Summary
Nuvarande ex vivo- modeller av glioblastom (GBM) är inte optimerade för fysiologiskt relevant studie av humant tumörinvasion. Här presenterar vi ett protokoll för generering och underhåll av organotypa skivkulturer från frisk human GBM-vävnad. En beskrivning av time-lapse-mikroskopi och kvantitativ cellmigrationsanalyssteknik tillhandahålls.
Abstract
Glioblastom (GBM) fortsätter att bära en extremt dålig klinisk prognos trots kirurgisk, kemoterapeutisk och strålbehandling. Progressiv tumörinvasion i omgivande hjärnparenchyma representerar en bestående terapeutisk utmaning. För att utveckla anti-migrerande terapier för GBM är väsentliga systemsystem som ger en fysiologiskt relevant bakgrund för kontrollerat experiment. Här presenterar vi ett protokoll för att generera skivkulturer från human GBM-vävnad erhållen under kirurgisk resektion. Dessa kulturer möjliggör experiment ex vivo utan passage genom djur xenotransplantat eller enskilda cellkulturer. Vidare beskriver vi användningen av time-lapse laserscanning-konfokalmikroskopi i samband med cellspårning för att kvantitativt studera tumörcellernas migrerande beteende och associerat svar på terapeutiken. Skivor genereras reproducerbart inom 90 minuter av kirurgiskt vävnadsförvärv. Retroviralt medierad fluorescerande cell laBeling, konfokal imaging och tumörcell migreringsanalyser avslutas därefter inom två veckor av odling. Vi har framgångsrikt använt dessa skivkulturer för att avslöja genetiska faktorer som hör samman med ökat migrerande beteende i human GBM. Vidare har vi validerat modellens förmåga att upptäcka patientspecifik variation som svar på anti-migrerande terapier. Förflyttning framåt är humana GBM-skivkulturer en attraktiv plattform för snabb ex vivo- bedömning av tumörkänslighet för terapeutiska medel, för att främja personlig neuro-onkologisk terapi.
Introduction
Laboratorieundersökningen av glioblastom (GBM) hindras av brist på modeller som troget rekapitulerar de nödvändiga patologiska egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen, nämligen tumörcells migration och invasion. Jämförande studier av 2D- och 3D- in vitro- analyser samt 3D-gnagarekulturmodeller har upptäckt mekaniskt olika cellmigreringsprogram i dessa två sammanhang, vilket potentiellt begränsar översättbarheten hos fynd från 2D-system till den mänskliga sjukdomen 1 , 2 , 3 . Det organotypa tumörskivningskulturen och avbildningsparadigmet som beskrivs här möjliggör studier av tumörcells migrering inom skivor av human vätskevävnad ex vivo erhållen från kirurgisk resektion. Sålunda tillhandahåller skivkulturer av kirurgiskt återvunnen tumörvävnad i samband med tidsförlust-konfokalmikroskopi en plattform för att studera tumörcells migrering i det inföddaMikromiljö utan vävnadsupplösning eller kulturpassage.
Det finns omfattande litteratur med användning av gnagare hjärnskivans odlingsmodeller av GBM genererad från humant tumör xenografter, retrovirala inducerade tumörer och cellulära överlagringar för att studera tumörinvasion 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Nyligen har flera grupper beskrivit genereringen av organotypa skivkulturer direkt från human GBM-vävnad 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Det finns emellertid en märkbar variation bland publicerade protokoll med avseende på skivteknik och kulturmedia. Vidare har användningen av organotypa skivkulturer fokuserat på statiska experimentella ändpunkter som har inkluderat förändringar i cell signalerNg, proliferation och död. Protokollet som beskrivs häri expanderar på tidigare skivodlingsparadigmer genom införlivande av tidsupplöst observation av dynamiska tumörcellsbeteenden genom tidsförlängning av laserskanning av konfokal mikroskopi. Nyligen upptäckt av inter 11 och intratumoral 12 , 13 genetisk variation i human GBM understryker betydelsen av att länka denna heterogenitet med tumörcellsbeteenden och dess konsekvenser för tumörrespons på terapi. Här rapporterar vi ett strömlinjeformat och reproducerbart protokoll för användning av direktskärkulturer från en mänsklig cancervävnad för att visualisera migrering av tumörceller i nära realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innan samling av patientvävnadsprover initieras måste informerat samtycke erhållas från varje patient enligt ett godkänt Institutional Review Board (IRB) protokoll. Författarna till detta protokoll mottog samtycke till det arbete som beskrivs under godkända IRB-protokoll vid University of Colorado Hospital och Inova Fairfax Hospital. Data som samlats in från dessa skivkulturer användes inte för att rikta patientvårdsbeslut.
1. Förskärning Förberedelse
- Förbered "tissue processing" media och "skivkultur underhåll" media dagen före planerad tumörresektion och vävnadsuppsamling (eller använd tidigare genererade medier inom 2 veckor). Tillsätt 5 ml penicillin-streptomycinlösning (10 000 U / ml) och 5 ml 1 M HEPES till 500 ml av en hög-glukos-DMEM för att alstra vävnadsbehandlingsmediet.
- Förbered 250 ml skivkulturunderhållsmedier med användning av en bas av neuronalt medium ( t.ex. Neurobasal) witFen fenol röd. Tillsätt detta medium med 10 mM HEPES, 1x B-27-supplement, 400 | iM L-glutamin, 600 | iM L-alanyl-L-glutamindipeptid, 60 U / ml penicillin, 60 | ig / ml streptomycin och 6 U / ml nystatin.
- Förvara all media vid 4 ° C i högst 2 veckor.
2. Dag för kirurgi: Vävnadstillverkning
- På dagen för vävnadsförvärv, förbered 50-100 ml 1% och 2% (vikt / volym) lösningar av agaros med låg smältpunkt i vävnadsbehandlingsmedier med autoklaverad glas och steril teknik i en laminär flödeskåpa. Båda koncentrationerna av agaros behövs för att tillgodose oförutsägbar variation i tumörvävnadskonsistens.
- Värm agarosususpensionen med en mikrovågsugn tills kokan är försiktig. Placera agaroslösningen i ett 37 ° C vattenbad för att behålla i flytande tillstånd tills användning.
- Placera 1 ml skivkulturunderhållsmedium i varje brunn i en 6-brunnsplatta.
- Använd en sterilTångar för att placera tomma PTFE-kulturinsatser i varje brunn. Placera plattan i en fuktad, vattenmantlad, vävnadsodlingsinkubator med en 5% CO 2 atmosfär som hölls vid 37 ° C.
- Med användning av en steril Pasteur-pipett i en huv med laminärt flöde, bubbla en blandning av 95% O 2/5% CO2 gas in i en kolv innehållande iskall vävnadsbehandling media för cirka 15 till 30 min, före tumörvävnad förvärvet. Användningen av supra-oxygenerade medier minimerar hypoxi i bulkvävnaden under bearbetningen.
- Förbered märkta 50 ml koniska rör (tillräckligt för önskat antal enskilda tumörregioner som ska isoleras) innehållande 20 ml alikvoter av ovanoxiderat iskallbehandlingsmedium för att transportera vävnad mellan operationsrummet och skivanordningen.
- I samband med en neurosurgeon planerar före-operativt tumörregionen för provköp. Välj en tumörregion med kontrastförbättring som visat på patientens kliniska fantasiG (T1 efter-gadolinium magnetisk resonans imaging (MRI) sekvenser). Tidigare erfarenheter antyder att detta område ger livskraftig tumörvävnad i motsats till nekrotisk vävnad.
OBS: Generering av skivor från den omgivande (peritumorala) vita substansen försökades; Bakgrundsautofluorescens och minskad tumörcellstäthet begränsade dock försöket för dessa skivor. - Skaffa tumörvävnad mot början av tumörresektion. Undvik insamling av tumörvävnad utsatt för omfattande bipolär rensning, vilket kan äventyra vävnadslevnadsförmågan sekundärt till värmeskador. Vävnadsprover som förvärvats under styckevis tumörresektion demonstrerar förbättrad viabilitet jämfört med vävnad förvärvats från långa klump resektioner. Denna observation kan relatera till differentiell tumörvävnadsavskrivning av blodflöde som ett resultat av kirurgisk resektion och förlängd tid till förvärv.
- Om så önskas, märka och lagra tumörvävnad i separata koniska rör för att isolera provFrån distinkta tumörregioner. ( Dvs ytlig vs djup tumörvävnad). Exakta vävnadslägen kan spelas in om / när intraoperativ kirurgisk navigering är tillgänglig.
3. Slice Culture Preparation
OBS! Detta protokoll kräver användning av färsk, icke-blandad mänsklig vävnad. Alla prover antas vara smittsamma och bör hanteras enligt universella blodburna patogenprotokoll. Lämplig personlig skyddsutrustning ska alltid användas. Tångar och skalpeller bör utsättas för 15 min UV-ljus före användning. Vid användning spraya verktygen med 70% etanol (EtOH), vilket gör att vätskan kan avdunsta före användning. Skärprocessen utförs på ett halvsterilt sätt med användning av en horisontell laminär flödeskåpa med filtrerad luft.
- Placera tumörvävnadsstycken i en petriskål med iskall bearbetningsmedium. För att tvätta tumörvävnaden och minimera vidhäftande röda blodkroppar, ossEa pipett för att byta ut och kassera mediet i petriskålen tre gånger.
- Använd en skalpell, skär tumörstycken i rektangulära lådformar. Trim vävnadsstyckena till ungefär 3 mm x 3 mm x 10 mm. Ta försiktigt bort alla bifogade kärl genom excision eller försiktig dragning med fina tangar.
- Pipettera 5 - 7 ml 37 ° C agaros i en liten kubformad (~ 2 cm 3 ) plastinkapsling. Bekräfta temperaturen på agaroslösningen är inte större än 37 ° C med en steril termometer före användning.
- Låt agaros sitta i ca 1 min på en bädd av is.
- Placera 2 - 4 tumörvävnad "remsor" i agaros med lång axel orienterad vertikalt.
OBS! Vävnadsremsor tenderar att "sjunka" i agarosen före stelning. För att undvika denna komplikation behåller du vävnadsremsan i vertikal orientering tills agarosen förstärks ytterligare. - Håll den vävnadshaltiga agarosformen på en isbädd i 2-5 miN för att underlätta stelningen.
- Ta bort mögel från is och ta försiktigt bort agarosblocket genom att skära sidorna av formen med en skalpell. Undvik att placera överdriven kraft på blocket, vilket kan bryta agarosen.
- Använd en generös droppe cyanoakrylatlim för att fästa agarosblocket på vibratomprovplattan. Låt lim sätta i ca 1 - 2 min.
- Fyll vibratombehållaren med iskall bearbetningsmedium för att sänka agarosblocket som fästs på provplattan.
- Under skivning, bubbla 95% O 2/5% CO2 gasblandning in vibratome reservoaren genom en trimmad steril plastpipett.
- Ställ in vibratomskivans tjocklek till 300 - 350 μm.
- Justera bladhastighet och bladamplitud i enlighet med vävnadskonsistens. "Stiffare" GBM-vävnad kräver långsammare bladhastighet och högre amplitud. Exakt bladhastighet och amplitudinställningar varierar beroende på vibratomspecifikationer.
- Överför vävnadsskivor till petriskålen med iskalla bearbetningsmedier med hjälp av en mikrospatel av rostfritt stål.
- Skaffa 6-brunnsplattor innehållande PTFE-insatser och jämviktat skivodlingsmedium från inkubatorn (som framställd i avsnitt 2, steg 4).
- Plåtvävnadskivor med en mikrospatel av rostfritt stål. Minimera direktkontakt och manipulation av vävnad genom att använda en liten fin borstefärgborste för att generera en "fluidvåg" för att försiktigt trycka skivan av spateln aNd på odlingsinsatsen.
OBS: Minimera mängden bearbetningsmedier som införs ovanpå vävnadsodlingsinsatsen. Om överdrivna mängder media överförs, vilket leder till att skivorna flyter, använd en steril Pasteur pipette för att ta bort media. - Returnera 6-brunnsplattor innehållande tumör skivor till en inkubator som hölls vid 37 ° C med en 5% CO 2 atmosfär.
OBS! Hela inbäddnings- och skivprotokollet ska slutföras inom 90 minuter från tumörvävnadsuppköp från operationssalen.
4. Slice Culture Maintenance
- Efter 12-24 h överför skivkulturerna genom att fånga varje inläggsfälg med sterila pincett och överföra till plattor innehållande fräsch skivkulturunderhållsmedium. Se till att skivkulturunderhållsmediet alikvotiseras i varje brunn jämviktar i inkubatorn i minst 15 minuter före överföring av insatser.
- Flytta insatserna till nya 6-brunnsplattor med färsk ekvilibrerad skivaTure media var 48: e timme.
- Om så önskas, alikvot gammal skivodling med en pipett för omedelbar användning i biokemiska analyser ( dvs. ELISA) eller frys vid -80 ° C för framtida bruk.
5. Tumörcellmärkning via grönt fluorescensprotein som uttrycker retrovirus
OBS: Tid-lapse-mikroskopi för analys av tumörcells migration kräver stabil, långsiktig fluorescerande märkning av celler inom skivkulturen. Användning av retrovirus föreslås eftersom det selektivt infekterar delande celler och därigenom berikar fluorescerande märkning inom tumörcellpopulationen i motsats till microglia eller andra celltyper närvarande inom skivan. Standardisering av infektion antyder att en viraltiter av 10 4 CFU / μL resulterar i tillräckligt grönt fluorescerande proteinuttryck för spårning och analys av cellmigration. Ökad viraltiter, användning av icke-selektivt virus ( dvs. adenovirus, lentivirus) eller otHennes medel för märkning av alla celler kan utesluta identifiering av klara cellgränser under migrering och därigenom komplicerad analys. Användning av alternativa fluorescerande markörer kan utnyttjas och optimeras vid behov.
- Hämta retrovirus för infektion av tumörskivor antingen via standardprotokoll 5 , 14 eller från en kommersiellt tillgänglig källa. Späd den virala supernatanten genom att tillsätta den lämpliga volymen i ouppfyllt neuronalt medium för att uppnå en viraltiter av 10 4 CFU / μL.
- Mellan 7-10 dagar av kulturen infekterar tumörskivarkulturerna av intresse med 5 - 10 μl virus (10 4 CFU / μL). Placera viruset försiktigt droppvis på ytan av varje vävnadsskiva. Minska supernatantvolymen tillsätts om skivan flyter på insatsens yta. Returplattor innehållande skivkulturer till inkubator.
- Bedöm skivorna för märkta tumörceller som börjar vid 24 h efter Virusinfektion (se avsnitt 6). Denna tidsfördröjning varierar beroende på viral inkorporering och fluorescensgenuttryckskinetik. För de virala konstruktionerna som användes här krävdes 72 h att observera robust fluorescerande signal med ett standard-epifluorescensmikroskop.
OBS! Sällan visar skivor en övervägande perifer fördelning av viralt märkta celler, som kan komplicera konfokal bildbehandling. För att undvika denna komplikation, försök att minska skivtyckelsen och tjockleksvariationen över skivan. Om skivkulturen har en tjockare region nära centrum kan detta förhindra adekvat näringsinträngning och därigenom begränsa populationen av aktivt delande tumörceller. En kvalitativ analys för screening för denna komplikation är tillsatsen av ett tetrazoliumfärgreagens ( dvs. MTT) till skivkulturmediet. Områden i skivan som inte blir blåa efter tillsats av reagenset indikerar brist på metabolisk aktivitet och kompromisserad skivhälsa.
ANMÄRKNING: Efter framgångsrik transduktion och hälsa hos kulturen bekräftas kan celler avbildas under kontrollbetingelser följt av en jämn bildperiod under behandlingsbetingelser. Genom att använda detta protokoll har cellerna framgångsrikt avbildats och spåras i 12 timmar i varje tillstånd. Kortare eller längre perioder av avbildning och miljöhantering kan emellertid också vara informativa.
- Fylla på mikroskopet
- Innan bildbehandling lägger du 1 ml färskt skivmedium i en glasskål.
- Låt media i glasskålen jämföras i en inkubator i 15 minuter.
OBS! Vid detta tillfälle kan lösliga märkningsmedel, såsom fluorescens-konjugerade lektiner ( dvs isolectin IB 4 för mikroglia-märkning) eller ligandkonjugerade kvanta punkter sättas till skivkulturmediet för identifiering av cellUlar subpopulations under bildbehandling. - Överför insatsen som ska avbildas på en glasbottenmaträtt med hjälp av sterila tångar i en laminär flödeskåpa. Flytta maträtten till mikroskopsteget.
- Upprätthålla slice kulturer vid 37 ° C och 5% CO 2 atmosfär i en förseglad mikroskop skede-top inkubator. Utnyttjar sterilt H2O befuktning av inkubationskammaren om tillgängligt för att förhindra överdriven medie avdunstning (särskilt viktigt för längre avbildning experiment).
- Använd ett konfokalmikroskop med ett långt arbetsavstånd 10X luftmått och laser excitation för singel-foton och / eller multi-foton.
OBS! Se till att objektivet för mikroskopets objektiv ger ett tillräckligt fungerande avstånd. Som en följd av den ökade höjden från scen-top-inkubatorn, glasbottenrätten och vävnadsodlingsinsatsen är långa arbetsdistansmål kritiska. - Skruva fast glasplattans bottenplatta, ta bort plastskyddslocket och täck med en gas-Permeabelt membran.
- Bildförvärv
- Använd mikroskopet för att visuellt inspektera skivan och lokalisera ett lämpligt fält med tillräcklig densitet av fluorescensmärkta tumörceller mellan skivkanten och mitten. Undvik avbildningsfält vid kanten av skivan på grund av ökad mottaglighet av vävnadsskift under bildbehandling. Vävnadsskiva harps kan användas för att begränsa denna skiftning.
- Använd bildhanteringsprogram i multidimensionellt analysläge för att ställa in de första (nedre) och sista (högsta) Z-stackgränserna, så att alla positioner som ska avbildas innehåller synlig fluorescerande cellulär signal. Bildning genom 150 - 200 μm av skivan med ett konstant Z-steg på 10 μm gav tillräcklig upplösning för att spåra cellbanor (detta kan anpassas för individuella bildbehov).
- Om mikroskopet har ett motoriserat stadium, se till att tillräcklig tid är tillåten för varje Z-stack-förvärv. Ställ in tidsintervallet mellan förvärv till likaSkanningstid per position x antal positioner till bild ( dvs. avbildade tumörregioner).
OBS! För samtidig excitering av de gröna och röda fluoroforerna, använd ett dubbellinjigt laserlinjeskanningsprogram med samtidig 488 nm och 633 nm excitation. Den valda våglängden för laser excitering varierar beroende på individuella fluorescerande proteiner uttryckta. - Behåll likformig laserkraft och konfokala pinhålinställningar mellan de bildade tumörregionerna. Använd den lägsta laserkraftsinställningen som behövs för att tydligt avgränsa tumörcellens kroppar och processer för att begränsa fototoxicitet. Specifika bildparameternheter ( dvs. effekt och konfokala pinhålinställningar) varierar beroende på specifikationerna för mikroskop och laserkälla.
- Kompensera för potentiell mediaindunstning genom att lägga till 2 - 3 "buffert" Z-stack steg i fokalplanen som går framåt mot målet. Detta förhindrar effektivt att vävnaden lämnar sortimentet av Z-stack-förvärvJoner i vertikalplanet.
7. Bild efterbehandling och tumörcellspårning
OBS! Många konfokala bildsystem är utrustade med egenutvecklad bildbehandlingsprogramvara. Behandlingsstegen som diskuteras nedan innefattar ett generellt protokoll som kan utföras över mjukvaruplattformar. Särskilda instruktioner kommer att ges för open-source-plattformarna, NIH ImageJ och MTrackJ 15 .
- Öppna en Z-stack-fil. I ImageJ klickar du på "Image → Stacks → Z Project." Välj den första och sista Z-stacken att inkludera, och välj "Max Intensity" som projektionstyp. Resultatet är en rendering kallad maximal projektionsprojektion (MIP). Skapa en MIP från varje uppsättning Z-stack-bilder som tagits i varje region som avbildats.
- Sammanfoga MIP från varje region för att skapa en tidsserie. Klicka på "Image → Stacks → Images to Stack".
- Ange platsen manuelltAv cellkroppen "centroid" genom att välja den visuellt approximerade mittpunkten för tumörcellkroppen. Detta uppnås genom att klicka på cellkroppen med hjälp av "add" -spårfunktionen i MTrackJ (en öppen källkodsinställning för NIH ImageJ).
- Klicka för att avgränsa cellkroppsplatsen i varje bildrams serie. Detta skapar en unik "spår" för varje cell. Markera cellcellslägena för nästa cell i följd. Upprepa denna process tills alla cellmigreringsbanor spåras.
- När en population av celler spåras i en given tumörmikroregion exporterar du alla cellspårskoordinater med hjälp av MTrackJs "mått" -funktion. Spara filen som ett .xls-format så att de råa data kan analyseras med hjälp av kalkylblad eller användargenererad programvara.
- Använd de koordinater som spelats in för varje punkt längs en cells migrationsspår för att utföra kvantitativa analyser, inklusive avledning av migrationshastighet, riktning och annan migrationMetrics, som beskrivits i Parker et al 16 .
OBS: Alla beräknade avstånd och hastigheter är undervärderingar av aktuella värden. Detta är inneboende i omvandlingen av tredimensionella bilder (och migrationsvägar) till tvådimensionella data genom generering av maximala intensitetsprojektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår grupp har framgångsrikt genererat skivkulturer från över 50 patienter som genomgår GBM-resektion. Detta segment för skivbildning, kultur, retroviral-märkning, bildbehandling och migrationsanalys har blivit strömlinjeformat till ett reproducerbart arbetsflöde ( Figur 1 ). Kritiskt visar dessa organotypiska GBM-skivor överensstämmelse med ursprunglig tumörvävnad genom hela odlingen, innefattande upprätthållande av patologiska kännetecken och microglia upp till 15 dagar i odling ( Figur 2 ). Dessutom har vi använt detta system för att utföra funktionella analyser av tumörsvar mot mikromiljöförändringar. Som ett mått av fysiologisk integritet, undersökte vi hur GBM slice kulturer svarade på hypoxi (1% O 2) genom mätning av produktionen av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), en process som sker rikligt inom GBM mikromiljö in vivo 17,"> 18. Vi visade att genom att placera skivkulturerna i hypoxiska förhållanden monterade skivorna ett snabbt fysiologiskt svar, vilket inducerade VEGF-frisättning i media ( Figur 3 ).
För att utvärdera kvalitativa och kvantitativa aspekter av migrering av tumörceller utnyttjade vi tidsfördröjda bilder för att generera detaljerade migreringskartor. Dessa kartor avgränser alla GBM-celler som spåras inom ramen för tumörmikroregioner (1 mm 2 ), vilket ger en statisk visualisering av tumörpopulationens dynamiska migrerande beteende. Kvantitativa åtgärder för migrationshastighet och riktning (cellförskjutning / totalt räckvidd) beräknades för varje cell, vilket möjliggjorde undersökning av förändringar i migrationsparametrar över tumörregioner, tumörprover och som svar på behandling ( Figur 4 ).
Cellmärkning och bildprotokoll desBeskrivna här tillhandahåller också tillräcklig rumslig och tidsmässig upplösning för att utvärdera förändringar i cellmorfologi under migrering genom den naturliga tumörmikromiljön. Vi observerade närvaron av morfologiskt distinkta, rörliga tumörceller och mikrogliala blandade i skivkulturen ( Figur 5A ). Tumörcellsrörelse kännetecknades av en "sök och utbrott" -process som innebar upprepad utskjutning och retraktion av filopodi från en statisk cell följt av en kort period av effektiv rörelse. Imagingskivor regioner ungefär var 10: e minut tillhandahöll också tillräcklig tidsmässig upplösning för att registrera tidsförlösta bilder av tumörceller som genomgår celldelning. Dessa delningsceller pausades från migration, fullbordad mitos och dottercellerna startade omedelbart migrering, allt inom en 3-timmars tidsram ( Figur 5D ). I motsats härtill migrerar microglia vid en högre och mer konsekvent hastighet, med lägre riktning än intilliggande tumörceller,Demonstrerar deras relativt ineffektiva migration ( Figur 5C, 5E-G ). Sådana observationer kan vara viktiga för att få insikt i biologin som ligger bakom patient- eller cellspecifika respons på behandlingen.
Slutligen använde vi detta protokoll för att visa patient-till-patientvariation i cellmigrationsparametrar på populationsnivån, inkluderande en korrelation av epidermal tillväxtfaktorreceptor ( EGFR ) genomförstärkning med ökad migrerande potential hos tumörceller 16 . Dessutom visade tidsförlindsmikroskopi av tumörskivor före och efter behandling med det antiinvasiva läkemedlet, gefitinib, en signifikant minskning av migrationen, som var specifik för EGFR- amplifierade tumörskivor 16 .
Figur 1: Human GBM Organotypic Slice Culture Infection, Imaging och Cell Migration Analysis Workflow. Tumörvävnaden är lokaliserad till en specifik region via intraoperativ navigationsutrustning. En vecka efter skivning sätts det ZsGreen-uttryckande retroviruset till skivkulturerna för att märka de mitotiskt aktiva tumörcellerna. 3 dagar efter infektion prepareras skivor för konfokal bildbehandling. 3D-avbildningsdata efterbehandlas till 2D-bilder för spårning av cellmigrationsbanor, generering av tumörcells migreringskartor och beräkning av tumörcells migrationsparametrar. Delar av denna figur publicerades ursprungligen i Parker et al , 2013 16 och reproducerades med tillstånd från Oxford University Press. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Humana GBM organotypiska skivor behåller histologiska egenskaper genom hela ex vivo- kulturen. ( A ) T1-kontrastförstärkta MR-sekvenser användes för att lokalisera och dokumentera regionen (erna) för vävnadsförvärv (pil). ( B ) H & E-färgning av initial donatorvävnad (OR) och skivor vid odlingsdag 8 från en skivkultur genererad från vävnad erhållen från regionen framhävd i A. ( C ) Mikromiljöpatologiska och cellulära särdrag hos GBM in vivo upprätthålls Genom hela skivkulturen. (I, II) Immunohistokemi för CD68, en mikroglia / makrofagmarkör, vid låg (topp) och hög (botten) förstoring, visar mikroglial persistens i skivor efter 15 dagars odling. H & E-färgning på dag 4 av skivkulturen bekräftar upprätthållande av pseudopalliserande nekros, en patoLogikmärke för GBM, vid både låg (iii) och hög (iv) förstoring. Skalstänger = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mänskliga GBM-skivkulturer Sekretera VEGF som svar på hypoxi. ( A ) Experimentet utnyttjade individuella odlingsinsatser innehållande 3 liknande storlekar av tumörskivor genererade från samma tumörregion. Skivorna bibehölls i normoxi under 12 h följt av två 12 h intervaller med hypoxi, med nya medier tillsatt före varje intervall. ( B ) VEGF-utsöndring i media mätt med ELISA (medelvärde ± standardavvikelse) från skivkulturer genererade från två representativa tumörer ökade signifikant unDer hypoxi än normoxi (p <0,05). ( C ) En poolad analys av skivkulturer från 4 olika tumörer visade ökad VEGF-sekretion efter sekventiella 12 h intervaller med hypoxi jämfört med normoxi (p <0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Tumorcellbanespårdata möjliggör kvantitativ bestämning av cellhastighet och riktning. ( A ) Tumörceller med en riktning av 1 representerar perfekt effektivitet längs en rak vektor, medan de med lägre riktning engagerar ineffektiva meanderande banor, såsom representeras i denna schema 16 . Reprinted med tillstånd från Oxford UniversityTryck. ( B ) Analys av representativa banspårdata ("låg" upplösning ~ 55 mins cellspårintervaller) visar cellvariation i hastighet och riktning. ( C ) Directionality versus migrationshastighet för varje cellspår planeras för att visualisera migreringsbeteendet över cellpopulationen (varje punkt representerar en enskild cell). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Microglia inom GBM-skivkulturer karaktäriseras av hög migrationshastighet och låg riktning i förhållande till tumörceller. ( A ) Replikera tumörceller som selektivt uttrycker ZsGreen retrovirus och microglia märkt med ett isolectin-I B 4 -647 konjugat existerar blandas i en representativ tumörmikro region från en representativ bit kultur. ( BC ) Stegen för individuellt spårad GBM ( B ) och microglia ( C ) i samma tumörmikroregion visar otillbörliga migrationsbeteenden. Skalstänger = 200 μm. ( D ) En aktivt migrerande tumörcell pauser, drar tillbaka sina processer (pilhuvud), genomgår celldelning och två dotterceller migrerar i motsatta riktningar (pilar). Skalstänger = 50 μm. ( E och F ) Microglia visar ökad migrationshastighet (p <0,0001) och minskad riktning (p <0,0001) jämfört med tumörceller i samma region. (G) Fördelningen av tumör- och mikroglceller baserat på hastighet och riktning demonstrerar de unika migrerande fenotyperna hos de två cellpopulationerna.Et = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organotypa skivkulturer från mänsklig cancervävnad ger en attraktiv och underutnyttjad plattform för prekliniska translationella experiment. Förståelse av befolkningsnivåbeteenden hos tumörceller med avseende på migration, proliferation och celldöd i den naturliga tumörmiljömiljön saknas. Kritiskt kan studier av tumörrespons på terapi på ett dynamiskt, tidsbeslutat sätt vid cellnivåbeteendet avslöja nya mekanismer för behandlingsresistens. Humana tumörskivkulturer tillhandahåller en länk mellan den humana sjukdomsprocessen och nuvarande ex vivo och in vivo modelleringstekniker 19 . Vi validerade nyligen tekniken som beskrivs här som en metod för att studera GBM-migrering och rapporterar för första gången mätbara intertumörsvariationer i cellmigreringsbeteende relaterat till EGFR-förstärkning och signalering 16 . Denna studie utnyttjade också skivodlingsmodellen för att testa patieNt-specifik effekt av EGFR-hämmaren, gefitinib, som en potentiell antiinvasiv terapi för GBM 16 .
Flera av de gemensamma fallgroparna under vävnadsskivning, retroviral infektion, bildbehandling och bildanalys paradigm har diskuterats ovan. Det retrovirala infektionsprotokollet garanterar dock ytterligare uppmärksamhet. Med tanke på patient-till-patient-variation kan det visa sig utmanande att titrera densiteten hos viralt märkta tumörceller inom varje skiva. Om otillräckligt antal celler är märkta med den virala konstruktionen, tillsätt ytterligare 5-10 | il alikvoter av retroviral supernatant till ytan av varje skiva dagligen tills önskad koncentration av märkta tumörceller uppnås. I primära skivkulturer är procenten av replikerande celler i allmänhet lägre än i transformerade cellinjer, vilket således begränsar delmängden av celler som är permissiva för retroviral inkorporering vid vilken tidpunkt som helst. Alternativt, om alltför många celler är märkta, förhindrar accUrat-avgränsning av cellmigrationsvägar, späd den virala supernatanten med neuronmedium för att uppnå en lägre effektiv titer. Tumörassocierad microglia inkorporerade det fluorescerande proteinuttryckande retroviruset vid en frekvens av ungefär 1% av alla märkta celler. Vi kunde visuellt isolera dessa celler för separat analys med hjälp av ett mikroglia bindande lektin för post-imaging data analyser ( Figur 5 ).
Tumörmiljömiljön inklusive aspekter av näringstilldelning, cellcellsinteraktioner och extracellulär matris spelar en roll i patogenesen av GBM 20 . Direkta humana GBM-skivkulturer eliminerar behovet av passering inom små djurmodeller eller spridd cellodling, samtidigt som man tillhandahåller en nära rekapitulation av den humana tumörmikromiljön. Vidare ger skivkulturer jämn tillgång till näringsämnen över proverna, samtidigt som celler och cell-ECM-interaktioner upprätthålls. Genom att minska varIationer i cellulär tillgång till näringsämnen som är kända för att förekomma inom tumörer, föreslår vi observerade skillnader i kulturerna kasta ljus på inbördes skillnader mellan tumörcellsbeteenden ( dvs. migration) på befolkningsnivå. Tolkning av data som samlats in över skivkulturer genererade från humana tumörer kompliceras emellertid av inneboende inter- och intra-tumoral heterogenitet. Kritiskt krävs ytterligare studier för att karakterisera de potentiella genetiska och epigenetiska skift som kan uppstå under ex vivo- underhåll av humana tumörskivkulturer.
Användningen av humana tumörskivkulturer parallellt med fas I / II kliniska prövningar är en lovande strategi för att korrelera skivparametrar med patientkliniska resultat. Validering av dessa potentiella prediktiva / prognostiska parametrar är nödvändig innan skivkulturer kan användas för att personifiera onkologisk terapi. Vårt arbete, liksom andra, visar på genomförbarheten av biomarkörens validering <Sup class = "xref"> 21, såväl som snabb ex vivo-testning av terapeutiska medel i skivkulturer från GBM 9 , 16 . Liknande humanknivskulturtekniker som använder lung 22 , kolon 22 , huvud och nacke 23 , bröst 24 och prostatacancer 25 vävnader tyder på att detta tillvägagångssätt är generaliserbart över humankanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka Dr Lee Niswander och Dr. Rada Massarwa för deras tekniska expertis och bidrag till protokollet om slice culture confocal imaging som beskrivs här. Vidare tack till Dr Kalen Dionne som tillhandahöll kompetens för att optimera hjärntumörsskivning och kulturparametrar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
- Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
- Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
- Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
- Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
- Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
- Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
- Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
- Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
- Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
- Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
- Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
- Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
- Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
