Summary
Los modelos ex vivo actuales de glioblastoma (GBM) no están optimizados para el estudio fisiológicamente relevante de la invasión tumoral humana. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y mantenimiento de cultivos de corte organotípico de tejido humano GBM fresco. Se proporciona una descripción de microscopía de lapso de tiempo y técnicas de análisis de migración celular cuantitativa.
Abstract
El glioblastoma (GBM) sigue teniendo un pronóstico clínico extremadamente pobre a pesar de la terapia quirúrgica, quimioterapéutica y de radiación. La invasión tumoral progresiva en el parénquima cerebral circundante representa un desafío terapéutico duradero. Para desarrollar terapias anti-migración para GBM, los sistemas modelo que proporcionan un fondo fisiológicamente relevante para la experimentación controlada son esenciales. Aquí, presentamos un protocolo para generar cultivos de corte de tejido GBM humano obtenido durante la resección quirúrgica. Estos cultivos permiten la experimentación ex vivo sin pasar a través de xenoinjertos animales o cultivos de células individuales. Además, se describe el uso de lapso de tiempo láser exploración microscopía confocal en relación con el seguimiento de células para estudiar cuantitativamente el comportamiento migratorio de las células tumorales y la respuesta asociada a la terapéutica. Las rebanadas se generan de forma reproducible dentro de los 90 minutos de la adquisición de tejido quirúrgico. Célula fluorescente mediada por retrovirusBeling, imágenes confocales y análisis de migración de células tumorales se completan posteriormente dentro de las dos semanas de cultivo. Hemos utilizado con éxito estos cultivos de sectores para descubrir los factores genéticos asociados con el aumento del comportamiento migratorio en el GBM humano. Además, hemos validado la capacidad del modelo para detectar variación específica del paciente en respuesta a terapias anti-migración. Avanzando, los cultivos de trozos GBM humanos son una plataforma atractiva para la evaluación rápida ex vivo de la sensibilidad tumoral a agentes terapéuticos, con el fin de avanzar en la terapia neuro-oncológica personalizada.
Introduction
El estudio de laboratorio del glioblastoma (GBM), se ve obstaculizado por la falta de modelos que recapitulan fielmente las características patológicas requeridas de la enfermedad humana, a saber, la migración e invasión de células tumorales. Los estudios comparativos de los ensayos de invasión in vitro 2D y 3D, así como los modelos de cultivo de roedores triturados en 3D, han descubierto programas de migración celular dispares de forma mecánica en estos dos contextos, limitando potencialmente la traslación de los hallazgos de los sistemas 2D a la enfermedad humana 1 , 2 , 3 . El cultivo de corte de tumor organotípico y el paradigma de formación de imágenes descrito aquí permite el estudio de la migración de células tumorales dentro de cortes de tejido tumoral humano ex vivo obtenido de resección quirúrgica. Por lo tanto, los cultivos en rebanadas de tejido tumoral resecado quirúrgicamente junto con la microscopía confocal de lapso de tiempo proporcionan una plataforma para estudiar la migración de células tumorales en la región nativaMicroambiente sin disolución de tejido o pasaje de cultivo.
Existe una extensa literatura empleando modelos de cultivo de GBM generados a partir de xenoinjertos tumorales humanos, tumores inducidos por retrovirus y superposiciones celulares para estudiar la invasión tumoral 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Recientemente, varios grupos han descrito la generación de cultivos de corte organotípico directamente de tejido GBM humano 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Sin embargo, existe una marcada variación entre los protocolos publicados con respecto a la técnica de corte y los medios de cultivo. Además, el uso de cultivos de corte organotípico se ha centrado en puntos finales experimentales estáticos que han incluido cambios en la señal celularNg, proliferación y muerte. El protocolo descrito aquí se expande sobre paradigmas previos de cultivo de rebanadas mediante la incorporación de observación resuelta en tiempo de comportamientos dinámicos de células tumorales a través de la microscopía confocal de barrido por láser de lapso de tiempo. El descubrimiento reciente de la variación genética inter 11 e intratumoral 12 , 13 en GBM humano subraya la importancia de vincular esta heterogeneidad con comportamientos de células tumorales y sus implicaciones en la respuesta tumoral a la terapia. Aquí, informamos de un protocolo racionalizado y reproducible para el uso de cultivos de rebanada directa de un tejido de cáncer humano para visualizar la migración de células tumorales en casi tiempo real.
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Protocol
Antes de iniciar la recolección de muestras de tejido del paciente, se debe obtener el consentimiento informado de cada paciente bajo un protocolo aprobado de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los autores de este protocolo recibieron consentimiento para el trabajo descrito en los protocolos IRB aprobados en el Hospital de la Universidad de Colorado y el Hospital Inova Fairfax. Los datos recolectados de estos cultivos en rebanadas no se usaron para dirigir las decisiones de cuidado del paciente.
1. Preparación pre-rebanado
- Preparar los medios de "procesamiento de tejidos" y los medios de "mantenimiento de cultivo de rebanadas" el día anterior a la resección del tumor y la recolección de tejidos (o utilizar los medios previamente generados en 2 semanas). Añadir 5 ml de solución de penicilina-estreptomicina (10.000 U / ml) y 5 ml de HEPES 1 M a 500 ml de DMEM de alta glucosa para generar el medio de procesamiento de tejidos.
- Preparar 250 ml de medio de mantenimiento del cultivo en rebanadas usando una base de medio neuronal ( por ejemplo , Neurobasal) witDe color rojo fenol. Complemente este medio con 10 mM de HEPES, 1x B-27 de suplemento, 400 μ M L-glutamina, 600 μ M L-alanil-L-glutamina dipéptido, 60 U / ml penicilina, 60 μ g / ml estreptomicina, y 6 U / ml nystatin.
- Almacene todos los medios a 4 ° C durante no más de 2 semanas.
2. Día de Cirugía: Adquisición de Tejidos
- En el día de la adquisición del tejido, se preparan de 50 a 100 ml de soluciones de agarosa de baja temperatura de fusión a 1% y 2% (p / v%) en medios de procesamiento de tejidos usando cristalería autoclavada y técnica estéril en una campana de flujo laminar. Ambas concentraciones de agarosa son necesarias para acomodar la variación impredecible en la consistencia del tejido tumoral.
- Calentar la suspensión de agarosa, utilizando un microondas, hasta que se observe una ebullición suave. Colocar la solución de agarosa en un baño de agua a 37 ° C para mantener en estado líquido hasta su uso.
- Coloque 1 ml de medio de mantenimiento del cultivo en rebanadas en cada pocillo de una placa de 6 pocillos.
- Utilice un estérilPinzas para colocar insertos de cultivo de PTFE vacíos en cada pocillo. Colocar la placa en una atmósfera humidificada,, incubadora de cultivo de tejidos con camisa de agua con una atmósfera de CO2 al 5% mantenido a 37 ° C.
- Utilizando una pipeta Pasteur estéril en una campana de flujo laminar, burbujea una mezcla de 95% de O 2 /5% de CO 2 en un matraz que contiene medios de procesamiento de tejido helado durante aproximadamente 15 a 30 min, antes de la adquisición de tejido tumoral. El uso de medios supra-oxigenados minimiza la hipoxia en el tejido a granel durante el procesamiento.
- Preparar tubos cónicos de 50 ml (suficientes para que el número deseado de regiones tumorales individuales sean aisladas) que contengan alícuotas de 20 ml de medios de procesamiento supra-oxigenados enfriados con hielo para transportar tejido entre la sala de operaciones y la instalación de corte.
- Conjuntamente con un neurocirujano, planificar previamente la región del tumor para la adquisición de la muestra. Seleccione una región de tumor con realce de contraste como se demuestra en la imaginología clínica del pacienteG (T1 secuencias de resonancia magnética post-gadolinio (MRI)). La experiencia previa sugiere que esta zona produce tejido tumoral viable en oposición al tejido necrótico.
NOTA: Se intentó generar rebanadas de la sustancia blanca peritumoral circundante; Sin embargo, la autofluorescencia de fondo y la disminución de la densidad de células tumorales limitó la utilidad experimental de estos cortes. - Obtener tejido tumoral hacia el inicio de la resección tumoral. Evitar la recolección de tejido tumoral expuesto a un cauterio bipolar extenso, que puede comprometer la viabilidad del tejido secundario a una lesión térmica. Las muestras de tejido adquiridas durante la resección tumoral fragmentada demuestran una viabilidad mejorada en comparación con el tejido adquirido a partir de resecciones largas en bloque . Esta observación puede estar relacionada con la falta de tejido tumoral diferencial del flujo sanguíneo como resultado de la resección quirúrgica y el tiempo prolongado hasta la adquisición.
- Si se desea, etiquetar y almacenar el tejido tumoral en tubos cónicos separados para aislar las muestrasDe regiones tumorales distintas. (Es decir, superficial frente a tejido tumoral profundo). Se pueden registrar lugares precisos en los tejidos si la cirugía intraoperatoria está disponible.
3. Preparación del cultivo en rebanadas
NOTA: Este protocolo requiere el uso de tejido humano fresco no fijado. Se presume que todas las muestras son infecciosas y deben ser manejadas de acuerdo con los protocolos de patógenos transmitidos por sangre universal. El equipo de protección personal apropiado debe ponerse en todo momento. Los fórceps y escalpelos deben ser expuestos a 15 minutos de luz UV antes de su uso. Durante el uso, rocíe intermitentemente las herramientas con etanol al 70% (EtOH), dejando tiempo para que el líquido se evapore antes de usarlo. El proceso de rebanado se realiza de una manera semi-estéril utilizando una campana de flujo laminar horizontal con aire filtrado.
- Coloque las piezas de tejido de tumor en una placa de Petri con medios de procesamiento helado. Para lavar el tejido tumoral y minimizar los glóbulos rojos adherentes,Una pipeta para intercambiar suavemente y descartar los medios de comunicación en la placa de Petri tres veces.
- Usando un bisturí, corte las piezas del tumor en formas rectangulares. Recorte las piezas de tejido para aproximar 3 mm x 3 mm x 10 mm. Retire con cuidado todos los vasos adheridos mediante excisión o tracción suave con fórceps finos.
- Pipetear de 5 a 7 ml de agarosa a 37 ° C en un pequeño molde de plástico con forma de cubo (~ 2 cm 3 ). Confirmar que la temperatura de la solución de agarosa no es mayor de 37 ° C con un termómetro estéril antes de su uso.
- Permita que la agarosa se sienta durante aproximadamente 1 min en un lecho de hielo.
- Coloque 2 - 4 tejido de tumor "tiras" en agarosa con eje largo orientado verticalmente.
NOTA: Las tiras de tejido tenderán a "hundirse" en la agarosa antes de la solidificación. Para evitar esta complicación, sujete temporalmente la tira de tejido en orientación vertical hasta que la agarosa se solidifique adicionalmente. - Mantenga el tejido que contiene moho de agarosa sobre una cama de hielo por 2 - 5 millasN para facilitar la solidificación.
- Retire el molde del hielo y retire suavemente el bloque de agarosa cortando los lados de la forma con un bisturí. Evite colocar una fuerza excesiva en el bloque, que puede fracturar la agarosa.
- Utilice una gota generosa de pegamento de cianoacrilato para fijar el bloque de agarosa a la placa del espécimen vibratomo. Deje el pegamento fijado por aproximadamente 1 - 2 min.
- Llene el depósito de vibratome con un medio de procesamiento helado para sumergir el bloque de agarosa pegado a la placa de muestra.
- Durante el rebanado, burbujee 95% de mezcla de gas O 2 /5% CO 2 en el depósito vibratorio a través de una pipeta de plástico estéril recortada.
- Ajuste el grosor de la rebanada vibratome a 300 - 350 μm.
- Ajuste la velocidad de avance de la cuchilla y la amplitud de la cuchilla de acuerdo con la consistencia del tejido. El tejido GBM "más rígido" requiere velocidades de avance de la cuchilla más lentas y una mayor amplitud. Los ajustes exactos de la velocidad y amplitud de la cuchilla varían de acuerdo con las especificaciones de vibratome.
- Transferir las rebanadas de tejido a la placa de Petri con medios de procesamiento helado usando una microespátula de acero inoxidable.
- Obtenga placas de 6 pocillos que contengan insertos de PTFE y medios de cultivo de rebanada equilibrados de la incubadora (como se preparó en la sección 2, etapa 4).
- Rebanadas de tejido de placa utilizando una microspatula de acero inoxidable. Minimice el contacto directo y la manipulación de los tejidos usando un pincel pequeño de cerdas finas para generar una "onda de fluido" para empujar suavemente la rebanada de la espátula aNd sobre el inserto de cultivo.
NOTA: Minimice la cantidad de medio de procesamiento introducido en la parte superior del inserto de cultivo de tejidos. Si se transfieren cantidades excesivas de medios que hacen que los segmentos floten, utilice una pipeta Pasteur estéril para retirar los medios. - Devolver las placas de 6 pocillos que contienen rebanadas tumorales a una incubadora mantenida a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO2.
NOTA: Todo el protocolo de incrustación y corte se debe completar dentro de los 90 minutos de la adquisición del tejido tumoral de la sala de operaciones.
4. Mantenimiento del cultivo en rebanadas
- Después de 12 - 24 h, transfiera los cultivos de la rebanada agarrando cada borde del inserto con una pinza estéril y transfiéralo a las placas que contienen el medio de mantenimiento del cultivo de la rebanada fresca. Asegúrese de que el medio de mantenimiento del cultivo en rebanadas alicuotado en cada pocillo se equilibra en la incubadora durante al menos 15 minutos antes de transferir insertos.
- Mueva las inserciones a nuevas placas de 6 pocillos con corte fresco equilibradoCada 48 h.
- Si se desea, alícular el medio de cultivo de la rebanada vieja con una pipeta para uso inmediato en ensayos bioquímicos ( es decir, ELISA) o congelar a -80 ° C para uso futuro.
5. Etiquetado de células tumorales a través de la proteína de fluorescencia verde que expresa el retrovirus
NOTA: La microscopia de lapso de tiempo para el análisis de la migración de células tumorales requiere un etiquetado fluorescente estable a largo plazo de las células dentro del cultivo en rebanadas. Se sugiere el uso de retrovirus porque infecta selectivamente las células en división, con lo que se enriquece el marcado fluorescente dentro de la población de células tumorales en oposición a microglia u otros tipos de células presentes en la porción. La estandarización de la infección sugiere que un título viral de 10 4 CFU / μL da como resultado suficiente expresión de proteína fluorescente verde para el seguimiento y análisis de la migración celular. Aumento del título viral, el uso de virus no selectivo ( es decir , adenovirus, lentivirus), o otSus medios de etiquetar todas las células pueden impedir la identificación de los límites celulares claros durante la migración, lo que complica el análisis. El uso de marcadores fluorescentes alternativos se puede utilizar y optimizar según sea necesario.
- Obtención de retrovirus para la infección de los cortes tumorales ya sea a través de protocolos estándar 5 , 14 o de una fuente comercial. Diluir el sobrenadante viral añadiendo el volumen apropiado en medio neuronal no suplementado para alcanzar un título viral de 10 4 UFC / μl.
- Entre 7 y 10 días de cultivo infectan los cultivos de corte de tumor de interés con 5 - 10 μl de virus (10 4 UFC / μl). Colocar el virus suavemente gota a gota sobre la superficie de cada rebanada de tejido. Disminuir el volumen sobrenadante añadido si la porción flota en la superficie del inserto. Devuelva las placas que contienen los cultivos de la rebanada a la incubadora.
- Evaluar las rodajas de células tumorales marcadas a partir de las 24 h después de Infección viral (ver sección 6). Este retardo de tiempo variará dependiendo de la incorporación viral y la cinética de expresión de los genes de fluorescencia. Para las construcciones víricas utilizadas aquí, se requirieron 72 h para observar una señal fluorescente robusta con un microscopio de epifluorescencia estándar.
NOTA: Rara vez, las rebanadas muestran una distribución predominantemente periférica de células marcadas viralmente, lo que puede complicar la formación de imágenes confocales. Para evitar esta complicación, intente reducir el grosor del corte y la variación del grosor a través de la rebanada. Si el cultivo en rebanada tiene una región más gruesa cerca del centro, esto puede impedir la penetración adecuada de nutrientes, limitando así la población de células tumorales que se dividen activamente. Un ensayo cualitativo para detectar esta complicación es la adición de un reactivo de colorante de tetrazolio ( es decir, MTT) al medio de cultivo en lonchas. Las áreas de la rebanada que no se vuelven azules después de añadir el reactivo indican una falta de actividad metabólica y una salud comprometida de la rebanada.
NOTA: Después de confirmar la transducción y la salud del cultivo, las células se pueden visualizar en condiciones de control, seguido por un período igual de formación de imágenes bajo condiciones de tratamiento. Usando este protocolo, las células fueron visualizadas con éxito y seguimiento durante 12 horas en cada condición. Sin embargo, períodos más cortos o más largos de imágenes y manipulación ambiental también pueden ser informativos.
- Carga del microscopio
- Antes de la obtención de imágenes, coloque 1 ml de medio de rebanada fresca en un plato inferior de vidrio.
- Deje que el medio en la placa inferior de vidrio se equilibre en una incubadora durante 15 min.
NOTA: En este punto soluble agentes de marcaje, tales como lectinas fluorescentemente conjugados (es decir, Isolectina IB 4 para el etiquetado microglia) o ligando conjugado puntos cuánticos, se puede añadir al medio de cultivo rebanada para la identificación de célulasDurante la formación de imágenes. - Transfiera el inserto que se va a imaginar a un plato inferior de vidrio usando fórceps estériles en una campana de flujo laminar. Transporte el plato a la etapa del microscopio.
- Mantener los cultivos en rebanadas a 37 ° C y 5% de atmósfera de CO 2 en un microscopio sellado con incubadora en la parte superior del escenario. Utilizar la humidificación estéril de H 2 O de la cámara de incubación si está disponible para evitar la evaporación excesiva del medio (especialmente importante para experimentos de formación de imágenes más largos).
- Utilizar un microscopio confocal con un objetivo de aire de larga distancia de trabajo de 10X y excitación láser para un solo fotón y / o multi-fotón.
NOTA: Asegúrese de que el objetivo del microscopio proporciona una distancia de trabajo adecuada. Como resultado de la altura añadida de la incubadora de escenario superior, plato inferior de vidrio y inserto de cultivo de tejido, los objetivos de larga distancia de trabajo son críticos. - Asegure la placa inferior de vidrio, retire la cubierta plástica de la caja de Petri, y cubra con una cubierta de gas-Permeable.
- Adquisición de imágen
- Utilice el microscopio para inspeccionar visualmente la rebanada y localice un campo adecuado con una densidad adecuada de células tumorales marcadas fluorescentemente entre el borde de la rebanada y el centro. Evite los campos de imágenes en el borde de la rebanada, debido a una mayor susceptibilidad de los cambios de tejido durante la obtención de imágenes. Se pueden emplear arpas de trozos de tejido para limitar este cambio.
- Utilice el software de imágenes en el modo de análisis multidimensional para establecer los límites de la primera pila Z (inferior) y la última (superior), de modo que todas las posiciones que se visualizarán contengan señal celular fluorescente visible. La obtención de imágenes a través de 150 - 200 μm de la rebanada, con un paso Z constante de 10 μm proporcionó una resolución adecuada para rastrear las trayectorias de las células (esto se puede ajustar para las necesidades de imagen individuales).
- Si el microscopio tiene una etapa motorizada, asegúrese de que haya un tiempo adecuado para cada adquisición de la pila Z. Establezca el intervalo de tiempo entre adquisicionesTiempo de exploración por posición x número de posiciones a imagen ( es decir , regiones tumorales con imágenes).
NOTA: Para la excitación simultánea de los fluoróforos verde y rojo, utilice un programa de exploración de láser de línea dual, con excitación simultánea de 488 nm y 633 nm. La longitud de onda de la excitación del láser seleccionada variará de acuerdo con las proteínas fluorescentes individuales expresadas. - Mantenga la potencia uniforme del láser y los ajustes confocal del agujero de alfiler entre las regiones tumorales con imágenes. Utilice la configuración de potencia láser más baja necesaria para demarcar claramente los cuerpos de células tumorales y los procesos para limitar la fototoxicidad. Las unidades específicas de parámetro de imagen ( es decir, la potencia y configuración confocal del agujero de alfiler) variarán según las especificaciones del microscopio y de la fuente láser.
- Compensar la evaporación potencial de los medios agregando 2 - 3 "buffer" Z pasos de pila en los planos focales avanzando hacia el objetivo. Esto evita efectivamente que el tejido abandone el rango de adquisición de la pila ZIones en el plano vertical.
7. Postprocesamiento de imágenes y seguimiento de células tumorales
NOTA: Muchos sistemas de imagen confocal están equipados con un software propietario de procesamiento de imágenes. Los pasos de procesamiento que se discuten a continuación comprenden un protocolo general, que puede realizarse a través de plataformas de software. Se darán instrucciones específicas para las plataformas de código abierto, NIH ImageJ y MTrackJ 15 .
- Abra un archivo de pila Z. En ImageJ, haga clic en "Imagen → Pilas → Proyecto Z". Elija la primera y última pila Z para incluirla y elija "Intensidad máxima" como tipo de proyección. El resultado es una representación llamada proyección de intensidad máxima (MIP). Cree un MIP de cada conjunto de imágenes de pila Z capturadas en cada región con imágenes.
- Concatenar los MIP de cada región para crear una serie de tiempo. Haga clic en "Imagen → Pilas → Imágenes para apilar."
- Identificar manualmente la ubicaciónDel "centroide" del cuerpo celular seleccionando el punto central visualmente aproximado del cuerpo de la célula tumoral. Esto se logra haciendo clic en el cuerpo de la celda utilizando la funcionalidad de pista "add" de MTrackJ (un complemento de código abierto para NIH ImageJ).
- Haga clic para demarcar la ubicación del cuerpo de la celda en cada fotograma de la serie de imágenes. Esto crea una "pista" única para cada celda. Secuencialmente, marque las ubicaciones del cuerpo celular de la célula siguiente. Repita este proceso hasta que se rastreen todas las rutas de migración de celdas.
- Una vez que una población de células es rastreada en una micro región del tumor, exportar todas las coordenadas de la pista celular utilizando la función "medida" de MTrackJ. Guarde el archivo como un formato .xls para que los datos sin procesar se puedan analizar utilizando hoja de cálculo o software generado por el usuario.
- Utilice las coordenadas registradas para cada punto a lo largo de la pista de migración de una célula, para realizar análisis cuantitativos incluyendo la derivación de la velocidad de migración, la direccionalidad y otras migracionesMétricas, como se describe en Parker et al [ 16] .
NOTA: Todas las distancias y velocidades calculadas son subestimaciones de los valores reales. Esto es inherente a la transformación de imágenes tridimensionales (y rutas de migración) a datos bidimensionales mediante la generación de proyecciones de máxima intensidad.
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Representative Results
Nuestro grupo ha generado exitosamente cultivos de rebanadas de más de 50 pacientes sometidos a resección inicial de GBM. Esta generación de rebanadas, cultivo, marcaje retroviral, imágenes y protocolo de análisis de migración se ha racionalizado en un flujo de trabajo reproducible ( Figura 1 ]. De forma crítica, estas rodajas organotípicas de GBM demuestran concordancia con el tejido tumoral de origen a lo largo de la cultura, incluyendo el mantenimiento de marcas patológicas y microglia hasta 15 días en cultivo ( Figura 2 ). Además, hemos utilizado este sistema para realizar ensayos funcionales de la respuesta del tumor a los cambios microambientales. Como una métrica de la integridad fisiológica, se examinó cómo los cultivos GBM rebanada respondió a la hipoxia (1% O 2 ) mediante la medición de la producción de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un proceso que se produce abundantemente en el GBM microambiente in vivo 17 ,"> 18. Hemos demostrado que mediante la colocación de los cultivos de rebanada en condiciones hipóxicas, las rodajas montado una rápida respuesta fisiológica, induciendo la liberación de VEGF en el medio ( Figura 3 ].
Para evaluar los aspectos cualitativos y cuantitativos de la migración de células tumorales, utilizamos las imágenes de lapso de tiempo para generar mapas de migración detallados. Estos mapas demarcan todas las células GBM rastreadas dentro de los confines de microrregiones tumorales (1 mm 2 ), proporcionando una visualización estática del comportamiento migratorio dinámico de la población tumoral. Para cada célula se calcularon medidas cuantitativas de la velocidad y direccionalidad de la migración (desplazamiento celular / distancia total recorrida), permitiendo investigar los cambios en los parámetros de migración a través de las regiones tumorales, las muestras de tumores y en respuesta al tratamiento ( Figura 4 ).
El protocolo de etiquetado e imaginería celularAquí también proporciona una resolución espacial y temporal suficiente para evaluar los cambios en la morfología celular durante la migración a través del microambiente tumoral nativo. Se observó la presencia de morfológicamente distintas células tumorales móviles y microglial entremezclados dentro de la rebanada de cultivo ( Figura 5A ]. El movimiento de las células tumorales se caracterizó por un proceso de "búsqueda y ráfaga", que implicó la protrusión y retracción repetidas de los filopodios de una célula estática, seguida de un corto período de movimiento eficiente. Las regiones de corte de imágenes aproximadamente cada 10 min también proporcionaron una resolución temporal adecuada para registrar imágenes de lapso de tiempo de células tumorales sometidas a división celular. Estas células en división se detuvieron de la migración, se completó la mitosis, y las células hijas reiniciaron la migración sin demora, todo dentro de un marco temporal de 3 h ( Figura 5D ). Por el contrario, la microglia migra a una velocidad más alta y más consistente, con direccionalidad más baja que las células tumorales adyacentes,Lo que demuestra su migración relativamente ineficiente ( Figura 5C, 5E-G ). Tales observaciones pueden ser importantes para obtener una visión de la biología subyacente de pacientes o células específicas respuestas al tratamiento.
Por último, hemos utilizado este protocolo a la demostración de paciente a paciente en la variabilidad de los parámetros de migración celular a nivel de población, incluyendo una correlación de epidérmico factor de crecimiento ( EGFR ) la amplificación genómica con aumento del potencial migratorio de las células tumorales [ 16] . Además, microscopía de lapso de tiempo de los cortes tumor antes y después del tratamiento con el fármaco anti-invasivo, gefitinib, demostró una reducción significativa en la migración, que era específico para EGFR amplificado tumor rodajas [ 16] .
Figura 1: Flujo de trabajo de análisis de migración de células, GBM organotípico de cultivo de rebanadas. El tejido tumoral se localiza en una región específica a través de equipos de navegación intraoperatoria. Una semana después del corte, se añade el retrovirus que expresa ZsGreen a los cultivos de rebanada para marcar las células tumorales activas mitotically. 3 días después de la infección, las rebanadas se preparan para la formación de imágenes confocal. Los datos de imagen 3D se procesan posteriormente en imágenes 2D para el seguimiento de la trayectoria de migración celular, la generación de mapas de migración de células tumorales y el cálculo de parámetros de migración de células tumorales. Partes de esta cifra fueron publicadas originalmente en Parker et al , 2013 16 y reproducidas con permiso de Oxford University Press. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Rebanadas organotípicas de GBM humano Retenen características histológicas a lo largo de la cultura ex vivo . ( A ) Se utilizaron secuencias de MRI mejoradas de contraste T1 para localizar y documentar la región (s) de adquisición de tejido (flecha). ( B ) coloración H & E del tejido donante inicial (OR) y cortes al día 8 del cultivo a partir de un cultivo de rebanada generado a partir de tejido obtenido de la región resaltada en A. ( C ) Se mantienen las características patológicas y celulares microambientales de GBM in vivo En todo el cultivo en lonchas. (I, II) La inmunohistoquímica para CD68, un marcador de microglia / macrófago, a una ampliación baja (arriba) y alta (inferior), demuestra la persistencia microglial en rodajas después de 15 días de cultivo. La tinción de H & E en el día 4 del cultivo de la rebanada confirma el mantenimiento de la necrosis pseudopallisading, un pathoLógica de GBM, tanto a bajo (iii) y alto (iv) ampliación. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los cultivos de segmentos de GBM humanos secretan el VEGF en respuesta a la hipoxia. ( A ) El experimento utilizó insertos de cultivo individuales que contenían 3 cortes de tamaño similar generados a partir de la misma región tumoral. Las rodajas se mantuvieron en normoxia durante 12 h, seguido de dos intervalos de 12 h de hipoxia, con nuevos medios añadidos antes de cada intervalo. ( B ) La secreción de VEGF en el medio medido por ELISA (media ± desviación estándar) de los cultivos de rebanada generados a partir de dos tumores representativos,Der hipoxia que normoxia (p <0,05). ( C ) Un análisis combinado de cultivos en rebanadas de 4 tumores diferentes demostró una secreción aumentada de VEGF después de intervalos secuenciales de hipoxia de 12 h en comparación con normoxia (p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los datos de la trayectoria de la trayectoria de la célula del tumor permiten la determinación cuantitativa de la velocidad y de la direccionalidad de la célula. ( A ) Las células tumorales con una direccionalidad de 1 representan una eficiencia perfecta a lo largo de un vector recto, mientras que aquellas con menor direccionalidad se implican en caminos de meandros ineficientes, tal como se representa en este esquema 16 . Reimpreso con permiso de la Universidad de OxfordPrensa. ( B ) El análisis de los datos representativos de la trayectoria de la trayectoria (los intervalos de seguimiento de la celda de la "baja" resolución ~ 55 min) demuestra la variabilidad celular en velocidad y direccionalidad. ( C ) La direccionalidad frente a la velocidad de migración para cada pista celular se representa para visualizar el comportamiento de migración a través de la población celular (cada punto representa una célula individual). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Microglia dentro de GBM Los cultivos en rebanadas se caracterizan por una alta velocidad de migración y baja direccionalidad en relación con las células tumorales. ( A ) Replicar células tumorales que expresan selectivamente el retrovirus ZsGreen y la microglia marcada con una Isolectina-I B 4 -647 conjugados existen entremezclados en una micro-región tumoral representativa de un cultivo de rebanada representativo. ( BC ) Los caminos de GBM ( B ) y microglia ( C ) rastreados individualmente en la misma micro-región del tumor muestran comportamientos de migración discordantes. Barras de escala = 200 μm. ( D ) Una célula tumoral activamente migratoria hace una pausa, retrae sus procesos (punta de flecha), sufre una división celular y dos células hijas emigran en direcciones opuestas (flechas). Barras de escala = 50 μm. ( E y F ) Microglia demostraron una mayor velocidad de migración (p <0,0001) y una direccionalidad disminuida (p <0,0001) cuando se compararon con células tumorales en la misma región. (G) La distribución de células tumorales y microgliales basada en velocidad y direccionalidad demuestra los fenotipos migratorios únicos de las dos poblaciones celulares.Et = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los cultivos de cortes organotípicos procedentes de tejidos de cáncer humano proporcionan una plataforma atractiva y subutilizada para la experimentación de traducción preclínica. Falta conocimiento de los comportamientos poblacionales de las células tumorales con respecto a la migración, la proliferación y la muerte celular en el microambiente tumoral nativo. De manera crítica, el estudio de la respuesta tumoral a la terapia de una manera dinámica y resuelta en el tiempo a nivel del comportamiento celular puede arrojar luz sobre nuevos mecanismos de resistencia al tratamiento. Cultivos de tallo tumoral humano proporcionan un vínculo entre el proceso de la enfermedad humana y actual ex vivo e in vivo las técnicas de modelado [ 19] . Recientemente hemos validado la técnica descrita aquí como un método para estudiar la migración GBM, la presentación de informes por primera vez mesurable inter-tumoral variaciones en el comportamiento de la migración celular relacionados con EGFR amplificación y señalización [ 16] . Este estudio también utilizó el modelo de corte de cultivo para probar el patieNt específicos de la eficacia del inhibidor de EGFR, gefitinib, como un potencial de tratamiento anti-invasivo para GBM [ 16] .
Varios de los escollos comunes durante el corte de tejido, la infección retroviral, la imagen y el paradigma de análisis de imágenes se han discutido anteriormente. Sin embargo, el protocolo de infección retroviral merece mayor atención. Dada la variación de paciente a paciente, puede resultar desafiante titular la densidad de células tumorales marcadas viralmente dentro de cada rebanada. Si un número insuficiente de células está marcado por la construcción viral, añada alícuotas adicionales de 5-10 μL de sobrenadante retrovírico a la superficie de cada rebanada diariamente hasta que se consiga la concentración deseada de células tumorales marcadas. En cultivos de rebanada primaria, el porcentaje de células de replicación es generalmente menor que en líneas celulares transformadas, limitando así el subconjunto de células permisivas a la incorporación retroviral en cualquier momento. Alternativamente, si se etiquetan demasiadas células,Urate de las vías de migración celular, diluir el sobrenadante viral con medios neuronales para lograr un título efectivo inferior. La microglia asociada al tumor incorporaba la proteína fluorescente que expresaba el retrovirus a una frecuencia de aproximadamente el 1% de todas las células marcadas. Hemos sido capaces de aislar visualmente estas células para el análisis por separado mediante el uso de una microglia vinculante lectina para post-imaging análisis de datos ( Figura 5 ].
El microambiente del tumor incluyendo aspectos de la entrega de nutrientes, las interacciones célula-célula y la matriz extracelular todos juegan un papel en la patogénesis de GBM [ 20] . Los cultivos de corte humano directo de GBM eliminan la necesidad de pasaje dentro de modelos de animales pequeños o cultivo de células diseminadas, proporcionando al mismo tiempo una recapitulación cercana del microambiente de tumor humano. Además, los cultivos en rebanadas proporcionan un acceso uniforme a los nutrientes a través de las muestras, manteniendo al mismo tiempo las interacciones célula - célula y célula - ECM. Al reducir varEn el acceso celular a los nutrientes que se sabe que se producen dentro de los tumores, se proponen diferencias observadas en los cultivos arrojar luz sobre las diferencias intrínsecas entre las conductas de las células tumorales ( es decir, la migración) a nivel de la población. Sin embargo, la interpretación de los datos recolectados a través de los cultivos de rebanadas generados a partir de tumores humanos se complica por la heterogeneidad intrínseca e intra-tumoral inherente. De forma crítica, se necesita un estudio adicional para caracterizar los cambios genéticos y epigenéticos potenciales que pueden ocurrir durante el mantenimiento ex vivo de cultivos de tiras tumorales humanas.
El uso de cultivos de tiras tumorales humanas en paralelo con los ensayos clínicos de Fase I / II es una estrategia prometedora para correlacionar los parámetros de corte con los resultados clínicos del paciente. La validación de estos posibles parámetros predictivos / pronósticos es necesaria antes de que los cultivos en rodajas puedan usarse para personalizar la terapia oncológica. Nuestro trabajo, así como el de otros, demuestra la viabilidad de la validación de biomarcadores <Sup class = "xref"> 21, así como pruebas rápidas ex vivo de agentes terapéuticos en cultivos de corte de GBM 9 , 16 . Técnicas similares de cultivo en rebanadas humanas que usan tejidos de pulmón 22 , colon 22 , cabeza y cuello 23 , mama 24 y cáncer de próstata 25 sugieren que este enfoque es generalizable a través de cánceres humanos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Dr. Lee Niswander y al Dr. Rada Massarwa por su experiencia técnica y sus contribuciones al protocolo de imagen confocal de cultura de corte descrito aquí. Además, gracias al Dr. Kalen Dionne, que aportó su experiencia en la optimización del corte del tejido tumoral cerebral y los parámetros de cultivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
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