Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluering af Planar-Cell-polaritet fænotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Published: February 21, 2016 doi: 10.3791/53559
Automatic Translation
1
1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Introduction

Primære cilier er lange mikrotubulus-baserede vedhæng, som strækker sig fra overfladen af ​​de fleste pattedyrceller. Primære cilier forveksles ofte med motile cilier, hvoraf der er altid flere per celle, og hvis formål er at bevæge fluid tværs membranoverflader. Primære cilier, derimod vedtage sensoriske roller og er derfor også betegnet som sensorisk cilia. Når længe glemt, dette organel er for nylig blevet "genopdaget" som et resultat af sin tilknytning til et væld af genetiske sygdomme hos mennesker 1. Ideelt placeret som en signalering organel, har den primære cilium blevet vist at regulere en lang række signalveje, hvoraf mange er vigtigt ikke blot i vævshomeostase og sygdom, men også under udvikling 2.

En af de første signalveje vist at være forbundet med cilia dysfunktion var den ikke-kanoniske Wnt signalvejen, også kendt som den plane cellepolaritet (PCP) pathway > 3. Denne signaleringskaskade oprindeligt identificeret i Drosophila, er afgørende for embryogenese; især for konvergenskriterierne og udvidelse processer og for den korrekte orientering af celler i flyet af epithel 4. Den sekventielle signalering af en kerne sæt regulatoriske proteiner oversætter retningsbestemte signaler, som i sidste ende fører til cytoskeletale omrokeringer og resultere i en koordineret polarisering af epitelceller i et plan 5. Processen med konvergens og udvidelse er absolut nødvendig for cochlear kanal til aflang og for korrekt cellulære mønster 6. Da disse er reguleret via aktivering af PCP pathway, en af de mest slående fænotyper af cochlea PCP mutanter er en forkortet cochlear kanal med uorganiseret sensoriske epithel 7. Tilsvarende mus mutanter, som mangler cilier, også udviser en sådan konvergens og udvidelse fænotype 8,9, men præcist, hvordan det er reguleret mangler at blive belyst.

ve_content "> Fordi konvergenskriterierne og udvidelse processer er afgørende for udvækst af cochlear kanalen, og cellulære mønster af den sensoriske epithel i cochlear kanalen, udviklingslandene cochlea er en ideel organ til at gennemgå PCP signalering under hvirveldyr udvikling. orgel Corti udtrykket givet til den specialiserede sensoriske epithel at linjer cochlear kanal, består af ikke-sensoriske understøttende celler og mechanosensory hårceller, som skal ensartet orienteret for cochlea til at fungere 10. de mechanosensory hårceller er såkaldte grund af den stereociliary bundter, der strækker sig fra den kutikulære plade (apikale overflade) af hvert sensorisk hår celle 11. Disse fungerer som primære transducere mechanosensation og trods deres nomenklatur som stereocilia, faktisk består af modificeret actin filament-baserede microvilli. Inden for hver chevron-formede hår bundt, tre rækker af stereocilia er organiseret i en meget ordnet og regelmæssig pattern i en trappe-lignende måde. Rigtig mikrotubuli-baserede cilier, betegnes kinocilia, er nødvendige for udviklingen og orienteringen af de stereociliary bundter 12. Ved hvert hår celle, er en enkelt kinocilium fysisk anbragt på stereocilia bundt, placeret centralt ved siden af ​​højeste række af stereocilia. Den præcise funktion af kinocilium er uklar, og en hypotese er, at kinocilium "trækker" den stereocilia i facon, som de modne fra mikrovilli 12. I hvirveldyr, kinocilia i cochlea er kun til stede kortvarigt og trækkes tilbage fra hårcellerne i mus før begyndelsen af hørelse 11,13,14.

Komplet tab af cilier i udviklingslandene cochlea resulterer i alvorligt forkortede cochlear kanaler, mis-formet og mis-orienterede stereociliary bundter samt mis-placerede basale organer 8,9. En funktionel cilium er ikke kun består af den ciliære axoneme. Mange proteiner forbundet med cilierfunktion forekommer i komplekser lokaliseret til cilia-relaterede underdomæner såsom basale krop, overgangszone eller ciliaere axoneme 15. Den basale legeme, der stammer fra moderen centriole af centrosom, er også en mikrotubulus-organiserende center for mikrotubuli strækker sig bort fra cilium i cellen kroppen og kan regulere intracellulær transport samt ciliær trafficking. Den ciliaere overgangszonen er en anden region, hvor ciliaere funktion er reguleret i forhold til at organisere import og eksport af ciliære forbindelser 16.

Flere studier har identificeret en sammenhæng mellem cilier og ikke-kanonisk Wnt (PCP signalering), selvom den præcise mekanisme er uklar 17. Redundans af ciliære og PCP gener og følsomheden af ​​cellepolaritet til generelle cellulære abnormaliteter, gør det vanskeligt at direkte forbinde en mutation til PCP-specifikke underskud. En af de læste outs af PCP signalering er positioneringen af ​​den basale legeme og Primary cilium derfor adskillelse den primære fra de sekundære defekter er udfordrende. Nogle undersøgelser i zebrafisk og mus mutanter har foreslået nogen forbindelse mellem cilier og Wnt signalering 18-20. Uoverensstemmelser i dataene kan afspejle arter, væv eller tidsmæssige-afhængige forskelle i ciliære bidrag til Wnt signalering. Desuden kan normal Wnt lydhørhed bibeholdes, hvis basale organer forbliver funktionelt. En dybere indsigt i den rolle, ciliære proteiner i cellulære signalveje og andre biologiske fænomener er afgørende for vores forståelse af cellulær og udviklingsmæssige biologi, samt til udvikling af målrettede behandlingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brug og aflive alle dyr i overensstemmelse med de institutionelle og statslige retningslinjer og forordninger, oftest via CO 2 indånding og cervikal dislokation.

1. Fremstilling af reagenser

BEMÆRK: Før starten forberede alle reagenser bruger kemikalier af analysekvalitet. Foretag løsninger ved hjælp af molekylærbiologisk kvalitet destilleret og demineraliseret vand, medmindre andet er angivet.

  1. Fosfat saltvand (1x PBS): Lav 1 l 1x PBS ved at opløse 8g NaCl, 0,2 g KCI, 1,44 g Na 2 HPO 4 og 0,24 g KH 2 PO 4 i 1 l H2O PH justeres til 7,4 med HCI. PBS behøver ikke at være steril og kan opbevares ved stuetemperatur. Bemærk, at denne buffer er lavet uden CaCl2 eller MgCl2.
  2. Paraformaldehyd (4% PFA): Forbered en 4% opløsning af PFA i 1x PBS i et ventileret stinkskab. Tilføj 40g paraformaldehyd pulver til 1 I 1x PBS. For at opløse, rør og opvarm til ca. 60 ° C,og tilsæt langsomt NaOH dråbevis at hæve pH. Når pulveret er opløst, justere pH til 7,4 med HCI. Der filtreres gennem et 0,45 um filter og fryse alikvoter. Optøning en frisk portion for hvert forsøg.
  3. Triton-buffer: Der fremstilles en 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 opløsning ved at opløse 8,77 g NaCl i 1 liter 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Tilsæt 1 ml Triton X-100. Stir at opløse. Store Triton-buffer ved stuetemperatur.
  4. Triton blok: Forbered 10% gedeserum i Triton buffer ved at tilsætte 1 ml gedeserum til 9 ml Triton buffer. Opbevares ved 4 ° C. Hvis der anvendes primære antistoffer rejst i mus, tilsæt gede-anti-muse-IgG Fab-fragmenter ved en fortynding på 1 200 til Triton-blokken på blokerende trin.
    BEMÆRK: Hvis planlægning at anvende prøver til scanning elektronmikroskopi (SEM), forberede yderligere reagenser som anført nedenfor.
  5. Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) med calcium og magnesium: Lav en 1x løsning HBSS ved at fortynde fra en stamopløsningi sterilt destilleret H2O Som HBSS buffer er kompliceret at lave, og der er risici, er det tilrådeligt at bestille en premade 10x stamopløsning. Slutkoncentrationen af HBBS buffer rutinemæssigt anvendte er følgende: 1,26 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2 -6H2O, 0,41 mM MgSO4 -7H2O, 5,33 mM KCI, 0,44 mM KH 2 PO 4, 4,17 mM NaHCO3, 137,93 mM NaCl , 0,34 mM Na 2 HPO 4, 5,56 mM dextrose.
  6. Hepes buffer: Forbered en 0,1 M Hepes løsning i 1x HBSS, ved at opløse 23,8 g HEPES i en L 1x HBSS buffer.
  7. Scanning elektronmikroskopi fiksativ (SEM Fix): fikseringsopløsning forberedes til SEM ved at fortynde elektronmikroskopi kvalitet glutaraldehyd (2,5%) og paraformaldehyd (4%) i Hepes-buffer. Tilføj CaCI2 til en slutkoncentration på 10 mM.
  8. 1% Osmiumtetroxid (OSO4) i Hepes-buffer; 1% Osmiumtetroxid i vand: Fortynd en stamopløsning af osmiumtetroxid i Hepes puffer, og separately i sterilt destilleret H2O, til en slutkoncentration på 1%. Osmiumtetroxid er meget giftigt og er mest almindeligt solgt som en 4% opløsning.
  9. 1% (vægt / volumen) Garvesyre: Opløs 0,5 g garvesyre i 50 ml sterilt destilleret H2O Filtrer steriliseres ved filtrering gennem et 0,45 porestørrelse.
  10. Graded ethanolopløsning serie: Fortynd 200 proof ethanol med sterilt destilleret H2O for at gøre 30, 50, 70, 90 og 95% ethanolopløsninger. For den endelige ethanol skylninger, er 100% ethanol 200 krævet dokumentation. Brug en frisk åbnet flaske 200 proof ethanol i de endelige skylninger.

2. Valg af Tissue

  1. Ideelt set undersøger embryoner eller unge hvalpe i alderen embryonale dag 16,5 (E16.5) og postnatal dag 3 (P3).
    BEMÆRK: forbening af den benede labyrint og tidsmæssige knogler gør dissektion gradvist mere udfordrende som mus modnes. Også kinocilia, den eneste sande mikrotubuli-baserede cilium fundet på cochlear hårceller,trækker under udvikling og er ikke længere til stede i voksne mus.
  2. Efter fiksering, afkalkning voksen cochleae. Placer dissekeret (se afsnit 3) benede labyrinter, i 2 ml EDTA (4,13% i PBS), pH 7,3, i et mikrocentrifugerør i 3 - 4 dage med rotation. Påfyld EDTA dagligt. Efter vævene blødgjort, skylles i 1,5 ml eller mere PBS 3 gange i 5 minutter på en nutator med forøget omrøring.

3. Cochlea Dissektion

  1. Indlæg euthanization via cervikal dislokation eller CO2 inhalation (100% CO2), fjern hovedet. Brug en skalpel eller lille saks, afhængigt af størrelsen af ​​dyret, at dissekere hovedet langs sagittale midterlinie begynder ved næsen og strækker kaudalt. Fjern hjernen fra hver halvdel af kraniet med en pincet. Identificere de tidsmæssige knogler, som indeholder u-benede labyrinter i det indre øre (se pil i figur 1A).
  2. Brug et par forCEPS til omhyggeligt isolere knoklet labyrinter fra kraniet (tidsmæssige knogler). Gør dette under et dissektionsmikroskop. Prise væk knoglevæv fra kraniet ved at køre pincet forsigtigt nedenunder knoklet labyrinter. Hos dyr op til P4 benet labyrinter stadig brusk og kan nemt fjernes uden brud.
  3. Efter dissektion, bruge spidsen af ​​de dissekere pincet til at fjerne den ovale og runde vinduer og lave et lille hul i spidsen af ​​den cochleære spiral. Fastgør knoklede labyrinter før yderligere dissektion af cochlear kanalen. For at give mulighed for nem fjernelse af den tectorial (se 3.7), fastsætte de knoklede labyrinter i 1,5 ml 4% PFA i 5 min på is.
    BEMÆRK: Hvis fjernelse af tectorial ikke er påkrævet, er længere fiksering tilrådes (se 4,1-4,3). Kortfattet fiksering af de tidsmæssige knogler før dissektion af cochlear kanalen hjælpemidler dissektion proces og fjernelse af tectorial. Indlæg dissektion og eksponering af organ Corti, furthendes fiksering er påkrævet.
  4. Yderligere dissekere de knoklede labyrinter at eksponere cochlear sensoriske epithel som følger. Placer knoklede labyrinter i en sort silikone elastomer-belagt dissekere skål indeholdende PBS for at lette dissektion. Brug minutien stifter til at immobilisere væv, hvis det kræves. For at bruge minutien pins, placere dem gennem det vestibulære del af knoklet labyrinter med den ventrale aspekt af cochlear spiral opad.
    BEMÆRK: Sort silikone elastomer fad: Bland silikone elastomer basiskomponent med pulveriseret kul for at opnå en uigennemsigtig sort farve. Tilføj hærdemidlet og hæld i en eller flere petriskåle (glas eller plastik). Tør under vakuum for at fjerne luftbobler. Tørre retter helt før brug.
  5. Brug fin pincet (# 5) for at fjerne den ydre brusk udsætte cochlear kanalen. Start med det ovale vindue; Sæt den nederste spids af tangen i det ovale vindue og forsigtigt brækkes den brusk, langsomt bevæger sig opad modspids.
  6. Efter eksponering af ductus cochlearis fjernes den ventrale overflade, den Reissner membran. Brug en fin pincet til at klemme Reissner membran i bunden af ​​cochlear kanalen og flå det i en opadgående bevægelse. Visualisere den dorsale aspekt af ductus cochlearis, herunder sensoriske epithel.
  7. Fjern tectorial som beskrevet nedenfor (valgfrit). For SEM eller immunhistokemi af kinocilium eller stereociliary bundter fjerne tectorial.
  8. Anvend en meget fin tang (# 55 eller finere) at klemme tectorial ved basis af sneglen og skræl opad mod spidsen.
    BEMÆRK: tectorial er optisk klar, hvilket gør det vanskeligt at identificere. Oftere end ikke membranen kommer ud i et stykke og selvom det ikke er nemt visualiseres, kan man føle modstand, når den trækkes fra den blotlagte cortiske organ.
  9. Efter at udsætte organ Corti, yderligere løse væv som described nedenfor. Behold det vestibulære region for at hjælpe yderligere forberedelse af væv.

4. Fiksering

  1. Til regelmæssig immunhistokemi fastsætte de dissekerede benede labyrinter i 1,5 ml 4% PFA ved 4 ° C på en nutator i 2 timer.
    BEMÆRK: På grund af følsomheden af ​​forskellige antistoffer og antigener, variationer i længde og sammensætning af fiksering kan kræves, og bør optimeres for hvert antistof.
  2. Efter fiksering vaskes prøverne ved rensning i 1,5 ml eller mere PBS 3 gange i 5 minutter på en nutator med forøget omrøring. Prøver kan opbevares i PBS ved 4 ° C i adskillige uger før behandling.
  3. Hvis forberede prøver til SEM, fix dissekeret tidsmæssige knogler i SEM fix (se 1.7) i 2 timer ved stuetemperatur. Vask ved rensning i 1,5 ml eller mere HEPES-buffer 3 gange i 5 minutter på en nutator med forøget omrøring. Opbevares i Hepes-buffer ved 4 ° C indtil yderligere forarbejdning. Opbevaring i længere end et par uges ikke anbefales.

5. Immunhistokemi

  1. Udfør immunhistokemi på dissekerede prøver i en brønd i en fladbundet plade med 96. Alternativt kan du bruge en PCR eller mikrocentrifugerør. Det er tilrådeligt at bevare den vestibulære del af den benede labyrint for at lette fremstillingen.
  2. Permeabilisere vævet ved inkubering i 1,5 ml Triton-buffer i 1 time ved stuetemperatur på en nutator med forsigtig omrøring.
  3. Blokere vævet ved inkubering i 0,5 ml Triton blok i mindst 1 time ved stuetemperatur. Hvis der anvendes primære antistoffer rejst i mus, tilsæt anti-mus IgG Fab-fragmenter til blokken ved en fortynding på 1 200 (se afsnit 1.4). Dette i høj grad reducerer ikke-specifik binding af anti-muse-IgG til muse væv.
  4. Inkuber vævet med primære antistoffer fortyndet i Triton blok O / N ved 4 ° C under forsigtig omrøring. Antistof fortynding afhænger af antistoffer bliver brugt (se afsnit 6.1). Alternativt inkuberes primære antibodies i 2 timer ved stuetemperatur. Ideelt bruge et minimum volumen på 0,5 ml primært antistof fortynding. Hvis antistof er begrænset, anvender den mindste mængde antistof fortynding, som fuldstændig indhyller vævet.
  5. Vask vævet ved skylning i 1,5 ml eller mere Triton buffer, mindst 3 gange i 15 minutter, på en nutator med forøget omrøring.
  6. Inkuber vævet med fluorescerende farvestof-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet i fabrikanterne anbefalede koncentration (typisk 1: 200-1: 1000) i Triton blok i 1 time ved stuetemperatur på en nutator. Brug en minimalt volumen af ​​0,5 ml sekundært antistof fortynding.
    1. Centrifugeres det fortyndede sekundære antistof ved 13.000 xg i 3 min før anvendelse for at minimere ikke-specifik binding af sekundært antistof aggregater. Shield vævet fra lys fra dette trin og fremefter for at undgå fotoblegning de fluorescerende farvestoffer.
  7. Som i trin 5.5, vaskes vævet ved skylning i 1,5 ml eller mere Triton-buffer, mindst 3 gange i 15 minutter, ved ennutator med forøget omrøring. Opbevar prøver i PBS ved 4 ° C indtil den er klar til at montere.

6. Antibody Selection

BEMÆRK: Kilden til anbefalede antistoffer og deres fortyndinger er angivet i tabellen i specifikke materialer og udstyr. Udfør antistofinkubationer som beskrevet i afsnit 5.

  1. For at visualisere mikrotubuli-baserede kinocilium, brug en ciliaere axoneme markør såsom anti-Arl13b (1: 1000) eller anti-acetyleret-α-tubulin (1: 800). Visualisere den basale legeme ved anvendelse af et antistof mod γ-tubulin (1: 200) eller enhver anden centrosomal markør.
  2. At visualisere stereociliary bundter actin filament-rige, tilføje phalloidin (1: 300 - 1.000) konjugeret til en af ​​flere forskellige fluoroforer til det sekundære antistof inkubation. Phalloidin etiketter også andre filamentøse aktin strukturer, herunder de kortikale actinfilamenter omkring periferien af ​​hver epitelcelle hår celle. Dette er nyttigt til at bestemmeomridset af hvert hår celle. Benytte en alternativ membran markør, såsom anti-Zo-1 (1: 500) om nødvendigt.
  3. Label cochlear hårceller ved anvendelse af antistoffer mod Myosin VI (1: 1000) eller Myosin VIIa (1: 1000). Disse kan anvendes, hvis vurderingen cochlea længde.

BEMÆRK: Anvend passende fluorescerende farvestof-konjugeret sekundære antistoffer optimeret til mikroskopet krav.

7. Montering og Imaging

  1. Prøven anbringes i en sort silikone elastomer skål indeholdende PBS. Ved hjælp af fine pincet, fjern det vestibulære region fra cochlear spiral.
  2. Meget forsigtigt fjerne den underliggende brusk og mesenkym fra cochlear spiral. Den resterende cochlear spiral indeholder den indre sulcus, cortiske organ og ydre sulcus.
  3. Overfør cochlear spiral i en dråbe af PBS anbringes på et objektglas. Hvis det ønskes, adskille cochlear spiral i stykker svarende til en omdrejning. Dette trin er ikke nødvendigt dog, og kan føre til loss af vævet. Den apikale overflade (stereocilia side) af Cochlear hårceller skal vende opad mod dækglasset.
  4. Wick væk PBS med en adsorbent væv eller stykke filterpapir og forsigtigt flytte cochlear spiral, hvis epitel er flyttet og overlapninger på sig selv.
  5. Tilføj en dråbe montering medier direkte på cochlea prøve og forsigtigt placere et dækglas på toppen, skal undgås luftbobler. Der kræves ingen afstandsstykker; placere dækglasset direkte på prøven. Et vandopløseligt, ikke-fluorescerende, semi-permanent montering medium, som ikke kræver yderligere trin til at holde dækglasset på plads anbefales. Montering medier og dækglas tykkelse bør modsvares til mikroskop specifikationer.
  6. Brug et epifluorescens eller laser-scanning konfokal mikroskop udstyret med høj forstørrelse (63 - 100X), høj numerisk apertur (1,2 - 1.4) mål at indfange billeder af den apikale overflade af cochlear hårcelle. Brug loWer mål (5 - 20X) for at tage overlappende billeder af cochlear spiral at kvantificere varigheden af ​​cochlear kanalen. Match excitation lasere og emission filtre til fluoroforer anvendes til sekundære antistoffer.

8. Scanning Electron Microscopy

  1. Fortsæt fra afsnit 4.3. Efter vask SEM faste prøver i Hepes buffer, udføre følgende trin under ventilation. Følgende protokol fungerer godt for cochlea væv og undgår anvendelsen af ​​sputter belægning med en ledende metal.
  2. Post-fix i 1% OSO4 i Hepes puffer i 1 time, efterfulgt af 3 vaske med 1 ml destilleret vand i 5 minutter hver. Den mindste mængde af OSO4 der fuldstændig omslutter vævet bør anvendes til at minimere giftigt affald. Uden omrøring er nødvendig.
  3. Inkuber prøver ved stuetemperatur i hver af de følgende opløsninger i 1 time med 3 vaske med 1 ml destilleret vand i 5 minutter hver i mellem trin: 1% garvesyre frisk gjort i vand og filstreret før brug; 1% OsO4 i vand, 1% garvesyre i vand, 1% OSO4 i vand.
  4. Dehydrere prøver gennem en gradueret ethanolserie ved inkubation i 10 minutter i hver af de følgende fortyndinger: 30, 50, 70, 90, og 95%. Uden omrøring er nødvendig.
  5. Overfør prøver gennem tre ændringer, 5 min hver, 100% ethanol (fra en nyligt åbnede flaske 200 proof ethanol).
  6. Kør prøverne selvom et kritisk punkt tørrere følgende producentens anvisninger.
  7. Monter prøver under anvendelse ledende carbon klæbemiddel oven på en SEM-stub før optagelse på et elektronmikroskop. Under et stereomikroskop, bruge et par fine pincet og en pensel til forsigtigt placere prøven med cochlear epitel opad. Brug vestibulære del af prøven til "anker" vævet til stubben. Opbevar prøver i en ekssikkator, indtil billedbehandling. Udfør SEM billeddannelse som beskrevet i Jones (2012) 21.

9.Kvantificering

  1. Efter immunhistokemi forberedelse, erhverve billeder ved hjælp af en epifluorescerende eller laser-konfokalt. Efter forberedelse til SEM, bruge et scanningselektronmikroskop af billedet enhederne. Billede den apikale overflade organ Corti med de udsatte cochlear hårceller og indskudte support celler.
  2. Definere specifikke positioner langs cochlear kanalen, såsom 25, 50, og 75% fra bunden og bruge disse til at sammenligne cochlea regioner mellem mutante og kontrolprøver. Analyser og sammenligne cilia mutanter med deres kuld kontroller, som forskelle i genetisk baggrund kan ændre cochlear fænotype.
    BEMÆRK: cortiske organ udvikler sig på en gradient, der strækker sig fra midten af ​​basen i retning både toppunktet og bunden. Hos mus, udvikling er ikke afsluttet, før P14, så det er vigtigt at sammenligne regioner på lignende udviklingstrin og positioner.
  3. Tage billeder ved hjælp software ledsager mikroskop, der allow for kvantificering af særlig fænotype efter behov (se nedenfor). Brug billedanalyse software såsom Billede J eller software ledsager mikroskop for at måle længder, tælle celler og bestemme protein lokalisering som beskrevet nedenfor. Graph disse data som et søjlediagram, scatter plot, box blot eller histogram, sammenligner mutant vs. kontrol.
  4. Samlede længde af cochlear kanalen (figur 3A):
    1. Ved hjælp af en hår celle markør eller phalloidin, (som markerer de stereociliary bundter), bestemme og måle, hvor det sensoriske epithel begynder og slutter. Længden af ​​ductus cochlearis ofte forkortet i cilia mutanter.
  5. Stereociliary bundt abnormiteter (figur 3B, D, E, G):
    1. Mål bundt konveksitet (højde) som den korteste afstand mellem toppunktet af bundtet og den linje, der strækker sig gennem begge ender af bundle "våben" som vist i figur 3G, venstre. Alternativt kvantificere områdetomfattet af armene på ydre hårceller stereociliary bundle som vist i figur 3G, højre. Hvis hårceller med cirkulære stereociliary bundter kan identificeres tæller disse som en procentdel af de samlede hårceller.
      BEMÆRK: I mange ciliære mutanter kan observeres bundt abnormiteter uanset bundt orientering. Det er vanskeligt nøjagtigt at kvantificere stereociliary bundt abnormiteter.
  6. Orientering af de stereociliary bundter (figur 3B, C, G):
    1. Vurdere orienteringen af ​​hver enkelt bundt forhold til en linje strækker sig vinkelret på rækken af ​​celler søjle, der adskiller den indre og ydre hårceller. Celler med en normal orientering er rettet ind langs denne vinkelrette akse og så har en rotation på 0 °. Bestem drejningsvinkler ved hjælp af enten en 360 ° notation eller som absolutte afvigelser fra 0 °.
  7. Kinocilia positionering eller stereociliary bundt positionering (figur3B, F, H):
    1. Tæl procentdelen af ​​celler i hvilke der mangler kinocilia. Måle afstanden fra kinocilium til 'toppunkt' eller center af bundtet. Den "toppunkt" af bundtet kan ikke være let at definere, om bundter er unormale, og så centrum af bundtet kan anvendes i stedet.
  8. Kvantificer stilling kinocilia og stereociliary bundter på den apikale hår celleoverfladen, ved overlejring af en positionel gitter på hver hår celle og markerer placeringen af ​​enten basen af ​​kinocilium eller toppunktet / midten af ​​stereociliary bundt. Vise dataene som en procentdel af hver kategori, der ligger inden for et specifikt område af gitteret, og ved at overlejre placeringerne af hver markering på én positionelle gitter.
    BEMÆRK: I kontrol væv, kinocilia er altid knyttet til toppunktet af stereociliary bundt. I cilia mutanter, der kinocilia ofte mangler, men mislocalized stadig er fastgjort, eller endog helt løsrevet fra stereociliary bundt.
  9. Kinocilia længde (fig 3I):
    1. Mål længden af ​​kinocilium ved mærkning med en ciliær axoneme markør. Kun måle kinocilia der ligger fladt i en 1,5 um konfokal fly. Bekræfter, at cilier er liggende fladt ved at observere et tværsnitsbillede af det scannede væv. Sammenlign alderen matchede prøver fra samme region af cochlea siden kinocilium trækker under udviklingen.
  10. Mislocalization af polaritet proteiner:
    1. Efter immunhistokemi hjælp antistoffer mod polaritet proteiner såsom Vangl2 og Gαi3, fastlægge lokalisering via billeddannelse.

BEMÆRK: I nogle cilia mutanter, er lokalisering af polaritet proteiner afbrudt. Disse omfatter Vangl2 og Gαi3, som har vist sig at blive forstyrret i Ift20, Bbs8 og Bbs6 mutant cochlea.

BEMÆRK: Yderligere eksempler på, hvordan man kan kvantificere og display hår celle Polarity kan findes i de følgende artikler. Curtin et al. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature 7, Wang et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology 24, maj-Simera et al. (2012) Methods in Molecular Biology 25, Yin et al (2012) PLoS ONE 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cochlea Dissektion og Tissue Forberedelse

Efter fjernelse af hjernen, post midterlinie sagittal dissektion af en P0 Mouse hoved, den benede labyrint, set bagfra, kan visualiseres (figur 1A, hvid pil) og fjernes. Figur 1B viser de isolerede benede labyrinter med cochlear hår vender opad, ventrale, (til venstre) og bagfra, dorsal (til højre). De hvide pil peger på det ovale vindue, hvorfra man kan begynde at fjerne den ydre brusk. Når den ydre brusk er blevet fuldstændigt fjernet, den udsatte cochlear kanalen, stadig intakt, kan observeres (figur 1C). Positionering af en stift gennem den vestibulære region til at hjælpe dissektion er vist. To stifter, tilføjet i forskellige vinkler kan også anvendes til at forankre vævet. Figur 1D viser ductus cochlearis efter fjernelse af Reissner '; S membranen og tectorial (venstre) og det isolerede cochlear epitel spiral når den er blevet isoleret fra det vestibulære region som forberedelse til montering for immunhistokemi (højre). At give en generel idé om, hvad den udsatte cochlear hår ligner, en intakt SEM præparat er vist i figur 1E.

Morfologi og Immunofluorescens i Kontrol Cochlea

Efter fremstilling af den cochleære væv, er den dorsale overflade af ductus cochlearis indeholdende cortiske organ eksponerede og kan blevet set via SEM eller immunfluorescensfarvning. Ses som en hel-mount tilberedning kan de fire rækker af mechanosensory hårceller (én række af indre hårceller og tre rækker af ydre hårceller) skelnes. Figur 2A viser en lav forstørrelse visning af basale vinding fra et embryonisk mus cochlea , tilberedt feller SEM. Bemærk den ensartede orientering og tilpasning af actin-baserede bundter stereociliary. Derudover morfologien af ​​stereociliary bundter er konsistent, hvert bundt har den klassiske ")" (på indre hårceller) eller "W" (på ydre hårceller) form. Ved nærmere forstørrelse i denne alder yderligere mikrovilli kan ses ikke kun på den apikale overflade af hårcellerne, men også i-mellem hårcellerne på den understøttende celler (figur 2B). Disse vil aftage efterlader kun tre rækker af stereociliary bundter på de ydre hårceller og to på de indre hårceller i voksne. Som det kan ses i figur 2C (hvid pil), er en enkelt mikrotubulus-baserede kinocilium (en sand primær cilium) placeret ved siden af højeste række af stereocilia ved toppunktet af hver stereociliary bundt. Disse er fastgjort til bundt via kinocilia links.

Fluorescerende mærkning med phalloidin, der labels actin, fremhæver den ensartede orientering og form af bundterne i kontrol væv (figur 2D). Cortical actin er også mærket, som er nyttig til at bestemme den apikale omkredsen af ​​hver enkelt hår celle. Co-mærkning med phalloidin og et antistof mod Myosin 7a (figur 2E), et hår celle markør, hjælper også til at skelne mellem hårceller og støtteceller. Myosin 7a er også en nyttig markør til måling cochlear kanal forlængelse (se figur 3A). Et antistof mod acetyleret α-tubulin er almindeligt anvendt til at identificere mikrotubulus-baserede kinocilium (figur 2F). Som støtteceller også huser primære cilier, er det vigtigt at skelne mellem cilia udgår fra hårceller vs. interkalerende støtteceller. En yderligere membran markør, såsom antistoffer mod ZO-1 (Zona occludens 1), som klart skitserer mosaik mønsterdannelse af den apikale membran af ductus cochlearis, er derfor nyttige (<strong> Figur 2F). Af yderligere overvejelse er, at antistoffer mod acetyleret-α-tubulin også mærke interne mikrotubuli og så pleje bør tages, når billeddannelse til at fokusere på håret celle apikale overflade. De mikrotubuli i cellerne søjlerne er særligt tætte (figur 2G, hvid stjerne). En kombination af phalloidin og anti-acetyleret-α-tubulin mærkning anvendes ofte til samtidigt at identificere stereociliary bundter og tilstødende kinocilia (figur 2G, hvid pil).

Cochlear Fænotype i Cilia Mutanter

Forlængelse af cochlear kanalen er en af ​​de bedste læste outs af konvergenskriterierne og udvidelse defekter, og forkortede cochlear kanaler er almindeligt observeret i klassiske PCP mutanter. Cochlea i ciliære mutanter ofte har forkortet cochlear kanaler og viser en markant udvidelse af den sensoriske epithelia ved toppunktet, som det kan ses i Ift20 CKO / CKO mus (figur 3A). En anden klassisk PCP defekt er forstyrrelser i den ensartede orientering af cochleare hårceller, som det kan ses i Bbs8 - / - mus både med immunhistokemi (figur 3B, højre pil) og med SEM (figur 3C). Ud over mis-orienterede bundter, fladtrykt og misdannede bundter er også almindeligt observeret (figur 3B, midterste pil, figur 3D). Ofte gange cirkulære bundter, som det kan ses i figur 3E, er til stede, især i hårceller helt blottet for kinocilia. Mis-lokalisering af kinocilium er også almindeligt.

Den mis-lokaliserede kinocilium kan eller ikke kan være fastgjort til stereociliary bundt (figur 3B, venstre pil, figur 3F). Eksempler på, hvordan at kvantificere bundle orientering og kinocilia eller bundt placering er vist i figur 3G og 3H. Orienteringen af ​​hver enkelt bundt kan derefter vurderes ved at bestemme rotation af af bundtet i forhold til en linje strækker sig vinkelret på rækken af ​​celler søjle, der adskiller den indre og ydre hårceller. Celler med en normal orientering er rettet ind langs denne vinkelrette akse og så har en rotation på 0 ° (Fig 3G). Placeringen af kinocilium, eller midt på stereociliary bundle, kan plottes ved overlejring en positionel gitter på luminale overflade af hårcellerne og derefter bestemme placeringen af kinocilia eller bundt inden nettet (Figur 3I). Mutationer i cilia gener påvirker ofte cilia længde, og så længden af ​​kinocilium kan vurderes. I Cep290 rd16 / rd16 mutanter, kinocilia er længere end i kontrolgruppen (figur 3J). Som cilium trækker,er det vigtigt at have alder matchede kuldsøskende og tage målinger fra samme region af cochlea. At få gode billeder til analyse og kvantificering for såvel immunhistokemi og SEM, er det afgørende at fjerne tectorial. Figur 3F viser et SEM mikrografi, hvor tectorial ikke er blevet fuldstændigt fjernet.

Figur 1
Figur 1. Dissektion af en Udvikling Mouse Cochlea (P0). (A) Mid-line sagittal dissektion af P0 mus hoved med hjerne fjernet. De hvide pilen peger på positionen af ​​den benede labyrint. (B) ventrale (til venstre) og dorsal (højre) synspunkter dissekerede knoklet labyrinter. Cochlea er placeret mod toppen med det vestibulære del på de nederste hvide pilen peger på det ovale vindue. (C) Den knoklet labyrint agtersteER fjernelse af den ydre brusk af cochlea. En tap er blevet placeret gennem det vestibulære system. (D) Venstre, samme billede som i C efter fjernelse af Reissner membran og tectorial. Højre, isoleret cochlear kanalen klar til montering. (E) Scannings-elektronmikroskopiske optagelser af en intakt, eksponeret cochlear spiral udsætter gulvet i ductus cochlearis, herunder sensoriske epithel. Scale bar er 100 pm. . (A - D) tilpasset fra maj-Simera et al, 2012 25 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Morfologi og Immunofluorescens i kontrol Cochlea (A - C). Scanningselektronmikrografer af den basale turn i embryonale (E18.5) vildtype cochleae. Én række af indre hårceller (nederst) og tre rækker af ydre hårceller (øverst) adskilles, og indskudt af støtteceller. Vinkelformede stereociliary bundter ensartet orientere hen imod den laterale kant af hver hår celle (øvre kant af billedet). På E18.5 yderligere mikrovilli dække apikale overflader af hårceller, hvilket er under stereociliary bundter og indskudte støtteceller (B). (C) En enkelt mikrotubulus-baserede kinocilium (hvid pil), er placeret ved toppunktet af bundtet, her vist fra den laterale kant. (D - G) immunfluorescensfarvning af basale vinding postnatal dag 1 (P1) vildtype cochleae. Phalloidin etiketter filamentøst actin i stereocilia og cortical actin på cellen periferi (D, E, G). Myosin 7a er en markør for indre og ydre hårceller (E). Zo_1 etiketter de tætte forbindelser i-mellem celler, gør det en stor markør til at skelne celle boundaRies (F). Acetyleret α-tubulin anvendes som markør for kinocilium ved toppunktet af bundtet (F, G hvid pil). Interne mikrotubuli er også mærket med acetyleret α-tubulin, som er særlig rigelige i celler søjle (G hvid stjerne). Skala barer A: 10 pm, B: 5 um, C: 1 um, DG:. 5 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Cochlear fænotype i fimrehår Mutanter. (A) Markant afkortning af Ift20 CKO / CKO cochleære kanaler sammenlignet med kontrol. Dissekeret cochlear kanaler på E18.5 farvet med acetyleret tubulin. (B Bbs8 - / - mutant (P0). Phalloidin-mærket filamentøs actin, stereocilia (rød), acetyleret tubulin, kinocilia (grøn). Stereociliary bundter i Bbs8 - / - cochleae er trinløst drejes (højre pil), fladtrykt og / eller mislocalized (midterste pil). Kinocilia er mislocalized eller axonemes mangler (venstre pil). (C - F) Højere forstørrelse SEM af stereociliary bundter og kinocilia i Bbs8 - / - OHCs. I C, roteret bundter i D, fladtrykt bundt, i E, cirkulære bundter og F mislocalized kinocilia. (G - I) Skematisk fremstilling af bundtet abnormitet kvantificering. (G) Venstre, bundle konveksitet (højde); den korteste afstand mellem toppunktet af bundtet og den linje, der strækker sig gennem begge ender af en pakke "våben". Som depicted af den faste sort linje. Right, areal under bundt; området. (H) skematiske repræsentationer af de kriterier, der anvendes til at kvantificere orientering stereociliary bundter. Drejningsvinklen af ​​bundtet er beregnet i forhold til en linie strækker sig vinkelret på rækken af ​​celler søjle. (I) Skematisk fremstilling af kriterierne for positionelle analyse af kinocilia og stereociliary bundter. En segmenteret gitter lægges over omkredsen af ​​håret celle og positionen noteret. (J) Højere forstørrelse billede af phalloidin-mærket stereocilia bundter (rød) og acetylerede tubulin-mærkede kinocilia (grøn) af ydre hårceller i P0 cochlea. I det tilstødende monokromatisk panel, røde linjer identificere kinocilia, som er længere Cep29 rd16 / rd16 mutanter i forhold til kontrol (hvide pile). (K) SEM mikrograf af embryonale cochlea med ufuldstændig fjernelse af tectorial. Scalebars A: 100 um, B: 5 um, C - F: 2.5 um, I: 5 um, J: 50 um. (A - F)... Modificeret fra maj-Simera et al, 2015 8, J Genoptryk med tilladelse fra Rachel et al, 2012 27 Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved udarbejdelsen cochlear væv til analyse, er der et par vigtige punkter at huske på. For det første kan forskelle i genetisk baggrund ændre cochlear fænotype, hvilket gør det nødvendigt at analysere og sammenligne kun kuld kontroller. For det andet er fuldstændig fjernelse af tectorial kræves for at opnå de bedste billeder med immunhistokemi og er afgørende for SEM. Den tectorial er en uigennemsigtig struktur og kan tilsløre cellerne i sensoriske epithel direkte under den, hvilket gør billeddannelse mere udfordrende. Lejlighedsvis under behandlingen, kan tectorial skrumpe tilbage, afdække hårcellerne. Selv i disse tilfælde fjernelse anbefales kraftigt. Dette trin kræver tålmodighed og praksis. For det tredje kan immunhistokemi ved anvendelse af antistoffer mod ciliære proteiner, især dem, der lokaliserer til den meget komprimerede basale legeme, være udfordrende og kræver optimering. Overvej at udføre antigen hentning, intensivere permeabilization trin, eller reducere koncentrationen eller tidspunktet for fiksering. Endelig, når billeddannelse af kinocilium (den primære cilium fundet på cochlear hårceller) huske på, at det begynder at trække fra P0 - P1 fremefter i en base-til-spids gradient. Derfor, når måle længden af ​​den kinocilium er det vigtigt at sammenligne hårceller fra den samme region i cochlea og i aldersmatchede dyr. De indskudte support celler har også primære cilier, som ikke trække. Der skal udvises forsigtighed for at skelne mellem støtte celle cilier og hår celle kinocilia.

Som mus modnes, bliver det stadig vanskeligere at rent isolere cochlear sensoriske epithel, på grund af forkalkning af de tidsmæssige knogler og benede labyrinter. Afkalkning af vævet er påkrævet, hvilket ikke altid er foreneligt med yderligere immunlokalisering teknikker, men giver mulighed for undersøgelse af brutto fænotype og er også kompatibel med SEM præparat. Indavlede mus strains ofte udviser auditive defekter såsom hårcelletab eller forhøjede auditive hjernestamme respons (ABRS), skyldes mutationer i kendte auditive gener eller modifier gener. Derfor er det vigtigt at sammenligne alder matchede kuld kontroller eller avle på en alternativ genetisk baggrund.

En af begrænsningerne af denne analyse er, at mus, den kinocilium begynder at trække indlæg fødsel og er ikke længere til stede på voksne hårceller. Af denne grund kinocilia målinger kan kun ske ved udviklingen væv. Også det er nødvendigt omhyggeligt at vælge aldersmatchede kontroller for sammenligninger mellem mutant og kontrolprøver. En anden begrænsning er, at ciliære mutant mus analyseret hidtil ikke vist alvorlig auditiv dysfunktion (dvs.., Auditive hjernestamme respons, ABR'er eller otoakustiske emission, OAEs), selv når cochlear udvikling er svækket. I overensstemmelse med dette, høre defekter er ikke en almindelig menneskelig ciliopathy fænotype. Undtagelsesvis tab af hearing er en af de primære træk ved Alström syndrom, forårsaget af mutationer i de basale kropsprotein ALMS1 28,29. Dette antyder, at stereociliary bundle morfologi ikke nødvendigvis er forbundet med auditiv dysfunktion i cilia mutanter, sandsynligvis på grund af korrigerende omlægning af bundter senere udvikling som er blevet rapporteret for Vangl2 CKO mutanter 30. Hvis ciliopathy spektrum udvides til også at omfatte Usher syndrom, den mest almindelige medfødte årsag til døvblindhed, så auditiv dysfunktion bliver yderst relevant. Nyere data har vist, at adskillige proteiner relateret til Ushers syndrom også lokalisere til den cilium og er involveret i ciliære-relaterede processer 31, men om disse proteiner vedrører PCP signalering er endnu ikke blevet undersøgt.

Indtil nu er de fleste ciliaere mus mutanter analyseret for cochlear PCP fejl kun blevet vagt undersøgt. De i dette håndskrift teknikker gør det muligt for en omfattende detaljering afcochlear fænotype, som uden tvivl vil føre til en mere præcis forståelse af ciliaere involvering i oprettelse hvirveldyr PCP signalering. Trods det store antal ciliopathy musemodeller rådighed, har overraskende få analyseret i form af cochlear PCP defekter. En fælles faldgrube er forbundet med disse modeller er embryonale dødelighed. Men da den udviklende cochlea kan undersøges embryonically rolle cilier i PCP i udviklingslandene øre kan stadig undersøges. Desuden kan meget tidlige embryonale dødelighed omgås ved hjælp af betingede knockouts. Foxg1 Cre 32 mus, tilgængelig fra JacksonLaboratories, er almindeligt anvendt til inactivategenes af interesse i thedeveloping indre øre fra E8.To dato har indsatsen primært fokuseret på at undersøge sygdomsfremkaldende ciliopathy gener men udforskning af andre cilia relaterede proteiner og hvordan disse påvirker PCP signalering under udvikling kan give større indsigt i cilIA biologi og funktion.

Hvis en auditiv fænotype er mistanke i musemodeller, der analyseres, eventuelle yderligere analyser omfatter audiometriske test af ABR'er 33 eller OAEs 34. Cochlear eksplantat extension assays (som beskrevet i May-Simera et al. 2012 25), kan også udføres og giver mulighed for identifikation af konvergerende extension defekter på tidligere udviklingsmæssige tidspunkter. Dyrkning af cochlea eksplantater giver også mulighed for behandling med forskellige signalering aktivatorer eller inhibitorer, der kan ændre eksplantation udvidelse og dermed bidrage til mekanistisk forståelse af de udviklingsmæssige processer. Skønt det er kendt, at kinocilium tilbagetrækkes efter fødslen 11,13,14, dette tilbagetrækning er ikke blevet grundigt behandlet i forbindelse med ciliære mutanter. Det ville være interessant at tage tid-specifikke målinger af kinocilia fremkomsten og tilbagetrækning i cilier mutants.Considering at en primær rolle for ciliær proproteiner er transport af gods ad mikrotubuli, det er meget sandsynligt, at disse proteiner også kan regulere aspekter af intracellulær handel langs cytoskelettet 35-37. En undergruppe af cilia proteiner er blevet vist at påvirke handel og asymmetrisk lokalisering af PCP molekyler 8. Lokalisering ved immunhistokemi af PCP molekyler, især membran-associerede proteiner såsom Vangl2, Frz3 og Dsh, anbefales derfor at fastslå, om PCP molekyler mislocalized. Etablering af polaritet synes at være en mangefacetteret affære, og der er stadig flere beviser for et ekstra celle autonom vej, som også er nødvendig for korrekt PCP i sensoriske hårceller 38. En nylig artikel viste, at G-protein-afhængig signalering styrer migrationen af cilium i en celle-uafhængig måde 39. I overensstemmelse med en rolle for ciliære proteiner i lokaliseringen af ​​polaritet molekyler, heterotrimere G-protein alfa-i-underenheden 3 (Gαi3) localization afbrydes i Bbs8 og Bbs6 knockout cochlea 8,39.

Skelne rolle individuelle ciliære komponenter og deres forskellige virkninger på PCP signalering vil give os større indsigt i den rolle, cilium etablere korrekt polaritet. Af særlig betydning er at skelne mellem ciliære proteiner fungerer i et ciliære kontekst, vs ikke-ciliære funktioner af traditionelt anses ciliære proteiner, såsom deres rolle i reguleringen af ​​ikke-ciliære relateret intracellulær handel. Den høje grad af regelmæssighed i mange aspekter af cochlear struktur, herunder cellulær mønsterdannelse og stereociliary bundt orientering, gør det muligt at detektere små ændringer i udviklingen af ​​PCP som reaktion på enten genetiske eller molekylære forstyrrelser i cilia relaterede proteiner. I betragtning af at der er mange ciliaere musemodeller til rådighed, og at udvikle mus cochlea er et af de bedste steder at undersøge PCPsignalering, er det af stor interesse at lære, i hvilket omfang individuelle protein mutationer forstyrre cochlea udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatteren vil gerne takke Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer og Zoe Mann og for deres kritiske evaluering af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) og Johannes-Gutenberg Universitet, Mainz, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Silicone elastomere - Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028-5EA See Note 2
Micro dissecting scissors-straight blade Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps Various
Dissecting microscope. Various
Uncoated glass microscope slides Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) Various
Transfer pipettes Various
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-10
SEM sample holder tousimis 8762
Scanning electron microscopy studs TED PELLA 16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive TED PELLA 16084-3
Fluorescent Microscope Various
Critical Point Dryer Various
Scanning Electron Microscope Various
Glass microscope slides Various
Glass coverslips Various
Kimwipe Tissue  Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS) Gibco/Life Technologies 10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1 Sigma-Aldrich G5882
Tris-HCl (pH 7.5) Various
NaCl Various
CaCl 2 Various
Triton X-100 Various
Normal Goat Serum Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-007-003
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Technologies 14065
Hepes Gibco/Life Technologies 15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 ) Sigma-Aldrich/Fluka Analytical 75632
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Ethanol 200 proof Various
Antibodies
anti Arl13b Protein Tech 17711-1-AP Suggested concentration 1:1,000
anti acetylated tubulin (611-B1) Sigma-Aldrich T6793 Suggested concentration 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88) Sigma-Aldrich T6557 Suggested concentration 1:200
anti Zo_1  Invitrogen 40-2300 Suggested concentration 1:500
Myosin VI Proteus Biosciences 25-6791 Suggested concentration 1:1000
Myosin VIIa Proteus Biosciences 25-6790 Suggested concentration 1:1,000
anti Vangl2 Merk Millipore ABN373 Suggested concentration 1:250
anti Gαi3 Sigma-Aldrich G4040 Suggested concentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:300 - 1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7 (2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378 (2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7 (2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839 (2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988 (2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925 (2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B (2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C (2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

Tags

Medicin Primary Cilia kinocilium Planar Cell polaritet cochlea Mouse Hår Cells stereocilia Wnt signalering
Evaluering af Planar-Cell-polaritet fænotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

May-Simera, H. Evaluation of… More

May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. J. Vis. Exp. (108), e53559, doi:10.3791/53559 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter