Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

Published: February 21, 2016 doi: 10.3791/53559
Automatic Translation
1
1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Introduction

Primaire cilia lange microtubule-gebaseerde aanhangsels die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van de meeste zoogdierlijke cellen. Primaire cilia worden vaak verward met beweeglijke cilia, waarvan er altijd meerdere per cel, en waarvan het doel is om de vloeistof over membraanoppervlakken bewegen. Primaire cilia daarentegen vast sensorische rollen en derhalve ook wel sensorische cilia. Eenmaal lang vergeten, dit organel is onlangs herontdekt als gevolg van de associatie met een veelheid van menselijke genetische ziekten 1. Idealiter gepositioneerd als een signalerende organel, heeft de primaire cilium aangetoond talrijke signaalwegen, waarvan vele niet alleen belangrijk in weefsel homeostase en ziekte, maar ook tijdens de ontwikkeling 2 reguleren.

Een van de eerste signaalwegen aangetoond geassocieerd te zijn met cilia disfunctie de Wnt signaling pathway, ook bekend als het vlakke celpolariteit (PCP) pathway > 3. Dit signaalcascade aanvankelijk geïdentificeerd in Drosophila, is van cruciaal belang voor embryogenese; met name convergentie en extensie processen en de juiste oriëntatie van cellen in het vlak van epitheel 4. De sequentiële signalering van een kern set van regulerende eiwitten vertaalt directionele signalen die uiteindelijk leiden tot het cytoskelet herschikkingen en resulteren in de gecoördineerde polarisatie van epitheelcellen in een vlak 5. Het proces van convergentie en uitbreiding is absoluut noodzakelijk voor het cochleair kanaal te verlengen en voor de juiste cellulaire patroonvorming 6. Aangezien dit gereguleerd via activatie van de PCP route, een van de meest opvallende fenotypen van mutanten cochlea PCP is een verkorte cochleair kanaal met ongeorganiseerd sensorische epithelia 7. Evenzo muismutanten die cilia missen, vertonen ook zo'n convergentie en extensie fenotype 8,9, maar precies hoe dit gereguleerd moet nog worden opgehelderd.

ve_content "> Omdat convergentie en extensie processen zijn van cruciaal belang voor de uitgroei van het cochleair kanaal, en cellulaire patroonvorming van de sensorische epitheel binnen het cochleair kanaal, de ontwikkelingslanden cochlea is een ideaal orgaan waarin PCP signalering te onderzoeken tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren. Het orgel van corti, de term voor de gespecialiseerde sensorische epitheel dat lijnen de cochleaire kanaal, bestaat uit niet-sensorische steuncellen en mechanosensorische haarcellen die uniform moeten worden georiënteerd om de cochlea functioneren 10. de mechanosensorische haarcellen worden zo genoemd omdat de stereociliary bundels die zich uitstrekken van de cuticulaire plaat (apicale oppervlak) van elk zintuighaarcellen cel 11. Deze fungeren als primaire omzetters van mechanosensation en ondanks hun nomenclatuur stereocilia, zijn eigenlijk samengesteld uit gemodificeerde actine-filament op basis van microvilli. Binnen elke chevron-vormige hair bundel, drie rijen stereocilia georganiseerd in een sterk geordende en regelmatige pattern in een trap-achtige manier. Real-microtubule gebaseerde trilharen, kinocilia genoemd, zijn vereist voor de ontwikkeling en oriëntatie van de stereociliary bundels 12. Bij elke haar cel, wordt één kinocilium fysiek verbonden aan de stereocilia bundel, centraal gelegen naast de langste rij stereocilia. De precieze functie van de kinocilium is onduidelijk, en een hypothese is dat de kinocilium 'trekt' de stereocilia in vorm als ze volwassen worden van microvilli 12. In vertebraten, kinocilia in de cochlea alleen aanwezig tijdelijk en intrekken van de haarcellen in muizen voorafgaand aan het begin van het gehoor 11,13,14.

Volledig verlies van trilharen in de ontwikkeling van cochlea resulteert in sterk verkorte cochleaire kanalen, verkeerd gevormde of scheef georiënteerde stereociliary bundels, evenals verkeerd gepositioneerd basaalkorrels 8,9. Een functioneel cilium is niet alleen bestaat uit het ciliaire axoneme. Veel eiwitten geassocieerd met ciliafunctie komen in complexen gelokaliseerd op cilia-gerelateerde subdomeinen, zoals de basale lichaam, overgangszone, of ciliaire axoneme 15. De basale instantie, gebaseerd op de moeder centriole van het centrosoom, is een microtubulus organiserende centrum voor microtubules weg van de cilium uitstrekt in het cellichaam en kan intracellulair transport en ciliaire handel reguleren. De ciliaire overgangszone is een ander gebied waar de ciliaire functie is geregeld op het gebied van het organiseren van import en export van trilharen verbindingen 16.

Meerdere studies hebben een verband tussen cilia en niet-canonieke Wnt (PCP signalering) geïdentificeerd, hoewel het precieze mechanisme is onduidelijk 17. Redundantie van ciliaire en PCP genen en de gevoeligheid van de cel polariteit van algemene cellulaire abnormaliteiten, maken het moeilijk om direct een mutatie koppelen aan PCP-specifieke tekorten. Een van de uitlezingen van PCP signalering is de positionering van de basale lichaamstemperatuur en primary cilium, dus scheiden de primaire uit de secundaire gebreken is uitdagend. Sommige studies in zebravis en muis mutanten hebben geen verband tussen de trilharen en Wnt signalering 18-20 voorgesteld. Discrepanties in de gegevens kunnen species, weefsel of tijdelijke-afhankelijke verschillen in ciliaire bijdragen aan Wnt-signalering weerspiegelen. Bovendien zou normaal Wnt reactievermogen blijven, indien basale lichamen blijven functioneren. Een beter inzicht in de rol van ciliaire eiwitten in cellulaire signaalroutes en andere biologische verschijnselen is cruciaal voor ons begrip van cellulaire en ontwikkelingsbiologie en voor de ontwikkeling van gerichte behandelingsstrategieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Gebruik en euthanaseren alle dieren in overeenstemming met de institutionele en bestuurlijke richtlijnen en voorschriften, meestal via CO 2 inademing en cervicale dislocatie.

1. Bereiding van reagentia

NB: Voorafgaand aan het begin, voor te bereiden alle reagentia met behulp van analytische chemicaliën. Maak oplossingen met behulp van moleculair-biologische kwaliteit gedestilleerd en gedemineraliseerd water, tenzij anders aangegeven.

  1. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS): Voeg 1 L 1X PBS door het oplossen van 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2PO 4 in 1 liter H2O Breng de pH op 7,4 met HCl. PBS hoeft niet steriel te zijn en kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Merk op dat deze buffer zonder CaCl2 of MgCl2.
  2. Paraformaldehyde (4% PFA): Bereid een 4% oplossing van PFA in 1x PBS in een geventileerde zuurkast. 40 g paraformaldehyde poeder toe te voegen aan 1 liter 1x PBS. Op te lossen, roer en verhit tot ongeveer 60 ° C,en voeg langzaam NaOH druppelsgewijs aan de pH te verhogen. Zodra het poeder is opgelost, stel de pH op 7,4 met HCl. Filtreer door een 0,45 pm filter en vries porties. Ontdooi een verse portie voor elk experiment.
  3. Triton buffer: Bereid een 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 oplossing door het oplossen van 8,77 g NaCl in 1 liter 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Voeg 1 ml Triton X-100. Roer om op te lossen. WINKEL Triton buffer bij kamertemperatuur.
  4. Triton blok: Bereid 10% geit serum in Triton-buffer door het toevoegen van 1 ml van de geit serum tot 9 ml van Triton buffer. Bewaren bij 4 ° C. Bij gebruik van primaire antilichamen opgewekt in muizen, voeg geit anti-muis IgG Fab fragmenten bij een verdunning van 1 in 200 tot de Triton blok voor de blokkeringsstap.
    OPMERKING: Indien plan om monsters voor scanning elektronenmicroscopie (SEM) gebruikt, aanvullende reagentia bereid zoals hieronder vermeld.
  5. Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) met calcium en magnesium: Maak een 1x oplossing van HBSS door verdunning van een voorraad oplossingin steriel gedestilleerd H2O Zoals HBSS buffer is ingewikkeld te maken en er zijn risico's, is het raadzaam om een ​​premade 10x voorraad-oplossing te bestellen. De eindconcentratie van HBBS buffer routinematig gebruikt is de volgende: 1,26 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2 -6H2O, 0,41 mM MgSO 4 -7H2O, 5,33 mM KCI, 0,44 mM KH 2PO 4, 4,17 mM NaHCO 3, 137,93 mM NaCl , 0,34 mM Na 2 HPO 4, 5,56 mM dextrose.
  6. Hepes buffer: Bereid een 0,1 M Hepes oplossing in 1x HBSS, door het oplossen van 23,8 g HEPES in 1 L 1x HBSS buffer.
  7. Scanning elektronenmicroscopie fixeermiddel (SEM Fix): Bereid fixatief SEM door verdunnen elektronenmicroscopie rang glutaaraldehyde (2,5%) en paraformaldehyde (4%) in Hepes buffer. Voeg CaCl2 tot een eindconcentratie van 10 mM.
  8. 1% osmiumtetroxide (OsO 4) in Hepes buffer; 1% osmiumtetroxide in water: Verdun een voorraadoplossing van osmiumtetroxide in Hepes buffer, en separately in steriel gedestilleerd H 2 O, tot een eindconcentratie van 1%. Osmiumtetroxide is zeer toxisch en wordt meestal verkocht als een 4% oplossing.
  9. 1% (w / v) Looizuur: Los 0,5 g looizuur in 50 ml steriel gedistilleerd H 2 O. Filter steriliseer filtreren door een 0,45 poriegrootte filter.
  10. Graded ethanoloplossing serie: Verdun 200 proof ethanol met steriel gedestilleerd H 2 O tot 30, 50, 70, 90 en 95% ethanoloplossingen maken. Voor het laatste ethanol spoelingen, wordt 100% ethanol 200 bewijsstukken. Gebruik een vers geopende fles van 200 proof ethanol voor de finale spoelingen.

2. Keuze van de Tissue

  1. In het ideale geval te onderzoeken embryo's of jonge honden in de leeftijd tussen embryonale dag 16,5 (E16.5) en postnatale dag 3 (P3).
    LET OP: verbening van de benige labyrint en temporele botten maakt dissectie steeds meer uitdagend als muizen rijpen. Ook kinocilia, de enige echte microtubule-gebaseerde cilium vinden op cochleaire haarcellen,trekt tijdens de ontwikkeling en is niet meer in volwassen muizen.
  2. Na fixatie, ontkalken volwassen cochleae. Place ontleed (zie paragraaf 3) benige labyrinten, in 2 ml EDTA (4,13% in PBS), pH 7,3, in een microcentrifugebuis voor 3-4 dagen met rotatie. Vul EDTA dagelijks. Nadat de weefsels zacht spoelen in 1,5 ml PBS of 3 keer gedurende 5 minuten op een nutator met verhoogde roeren.

3. Cochlea Dissection

  1. Bericht euthanization via cervicale dislocatie of CO 2 inhalatie (100% CO 2) en verwijder de kop. Gebruik een scalpel of schaartje, afhankelijk van de grootte van het dier de kop ontleden langs de sagittale middellijn vanaf de neus en caudaal uitstrekken. Verwijder de hersenen uit elke helft van de schedel met een pincet. Identificeer de temporele botten, waardoor de ontwikkeling van benige labyrinten van het binnenoor bevatten (zie pijl in figuur 1A).
  2. Gebruik een paar voorCEPS aan de benige labyrinten van de schedel (temporale botten) zorgvuldig te isoleren. Doe dit onder een dissectie microscoop. Prise weg het botweefsel van de schedel door het uitvoeren van de tang voorzichtig onder het benige labyrinten. In dieren tot P4 de benige labyrint nog kraakbeen en kan gemakkelijk worden verwijderd zonder te breken.
  3. Na dissectie, met de punt van het ontleden tang om de ovaal en rond leeg te maken en een gaatje in de apex van de cochleaire spiraal. Bevestig de benige labyrint voordat verdere dissectie van het cochleair kanaal. Om te zorgen voor een gemakkelijke verwijdering van de tectorial membraan (zie 3.7), bevestig de benige labyrinten in 1,5 ml 4% PFA gedurende 5 minuten op ijs.
    LET OP: Als het verwijderen van de tectorial membraan niet nodig is, wordt langer fixatie geadviseerd (zie 4,1-4,3). Korte fixatie van de rotsbeenderen vóór dissectie van de cochleaire kanaal helpt het proces dissectie en verwijdering van de tectoriaal membraan. Bericht dissectie en blootstelling van het orgaan van Corti, furthaar bevestiging vereist.
  4. Verdere ontleden de benige labyrint om naar het cochleair sensorische epitheel bloot als volgt. Plaats de benige labyrinten in een zwart siliconen-elastomeer gecoate ontleden schotel met PBS tot dissectie te vergemakkelijken. Gebruik minutien pinnen om het weefsel te immobiliseren indien nodig. Om minutien pinnen te gebruiken, plaatst u deze door middel van het evenwichtsorgaan deel van de benige labyrint met het ventrale aspect van de cochleaire spiraal naar boven.
    LET OP: Black silicone elastomeer gerecht: Meng siliconen elastomeer basiscomponent met poederkool tot een ondoorzichtige zwarte kleur te verkrijgen. Voeg het hardingsmiddel en giet het in een of meer petrischalen (glas of plastic). Droog onder vacuüm om ingesloten luchtbelletjes te verwijderen. Opgedroogde vaat volledig vóór gebruik.
  5. Gebruik fijne pincet (# 5) aan de buitenste kraakbeen waardoor de cochleaire put genomen. Begin bij het ovale venster; Steek de onderste uiteinde van de tang in het ovale venster en voorzichtig wrikken openen het kraakbeen, langzaam omhoog naar detop.
  6. Na blootstelling van het cochleair kanaal, verwijder het ventrale oppervlak van de Reissner membraan. Met een fijne tang de Reissner membraan knijpen aan de basis van de cochleaire kanaal en afschilferen boven te bewegen. Visualiseren het dorsale aspect van de cochleaire kanaal, inclusief de sensorische epitheel.
  7. Verwijder de tectoriale membraan zoals hieronder beschreven (optioneel). Voor SEM of immunohistochemie van de kinocilium of stereociliary bundels verwijder de tectorial membraan.
  8. Gebruik een zeer fijne pincet (# 55 of fijner) aan de tectoriaal membraan knijpen aan de basis van het slakkenhuis en schil omhoog naar de top.
    OPMERKING: Het tectoriaal membraan optisch helder is, waardoor het moeilijk te identificeren. Vaak is het membraan loskomt uit een stuk en hoewel het niet gemakkelijk gevisualiseerd, kan men de weerstand voelen als wordt afgetrokken van de blootgestelde orgaan van Corti.
  9. Na blootstellen van het orgaan van Corti, het weefsel d verder oplossenHieronder escribed. Bewaar het vestibulaire regio verdere bereiding van het weefsel bevorderen.

4. fixatie

  1. Regelmatige immunohistochemie bevestig de benige ontleed labyrinten in 1,5 ml 4% PFA bij 4 ° C op een nutator voor 2 uur.
    Opmerking: Door de gevoeligheid van verschillende antilichamen en antigenen, variaties in de lengte en samenstelling van fixatie gewenst zijn en moeten worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam.
  2. Na fixatie was de monsters door spoelen in 1,5 ml PBS of 3 keer gedurende 5 minuten op een nutator met verhoogde roeren. De monsters kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C gedurende enkele weken vóór de verwerking.
  3. Als voorbereiding monsters voor SEM, fix ontleed rotsbeenderen in SEM fix (zie 1.7) gedurende 2 uur bij KT. Wassen spoelen in 1,5 ml of meer Hepes buffer 3 maal gedurende 5 minuten op een nutator met verhoogde roeren. Bewaren in Hepes-buffer bij 4 ° C tot verdere verwerking. Opslag langer dan een paar van de weeks wordt niet aanbevolen.

5. Immunohistochemie

  1. Voer immunohistochemie op ontleed monsters in een putje van een vlakke bodem 96 wells plaat. U kunt ook gebruik maken van een PCR of microcentrifugebuis. Het is raadzaam om het vestibulaire deel van de benige labyrint behouden om verwerking te vergemakkelijken.
  2. Permeabilize het weefsel door te incuberen in 1,5 ml Triton-buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een nutator onder zacht schudden.
  3. Blokkeer de weefsel door te incuberen in 0,5 ml Triton blok gedurende ten minste 1 uur bij KT. Bij gebruik van primaire antilichamen opgewekt in muizen, voeg anti-muis IgG Fab-fragmenten aan het blok bij een verdunning van 1 op 200 (zie paragraaf 1.4). Dit vermindert sterk niet-specifieke binding van anti-muis IgG aan muis weefsel.
  4. Incubeer het weefsel met primaire antilichamen verdund in Triton blok O / N bij 4 ° C onder zacht schudden. Antilichaam verdunning is afhankelijk van antilichamen worden gebruikt (zie paragraaf 6.1). Als alternatief broeden primaire antibodies gedurende 2 uur bij KT. Gebruik bij voorkeur een minimaal volume van 0,5 ml primaire antilichaam verdunning. Als antilichaam is beperkt, de kleinst volume antilichaam verdunning waarin het weefsel volledig omhult.
  5. Was het weefsel door spoelen in 1,5 ml Triton-buffer of meer, minstens 3 maal gedurende 15 minuten op een nutator met verhoogde roeren.
  6. Incubeer het weefsel met fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund tot de fabrikant aanbevolen concentratie (gewoonlijk 1: 200-1: 1000) in blok Triton gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een nutator. Gebruik een minimaal volume van 0,5 ml secundair antilichaam verdunning.
    1. Centrifugeer de verdunde secundaire antilichaam bij 13.000 xg gedurende 3 min vóór gebruik van niet-specifieke binding van secundair antilichaam aggregaten minimaliseren. Scherm de weefsel van licht van deze stap verder om te voorkomen dat fotobleken van de fluorescerende kleurstoffen.
  7. Zoals in stap 5,5, was het weefsel door spoelen in 1,5 ml Triton-buffer of meer, minstens 3 maal gedurende 15 min, op eennutator met verhoogde roeren. WINKEL monsters in PBS bij 4 ° C tot klaar voor montage.

6. Antibody Selection

LET OP: De bron van de aanbevolen antilichamen en hun verdunningen worden vermeld in de tabel van specifieke materialen en apparatuur. Voer antilichaam incubaties zoals beschreven in hoofdstuk 5.

  1. Het microtubule-gebaseerde kinocilium visualiseren, gebruikt een ciliaire axoneme merker zoals anti-Arl13b (1: 1000) of anti-geacetyleerd-α-tubuline (1: 800). Visualiseren basislichaamstemperatuur gebruikmaking van een antilichaam tegen γ-tubuline (1: 200) of andere centrosomal marker.
  2. De actine filament-rijke stereociliary bundels visualiseren, voeg phalloidin (1: 300 - 1000) geconjugeerd aan een van de verschillende fluoroforen aan het secundaire antilichaam incubatie. Phalloidin etiketten ook andere filamenteus actine structuren zoals de corticale actine filamenten rond de omtrek van elke epitheliale haarcellen. Dit is handig bij het bepalende omtrek van elke haar cel. Gebruik een ander membraan merker zoals anti-Zo-1 (1: 500) indien nodig.
  3. Label cochleaire haarcellen met behulp van antilichamen tegen myosine VI (1: 1000) of myosine VIIa (1: 1000). Deze kunnen worden gebruikt als de beoordeling cochlea lengte.

LET OP: Gebruik de juiste fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen geoptimaliseerd om de microscoop eisen.

7. Montage en Imaging

  1. Plaats het monster in een zwarte siliconen elastomeer schotel met PBS. Met behulp van fijne tang, verwijder het vestibulair regio uit de cochleaire spiraal.
  2. Heel voorzichtig verwijderen van de onderliggende kraakbeen en mesenchym uit het cochleaire spiraal. De resterende cochleaire spiraal bevat de binnenste sulcus, orgaan van Corti en buitenste sulcus.
  3. Breng de cochleaire spiraal in een druppel PBS geplaatst op een microscoopglaasje. Desgewenst scheiden de cochleaire spiraal in stukken gelijk aan een slag. Deze stap is evenwel niet nodig en kunnen leiden tot loss van het weefsel. De apicale oppervlak (stereocilia zijde) van de cochleaire haarcellen moet naar omhoog naar het dekglaasje.
  4. Wick weg de PBS met een adsorbens weefsel of een stuk filtreerpapier en voorzichtig de positie van de cochleaire spiraal als de epitheel is verschoven en overlappingen op zichzelf.
  5. Voeg een druppel van de montage media direct op de cochlea monster en voorzichtig plaats een dekglaasje op de top, de zorg om luchtbellen te voorkomen. Geen afstandhouders vereist; Plaats het dekglaasje direct op het monster. Een in water oplosbare, niet-fluorescerende, semi-permanente bevestiging medium dat extra stappen niet vereist dat het dekglaasje op hun plaats te houden wordt aanbevolen. Montage media en dekglaasje dikte moet worden afgestemd op de specificaties microscoop.
  6. Gebruik een epifluorescerende of laser-scanning confocale microscoop met hoge vergroting (63 - 100x), hoge numerieke apertuur (1,2-1,4) doelstellingen beelden van het apicale oppervlak van de cochleaire haarcellen vangen. gebruik lower doelstellingen (5 - 20X) overlappende beelden van de cochleaire spiraal om de lengte van het cochleair kanaal kwantificering. Match excitatie lasers en emissie filters om fluoroforen gebruikt voor secundaire antilichamen.

8. Scanning Electron Microscopy

  1. Ga verder met paragraaf 4.3. Na het wassen van SEM gefixeerde monsters in Hepes buffer, voert u de volgende stappen onder ventilatie. Het volgende protocol werkt goed voor cochlea weefsel en vermijdt het gebruik van sputter coating met een geleidend metaal.
  2. Post-fix in 1% OsO 4 in Hepes buffer gedurende 1 uur, gevolgd door 3 wassingen met 1 ml gedestilleerd water gedurende 5 minuten elk. De kleinste hoeveelheid OsO 4 dat het weefsel volledig omhult worden gebruikt voor giftig afval te minimaliseren. Nr roeren vereist.
  3. Incubeer monsters bij kamertemperatuur in elk van de volgende oplossingen 1 uur met 3 wassingen met 1 ml gedestilleerd water gedurende 5 minuten elk in tussen stappen: 1% tannine vers in water en filtreerd vóór gebruik; 1% OsO 4 in water, 1% tannine in water, 1% OsO 4 in water.
  4. Uitdrogen monsters door een ethanolreeks door incubatie gedurende 10 min in elk van de volgende verdunningen: 30, 50, 70, 90 en 95%. Nr roeren vereist.
  5. Doorvoermonsters via drie wijzigingen, 5 minuten elk, van 100% ethanol (uit een nieuw geopende fles 200 proof ethanol).
  6. Run de monsters hoewel een kritisch punt droger volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Monteer de monsters met behulp van geleidende koolstofkleefband bovenop een SEM stub voorafgaand aan beeldvorming op een elektronenmicroscoop. Onder een stereomicroscoop, gebruik maken van een paar fijne pincet en een penseel om voorzichtig te positioneren van het monster met het cochleair epitheel naar boven. Gebruik het vestibulaire deel van het monster "anker het weefsel aan de stub. WINKEL monsters in een exsiccator tot beeldvorming. Voeren SEM beeldvorming zoals beschreven in Jones (2012) 21.

9.kwantificatie

  1. Na immunohistochemie voorbereiding, het verwerven van beelden met behulp van een epifluorescerende of laser-scanning confocale microscoop. Na voorbereiding van SEM, gebruikt een scanning elektronenmicroscoop beeld specimens. Afbeelding het apicale oppervlak van het orgaan van Corti met de blootgestelde cochleaire haarcellen en steuncellen geïntercaleerd.
  2. specifieke posities definieert langs het cochleair kanaal, zoals 25, 50 en 75% van de basis en deze gebruiken om cochlea gebieden te vergelijken tussen mutant en controlemonsters. Analyseren en vergelijken cilia mutanten met hun nestgenoot controles, zoals verschillen in genetische achtergrond de cochleaire fenotype kunnen wijzigen.
    Opmerking: Het orgaan van Corti ontwikkelt in een gradiënt die zich uitstrekt vanaf het midden van basis naar zowel de top en de basis. In de muis ontwikkeling is pas voltooid P14, dus is het belangrijk om gebieden te vergelijken met vergelijkbare ontwikkelingsstadia en posities.
  3. Maak foto's met behulp van software die bij de microscoop dat allow kwantificering van de specifieke fenotype vereist (zie hieronder). Met beeldanalyse software zoals Image J of software die bij de microscoop om lengten te meten, tellen cellen en eiwit lokalisatie bepalen zoals hieronder beschreven. Grafiek deze gegevens als een staafdiagram, scatterplot, doos vlek of histogram, het vergelijken van mutant versus controle.
  4. Totale lengte van het cochleair kanaal (figuur 3A):
    1. Behulp van een haar cel merker of phalloidin (die de stereociliary bundels markeert) bepalen en te meten waar het sensorische epitheel begint en eindigt. De lengte van het cochleair kanaal wordt vaak afgekort in trilharen mutanten.
  5. Stereociliary bundel afwijkingen (figuur 3B, D, E, G):
    1. Meet bundel convexiteit (hoogte) als de kortste afstand tussen de top van de bundel en de lijn die zich uitstrekt door beide uiteinden van de bundel "armen", zoals getoond in figuur 3G, links. Als alternatief kwantificeren het gebiedomvat door de armen van de buitenste haarcellen stereociliary bundel zoals getoond in figuur 3G, rechts. Als haarcellen cirkelvormige stereociliary bundels kunnen worden geïdentificeerd tellen deze als een percentage van de totale haarcellen.
      LET OP: In veel trilharen mutanten kunnen bundel abnormaliteiten worden vastgesteld, ongeacht bundel oriëntatie. Het is moeilijk om nauwkeurig te kwantificeren stereociliary bundel afwijkingen.
  6. Oriëntatie van de stereociliary bundels (Figuur 3B, C, G):
    1. Beoordeel de oriëntatie van elke afzonderlijke bundel ten opzichte van een lijn loodrecht uitstrekt op de rij pilaar cellen die de binnenste en buitenste haarcellen scheidt. Cellen met een normale richting worden uitgelijnd langs deze loodlijn as en dus een rotatie van 0 °. Bepaal rotatiehoeken behulp van een 360 ° notatie of absolute afwijking van 0 °.
  7. Kinocilia positioneren of stereociliary bundel positionering (figuur3B, F, H):
    1. Tel het percentage cellen waarin kinocilia ontbreken. Meet de afstand tussen de kinocilium naar de "top" of het midden van de bundel. De 'top' van de bundel kan niet gemakkelijk te bepalen of bundels abnormaal, en dus het midden van de bundel kan worden aangehouden worden.
  8. Kwantificeren van de positie van kinocilia en stereociliary bundels op de apicale haar celoppervlak door overlappen een positionele raster op elke haarcellen en markeren van de plaats van ofwel de basis van de kinocilium of de top / centrum van de stereociliary bundel. Tonen de gegevens als een percentage van elke categorie die in een specifiek gebied van het raster ligt, en bedekken de locaties van elke streep op een positionele raster.
    Opmerking: In controle weefsels kinocilia altijd aan de top van de stereociliary bundel. In cilia mutanten, worden kinocilia vaak ontbreekt, maar mislocalized nog steeds verbonden, of zelfs volledig los van de stereociliary bundel.
  9. Kinocilia lengte (Figuur 3I):
    1. Meet de lengte van de kinocilium door het merken met een ciliaire axoneme marker. Alleen meten kinocilia die plat liggen binnen een 1,5 urn confocale vlak. Controleer of cilia plat liggen door het observeren van een dwarsdoorsnede van het gescande weefsel. Vergelijk leeftijd paste monsters van hetzelfde gebied van de cochlea aangezien de kinocilium terugtrekt tijdens de ontwikkeling.
  10. Mislocalisatie van polariteit eiwitten:
    1. Na immunohistochemie met behulp van antilichamen tegen polariteit eiwitten zoals Vangl2 en Gai3, bepalen de lokalisering via beeldvorming.

LET OP: In sommige cilia mutanten, is lokalisatie van de polariteit eiwitten verstoord. Deze omvatten Vangl2 en Gai3, waarvan is aangetoond dat om te worden verstoord in Ift20, Bbs8 en Bbs6 mutant slakkenhuis.

LET OP: Verdere voorbeelden voor hoe te kwantificeren en weer haar cel Polarity kan worden gevonden in de volgende papiersoorten. Curtin et al. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature 7, Wang, et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et al. (2008) Methods in Molecular Biology 24, mei-Simera, et al. (2012) Methods in Molecular Biology 25, Yin et al (2012) PLoS One 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Slakkenhuis Dissection en Tissue Voorbereiding

Na verwijdering van de hersenen, post middellijn sagittale dissectie van een P0 muis hoofd, de benige labyrint, van achteren gezien, kunnen worden gevisualiseerd (Figuur 1A, witte pijl) en verwijderd. Figuur 1B toont de geïsoleerde benige labyrint met cochleair haren naar boven, ventrale, (links) en van achteren, dorsale (rechts). De witte pijl wijst naar het ovale venster van waaruit men kan beginnen met het verwijderen van de buitenste kraakbeen. Zodra de buitenste kraakbeen volledig is verwijderd, de blootgestelde cochleaire kanaal, nog intact kan worden waargenomen (Figuur 1C). Positionering van een pen door het evenwichtsorgaan regio om dissectie helpen getoond. Twee pinnen, geplaatst op verschillende hoeken kan ook worden gebruikt om het weefsel te verankeren. Figuur 1D toont het cochleair kanaal na verwijdering van de Reissner '; S membraan en de tectoriaal membraan (links) en de geïsoleerde cochleair epitheel spiraal eenmaal is geïsoleerd uit de vestibulaire regio als voorbereiding voor de montage van immunohistochemie (rechts). Om een algemeen idee van wat de blootgestelde cochleair haren eruit ziet, een intacte SEM voorbereiding is weergegeven in figuur 1E geven.

Morfologie en Immunofluorescentie in Controle Cochlea

Na bereiding van de cochleaire weefsel, wordt het dorsale oppervlak van de cochleaire kanaal met het orgaan van Corti blootgesteld en kan bekeken via SEM of immunofluorescentie kleuring. Gezien als een geheel-mount voorbereiding, kan de vier rijen mechanosensorische haarcellen (één rij binnenste haarcellen en drie rijen van de buitenste haarcellen) worden onderscheiden. Figuur 2A toont een lage vergroting uitzicht op de basale beurt uit een embryonale muis cochlea , bereid fof SEM. Let op de uniforme oriëntatie en uitlijning van de actine gebaseerde stereociliary bundels. Bovendien is de morfologie van de stereociliary bundels consistent, elke bundel heeft de klassieke ")" (op binnenste haarcellen) of "W" (op de buitenste haarcellen) vorm. Bij nader vergroting op deze leeftijd extra microvilli blijkt niet alleen op het apicale oppervlak van de haarcellen, maar ook in de tussen haarcellen op de ondersteunende cellen (Figuur 2B). Deze zullen wijken waardoor er slechts drie rijen stereociliary bundels op de buitenste haarcellen en twee aan de binnenste haarcellen bij volwassenen. Zoals te zien is in figuur 2C (witte pijl) wordt een microtubulus gebaseerde kinocilium (a true primaire cilium) gelegen naast het langste rij stereocilia bij de top van elke stereociliary bundel. Deze worden via kinocilia koppelingen aan de bundel.

Fluorescerende labeling met phalloidin, die labels actine, wijst op de uniforme oriëntatie en vorm van de bundels in de controle weefsel (figuur 2D). Corticale actine wordt ook het label, die nuttig is de apicale omtrek van elke individuele haarcellen bepalen. Co-labeling met falloïdine en een antilichaam tegen myosine 7a (figuur 2E), een haarcel bewaker, helpt ook te maken tussen haarcellen en steuncellen. Myosine 7a ook een nuttige merker voor het meten van cochleaire buis verlenging (zie figuur 3A). Een antilichaam tegen geacetyleerd-α-tubuline wordt algemeen gebruikt om het microtubule-gebaseerde kinocilium (figuur 2F) te identificeren. Zoals steuncellen ook haven primaire cilia, is het belangrijk om onderscheid te maken tussen cilia afkomstige haarcellen vs. intercalatie steuncellen. Een bijkomend membraan merker zoals antilichamen tegen ZO-1 (Zona occludens 1), die duidelijk schetst de mozaïek patroon van het apicale membraan van de cochleaire kanaal, dus behulpzaam (<strong> Figuur 2F). Verdere overweging is dat antilichamen tegen geacetyleerde-α-tubuline ook labelen interne microtubules en dus zorg moeten worden genomen bij beeldvorming om zich te concentreren op het haar cel apicale oppervlak. De microtubules in de pilaar cellen zijn bijzonder dichte (figuur 2G, witte asterisk). Een combinatie van phalloidin en anti-geacetyleerd-α-tubuline labeling wordt vaak gebruikt om tegelijkertijd stereociliary bundels en naburige kinocilia (figuur 2G, witte pijl) te identificeren.

Cochlear fenotype in Cilia Mutanten

Verlenging van de cochleaire kanaal is een van de beste uitlezingen convergentie en extensie gebreken en verkorte cochleaire kanalen worden vaak waargenomen bij klassieke PCP mutanten. Het slakkenhuis in ciliaire mutanten vaak cochleaire kanalen verkort en tonen een aanzienlijke verbreding van de sensorische epithelia aan de top, zoals kan gezien in Ift20 cko / CKO-muizen (Figuur 3A). Een andere klassieke PCP defect verstoring van de uniforme oriëntatie van cochleaire haarcellen, zoals te zien in de Bbs8 - / - muizen zowel immunohistochemie (Figuur 3B, pijl rechts) en SEM (Figuur 3C). Naast verkeerd gerichte bundels, afgeplat en misvormde bundels worden ook vaak waargenomen (Figuur 3B, middelste pijl Figuur 3D). Vaak cirkelvormige bundels, zoals kan gezien in figuur 3E, aanwezig zijn, met name in haarcellen totaal geen kinocilia. Mis-lokalisatie van de kinocilium is ook gebruikelijk.

Het verkeerd gelokaliseerde kinocilium wel of niet worden bevestigd aan de stereociliary bundel (Figuur 3B, pijl links Figuur 3F). Voorbeelden van hoe de bu kwantificerenndle oriëntatie en kinocilia of bundel positionering worden weergegeven in figuur 3G en 3H. De oriëntatie van elke afzonderlijke bundel kan dan worden beoordeeld door de rotatie van de bundel ten opzichte van een lijn loodrecht op de rij pilaar cellen die de binnenste en buitenste haarcellen scheidt. Cellen met een normale richting worden uitgelijnd langs deze loodlijn as en dus een rotatie van 0 ° (Figuur 3G). De positie van de kinocilium, of het midden van de bundel stereociliary, kan worden uitgezet door overlappen een positionele raster op het luminale oppervlak van de haarcellen en bepalen van de locatie van de kinocilia of bundel in het raster (Figuur 3I). Mutaties in genen cilia vaak invloed cilia lengte, en dus de lengte van de kinocilium kan worden beoordeeld. In Cep290 rd16 / rd16 mutanten, kinocilia zijn langer dan in de controlegroep (figuur 3J). Zoals het cilium terugtrekt,is het essentieel om dezelfde leeftijd nestgenoten te hebben en om metingen uit dezelfde regio van de cochlea. Om goede beelden voor analyse en kwantificering, zowel immunohistochemie en SEM krijgen, is het essentieel om de tectoriaal membraan te verwijderen. Figuur 3F toont een SEM microfoto waarin de tectoriaal membraan niet volledig is verwijderd.

Figuur 1
Figuur 1. Dissectie van een zich ontwikkelende Muis Cochlea (P0). (A) Mid-lijn sagittal dissectie van P0 muis hoofd met hersenen verwijderd. De witte pijl wijst naar de positie van de benige labyrint. (B) Ventral (links) en dorsale (rechts) uitzicht op ontleed benige labyrinten. De cochlea is gelegen aan de bovenkant met de vestibulaire gedeelte onderaan Witte pijl wijst naar het ovale venster. (C) De benige labyrint after verwijdering van de buitenste kraakbeen van de cochlea. Een speld is geplaatst door middel van het evenwichtsorgaan. (D) Links, hetzelfde aanzicht als in C na verwijdering van het membraan van de Reissner en tectorial membraan. Rechts, geïsoleerde cochleaire kanaal klaar voor montage. (E) Aftastelektronmicrofoto van een intact blootgesteld cochleaire spiraal blootstellen van de vloer van de cochleaire kanaal, inclusief de sensorische epitheel. Schaal bar is 100 micrometer. . (A - D) aangepast van May-Simera et al, 2012 25 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Morfologie en immunofluorescentie in het Configuratie Slakkehuis (A - C). Rasterelektronenmicrografieën van de basale turn in embryonale (E18.5) wild type cochleae. Een rij van binnenste haarcellen (onder) en drie rijen van de buitenste haarcellen (boven) worden gescheiden en tussengevoegd door steuncellen. Chevron-vormige stereociliary bundels uniform oriënteren op de zijrand van elke haar cel (bovenrand van het beeld). Bij E18.5 extra microvilli betrekking op de apicale oppervlakken van haarcellen, onder de stereociliary bundels en geïntercaleerde steuncellen (B). (C) Een enkele microtubule gebaseerde kinocilium (witte pijl), zich bij de top van de bundel, hier de zijrand. (D - G) Immunofluorescente kleuring van basale beurt postnatale dag 1 (P1) wild type cochleae. Phalloidin labels filamenteus actine in stereocilia en corticale actine in de cel periferie (D, E, G). Myosine 7a is een merker voor binnenste en buitenste haarcellen (E). Zo_1 labelt de krappe kruispunten in-tussen de cellen, waardoor het een geweldige marker naar cel Bounda onderscheidenRies (F). Geacetyleerde α-tubuline wordt gebruikt als een marker voor de kinocilium bij de top van de bundel (F, G witte pijl). Interne microtubuli worden ook gelabeld door geacetyleerde α-tubuline, die bijzonder overvloedig in pijler cellen zijn (G wit asterix). Schaal bars A: 10 pm, B: 5 micrometer, C: 1 urn, DG:. 5 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Cochlear fenotype in Cilia Mutants. (A) Duidelijke verkorting van Ift20 cko / CKO cochleaire kanalen vergeleken met de controlegroep. Ontleed cochleaire kanalen op E18.5 gekleurd met geacetyleerde tubuline. (B Bbs8 - / - mutant (P0). -Phalloidin gelabeld filamenteus actine, stereocilia (rood), geacetyleerd tubuline, kinocilia (groen). Stereociliary bundels in Bbs8 - / - cochleae zijn variabel gedraaid (pijl naar rechts), afgeplat en / of mislocalized (middelste pijl). Kinocilia zijn mislocalized of axonemes ontbreken (pijl naar links). (C - F) Hogere vergroting SEM van stereociliary bundels en kinocilia in Bbs8 - / - OHCS. In C, gedraaid bundels, in D, afgevlakt bundel, in E, ronde bundels en in F mislocalized kinocilia. (G - I) Schematische weergave van bundel abnormaliteit kwantificering. (G) Links, bundelen convexiteit (hoogte); de kortste afstand tussen de top van de bundel en de lijn die zich uitstrekt door beide uiteinden van de bundel "armen". zoals depicted door de stevige zwarte lijn. Rechts, het gebied in het kader van de bundel; het gebied. (H) Schematische weergave van de gebruikte om de oriëntatie van stereociliary bundels te kwantificeren criteria. De rotatiehoek van de bundel wordt berekend ten opzichte van een lijn loodrecht op de rij pilaar cellen. (I) Schematische weergave van de criteria voor positionele analyse van kinocilia en stereociliary bundels. Een gesegmenteerde raster gelegd over de omtrek van de haarcellen en de positie genoteerd. (J) Hogere-vergroting beeld van-phalloidin gelabeld stereocilia bundels (rood) en geacetyleerde-tubuline gelabeld kinocilia (groen) van de buitenste haarcellen in P0 slakkenhuis. In het aangrenzende monochroom scherm, rode lijnen identificeren van de kinocilia, die langer in Cep29 rd16 / rd16 mutanten vergelijking met de controlegroep (witte pijlen) zijn. (K) SEM microfoto van de embryonale cochlea met onvolledige verwijdering van tectorial membraan. Schaalbars A: 100 urn, B: 5 urn, C - F: 2,5 urn, I: 5 urn, J: 50 urn. (A - F)... Gewijzigd ten opzichte van mei-Simera et al, 2015 8, J Herdruk met toestemming van Rachel et al, 2012 27 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bij de voorbereiding van cochleaire weefsel voor analyse, er zijn een paar belangrijke punten in gedachten te houden. Ten eerste, de verschillen in genetische achtergrond kan het cochleair fenotype aan te passen, waardoor het noodzakelijk is om te analyseren en te vergelijken alleen nestgenoot controles. Ten tweede is volledige verwijdering van de tectoriaal membraan vereist om de beste beelden met immunohistochemie verkrijgen en is essentieel voor SEM. Het tectoriaal membraan een ondoorzichtige structuur en kunnen de cellen van het sensorische epitheel rechtstreeks verdoezelen eronder, waardoor beeldvorming moeilijker. Af en toe tijdens de verwerking, kan de tectorial membraan terugdeinzen, het blootleggen van de haarcellen. Zelfs in deze gevallen de verwijdering is sterk aangeraden. Deze stap vereist geduld en oefening. Ten derde kan immunohistochemie met behulp van antilichamen tegen ciliaire eiwitten, in het bijzonder degenen die lokaliseren de sterk verdichte basislichaamstemperatuur, uitdagend en vereisen optimalisatie. Overweeg het uitvoeren van antigen herstel, het intensiveren van de permeabilordening stappen, of het verminderen van de concentratie of de tijd van fixatie. Tot slot, wanneer de beeldvorming van de kinocilium (de primaire cilium vinden op de cochleaire haarcellen) in gedachten houden dat het begint terug te trekken uit P0 - vanaf P1 in een base-to-top verloop. Wanneer derhalve Lengtemeetapparaten de kinocilium is het belangrijk om haarcellen vergelijken van hetzelfde gebied van de cochlea en met dezelfde leeftijd dieren. De geïntercaleerde steuncellen hebben ook primaire cilia, die niet terug te trekken. Er moet onderscheid worden gemaakt tussen ondersteunende cellen cilia en haarcellen kinocilia.

Volwassen muizen, wordt het steeds moeilijker de cochleaire sensorische epitheel netjes isoleren door de verkalking van de temporale bot en bot labyrinten. Ontkalking van het weefsel vereist, wat niet altijd compatibel met verdere immuunlokalisatie technieken maar zorgen voor onderzoek van de bruto fenotype en is ook compatibel met SEM voorbereiding. Inteelt muis strAins vertonen vaak auditieve defecten zoals haar celverlies of verhoogde auditieve hersenstam responsen (ABR), door mutaties in bekende auditieve genen of genetische factoren. Daarom is het essentieel om leeftijd gematchte controle nestgenoten vergelijken of kweken op een andere genetische achtergrond.

Een van de beperkingen van deze analyse is dat, in muizen, de kinocilium begint na geboorte trekken en is niet meer op volwassen haarcellen. Daarom kinocilia metingen alleen kan worden gedaan bij de ontwikkeling van weefsel. Ook moet zorgvuldig te selecteren op leeftijd gematchte controles vergelijkingen tussen mutant en controlemonsters. Een andere beperking is dat ciliaire mutante muizen tot dusver geanalyseerde weet ernstige auditieve disfunctie niet weergegeven (bijv., Auditieve hersenstam reacties ABRs of otoakoestische emissie, OAEs) zelfs wanneer cochleair ontwikkeling wordt belemmerd. In overeenstemming met deze, het horen van gebreken zijn niet een gemeenschappelijke menselijke ciliopathie fenotype. Bij wijze van uitzondering, het verlies van hearinG is een van de belangrijkste kenmerken van Alström syndroom, veroorzaakt door mutaties in de basale lichaamstemperatuur eiwit ALMS1 28,29. Dit suggereert dat stereociliary bundel morfologie niet beperkt hoeft auditieve disfunctie bij cilia mutanten, waarschijnlijk door heroriëntatie corrigerende bundels later in ontwikkeling is gerapporteerd voor Vangl2 CKO 30 mutanten. Als de ciliopathie spectrum wordt verbreed tot Usher Syndrome, de meest voorkomende erfelijke oorzaak van doof-blindheid omvatten, dan auditieve dysfunctie wordt zeer relevant. Recente gegevens hebben aangetoond dat verscheidene eiwitten gerelateerd aan syndrome Usher ook lokaliseren de cilium en zijn betrokken bij ciliaire processen 31, maar of deze eiwitten betreffen PCP signalering nog niet besproken.

Tot nu toe de meeste trilharen muismutanten geanalyseerd op cochleaire PCP defecten zijn slechts vaag onderzocht. De in dit manuscript beschreven technieken maken een uitgebreide detaillering van decochleair fenotype, die ongetwijfeld zal leiden tot een nauwkeuriger inzicht in ciliaire betrokkenheid bij de vaststelling van gewervelde PCP signalering. Ondanks het grote aantal ciliopathie muismodellen beschikbaar zijn, zijn verrassend weinig geanalyseerd in termen van cochleaire PCP defecten. Een gemeenschappelijk valkuil geassocieerd met deze modellen embryonale letaliteit. Aangezien de ontwikkeling slakkenhuis kan worden embryonaal de rol van trilharen in ontwikkelingslanden oor onderzocht PCP kan nog worden onderzocht. Verder kunnen zeer vroege embryonale letaliteit worden omzeild die voorwaardelijke knockouts. Foxg1 32 Cre muizen, verkrijgbaar bij JacksonLaboratories, worden vaak gebruikt voor inactivategenes plaats in thedeveloping binnenoor van E8.To heden zijn pogingen vooral gericht op de behandeling ziekteveroorzakende genen ciliopathie maar verkenning van andere cilia verwante eiwitten en hoe deze invloed hebben op PCP signalering tijdens de ontwikkeling kan meer inzicht in cil biedenia biologie en functie.

Als een auditieve fenotype wordt verdacht in de muismodellen geanalyseerd, mogelijke verdere analyses bevatten audiometrisch onderzoek van ABR 33 of OAEs 34. Cochleair explantaat extensie assays (zoals beschreven in May-Simera et al., 2012 25) kan ook worden uitgevoerd en zorgen voor identificatie van convergente uitbreiding defecten in eerdere ontwikkelingsstoornissen tijdstippen. Kweken van cochlea explantaten maakt het ook mogelijk voor een behandeling met verschillende signalering activatoren of remmers, die explantatie uitbreiding kan wijzigen, hetgeen bijdraagt ​​tot mechanistisch begrip van de ontwikkelingsprocessen betrokken. Hoewel bekend is dat de kinocilium terugtrekt na de geboorte 11,13,14, waarbij deze intrekking niet grondig behandeld in verband met ciliaire mutanten. Het zou interessant zijn om de tijd-specifieke metingen van kinocilia opkomst en intrekken nemen cilia mutants.Considering dat een primaire rol voor de ciliaire proproteïnen is de beweging van lading langs microtubuli, is het zeer waarschijnlijk dat deze eiwitten ook aspecten van het intracellulair verkeer kan regelen langs het cytoskelet 35-37. Een subset van cilia eiwitten is aangetoond dat handel en asymmetrische lokalisatie van PCP moleculen 8 beïnvloeden. Vertaling door immunohistochemie van PCP moleculen, in het bijzonder membraan-geassocieerde eiwitten zoals Vangl2, Frz3 en Dsh wordt daarom aanbevolen om vast te stellen of PCP moleculen mislocalized. Vaststelling van polariteit blijkt een veelzijdig aangelegenheid, en er is toenemend bewijs tegen cel autonome route, die ook correct PCP in sensorische haarcellen 38 vereist. Een recente studie toonde aan dat G-eiwit-afhankelijke signalering regelt de migratie van de cilium in een cel-autonome wijze 39. Consistent met een rol voor ciliaire eiwitten in de lokalisatie van polariteit moleculen heterotrimere G-eiwit alfa subeenheid-i 3 (Gai3) localization wordt verstoord in Bbs8 en Bbs6 knockout slakkenhuis 8,39.

Het onderscheiden van de rol van individuele trilharen componenten en hun verschillende effecten op PCP signalering zal ons meer inzicht in de rol van het cilium bij het vaststellen van de juiste polariteit te geven. Van bijzonder belang onderscheid te maken tussen ciliaire eiwitten functioneren in een ciliaire context versus niet-ciliaire functie van traditioneel beschouwd ciliaire eiwitten, zoals hun rol in het reguleren van niet-ciliaire gerelateerde intracellulair verkeer. De hoge mate van regelmatigheid in vele aspecten van cochleaire structuur, inclusief cellulaire patroonvorming en stereociliary bundel oriëntatie maakt het mogelijk om subtiele veranderingen in de ontwikkeling van PCP in reactie op hetzij genetische of moleculaire verstoringen in trilharen verwante proteïnen te detecteren. Gezien het feit dat er veel trilharen muismodellen beschikbaar zijn, en dat de ontwikkeling van de muis slakkenhuis is een van de beste plaatsen om PCP te onderzoekensignalering, is het van groot belang om te leren in hoeverre individuele eiwitten mutaties verstoren slakkenhuis ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteur wil graag bedanken Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer en Zoe Mann en hun kritische evaluatie van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) en de Johannes-Gutenberg Universiteit, Mainz, Duitsland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Silicone elastomere - Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028-5EA See Note 2
Micro dissecting scissors-straight blade Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps Various
Dissecting microscope. Various
Uncoated glass microscope slides Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) Various
Transfer pipettes Various
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-10
SEM sample holder tousimis 8762
Scanning electron microscopy studs TED PELLA 16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive TED PELLA 16084-3
Fluorescent Microscope Various
Critical Point Dryer Various
Scanning Electron Microscope Various
Glass microscope slides Various
Glass coverslips Various
Kimwipe Tissue  Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS) Gibco/Life Technologies 10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1 Sigma-Aldrich G5882
Tris-HCl (pH 7.5) Various
NaCl Various
CaCl 2 Various
Triton X-100 Various
Normal Goat Serum Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-007-003
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Technologies 14065
Hepes Gibco/Life Technologies 15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 ) Sigma-Aldrich/Fluka Analytical 75632
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Ethanol 200 proof Various
Antibodies
anti Arl13b Protein Tech 17711-1-AP Suggested concentration 1:1,000
anti acetylated tubulin (611-B1) Sigma-Aldrich T6793 Suggested concentration 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88) Sigma-Aldrich T6557 Suggested concentration 1:200
anti Zo_1  Invitrogen 40-2300 Suggested concentration 1:500
Myosin VI Proteus Biosciences 25-6791 Suggested concentration 1:1000
Myosin VIIa Proteus Biosciences 25-6790 Suggested concentration 1:1,000
anti Vangl2 Merk Millipore ABN373 Suggested concentration 1:250
anti Gαi3 Sigma-Aldrich G4040 Suggested concentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:300 - 1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7 (2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378 (2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7 (2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839 (2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988 (2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925 (2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B (2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C (2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

Tags

Geneeskunde Primary Cilia Kinocilium Planar Cell Polariteit Cochlea Muis haarcellen stereocilia Wnt-signalering
Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

May-Simera, H. Evaluation of… More

May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. J. Vis. Exp. (108), e53559, doi:10.3791/53559 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter