoltre, abbiamo convalidato la capacità del modello di individuare variazioni specifiche del paziente in risposta alle terapie anti-migrazione. Passando in avanti, le colture umane GBM fetta sono una piattaforma attraente per una rapida valutazione ex vivo della sensibilità tumorale agli agenti terapeutici, al fine di favorire la terapia neuro-oncologica personalizzata.
Introduction
Lo studio di laboratorio del glioblastoma (GBM) è ostacolato da una mancanza di modelli che ricapitolano fedelmente le caratteristiche patologiche necessarie della malattia umana, vale a dire la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Gli studi comparativi relativi ai test di invasione in vitro 2D e 3D, nonché i modelli di coltura a fetta di roditori 3D, hanno messo in evidenza programmi migratori cellulari disarmati meccanicamente in questi due contesti, potenzialmente limitando la traducibilità dei risultati dei sistemi 2D alla malattia umana 1 , 2 , 3 . Il paradigma della coltura del tumore dell'organotipo e del processo di imaging qui descritto consente lo studio della migrazione delle cellule tumorali all'interno di fette di tessuto tumorale umano ex vivo ottenuto da resezione chirurgica. Così, le colture di tessuti tumorali chirurgicamente resecati in combinazione con la microscopia confocale a tempo scadere forniscono una piattaforma per studiare la migrazione delle cellule tumorali nel nativoMicroambiente senza dissoluzione del tessuto o passaggio della cultura.
C'è una vasta letteratura che utilizza modelli di coltura di fegato di cervello di roditore di GBM generati da tumori umani xenografts, tumori indotti da retrovirus e sovrapposizioni cellulari per studiare l'invasione tumorale 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Recentemente, diversi gruppi hanno descritto la generazione di colture di fetta organotipiche direttamente dal tessuto GBM umano 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Tuttavia, vi è una marcata differenza tra i protocolli pubblicati per quanto riguarda la tecnica di affettatura e il supporto della cultura. Inoltre, l'uso di culture di fetta organotipiche si è concentrato sugli endpoint sperimentali statici che hanno incluso i cambiamenti nei segnali cellulariNg, proliferazione e morte. Il protocollo qui descritto si espande sui precedenti paradigmi della coltura della fetta incorporando un'osservazione temporale del comportamento delle cellule tumorali dinamiche attraverso la microscopia confocale di scansione laser a tempo scadente. La scoperta recente della variazione genetica di inter 11 e intratumoral 12 , 13 nel GBM umano sottolinea l'importanza di collegare questa eterogeneità con i comportamenti delle cellule tumorali e le sue implicazioni sulla risposta tumorale alla terapia. Qui riportiamo un protocollo semplificato e riproducibile per l'utilizzo di culture di fetta diretta da un tessuto tumorale umano per visualizzare la migrazione delle cellule tumorali in quasi tempo reale.
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Protocol
Prima di iniziare la raccolta di campioni di tessuti del paziente, è necessario ottenere un consenso informato da ciascun paziente in base ad un protocollo IRB approvato. Gli autori di questo protocollo hanno ricevuto il consenso per i lavori descritti in protocolli IRB approvati presso l'Università di Colorado Hospital e l'Inova Fairfax Hospital. I dati raccolti da queste culture di fetta non sono stati usati per dirigere le decisioni di cura del paziente.
1. Preparazione di pre-affettatura
- Preparare il supporto di "tessuto" e "mantenere la cultura della fetta" il giorno prima della pianificazione della resezione tumorale e della raccolta dei tessuti (o utilizzare i media precedentemente generati entro 2 settimane). Aggiungere 5 ml di soluzione Penicillina-Streptomicina (10.000 U / mL) e 5 mL di 1 M HEPES a 500 mL di un DMEM ad alto Glucosio per generare il mezzo di trattamento dei tessuti.
- Preparare 250 ml di mezzi di manutenzione della coltura a fetta usando una base del mezzo neuronale ( ad es. , Neurobasal)Hout fenolo rosso. Supplementare questo mezzo con 10 mM HEPES, 1x B-27 supplemento, 400 μM di L-glutamina, 600 μM L-alanyl-L-glutammina dipeptide, 60 U / mL penicillina, 60 μg / mL streptomicina e 6 U / ml nistatina.
- Conservare tutti i supporti a 4 ° C per non più di 2 settimane.
2. Giornata della chirurgia: Acquisizione tissutale
- Nel giorno dell'acquisizione dei tessuti, preparare 50-100 mL di soluzione di agarosio a basse temperature di fusione nel mezzo di lavorazione dei tessuti, utilizzando 50-100 mL di un mezzo di trattamento tessuto utilizzando vetri autoclavati e una tecnica sterile in un cappuccio di flusso laminare. Entrambe le concentrazioni di agarosio sono necessarie per accogliere variazioni imprevedibili nella coerenza del tessuto tumorale.
- Scaldare la sospensione di agarosio usando un forno a microonde, fino a quando non viene osservata una bolla leggera. Mettere la soluzione agarosa in un bagno d'acqua di 37 ° C per mantenere in uno stato liquido fino all'uso.
- Inserire 1 ml di supporti di mantenimento della coltura in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
- Usa un sterilePinza per inserire inserti vuoti della coltura PTFE in ogni pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale umidificato con acqua con una atmosfera di 5% di CO 2 mantenuta a 37 ° C.
- Usando una pipetta sterile di Pasteur in un cappuccio di flusso laminare, bolle una miscela di gas 95% O 2 /5% CO 2 in un pallone contenente mezzi di trattamento del freddo di ghiaccio per circa 15-30 minuti, prima dell'acquisizione del tessuto tumorale. L'utilizzo di supporti sovra ossigenati minimizza l'ipossia nel tessuto di massa durante l'elaborazione.
- Preparare etichettati tubi conici da 50 mL (sufficienti per il numero desiderato di singole regioni tumorali da isolare) contenenti aliquote di 20 mL di supporti di trattamento ghiacciati sovra ossigenati per trasportare il tessuto tra sala operatoria e impianto di affettatura.
- In combinazione con un neurochirurgo, pianificare pre-operativamente la regione tumorale per l'acquisizione del campione. Selezionare una regione tumorale con miglioramento del contrasto come dimostrato nell'immagine clinica del pazienteG (sequenze T1 post-gadolinium di risonanza magnetica (MRI)). L'esperienza precedente suggerisce che questa zona renda il tessuto tumorale vivo al contrario del tessuto necrotico.
NOTA: è stata tentata la generazione di fette dalla materia bianca (peritumorale) circostante; Tuttavia, l'autofluorescenza di sottofondo e la diminuzione della densità delle cellule tumorali hanno limitato l'utilità sperimentale di queste fette. - Ottenere il tessuto tumorale verso l'inizio della resezione tumorale. Evitare la raccolta di tessuti tumorali esposti a cautery bipolare estesa, che può compromettere la vitalità del tessuto a seguito di lesioni termiche. I campioni di tessuto acquisiti durante la resezione del tumore frammentario dimostrano una vitalità migliorata rispetto al tessuto acquisito da lunghe rese bloc . Questa osservazione può riguardare la deprivazione differenziale del tessuto tumorale del flusso sanguigno come risultato della resezione chirurgica e del tempo prolungato all'acquisizione.
- Se lo si desidera, etichettare e memorizzare i tessuti tumorali in tubi conici separati per isolare campioniDa regioni tumorali distinte. (Vale a dire il tessuto tumorale superficiale o profondo). Le posizioni tissutali precise possono essere registrate se / quando è disponibile la navigazione chirurgica intraoperatoria.
3. Preparazione della cultura della fetta
NOTA: Questo protocollo richiede l'uso di tessuti umani freschi e non fischiati. Tutti i campioni sono presunti infettati e devono essere trattati secondo i protocolli patogeni universali. Appropriate attrezzature di protezione personale devono essere indossate in qualsiasi momento. Le pinze ei bisturi devono essere esposti a 15 minuti di luce UV prima dell'uso. Durante l'uso, spruzzare a intermittenza gli utensili con etanolo al 70% (EtOH), lasciando tempo per evaporare il liquido prima dell'uso. Il processo di taglio viene eseguito in modo semi-sterile utilizzando un cappuccio di flusso laminare orizzontale con aria filtrata.
- Posizionare i pezzi di tessuto tumorale in un piatto di Petri con i mezzi di trattamento ghiacciati. Per lavare il tessuto tumorale e ridurre al minimo i globuli rossi aderenti, noiEa pipetta per scambiare delicatamente e scartare i supporti nel piatto di Petri tre volte.
- Usando un bisturi, tagliare i pezzi del tumore in forme di scatola rettangolare. Tagliare i pezzi di tessuto a circa 3 mm x 3 mm x 10 mm. Rimuovere con cautela le eventuali imbarcazioni collegate tramite l'estrazione o la trazione dolce con le pinze fine.
- Pipettare 5 - 7 ml di agarosio 37 ° C in un piccolo stampo in plastica (~ 2 cm 3 ) a forma di cubo. Confermare che la temperatura della soluzione di agarosio non sia superiore a 37 ° C con un termometro sterile prima dell'uso.
- Lasciare agarossi sedere per circa 1 min su un letto di ghiaccio.
- Inserire 2 "4" strisce tumorali in agarosio con asse lungo orientato verticalmente.
NOTA: Le strisce tissutali tendono a "affondare" nell'agarose prima della solidificazione. Per evitare questa complicazione, tenere temporaneamente la striscia tissutale in posizione verticale finché l'agarosio non viene ulteriormente solidificato. - Tenere il tessuto contenente agarosio in un letto di ghiaccio per 2 - 5 miN per facilitare la solidificazione.
- Rimuovere lo stampo dal ghiaccio e rimuovere delicatamente il blocco agarosio tagliando i lati della forma con un bisturi. Evitare di applicare una forza eccessiva sul blocco, che può rompere l'agarosio.
- Usare una generosa goccia di colla cianoacrilato per inserire il blocco di agarosio sulla piastra del campione vibratome. Lasciare incollare per circa 1 - 2 min.
- Riempire il serbatoio vibratome con supporti di trattamento ghiacciati per immergere il blocco agarosio apposto sulla piastra del campione.
- Durante la tranciatura, bolle una miscela di gas 95% O 2 /5% CO 2 nel serbatoio vibratome attraverso una pipetta in plastica sterile tagliata.
- Impostare lo spessore della fetta di vibratore a 300 - 350 μm.
- Regolare la velocità di avanzamento della lama e l'ampiezza della lama in base alla consistenza del tessuto. Il tessuto "Stiffer" GBM richiede velocità di avanzamento più lente e ampiezza più elevata. Le regolazioni esatte della velocità e delle ampiezze della lamierina variano in base alle specifiche del vibratome.
- Trasferire le fette di tessuto in un piatto di Petri con supporti di trattamento con ghiaccio freddo utilizzando una microspatula in acciaio inossidabile.
- Ottenere piastre a 6 pozzetti contenenti inserti PTFE e supporti di coltura equilibrati di fetta dall'incubatore (come preparato nella sezione 2, passaggio 4).
- Fette di tessuto a piastre utilizzando una microspatula in acciaio inossidabile. Ridurre al minimo il contatto diretto e la manipolazione del tessuto utilizzando un piccolo pennello di seta fine per generare una "onda fluida" per spingere delicatamente la fetta dalla spatola aNd sull'inserto di coltura.
NOTA: Ridurre al minimo la quantità di supporti di elaborazione introdotti in cima all'inserto della coltura tissutale. Se si trasferiscono quantità eccessive di supporti che causano le fette di galleggiamento, utilizzare una pipetta sterile Pasteur per rimuovere i supporti. - Restituire le piastre a 6 pozzetti contenenti fette tumorali in un incubatore mantenuto a 37 ° C con un'atmosfera al 5% di CO 2 .
NOTA: L'intero protocollo di embedding e di affettatura dovrebbe essere completato entro 90 minuti dall'acquisizione dei tessuti tumorali dalla sala operatoria.
4. Manutenzione della cultura della fetta
- Dopo 12 - 24 h, trasferire le colture di fettine afferrando ogni bordo dell'inserto con una pinza sterile e trasferendo su piastre contenenti mezzi di manutenzione della coltura fresca della fetta. Assicurarsi che i mezzi di manutenzione della cultura della fetta, aliquotati in ciascun pozzetto, si equilibrino nell'incubatrice per almeno 15 minuti prima di trasferire gli inserti.
- Spostare gli inserti in nuovi piatti a 6 pozzetti con cul fresco equilibratoOgni 48 ore.
- Se si desidera, l'aliquota di vecchia coltura di fetta con una pipetta per uso immediato nei dosaggi biochimici ( cioè ELISA) o congelare a -80 ° C per un futuro impiego.
5. Etichettatura delle cellule tumorali attraverso la proteina fluorescente verde esprimendo retrovirus
NOTA: La microscopia a tempo trascorso per l'analisi della migrazione delle cellule tumorali richiede una stabile e lunga durata di etichettatura fluorescente delle cellule all'interno della coltura di fetta. L'uso del retrovirus è suggerito perché infetta infatti selettivamente le cellule di divisione, arricchendo così l'etichettatura fluorescente all'interno della popolazione delle cellule tumorali in contrasto con microglia o altri tipi di cellule presenti all'interno della fetta. La standardizzazione dell'infezione suggerisce che un titolo virale di 10 4 CFU / μL abbia un'espressione sufficiente di proteine fluorescenti verdi per il monitoraggio e l'analisi della migrazione cellulare. Aumento del titolo virale, uso di virus non selettivi (ad es. Adenovirus, lentivirus) o otI suoi mezzi di etichettatura di tutte le cellule possono escludere l'identificazione dei confini delle cellule chiare durante la migrazione, complicando così l'analisi. L'uso di marcatori fluorescenti alternativi può essere utilizzato e ottimizzato se necessario.
- Ottieni il retrovirus per l'infezione di fette tumorali sia tramite protocolli standard 5 , 14 , sia da una fonte disponibile in commercio. Diluire il surnatante virale aggiungendo il volume appropriato in un mezzo neuronale non fornito per ottenere un titolo virale di 10 4 CFU / μL.
- Tra 7 e 10 giorni di coltura infettano le colture tumorali di interesse con 5-10 μL di virus (10 4 CFU / μL). Posizionare il virus delicatamente in goccia sulla superficie di ogni fetta di tessuto. Diminuire il volume di supernatante aggiunto se la fetta galleggia sulla superficie dell'inserto. Piastre di ritorno contenenti culture di fetta all'incubatore.
- Valutare le fette per le cellule tumorali etichettate a partire da 24 h dopo Infezione virale (vedere paragrafo 6). Questo ritardo di tempo varia a seconda dell'insorgenza virale e della cinetica di espressione genica di fluorescenza. Per i costrutti virali utilizzati qui, è stato richiesto 72 h per osservare un robusto segnale fluorescente con un microscopio standard di epifluorescenza.
NOTA: Raramente, le fette mostrano una distribuzione prevalentemente periferica di celle con etichetta viralmente, che può complicare l'imaging confocale. Per evitare questa complicazione, cercare di ridurre lo spessore della fetta e la variazione dello spessore in tutta la fetta. Se la cultura della fetta ha una regione più spessa vicino al centro, questo può impedire una adeguata penetrazione dei nutrienti, limitando così la popolazione di dividere attivamente le cellule tumorali. Un test qualitativo per la visualizzazione di questa complicazione è l'aggiunta di un reagente di tint tetrazolio ( cioè MTT) al supporto di coltura della fetta. Le aree della fetta che non diventano blu dopo l'aggiunta del reagente indicano una mancanza di attività metabolica e compromesso la salute delle fette.
NOTA: Una volta confermata la buona trasduzione e la salute della cultura, le cellule possono essere riprese in condizioni di controllo, seguite da un periodo di imaging simile in condizioni di trattamento. Utilizzando questo protocollo, le cellule sono state immagazzinate e monitorate con successo per 12 ore in ogni condizione. Tuttavia, periodi più brevi o più lunghi di imaging e manipolazione ambientale possono anche essere informativi.
- Caricamento del microscopio
- Prima di imaging, posizionare 1 ml di supporti freschi della fetta in un piatto di fondo in vetro.
- Lasciare che i supporti nel piatto di fondo in vetro siano equilibrati in un incubatore per 15 minuti.
NOTA: A questo punto possono essere aggiunti agenti di etichettatura solubili, quali lectine coniugate fluorescenti ( cioè Isolectin IB 4 per etichettatura microglia) o punti quantici coniugati ligandi, al supporto di coltura della fetta per identificare la cellulaSubpopulazioni ular durante l'imaging. - Trasferire l'inserto da imaging su un piatto di fondo in vetro utilizzando pinze sterili in un cappuccio flusso laminare. Trasportare il piatto alla fase del microscopio.
- Mantenere le colture di fetta a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore a microscopio sigillato. Utilizzare l'umidificazione sterile di H 2 O della camera di incubazione, se disponibile per prevenire l'evaporazione eccessiva del mezzo (particolarmente importante per esperimenti di imaging più lunghi).
- Utilizzare un microscopio confocale con una lunga distanza di lavoro 10x e l'eccitazione laser per singolo fotone e / o multi-fotone.
NOTA: Assicurarsi che l'obiettivo obiettivo del microscopio fornisca una distanza di lavoro adeguata. Come risultato dell'altezza aggiunta dall'incubatrice a palchi, piatto di fondo in vetro e inserto per la coltura tissutale, gli obiettivi di lunga distanza di lavoro sono critici. - Fissare la lastra di vetro, rimuovere la copertura in plastica di Petri e coprire con un gas-Membrana permeabile.
- Acquisizione dell'immagine
- Utilizzare il microscopio per ispezionare visivamente la fetta e individuare un campo adatto con un'adeguata densità di cellule tumorali a fluorescenza tra il bordo della fetta e il centro. Evitare i campi di imaging al bordo della fetta, a causa di una maggiore suscettibilità dei cambi di tessuto durante l'imaging. Possono essere impiegate arpe di fetta di tessuto per limitare questo turno.
- Utilizzare il software di imaging in modalità di analisi multidimensionale per impostare i primi (inferiori) e ultimi (superiori) confini dello stack Z, in modo che tutte le posizioni da immaginare contengano il segnale cellulare fluorescente visibile. L'imaging attraverso 150 - 200 μm della fetta, con una costante Z di 10 μm, ha fornito una risoluzione adeguata per il tracciamento dei percorsi cellulari (questo può essere regolato per esigenze individuali di imaging).
- Se il microscopio ha uno stadio motorizzato, assicurarsi che sia sufficiente un tempo sufficiente per ogni acquisizione di stack Z. Imposta l'intervallo di tempo tra le acquisizioni a pariTempo di scansione per posizione x numero di posizioni all'immagine ( vale a dire regioni tumorali rappresentate).
NOTA: per l'eccitazione simultanea dei fluorofori verdi e rossi, utilizzare un programma di scansione lineare a doppia linea, con eccitazione simultanea di 488 nm e 633 nm. La lunghezza d'onda dell'eccitazione laser selezionata varia in base alle singole proteine fluorescenti espresse. - Mantenere il potere laser uniforme e le impostazioni del pinhole confocale tra le regioni del tumore imaged. Utilizzare l'impostazione più bassa di potenza laser necessaria per chiarire chiaramente i corpi e processi delle cellule tumorali per limitare la fototossicità. Le unità di parametri di imaging specifiche (ad es., Potenza e confocal pinhole) variano in base alle specifiche del microscopio e della sorgente laser.
- Compensare l'evaporazione potenziale del mezzo aggiungendo i gradini Z-stack da 2 a 3 "tampone" nei piani focali che avanzano verso l'obiettivo. Questo impedisce efficacemente il tessuto di lasciare la gamma di acquisizione Z-stackIoni nel piano verticale.
7. L'elaborazione dell'immagine e il monitoraggio delle cellule tumorali
NOTA: Molti sistemi di imaging confocale sono dotati di software di elaborazione delle immagini proprietari. Le fasi di elaborazione di seguito descritte comprendono un protocollo generale, che può essere eseguito su piattaforme software. Le istruzioni specifiche verranno fornite per le piattaforme open source, NIH ImageJ e MTrackJ 15 .
- Aprire un file Z-stack. In ImageJ, fai clic su "Immagine → Stack → Progetto Z". Sceglie la prima e l'ultima Z-stack da includere e sceglie "Max Intensity" come tipo di proiezione. Il risultato è un rendering chiamato proiezione di intensità massima (MIP). Creare un MIP da ciascun insieme di immagini Z-stack catturate in ciascuna regione imaged.
- Concatenare i MIP di ciascuna regione per creare una serie temporale. Fai clic su "Immagine → Pile → Immagini in pila".
- Identificare manualmente la posizioneDel corpo cellulare "centroid" selezionando il punto centrale approssimato dal punto di vista del corpo della cellula tumorale. Ciò avviene facendo clic sul corpo della cella usando la funzionalità di traccia "add" di MTrackJ (un plugin open-source per NIH ImageJ).
- Fare clic per demarcare la posizione del corpo cellulare in ogni fotogramma delle immagini. Ciò crea una "traccia" univoca per ogni cella. Sequentemente, contrassegnare le posizioni del corpo cellulare della cella successiva. Ripetere questo processo finché non vengono tracciati tutti i percorsi di migrazione della cella.
- Una volta che una popolazione di cellule viene tracciata in una determinata regione microumorale del tumore, esportare tutte le coordinate della traccia cellulare utilizzando la funzione "misura" di MTrackJ. Salvare il file in formato .xls in modo da analizzare i dati grezzi utilizzando il foglio di calcolo o il software generato dall'utente.
- Utilizza le coordinate registrate per ogni punto lungo la traccia di migrazione di una cella, per eseguire analisi quantitative tra cui la derivazione della velocità di migrazione, della direzionalità e di altre migrazioniMetrici, come descritto in Parker et al 16 .
NOTA: Tutte le distanze e le velocità calcolate sono sotto-stime dei valori reali. Questo è inerente alla trasformazione di immagini tridimensionali (e percorsi di migrazione) a dati bidimensionali attraverso la generazione di proiezioni di massima intensità.
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Representative Results
Il nostro gruppo ha generato con successo colture di fetta da oltre 50 pazienti sottoposti a resezione iniziale GBM. Questa generazione di fetta, la cultura, l'etichettatura retrovirale, l'imaging e il protocollo di analisi delle migrazioni sono stati semplificati in un flusso di lavoro riproducibile ( Figura 1 ). Criticalamente, queste fettine organotipiche GBM dimostrano la concordanza con il tessuto tumorale originario in tutta la cultura, compreso il mantenimento di segni patologici e microglia fino a 15 giorni di coltura ( Figura 2 ). Inoltre, abbiamo utilizzato questo sistema per eseguire test funzionali della risposta tumorale ai cambiamenti microambientali. Come metrica dell'integrità fisiologica, abbiamo esaminato come colture GBM fecero risposta all'ipossia (1% O 2 ) misurando la produzione di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), un processo che si verifica abbondantemente all'interno del microambiente GBM in vivo 17 ,"> 18. Abbiamo dimostrato che posizionando le culture di fetta in condizioni ipossiche, le fette hanno montato una rapida risposta fisiologica, inducendo la liberazione del VEGF nel supporto ( Figura 3 ).
Per valutare gli aspetti qualitativi e quantitativi della migrazione delle cellule tumorali abbiamo utilizzato le immagini di scadenza per generare mappe di migrazione dettagliate. Queste mappe demarcano tutte le cellule GBM tracciate all'interno dei confini delle microregioni tumorali (1 mm 2 ), fornendo una visualizzazione statica del comportamento migratorio dinamico della popolazione tumorale. Sono state calcolate misure quantitative della velocità di migrazione e della direzionalità (spostamento della cellula / distanza totale percorsa) per ciascuna cella, consentendo di studiare le variazioni dei parametri di migrazione attraverso le aree tumorali, i campioni tumorali e in risposta al trattamento ( Figura 4 ).
Il protocollo di etichettatura e imaging delle celleCriptato qui fornisce anche una sufficiente risoluzione spaziale e temporale per valutare i cambiamenti nella morfologia delle cellule durante la migrazione attraverso il microambiente del tumore nativo. Abbiamo osservato la presenza di cellule tumorali motile morfologicamente distinte e microgliali mescolati all'interno della coltura di fetta ( Figura 5A ). Il movimento della cellula tumorale è stato caratterizzato da un processo di "ricerca e scoppio", che ha coinvolto ripetuta sporgenza e ritrazione della filopodia da una cella statica, seguita da un breve periodo di movimento efficace. Le regioni di fetta di immagini circa ogni 10 minuti hanno fornito anche una risoluzione temporale adeguata per registrare immagini di cellule tumorali in fase di divisione cellulare. Queste cellule divide in pausa dalla migrazione, completate la mitosi e le cellule figlia hanno riavviato la migrazione senza indugio, tutte all'interno di un periodo di 3 ore ( Figura 5D ). Al contrario, la microglia migra a una velocità più elevata e più coerente, con direzioni inferiori rispetto alle cellule tumorali adiacenti,Dimostrando la loro migrazione relativamente inefficiente ( Figura 5C, 5E-G ). Tali osservazioni possono essere importanti per ottenere una visione della biologia sottostante alle risposte specifiche del paziente o delle cellule al trattamento.
Infine, abbiamo usato questo protocollo per dimostrare la variabilità paziente-paziente nei parametri di migrazione cellulare a livello di popolazione, compresa una correlazione dell'ampliamento genomico del recettore dei fattori di crescita epidermica ( EGFR ) con un potenziale migratorio aumentato delle cellule tumorali 16 . Inoltre, la microscopia delle fasce tumorali prima e dopo il trattamento con il farmaco anti-invasivo, gefitinib, ha dimostrato una significativa riduzione della migrazione, che era specifica per le fette tumorali amplificate EGFR 16 .
Figura 1: umana GBM Fetta organotipica Infezione infezione, imaging e flusso di lavoro di analisi migrazione cellulare. Il tessuto tumorale è localizzato in una regione specifica tramite apparecchiatura di navigazione intraoperatoria. Una settimana dopo l'affettamento, il retrovirus esprimente ZsGreen viene aggiunto alle colture di fetta per etichettare le cellule tumorali mitotiche attive. 3 giorni dopo l'infezione, le fette sono preparate per l'imaging confocale. I dati di imaging 3D vengono post-elaborati in immagini 2D per il tracciamento delle tracce di migrazione cellulare, la generazione di mappe di migrazione delle cellule tumorali e il calcolo dei parametri di migrazione delle cellule tumorali. Porzioni di questa cifra sono state originariamente pubblicate in Parker et al. , 2013 16 e riprodotte con permesso di Oxford University Press. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Fettine organotipiche umane GBM mantengono le caratteristiche istologiche durante la cultura Ex Vivo . ( A ) La sequenza MRI di contrasto T1 è stata utilizzata per localizzare e documentare la regione (i) di acquisizione dei tessuti (freccia). ( B ) la colorazione H & E del tessuto iniziale del donatore (OR) e le fette al giorno 8 della coltura da una coltura di fetta generata da tessuto ottenuto dalla regione evidenziata in A. ( C ) Le caratteristiche patologiche e cellulari microenvironmentali del GBM, in vivo In tutta la cultura della fetta. (I, II) Immunohistochemistry per CD68, un marker microglia / macrofago, a basso (superiore) e alto (basso) ingrandimento, dimostra la persistenza microglia in fette dopo 15 giorni di coltura. La colorazione H & E nel giorno 4 della coltura della fetta conferma la manutenzione della necrosi pseudopallisading, un pathoMarchio logico di GBM, sia a basso (iii) sia ad alto (iv) ingrandimento. Barre di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le colture human GBM Slice secernono VEGF in risposta all'iposia. ( A ) L'esperimento ha utilizzato inserti di coltura individuale contenenti 3 fette di tumore di dimensioni simili generate dalla stessa regione tumorale. Le fette sono state mantenute in normoxia per 12 h, seguite da due intervalli di 12 anni di ipossia, con nuovi mezzi aggiunti prima di ogni intervallo. ( B ) La secrezione di VEGF nei media misurata con ELISA (media ± deviazione standard) dalle colture di fetta generata da due tumori rappresentativi, è stata significativamente aumentataDer ipossia rispetto alla normossia (p <0,05). ( C ) Un'analisi aggregata di colture di fetta provenienti da 4 tumori differenti ha dimostrato una maggiore secrezione di VEGF dopo 12 mesi di sequenza di ipossia sequenziale rispetto alla normossia (p <0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: I dati della traccia di cellule tumorali permettono la determinazione quantitativa della velocità e della direzione della cellula. ( A ) Le cellule tumorali con una direzionalità di 1 rappresentano un'efficienza perfetta lungo un vettore rettilineo, mentre quelli con una minore direzionalità si impegnano in percorsi di meandri inefficienti, come rappresentato in questo schema 16 . Ristampato con l'autorizzazione dell'Università di OxfordStampa. ( B ) L'analisi dei dati relativi alle tracce rappresentative ("bassa" risoluzione di intervalli di tracciamento delle celle di 55 minuti) dimostra la variabilità cellulare nella velocità e nella direzionalità. ( C ) La direzione della velocità di migrazione per ogni traccia cellulare viene tracciata per visualizzare il comportamento di migrazione attraverso la popolazione cellulare (ogni punto rappresenta una singola cella). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Microglia all'interno delle colture GBM Slice sono caratterizzate da alta velocità di migrazione e bassa direzionalità rispetto alle cellule tumorali. ( A ) Replicare le cellule tumorali selettivamente esprimendo ZsGreen retrovirus e microglia tagged con un isolectin-I B 4 -647 coniugato esistono mescolati in una micro regione regione tumorale rappresentativa da una coltura di fetta rappresentativa. ( BC ) I percorsi di GBM ( B ) e microglia ( C ) individuati nello stesso micro-regione tumorale dimostrano comportamenti discordanti di migrazione. Barre di scala = 200 μm. ( D ) Una pausa di cellule tumorali che migra attivamente, ritrae i suoi processi (punta di freccia), subisce una divisione cellulare e due cellule figlia migrano in direzioni opposte (frecce). Barre di scala = 50 μm. ( E e F ) Microglia dimostra una maggiore velocità di migrazione (p <0,0001) e diminuzione della direzionalità (p <0,0001) rispetto alle cellule tumorali nella stessa regione. (G) La distribuzione di cellule tumorali e microgliali basata sulla velocità e la direzionalità dimostra i fenotipi migratori unici delle due popolazioni cellulari.Et = "_ blank"> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le colture organotipiche di fetta del tessuto tumorale umano forniscono una piattaforma attraente e inutilizzata per la sperimentazione preclinica di traslazione. La comprensione dei comportamenti a livello di popolazione delle cellule tumorali per quanto riguarda la migrazione, la proliferazione e la morte cellulare nel microambiente del tumore nativo manca. Critico, studiare la risposta tumorale alla terapia in modo dinamico e temporaneo a livello di comportamento delle cellule possono illuminare nuovi meccanismi di resistenza al trattamento. Le culture di fetta del tumore umano forniscono un legame tra il processo di malattia umana e le tecniche di modellazione ex vivo e in vivo 19 . Abbiamo recentemente convalidato la tecnica qui descritta come un metodo per studiare la migrazione GBM, riportando per la prima volta variazioni inter-tumorali misurabili nel comportamento della migrazione cellulare correlate all'amplificazione e alla segnalazione di EGFR 16 . Questo studio ha anche utilizzato il modello della coltura di fetta per testare il patieNt-specifica efficacia dell'inibitore EGFR, gefitinib, come potenziale terapia anti-invasiva per GBM 16 .
Diverse delle insidie comuni durante il taglio dei tessuti, l'infezione retrovirale, l'imaging e il paradigma di analisi delle immagini sono stati discussi in precedenza. Tuttavia, il protocollo antiretrovirale richiede un'ulteriore attenzione. Dato la variazione del paziente al paziente, può risultare difficile titolare la densità delle cellule tumorali viralmente etichette all'interno di ciascuna fetta. Se un numero insufficiente di cellule è etichettato dal costrutto virale, aggiungete altre aliquote da 5-10 μL di supernatante retrovirale alla superficie di ciascuna fetta ogni giorno fino a raggiungere la concentrazione desiderata di cellule tumorali etichettate. Nelle colture primarie di fetta, il cento delle cellule di replicazione è generalmente inferiore rispetto alle linee cellulari trasformate, limitando così il sottoinsieme di cellule permissive all'incorporazione retrovirale in qualsiasi momento. In alternativa, se troppe cellule sono etichettate, impedendo di accUrare la demarcazione dei percorsi di migrazione cellulare, diluire il supernatante virale con i mezzi neuronali per ottenere un titolo efficace inferiore. La microglia associata tumorale incorpora la proteina fluorescente che esprime il retrovirus ad una frequenza di circa l'1% di tutte le cellule etichettate. Siamo stati in grado di isolare visivamente queste cellule per un'analisi separata mediante l'uso di un lectino legante microglia per analisi dei dati post-imaging ( Figura 5 ).
Il microambiente del tumore, compresi aspetti della consegna dei nutrienti, interazioni delle cellule cellulari e matrice extracellulare, svolgono un ruolo nella patogenesi del GBM 20 . Le culture dirette umane del GBM eliminano la necessità di passare in piccoli modelli animali o di colture cellulari diffuse, pur fornendo una stretta recapitolazione del microambiente tumorale umano. Inoltre, le culture di fetta offrono un accesso uniforme alle sostanze nutritive attraverso i campioni, mantenendo interazioni tra cellule e cellule ECM. Riducendo la variations in accesso cellulare ai nutrienti che sono noti a verificarsi all'interno dei tumori, proponiamo differenze osservate nelle culture mettono in luce differenze intrinseche tra comportamenti delle cellule tumorali (cioè migrazione) a livello di popolazione. Tuttavia, l'interpretazione dei dati raccolti attraverso le culture di fetta generata da tumori umani è complicata da eterogeneità intrinseca e intra-tumorale intrinseca. Critico, è necessario studiare ulteriormente per caratterizzare i cambiamenti genetici e epigenetici potenziali che possono verificarsi durante la conservazione ex vivo delle colture tumorali umane.
L'uso delle colture tumorali umane in parallelo con le sperimentazioni cliniche di fase I / II è una strategia promettente per correlare i parametri della fetta con i risultati clinici del paziente. La validazione di questi potenziali parametri predittivi / prognostici è necessaria prima che le culture di fetta possano essere utilizzate per personalizzare la terapia oncologica. Il nostro lavoro, così come quello di altri, dimostra la fattibilità della convalida del biomarker <Sup class = "xref"> 21, oltre a test rapidi ex vivo degli agenti terapeutici nelle colture di fetta da GBM 9 , 16 . Tecniche di coltura umana simili di colture usando il polmone 22 , il colon 22 , la testa e il collo 23 , il seno 24 e il tessuto tumore della prostata 25 suggeriscono che questo approccio è generalizzabile attraverso i tumori umani.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il dottor Lee Niswander e il dottor Rada Massarwa per la loro competenza tecnica e contributi al protocollo di imaging confocale della cultura di fetta qui descritto. Più ulteriormente grazie al dottor Kalen Dionne che ha fornito le competenze per quanto riguarda l'ottimizzazione dei parametri di affettatura e cultura del tessuto tumorale cerebrale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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