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Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

Published: February 21, 2016 doi: 10.3791/53559
Automatic Translation
1
1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Introduction

cilios primarios son apéndices largos basados ​​en microtúbulos que se extienden desde la superficie de la mayoría de células de mamífero. cilios primarios se confunde a menudo con cilios móviles, de los cuales siempre hay múltiples por célula, y cuya finalidad es mover fluido a través de superficies de la membrana. cilios primarios, por el contrario, adoptar funciones sensoriales y son por consiguiente también se hace referencia como cilios sensorial. Una vez en el olvido, este orgánulo ha sido recientemente 'redescubierto' como resultado de su asociación con una multitud de enfermedades genéticas humanas 1. Idealmente posicionado como un orgánulo de señalización, el cilio primaria se ha demostrado que regulan numerosas rutas de señalización, muchas de las cuales son importantes no sólo en la homeostasis del tejido y la enfermedad, sino también durante el desarrollo 2.

Una de las primeras vías de señalización demostrado estar asociadas con la disfunción cilios fue la vía de señalización Wnt no canónica, conocido también como vía de la polaridad celular plana (PCP) > 3. Esta cascada de señalización inicialmente identificado en Drosophila, es fundamental para la embriogénesis; en particular para los procesos de convergencia y de extensión y para la orientación correcta de las células en el plano de los epitelios 4. La señalización secuencial de un conjunto básico de proteínas reguladoras traduce las señales direccionales que en última instancia conducen a reordenamientos del citoesqueleto y dan como resultado la polarización coordinada de las células epiteliales en un plano 5. El proceso de convergencia y la extensión es absolutamente necesario para el conducto coclear para alargar y para el correcto patrón celular 6. Como esto se regula a través de la activación de la vía de PCP, uno de los fenotipos más llamativos de mutantes PCP cóclea es un conducto coclear acortado con epitelios sensoriales desorganizado 7. Del mismo modo, los mutantes de ratón, que carecen de cilios, también presentan una convergencia y la extensión fenotipo tan 8,9, aunque precisamente cómo esto está regulado aún no se ha dilucidado.

ve_content "> Debido a que los procesos de convergencia y de extensión son críticos para la derivación del conducto coclear, y el patrón celular de los epitelios sensoriales dentro del conducto coclear, la cóclea en desarrollo es un órgano ideal en el que para examinar la señalización de PCP durante el desarrollo de los vertebrados. El órgano de Corti, el término dado al epitelio sensorial especializado que recubre el conducto coclear, está compuesto por células de soporte no sensoriales y las células ciliadas mechanosensory que deben ser orientados de manera uniforme para la cóclea para funcionar 10. las células ciliadas mechanosensory se llama así debido a la manojos estereociliar que se extienden desde la placa cuticular (superficie apical) de cada una de las células ciliadas sensoriales 11. Estos actúan como transductores primarios de mechanosensation ya pesar de su nomenclatura como estereocilios, en realidad están compuestas por microvellosidades a base de filamentos de actina modificado. Dentro de cada pelo en forma de V haz, tres filas de estereocilios se organizan en un pa altamente ordenada y regular,ttern caso de una manera similar a la escalera. Cilios real basado en los microtúbulos, cinetocilios llamados, son necesarios para el desarrollo y orientación de los haces estereociliar 12. Sobre cada célula de pelo, una sola cinocilio está unido físicamente al haz estereocilios, centralmente situada adyacente a la fila más alta de estereocilios. La función precisa de la cinocilio no está claro, y una hipótesis es que la cinocilio 'tira' los estereocilios en forma a medida que maduran desde microvellosidades 12. En los vertebrados, cinetocilios en la cóclea solamente están presentes de forma transitoria y se retraen de las células pilosas en los ratones antes de la aparición de la audición 11,13,14.

La pérdida completa de los cilios en los resultados en desarrollo cóclea en conductos cocleares acortar gravemente, mal formado y mal orientada haces estereociliar, así como los cuerpos basales mis-posicionado 8,9. Un cilio funcional no es sólo formaba parte del axonema ciliar. Muchas proteínas asociadas con los ciliosse producen en función de los complejos localizados en subdominios cilios afines, como la basal del cuerpo, zona de transición, o axonema ciliar 15. El cuerpo básica, derivada del centríolo madre del centrosoma, es también un centro organizador de microtúbulos por los microtúbulos se extienden lejos del cilio en el cuerpo celular y puede regular el tráfico intracelular, así como el tráfico ciliar. La zona de transición ciliar es otra región donde la función ciliar se regula en función de la organización de importación y exportación de compuestos ciliares 16.

Múltiples estudios han identificado una conexión entre los cilios y Wnt no canónica (de señalización PCP), aunque el mecanismo exacto no está claro 17. La redundancia de ciliares y PCP genes y la sensibilidad de la polaridad celular a anormalidades celulares generalizadas, hacen que sea difícil para enlazar directamente a una mutación específica déficit de PCF. Una de las salidas de lectura de la señalización de PCP es el posicionamiento del cuerpo basal y primarcilio y, por lo tanto, la segregación de la primaria de los defectos secundarios es un reto. Algunos estudios en el pez cebra y el ratón mutantes han sugerido ninguna conexión entre cilios y la señalización Wnt 18-20. Las discrepancias en los datos siempre son representativas de las especies, tejidos, o las diferencias temporales que dependen de las contribuciones ciliares hacia la señalización de Wnt. Además, la capacidad de respuesta normal de Wnt podría ser retenida si cuerpos basales siguen siendo funcionales. Una comprensión más profunda de la función de las proteínas ciliares en vías de señalización celular y otros fenómenos biológicos es crucial para nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo, así como para el desarrollo de estrategias de tratamiento dirigidas.

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Protocol

Uso y la eutanasia a todos los animales de conformidad con las directrices y normas institucionales y gubernamentales, más comúnmente a través de inhalación de CO2 y dislocación cervical.

1. Preparación de los reactivos

NOTA: Antes de comenzar, prepare todos los reactivos que utilizan productos químicos de grado analítico. Hacer que las soluciones de grado molecular utilizando agua destilada y desionizada a menos que se especifique lo contrario.

  1. Salina tamponada con fosfato (PBS 1x): Hacer 1 L de 1x PBS disolviendo 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 y 0,24 g KH 2 PO 4 en 1 L de H 2 O. Ajustar el pH a 7,4 con HCl. PBS no tiene que ser estéril y puede ser almacenado a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que este tampón se realiza sin CaCl 2 o MgCl 2.
  2. Paraformaldehído (PFA al 4%): Se prepara una solución al 4% de PFA en PBS 1x en una campana ventilada. Añadir 40 g de polvo de paraformaldehído a 1 l de 1x PBS. Para disolver, mezclar y calentar a aproximadamente 60 ° C,y se añade lentamente gota a gota NaOH para elevar el pH. Una vez que el polvo se haya disuelto, vuelva a ajustar el pH a 7,4 con HCl. Filtrar a través de un filtro de 0,45 M y congelar alícuotas. Descongelar una alícuota para cada experimento.
  3. tampón Triton: Preparar un M Tris-HCl 0,1 (pH 7,5), NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 solución disolviendo 8,77 g de NaCl en 1 l de 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Añadir 1 ml de Triton X-100. Agitar para disolver. Tienda tampón Triton a TA.
  4. bloque Triton: Preparar 10% de suero de cabra en tampón Triton mediante la adición de 1 ml de suero de cabra a 9 ml de tampón de Triton. Almacenar a 4 ° C. Si el uso de anticuerpos primarios planteadas en ratón, de cabra añadir fragmentos de anti-IgG de ratón Fab a una dilución de 1 en 200 al bloque de Triton para la etapa de bloqueo.
    NOTA: Si planea utilizar las muestras para microscopía electrónica de barrido (SEM), preparar reactivos adicionales que se enumeran a continuación.
  5. Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) con calcio y magnesio: obtener una solución 1X de HBSS por dilución de una solución madreen agua destilada estéril H 2 O. Como tampón HBSS es complicado de hacer y hay riesgos involucrados, es recomendable pedir una solución 10x preparado de antemano. La concentración final de HBBS tampón usado habitualmente es el siguiente: 1,26 mM CaCl 2, 0,49 mM MgCl2 -6H2O, 0,41 mM MgSO4 -7H2O, KCl 5,33 mM, KH 0,44 mM 2 PO 4, 4,17 mM NaHCO3, NaCl 137.93 mM , 0,34 mM Na 2 HPO 4, dextrosa 5,56 mM.
  6. tampón Hepes: Preparar una solución 0,1 M en HEPES 1x HBSS, disolviendo 23,8 g de HEPES en 1 l de tampón 1x HBSS.
  7. Scanning fijador microscopía electrónica (SEM Fix): Preparar fijador para SEM diluyendo electrones glutaraldehído grado microscopía (2,5%) y paraformaldehído (4%) en tampón Hepes. Añadir CaCl 2 a una concentración final de 10 mM.
  8. 1% de tetróxido de osmio (OsO4) en tampón Hepes; 1% de tetróxido de osmio en agua: Se diluye una solución madre de tetróxido de osmio en tampón Hepes, y separately en estéril destilada H 2 O, a una concentración final de 1%. El tetróxido de osmio es muy tóxico y se vende más comúnmente como una solución de 4%.
  9. 1% (w / v) de ácido tánico: Disolver 0,5 g de ácido tánico en 50 ml H destilada estéril 2 O. Filtro de esterilizar por filtración a través de un filtro de tamaño de poro 0,45.
  10. Serie calificada solución de etanol: Diluir etanol 200 proof con H 2 O destilada estéril para hacer soluciones 30, 50, 70, 90 y 95% de etanol. Para los enjuagues finales de etanol, se requiere el 100% de etanol prueba 200. Utilice una botella recién abierta de etanol de prueba 200 para los enjuagues finales.

2. Elección de Tejido

  1. Lo ideal es examinar los embriones o los cachorros jóvenes entre las edades de día embrionario 16.5 (E16.5) y después del día 3 (P3).
    NOTA: La osificación del laberinto óseo y el hueso temporal hace la disección progresivamente más difícil ya que los ratones maduros. También cinetocilios, la única verdadera cilio basadas en microtúbulos encuentran en las células ciliadas de la cóclea,retrae durante el desarrollo y ya no está presente en ratones adultos.
  2. Después de la fijación, descalcificación cochleae adulto. Lugar disecados (véase la sección 3) laberintos óseas, en 2 ml de EDTA (4,13% en PBS), pH 7,3, en un tubo de microcentrífuga durante 3 - 4 días con rotación. EDTA reponer todos los días. Después de que los tejidos se han suavizado, enjuague en 1,5 ml de PBS o más 3 veces durante 5 minutos en un nutator con aumento de la agitación.

3. La disección cóclea

  1. Eutanasia mediante dislocación cervical posterior o inhalación de CO2 (100% CO2), quitar la cabeza. Utilice una hoja de bisturí o pequeño par de tijeras, dependiendo del tamaño del animal, para diseccionar la cabeza a lo largo de la línea media sagital a partir de la nariz y que se extiende en sentido caudal. Retire el cerebro de cada mitad del cráneo con un par de pinzas. Identificar los huesos temporales, que contienen los laberintos en desarrollo óseas del oído interno (véase la flecha en la figura 1A).
  2. Use un par de deceps para aislar cuidadosamente los laberintos óseas del cráneo (huesos temporales). Hacer esto bajo un microscopio de disección. Prise el tejido óseo del cráneo mediante la ejecución de las pinzas suavemente por debajo de los laberintos óseas. En los animales hasta P4 los laberintos óseas son todavía cartilaginoso y se puede quitar fácilmente sin romperse.
  3. Después de la disección, utilice la punta de las pinzas de disección para despejar el óvalo y ventanas redondas y hacer un pequeño agujero en el vértice de la espiral coclear. Fijar los laberintos óseas antes de una nueva disección del conducto coclear. Para permitir la fácil extracción de la membrana tectorial (véase 3.7), fijar los laberintos óseas en 1,5 ml 4% PFA durante 5 min en hielo.
    NOTA: Si no se requiere la eliminación de la membrana tectoria, se recomienda la fijación más largo (ver 4.1 hasta 4.3). Breve fijación de los huesos temporales antes de la disección del conducto coclear ayuda al proceso de disección y retirada de la membrana tectorial. la disección posterior y la exposición del órgano de Corti, FurtSe requiere su fijación.
  4. diseccionar los laberintos óseas para exponer el epitelio sensorial coclear de la siguiente manera. Coloque los laberintos óseas en un plato de disección elastómero de silicona recubierto de negro que contiene PBS para facilitar la disección. Utilice pasadores minutien para inmovilizar el tejido, si es necesario. Para utilizar pasadores minutien, colocarlos a través de la porción vestibular de los laberintos óseas con la cara ventral de la espiral coclear hacia arriba.
    NOTA: silicón Negro plato de elastómero: Mezcla de silicona componente de base de elastómero con carbón en polvo para obtener un color negro opaco. Añadir el agente de curado y se vierte en una o más placas de Petri (de vidrio o plástico). Seca al vacío para eliminar las burbujas de aire atrapadas. los platos se sequen por completo antes de su uso.
  5. Utilice unas pinzas finas (# 5) para extraer el cartílago exterior exponer el conducto coclear. Comience en la ventana oval; inserte la punta inferior de la pinza en la ventana oval y suavemente forzar la apertura del cartílago, que se mueve lentamente hacia arriba, hacia laápex.
  6. Después de la exposición del conducto coclear, retire la superficie ventral, la membrana de la Reissner. Use un buen par de pinzas para pellizcar la membrana de la Reissner en la base del conducto coclear y despegarlo en un movimiento ascendente. Visualizar el aspecto dorsal del conducto coclear, incluyendo el epitelio sensorial.
  7. Retire la membrana tectoria como se describe a continuación (opcional). Para SEM o inmunohistoquímica de la cinocilio o haces estereociliar retirar la membrana tectoria.
  8. Utilice un muy buen par de pinzas (# 55 o más fino) para apretar la membrana tectoria en la base de la cóclea y la cáscara hacia arriba, hacia el ápice.
    NOTA: La membrana tectoria es ópticamente transparente que hace que sea difícil de identificar. Más a menudo que no la membrana se retira en una sola pieza y, aunque no se visualiza fácilmente, uno puede sentir la resistencia, ya que se retira del órgano expuesto de Corti.
  9. Después de exponer el órgano de Corti, fijar aún más el tejido como described continuación. Conservar la región vestibular para ayudar a las operaciones de preparación de los tejidos.

4. Fijación

  1. Por inmunohistoquímica regular de fijar los laberintos óseas disecados en 1,5 ml de PFA al 4% a 4 ° C en un nutator durante 2 horas.
    NOTA: Debido a la sensibilidad de los diferentes anticuerpos y antígenos, las variaciones en la longitud y la composición de la fijación puede ser necesaria y debe ser optimizado para cada anticuerpo.
  2. Después de la fijación, lavar las muestras de un enjuague en 1,5 ml o más PBS 3 veces durante 5 min en un nutator con aumento de la agitación. Las muestras se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante varias semanas antes de procesar.
  3. Si la preparación de muestras para SEM, FIX diseccionado huesos temporales en solución SEM (véase 1.7) durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar mediante lavado en 1,5 ml de tampón Hepes o más 3 veces durante 5 minutos en un nutator con aumento de la agitación. Tienda en tampón Hepes a 4 ° C hasta su posterior procesamiento. El almacenamiento por más de un par de semanass no es recomendable.

5. La inmunohistoquímica

  1. Realizar inmunohistoquímica en muestras disecadas en un pocillo de una placa de pocillos de fondo plano 96. Como alternativa, utilice una PCR o tubo de microcentrífuga. Es aconsejable para retener la porción vestibular del laberinto óseo para facilitar el procesamiento.
  2. Permeabilizar el tejido por incubación en 1,5 ml de tampón Triton durante 1 hora a RT en una nutator con agitación suave.
  3. Bloquear el tejido por incubación en 0,5 ml bloque Triton durante un mínimo de 1 hora a RT. Si el uso de anticuerpos primarios planteados en ratón, añadir fragmentos de IgG anti-ratón Fab al bloque a una dilución de 1 en 200 (ver sección 1.4). Esto disminuye en gran medida la unión no específica de IgG anti-ratón de tejido de ratón.
  4. Se incuba el tejido con anticuerpos primarios diluidos en Triton bloque de O / N a 4 ° C con agitación suave. dilución de anticuerpo depende de anticuerpos utilizado (ver sección 6.1). Alternativamente incubar antibodie primarias durante 2 horas a RT. Idealmente utilizar un volumen mínimo de dilución de anticuerpo primario ml 0.5. Si el anticuerpo es limitada, utilizar el volumen más pequeño de dilución de anticuerpo que envuelve completamente el tejido.
  5. Lavar el tejido mediante lavado en 1,5 ml de tampón Triton o más, un mínimo de 3 veces durante 15 minutos, en un nutator con aumento de la agitación.
  6. Incubar el tejido con anticuerpos secundarios conjugados con colorantes fluorescentes diluido a los fabricantes concentración recomendada (típicamente 1: 200 a 1: 1000) en el bloque Triton durante 1 hora a RT en una nutator. Utilizar un volumen mínimo de dilución de anticuerpo secundario 0,5 ml.
    1. Centrifugar el anticuerpo secundario diluido a 13.000 xg durante 3 min antes de su uso para minimizar la unión no específica de los agregados de anticuerpos secundarios. Proteger el tejido de la luz procedente de esta etapa en adelante para evitar photobleaching los tintes fluorescentes.
  7. Como en el paso 5.5, lavar el tejido de un enjuague en 1,5 ml o más tampón Triton, un mínimo de 3 veces por 15 min, en unanutator con aumento de la agitación. Almacenar las muestras en PBS a 4 ° C hasta que esté listo para montar.

6. Selección de Anticuerpos

NOTA: La fuente de anticuerpos recomendados y sus diluciones se enumeran en la Tabla de materiales y equipos específicos. Realice las incubaciones de anticuerpos tal como se describe en la sección 5.

  1. Para visualizar el cinocilio basado en microtúbulos, utilizar un ciliar axonema marcador tal como anti-Arl13b (1: 1000) o anti-acetilada-α-tubulina (1: 800). Visualizar el cuerpo basal utilizando un anticuerpo contra γ-tubulina (1: 200) o cualquier otro marcador centrosomal.
  2. Para visualizar los haces de actina estereociliar de filamento-rico, añadir faloidina (1: 300 - 1000) conjugado a uno de varios fluoróforos diferentes para la incubación de anticuerpo secundario. Faloidina también etiqueta otras estructuras de actina filamentosa incluyendo los filamentos de actina cortical que rodean la periferia de cada célula de pelo epitelial. Esto es útil para determinarel contorno de cada célula de pelo. Use un marcador de membrana alternativa como anti-Zo-1 (1: 500) si es necesario.
  3. Marcar las células ciliadas de la cóclea utilizando anticuerpos contra la miosina VI (1: 1.000) o miosina VIIa (1: 1.000). Estos pueden ser usados ​​si la evaluación de la longitud cóclea.

NOTA: Use anticuerpos conjugados de tinte-fluorescentes adecuados secundarios optimizados para los requisitos de microscopio.

7. Montaje e Imagen

  1. Colocar la muestra en un plato de elastómero de silicona negro que contenía PBS. Con unas pinzas finas, eliminar la región vestibular de la espiral coclear.
  2. Muy retirar con cuidado el cartílago subyacente y el mesénquima de la espiral coclear. La espiral coclear restante contiene el surco interno, órgano de Corti y el surco exterior.
  3. La transferencia de la espiral coclear en una gota de PBS colocado en un portaobjetos de microscopio. Si se desea, separar la espiral coclear en piezas equivalentes a una vuelta. Sin embargo, este paso no es necesario, y puede conducir a loss del tejido. El (lado estereocilios) superficie apical de las células ciliadas de la cóclea debe estar mirando hacia arriba, hacia el cubreobjetos.
  4. Mecha de distancia del PBS con un tejido absorbente o un pedazo de papel de filtro y suavemente cambiar la posición de la espiral coclear si el epitelio se ha desplazado y se superpone sobre sí misma.
  5. Añadir una gota de medio de montaje directamente sobre la muestra cóclea y colocar suavemente un cubreobjetos en la parte superior, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. No se requieren espaciadores; colocar el cubreobjetos directamente sobre la muestra. Se recomienda A, no-fluorescente soluble en agua, medio de montaje semi-permanente que no requiere pasos adicionales para mantener el cubreobjetos en su lugar. Medio de montaje y cubreobjetos espesor debe corresponder al microscopio especificaciones.
  6. Utilice un microscopio de epifluorescencia o de escaneo láser confocal equipado con una gran ampliación (63 - 100X), alta apertura numérica (1.2 a 1.4) objetivos para capturar imágenes de la superficie apical de la célula de pelo coclear. uso loobjetivos wer (5 - 20X) para tomar imágenes de la espiral coclear superposición de cuantificar la longitud del conducto coclear. láseres de excitación y filtros de emisión de los partidos a fluoróforos utilizados para anticuerpos secundarios.

8. Microscopía Electrónica de Barrido

  1. Continuar desde la sección 4.3. Después de lavar las muestras SEM fijos en tampón Hepes, realice los siguientes pasos debajo de la ventilación. El siguiente protocolo funciona bien para tejido cóclea y evita el uso de revestimiento por bombardeo iónico con un metal conductor.
  2. Post-fix en 1% OSO 4 en tampón Hepes para 1 hr, seguido de 3 lavados con 1 ml de agua destilada durante 5 minutos cada uno. El volumen más pequeño de OsO4 que envuelve completamente el tejido debe ser utilizado para minimizar los residuos tóxicos. No se requiere ninguna agitación.
  3. Incubar las muestras a temperatura ambiente en cada uno de las siguientes soluciones durante 1 hora con 3 lavados con 1 ml de agua destilada durante 5 min cada uno en entre pasos: 1% de ácido tánico recién hecho en agua y filtered antes de su uso; 1% OsO4 en agua, ácido tánico 1% en agua, 1% OsO4 en agua.
  4. Deshidratar muestras a través de una serie de etanol de una incubación de 10 min en cada una de las siguientes diluciones: 30, 50, 70, 90, y 95%. No se requiere ninguna agitación.
  5. Transferir las muestras a través de tres cambios, 5 minutos cada uno, de etanol al 100% (a partir de una botella recién abierta etanol de 200 grados).
  6. Ejecutar las muestras mediante un secador de punto crítico siguiendo las instrucciones del fabricante.
  7. Montar las muestras usando adhesivo de carbón conductor en la parte superior de un talón de SEM antes de la formación de imágenes en un microscopio electrónico. Bajo un microscopio estereoscópico, utilice un par de pinzas finas y un pincel para colocar suavemente la muestra con los epitelios cocleares hacia arriba. Utilice la parte vestibular de la muestra a "ancla" el tejido para el talón. Almacenar las muestras en un desecador hasta la imagen. Realizar las imágenes de SEM como se describe en Jones (2012) 21.

9.Cuantificación

  1. Después de la preparación inmunohistoquímica, adquirir imágenes con un microscopio confocal de epifluorescencia o de escaneo láser. Después de la preparación para SEM, usar un microscopio electrónico de barrido de la imagen de los especímenes. Image la superficie apical del órgano de Corti con las células ciliadas cocleares expuestos y células de apoyo intercaladas.
  2. Definir posiciones específicas a lo largo del conducto coclear, tales como 25, 50, y 75% de la base y utilizar éstos para comparar regiones cóclea entre las muestras mutantes y de control. Analizar y comparar los mutantes cilios con sus controles de la misma camada, como las diferencias en los antecedentes genéticos pueden modificar el fenotipo coclear.
    NOTA: El órgano de Corti se desarrolla en un gradiente que se extiende desde la base hacia mediados de tanto el vértice y la base. En el ratón, el desarrollo no es completo hasta P14, por lo que es importante comparar las regiones en las etapas de desarrollo similares y posiciones.
  3. Para tomar las fotografías utilizando el software que acompaña al microscopio que allow para la cuantificación del fenotipo particular, según sea necesario (ver abajo). Utilice el software de análisis de imágenes tal como J o software Image acompaña al microscopio para medir longitudes, contar las células y determinar la localización de proteínas como se describe a continuación. Gráfico estos datos como un gráfico de barras, gráfico de dispersión, caja de transferencia o histograma, la comparación de control frente a mutante.
  4. La longitud total del conducto coclear (Figura 3A):
    1. Con un marcador de las células ciliadas o faloidina, (que marca los paquetes estereociliar), determinar y medir donde el epitelio sensorial comienza y termina. La longitud del conducto coclear a menudo se acorta en mutantes cilios.
  5. Anomalías de haces estereociliar (Figura 3 B, D, E, G):
    1. Medir la convexidad paquete (altura) como la distancia más corta entre el vértice del haz y la línea que se extiende a través de ambos extremos del haz de 'brazos', como se muestra en la Figura 3G, a la izquierda. Alternativamente, cuantificar el área deabarcada por los brazos de la célula de pelo haz estereociliar exterior como se muestra en la Figura 3G, a la derecha. Si las células del pelo con haces estereociliar circulares pueden ser identificados éstos cuentan como un porcentaje del total de células de pelo.
      NOTA: En muchos mutantes ciliares anomalías de paquetes pueden ser observados con independencia de la orientación de haz. Es difícil cuantificar con precisión las anormalidades de haces estereociliar.
  6. Orientación de los haces estereociliar (Figura 3B, C, G):
    1. Evaluar la orientación de cada haz en relación individuo a una línea que se extiende perpendicular a la fila de celdas pilar que separa las células ciliadas internas y externas. Las células con una orientación normal están alineados a lo largo de este eje perpendicular y así tener una rotación de 0 °. Determinar ángulos de rotación utilizando una notación de 360 ​​° o desviaciones absolutas de 0 °.
  7. Posicionamiento cinetocilios o estereociliar posicionamiento paquete (figura3B, F, H):
    1. Contar el porcentaje de células en las que cinetocilios faltan. Medir la distancia desde el cinocilio a la "vértice" o centro del haz. El 'vértice' del haz puede no ser fácil de definir si los paquetes son anormales, por lo que el centro del haz se pueden utilizar en su lugar.
  8. Cuantificar la posición de cinetocilios y haces de estereociliar en la superficie celular apical de pelo, mediante la superposición de una cuadrícula de posición en cada célula de pelo y marca la ubicación de cualquiera de la base de la cinocilio o el vértice / centro del haz estereociliar. Mostrar los datos como porcentaje de cada categoría que se encuentra dentro de una región específica de la red, y mediante la superposición de las ubicaciones de cada marca sobre una cuadrícula de posición.
    NOTA: En los tejidos de control, cinetocilios están siempre unido al vértice del haz estereociliar. En los mutantes cilios, cinetocilios a menudo faltan, sin embargo, todavía unido mislocalized, o incluso completamente separado de los shaz tereociliary.
  9. Cinetocilios longitud (Figura 3I):
    1. Medir la longitud de la cinocilio mediante el etiquetado con un marcador ciliar axonema. medir únicamente cinetocilios que se mantengan planos dentro de un plano confocal de 1,5 micras. Confirmar que los cilios están mintiendo plana mediante la observación de una vista en sección transversal del tejido escaneado. Comparación de diferentes muestras de edad de la misma región de la cóclea desde el cinocilio retrae durante el desarrollo.
  10. Mislocalization de las proteínas de polaridad:
    1. Después de inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra las proteínas de polaridad tales como Vangl2 y Gαi3, determinar la localización a través de formación de imágenes.

NOTA: En algunos mutantes cilios, localización de las proteínas de polaridad se interrumpe. Estos incluyen Vangl2 y Gαi3, que se ha demostrado que ser interrumpido en IFT20, Bbs8 y Bbs6 cóclea mutante.

NOTA: Otros ejemplos de cómo cuantificar y Polarit de células ciliadas pantallaY se muestran en los siguientes documentos. Curtin, et al. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol, et al. (2003) Naturaleza 7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biología 24, mayo-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology 25, Yin et al (2012) PLoS ONE 26.

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Representative Results

La disección y la cóclea Preparación del tejido

Después de la eliminación del cerebro, puesto línea media disección sagital de una cabeza P0 ratón, el laberinto óseo, visto desde atrás, puede ser visualizado (Figura 1A, flecha blanca) y se retira. La Figura 1B muestra los laberintos óseas aisladas con el cabello coclear mirando hacia arriba, ventral, (izquierda) y por detrás, dorsal (derecha). La flecha blanca a la ventana oval de la cual uno puede empezar a retirar el cartílago exterior. Una vez que el cartílago externa se ha eliminado por completo, el conducto coclear expuesta, aún intacto, se puede observar (Figura 1C). se muestra de posicionamiento de un perno a través de la región vestibular para ayudar a la disección. Dos pines, colocados en diferentes ángulos se pueden también utilizar para anclar el tejido. La Figura 1D muestra el conducto coclear después de la eliminación de la Reissner '; S de la membrana y la membrana tectoria (izquierda) y el aislado espiral coclear epitelial una vez que se ha aislado de la región vestibular en preparación para el montaje para inmunohistoquímica (derecha). Para dar una idea general de lo que el pelo cocleares expuestos parece, una preparación SEM intacta se muestra en la Figura 1E.

Morfología e inmunofluorescencia en el control de la cóclea

Después de la preparación del tejido coclear, la superficie dorsal del conducto coclear que contiene el órgano de Corti se expone y puede sido visto a través de SEM o la tinción de inmunofluorescencia. Visto como todo el montaje en una preparación, las cuatro filas de células ciliadas mechanosensory (una fila de células ciliadas internas y tres hileras de células ciliadas externas) pueden distinguirse. La figura 2A muestra una vista bajo aumento de la espira basal de una cóclea de embriones de ratón , f preparadoo SEM. Observe la orientación uniforme y la alineación de los haces de estereociliar basado en actina. Además la morfología de los haces estereociliar es consistente, cada haz tiene la forma clásica ")" (en las células ciliadas internas) o "W" (en las células ciliadas externas). Tras la ampliación de más cerca a esta edad microvellosidades adicionales se pueden ver no solamente en la superficie apical de las células ciliadas, sino también en medio de las células ciliadas en las células de apoyo (Figura 2B). Estos irán desapareciendo dejando sólo tres filas de haces de estereociliar sobre las células ciliadas externas y dos en las células ciliadas internas en los adultos. Como puede verse en la Figura 2C (flecha blanca), una sola cinocilio basado en microtúbulos (un verdadero cilio primario) se encuentra adyacente a la fila más alta de estereocilios en el vértice de cada haz estereociliar. Estos se adjuntan al paquete a través de enlaces cinetocilios.

etiquetado fluorescente con faloidina, que laboratorioels actina, se destaca la orientación y la forma uniforme de los haces de tejido de control (Figura 2D). actina cortical también se etiqueta, que es útil para determinar la circunferencia apical de cada célula de pelo individual. Co-etiquetado con faloidina y un anticuerpo contra la miosina 7a (Figura 2E), un marcador de células de cabello, también ayuda a diferenciar entre células pilosas y células de soporte. La miosina 7a es también un marcador útil para la medición de la extensión del conducto coclear (véase la Figura 3A). Un anticuerpo contra acetilada-α-tubulina se utiliza comúnmente para identificar la cinocilio basado en microtúbulos (Figura 2F). Como las células de apoyo también albergan cilios primarios, es importante distinguir entre los cilios que emanan de las células ciliadas vs. intercalantes células de apoyo. Un marcador de membrana adicional, como anticuerpos contra ZO-1 (Zona occludens 1), que describe claramente el patrón de mosaico de la membrana apical del conducto coclear, es por lo tanto útil (<strong> Figura 2F). De mayor consideración es que los anticuerpos contra acetilado-α-tubulina también etiquetar los microtúbulos internos y por lo tanto se debe tener cuidado al tomar las imágenes para centrarse en la superficie apical de las células ciliadas. Los microtúbulos en las células pilares son particularmente densa (Figura 2G, asterisco blanco). Una combinación de faloidina y etiquetado anti-acetilada-α-tubulina a menudo se utiliza para identificar simultáneamente haces estereociliar y cinetocilios vecinos (Figura 2G, flecha blanca).

Fenotipo coclear en Cilia Mutantes

Alargamiento del conducto coclear es una de las mejores salidas de lectura de la convergencia y de extensión defectos, y los conductos cocleares acortadas se observan comúnmente en mutantes PCP clásicos. La cóclea en los mutantes ciliares a menudo han acortado conductos cocleares y muestran una marcada ampliación de la epithe sensoriallia en el vértice, como se puede observar en IFT20 cko / cko ratones (Figura 3A). Otro defecto PCP clásica es la interrupción de la orientación uniforme de las células ciliadas cocleares, como puede verse en las Bbs8 - / - ratones tanto con inmunohistoquímica (Figura 3B, flecha derecha) y con SEM (Figura 3C). Además de los paquetes mis-orientados, aplanados y paquetes deformes también son comúnmente observados (Figura 3B, flecha central; Figura 3D). Muchas veces circulares haces, como se puede ver en la Figura 3E, están presentes, especialmente en células de pelo completamente desprovisto de cinetocilios. Mala localización de la cinocilio también es común.

El cinocilio mis-localizada puede o no puede estar unido al haz estereociliar (Figura 3B, flecha hacia la izquierda; la Figura 3F). Los ejemplos de la forma de cuantificar buorientación y cinetocilios ndle o posicionamiento haz se muestran en la Figura 3G y 3H. La orientación de cada haz individuo entonces se puede evaluar mediante la determinación de la rotación de la de relativa paquete a una línea que se extiende perpendicular a la fila de celdas pilar que separa las células ciliadas internas y externas. Las células con una orientación normal están alineados a lo largo de este eje perpendicular y así tener una rotación de 0 ° (Figura 3G). La posición de la cinocilio, o centro del haz estereociliar, se puede trazar mediante la superposición de una cuadrícula de posición en la superficie luminal de las células ciliadas y luego determinar la localización de los cinetocilios o paquete dentro de la red (Figura 3I). Las mutaciones en genes cilios a menudo afectan a la longitud cilios, y así la longitud de la cinocilio se pueden evaluar. En CEP290 mutantes rd16 / rd16, cinetocilios son más largos que en los controles (Figura 3J). A medida que se retrae la cilio,es fundamental contar con emparejados por edad compañeros de camada y tomar mediciones de la misma región de la cóclea. Para obtener buenas imágenes para el análisis y la cuantificación, por tanto inmunohistoquímica y SEM, es fundamental para eliminar la membrana tectoria. Figura 3F muestra una micrografía SEM en la que la membrana tectoria no se ha eliminado por completo.

Figura 1
Figura 1. Disección de un desarrollo del ratón cóclea (P0). (A) de la línea media sagital disección de la cabeza del ratón P0 con el cerebro removido. La flecha blanca indica la posición del laberinto óseo. (B) ventral (izquierda) y dorsal (derecha) puntos de vista de laberintos óseas disecados. La cóclea está situado hacia la parte superior con la parte vestibular en los puntos de flecha blanca inferiores a la ventana oval. (C) La popa laberinto óseoeliminación er del cartílago exterior de la cóclea. Un pasador se ha colocado a través del sistema vestibular. (D) Izquierda, misma vista que en C después de la eliminación de la membrana de Reissner la membrana y tectoria. Derecha, aislado conducto coclear listo para el montaje. Micrografía electrónica (E) de exploración de una espiral coclear intacto, expuesta exponiendo el piso del conducto coclear, incluyendo el epitelio sensorial. La barra de escala es de 100 micras. . (A - D) adaptado de mayo-Simera et al, 2012 25 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Morfología e inmunofluorescencia en el control de la cóclea (A - C). Micrografías electrónicas de barrido de la tur basaln en embrionaria (E18.5) cochleae salvaje tipo. Una fila de células internas del pelo (abajo) y tres hileras de células ciliadas externas (arriba) se separan y se intercala por las células de apoyo. haces estereociliar en forma de Chevron uniformemente orientan hacia el borde lateral de cada célula de pelo (borde superior de la imagen). En E18.5 microvellosidades adicionales cubren las superficies apicales de las células ciliadas, por debajo de los haces de estereociliar, y células de apoyo intercaladas (B). (C) A cinocilio única basada en microtúbulos (flecha blanca), se encuentra en el vértice del haz, que se muestra aquí desde el borde lateral. (D - G) tinción de inmunofluorescencia de vuelta basal postnatal día 1 (P1) de tipo salvaje cócleas. Faloidina etiquetas de actina filamentosa en los estereocilios y la actina cortical en la periferia de la célula (D, E, G). Miosina 7a es un marcador para las células ciliadas internas y externas (E). Zo_1 etiquetas de las uniones estrechas entre las células en, por lo que es un buen marcador para distinguir bounda celularRies (F). Acetilado α-tubulina se utiliza como un marcador para la cinocilio en el vértice del haz (F, G flecha blanca). Microtúbulos internos también son etiquetados por acetilado α-tubulina, que son especialmente abundantes en las células pilar (G asterisco blanco). Barras de escala A: 10 m, B: 5 micras, C: 1 m, DG:. 5 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. coclear fenotipo de los mutantes Cilia. (A) marcado acortamiento de IFT20 cko / cko conductos cocleares en comparación con el control. conductos cocleares disecados en E18.5 teñidas con tubulina acetilada. (B Bbs8 - / - mutante (P0). Faloidina marcada con actina filamentosa, estereocilios (rojo), la tubulina acetilada, cinetocilios (verde). Manojos estereociliar en Bbs8 - / - cócleas se giran de forma variable (flecha derecha), aplanados y / o mislocalized (flecha central). Cinetocilios se mislocalized o axonemes faltan (flecha izquierda). (C - F) Mayor aumento SEM de paquetes estereociliar y cinetocilios en Bbs8 - / - CCE. En C, giran paquetes, en D, aplanados paquete, en E, haces circulares y en fa mislocalized cinetocilios. (G - I) Las representaciones esquemáticas de cuantificación anormalidad paquete. (G) Izquierda, Bulto convexidad (altura); la distancia más corta entre el vértice del haz y la línea que se extiende a través de ambos extremos del haz de "brazos". como depicted por la línea de negro sólido. Derecho, el área bajo el bulto; la zona. (H) Las representaciones esquemáticas de los criterios utilizados para cuantificar la orientación de los haces estereociliar. El ángulo de rotación del haz se calcula en relación a una línea que se extiende perpendicular a la fila de celdas pilar. (I) Representación esquemática de los criterios para el análisis posicional de cinetocilios y haces de estereociliar. Una rejilla segmentado se coloca sobre la circunferencia de la célula de pelo y la posición observó. (J) la imagen a mayor aumento de los haces con faloidina marcada con estereocilios (rojo) y cinetocilios tubulina acetilada marcada con (verde) de las células ciliadas externas de la cóclea P0. En el panel monocromática adyacente, líneas rojas identifican los cinetocilios, que son más largos en Cep29 mutantes rd16 / rd16 comparación con el control (flechas blancas). (K) Micrografía SEM de la cóclea embrionaria con la eliminación incompleta de la membrana tectoria. EscalaUn bares: 100 m, B: 5 micras, C - F: 2,5 m, I: 5 micras, J: 50 micras. (A - F)... Modificada a partir de mayo-Simera et al, 2015 8, J Reimpresión con permiso de Rachel y col, 2012 27 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Cuando se prepara el tejido coclear para el análisis, hay algunos puntos clave a tener en cuenta. En primer lugar, las diferencias en el fondo genético puede modificar el fenotipo coclear, por lo que es necesario analizar y comparar sólo los controles de la misma camada. En segundo lugar, se requiere la eliminación completa de la membrana tectorial para obtener las mejores imágenes con inmunohistoquímica y es esencial para SEM. La membrana tectorial es una estructura opaca y puede oscurecer las células del epitelio sensorial directamente debajo de ella, lo que hace más difícil de formación de imágenes. De vez en cuando durante el proceso, la membrana tectoria puede contraerse de nuevo, el descubrimiento de las células ciliadas. Incluso en estos casos es muy recomendable la eliminación. Este paso requiere paciencia y práctica. En tercer lugar, la inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra las proteínas ciliares, en particular los que se localizan a la basal del cuerpo muy compactado, puede ser difícil y requerir optimización. Considere la posibilidad de llevar a cabo la recuperación de antígenos, la intensificación de la permeabilzación pasos, o la disminución de la concentración o la hora de la fijación. Por último, cuando se generan imágenes del cinocilio (el cilio primario que se encuentra en las células ciliadas de la cóclea) tener en cuenta que comienza a retraerse de P0 - P1 en adelante en un gradiente-ápex. Por lo tanto, cuando se mide la longitud de la cinocilio es importante comparar las células ciliadas de la misma región de la cóclea y en los animales de edad coincidente. Las células de apoyo intercaladas también tienen cilios primarios, que no se retraiga. Se debe tener cuidado de distinguir entre el apoyo cilios celular y cinetocilios célula de pelo.

Como los ratones maduran, se hace cada vez más difícil aislar limpiamente el epitelio sensorial coclear, debido a la calcificación de los huesos temporales y laberintos óseas. Se requiere Descalcificación del tejido, que no siempre es compatible con otras técnicas de inmunolocalización pero permite el examen del fenotipo bruto y también es compatible con la preparación de SEM. str ratones consanguíneosAINS a menudo presentan defectos auditivos tales como pérdida de células ciliadas o respuestas auditivas del tronco cerebral (ABR) elevados, debido a mutaciones en genes auditivos conocidos o genes modificadores. Por lo tanto, es esencial para comparar los controles de la misma camada emparejados por edad o raza sobre un fondo genético alternativo.

Una de las limitaciones de este análisis es que, en ratones, la cinocilio comienza a retraer poste nacimiento y ya no está presente en células de pelo adultos. Por esta razón mediciones cinetocilios sólo se puede hacer en el desarrollo de tejido. También es necesario seleccionar cuidadosamente los controles emparejados por edad para las comparaciones entre las muestras mutantes y de control. Otra limitación es que los ratones mutantes ciliares analizados hasta el momento no muestran disfunción auditiva severa (es decir., Respuestas auditivas del tronco cerebral, ABR o emisiones otoacústicas, OAE), incluso cuando se altera el desarrollo coclear. En consonancia con esto, los defectos de audición no son un fenotipo común ciliopathy humano. Excepcionalmente, la pérdida de hearing es una de las características principales del síndrome de Alström, causada por mutaciones en la proteína corporal basal ALMS 1 28,29. Esto sugiere que la morfología haz estereociliar no está necesariamente ligada a la disfunción auditiva en los mutantes cilios, probablemente debido a la reorientación correctivo de los paquetes más adelante en el desarrollo como ha sido reportado para los mutantes Vangl2 CKO 30. Si el espectro ciliopatía se amplió para incluir el síndrome de Usher, la causa congénita más común de ceguera-sordera, a continuación, disfunción auditiva adquiere gran relevancia. Los datos recientes han demostrado que varias proteínas relacionadas con el síndrome de Usher también se localizan en el cilio y están involucrados en procesos relacionados con ciliares-31, pero si estas proteínas se refieren a la señalización PCP aún no ha sido examinado.

Hasta que sólo se han examinado vagamente ahora la mayoría de los mutantes ciliar ratón analizadas en busca de defectos PCP cocleares. Las técnicas descritas en este manuscrito permiten una extensa detalle de lafenotipo coclear, lo que sin duda dará lugar a una comprensión más precisa de la implicación ciliar en el establecimiento de la señalización PCP vertebrados. A pesar de la gran cantidad de modelos de ratón ciliopatía disponibles, sorprendentemente pocos han sido analizados en términos de defectos PCP cocleares. Un error común asociado con estos modelos es la letalidad embrionaria. Sin embargo, desde el desarrollo de la cóclea se puede examinar embriónicamente el papel de los cilios en el PCP en el oído pueden desarrollar aún por investigar. Por otra parte, la letalidad embrionaria temprana se puede evitar utilizando knockouts condicionales. Foxg1 Cre 32 ratones, disponibles de JacksonLaboratories, se utilizan comúnmente para inactivategenes de interés en thedeveloping oído interno desde la fecha E8.To, los esfuerzos se han centrado principalmente en el examen de los genes causantes de enfermedades ciliopatía Sin embargo, la exploración de otras proteínas relacionados con los cilios y cómo éstos afectan la señalización durante el desarrollo PCP puede proporcionar una mayor comprensión de CILbiología ia y función.

Si un fenotipo auditivo se sospecha en los modelos de ratón que se está analizando, posibles análisis adicionales incluyen pruebas de audiometría de ABR 33 o 34 OAE. Ensayos de extensión de explante coclear (como se describe en mayo-Simera et al., 2012 25), también se pueden realizar y permiten la identificación de los defectos de la extensión convergente en los puntos de tiempo de desarrollo anteriores. El cultivo de explantes de cóclea también permite el tratamiento con diversos activadores o inhibidores de la señalización, que pueden modificar la extensión de explante, lo que contribuye a la comprensión mecanicista de los procesos de desarrollo involucradas. Aunque se sabe que el cinocilio retrae después del nacimiento 11,13,14, esta retracción no se ha abordado a fondo en el contexto de mutantes ciliares. Sería de interés para tomar mediciones en tiempo específico de emergencia cinetocilios y retracción de los cilios que mutants.Considering un papel principal para pro ciliarproteínas es el movimiento de la carga a lo largo de los microtúbulos, es muy probable que estas proteínas también pueden regular aspectos del tráfico intracelular a lo largo del citoesqueleto 35-37. Un subconjunto de proteínas cilios se ha demostrado que afectan a la trata y la localización asimétrica de moléculas PCP 8. La localización por inmunohistoquímica de moléculas de PCP, particularmente las proteínas asociadas a la membrana tales como Vangl2, Frz3 y DSH, por lo tanto, se recomienda establecer si se mislocalized moléculas PCP. Establecimiento de la polaridad parece ser un asunto multifacético, y hay una creciente evidencia de una vía adicional de la célula autónoma, que también se requiere para la correcta PCP en las células ciliadas sensoriales 38. Un trabajo reciente mostró que G de señalización dependiente de la proteína controla la migración del cilio en una celda de manera autónoma 39. Consistente con un papel de las proteínas ciliares en la localización de las moléculas de polaridad, heterotrimeric G-proteína alfa-i subunidad 3 (Gαi3) localization se interrumpe en Bbs8 y Bbs6 nocaut cóclea 8,39.

Distinguir el papel de los componentes individuales ciliares y sus distintos efectos sobre la señalización PCP nos dará una mayor comprensión de la función de los cilios en el establecimiento de la polaridad correcta. De particular importancia es distinguir entre proteínas ciliares que funcionan en un contexto ciliar, frente a las funciones no ciliares de proteínas ciliares tradicionalmente consideradas, tales como su papel en la regulación de la no-ciliar relacionados con el tráfico intracelular. El alto grado de regularidad en muchos aspectos de la estructura coclear, incluyendo el patrón celular y la orientación haz estereociliar, hace que sea posible detectar cambios sutiles en el desarrollo de PCP en respuesta a cualquiera de perturbaciones genéticas o moleculares en las proteínas relacionadas con cilios. Teniendo en cuenta que hay muchos modelos de ratón ciliar disponibles, y que la cóclea del ratón en desarrollo es uno de los mejores lugares para examinar PCPde señalización, es de gran interés para conocer en qué medida las mutaciones individuales de proteínas interrumpen el desarrollo cóclea.

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Acknowledgments

El autor desea agradecer a Mateo Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer y Zoe Mann y para su evaluación crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Premio Sofja Kovalevskaya (Fundación Humbodlt) y la Universidad Johannes Gutenberg, Mainz, Alemania.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Silicone elastomere - Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028-5EA See Note 2
Micro dissecting scissors-straight blade Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps Various
Dissecting microscope. Various
Uncoated glass microscope slides Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) Various
Transfer pipettes Various
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-10
SEM sample holder tousimis 8762
Scanning electron microscopy studs TED PELLA 16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive TED PELLA 16084-3
Fluorescent Microscope Various
Critical Point Dryer Various
Scanning Electron Microscope Various
Glass microscope slides Various
Glass coverslips Various
Kimwipe Tissue  Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS) Gibco/Life Technologies 10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1 Sigma-Aldrich G5882
Tris-HCl (pH 7.5) Various
NaCl Various
CaCl 2 Various
Triton X-100 Various
Normal Goat Serum Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-007-003
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Technologies 14065
Hepes Gibco/Life Technologies 15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 ) Sigma-Aldrich/Fluka Analytical 75632
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Ethanol 200 proof Various
Antibodies
anti Arl13b Protein Tech 17711-1-AP Suggested concentration 1:1,000
anti acetylated tubulin (611-B1) Sigma-Aldrich T6793 Suggested concentration 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88) Sigma-Aldrich T6557 Suggested concentration 1:200
anti Zo_1  Invitrogen 40-2300 Suggested concentration 1:500
Myosin VI Proteus Biosciences 25-6791 Suggested concentration 1:1000
Myosin VIIa Proteus Biosciences 25-6790 Suggested concentration 1:1,000
anti Vangl2 Merk Millipore ABN373 Suggested concentration 1:250
anti Gαi3 Sigma-Aldrich G4040 Suggested concentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:300 - 1,000

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Medicina No. 108 primaria cilios cinocilio planar de la célula de la polaridad la cóclea el ratón células de pelo estereocilios señalización Wnt
Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea
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May-Simera, H. Evaluation of… More

May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. J. Vis. Exp. (108), e53559, doi:10.3791/53559 (2016).

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