Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluering av Planar-Cell-polaritet fenotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Published: February 21, 2016 doi: 10.3791/53559
Automatic Translation
1
1Cell and Matrix Biology, Institute of Zoology, Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Introduction

Primære cilia er lange mikrotubul-baserte vedheng som strekker seg fra overflaten av de fleste pattedyrceller. Primær cilia forveksles ofte med motile flimmerhårene, som det alltid er flere pr celle, og hvis formål er å bevege fluidet på tvers av membranoverflatene. Primær flimmerhårene, i motsetning, vedta sensoriske roller og er følgelig også referert til som sensorisk flimmerhårene. Når lenge glemt, dette organ har nylig blitt "gjenoppdaget" som et resultat av sin tilknytning til et mangfold av menneskelige genetiske sykdommer 1. Ideelt plassert som en signalorganelle, har det primære cilium blitt vist å regulere en rekke signalveier, hvorav mange er viktig ikke bare i vev homeostase og sykdommer, men også under utvikling to.

En av de første signalveier er vist å være forbundet med cilia dysfunksjon var den ikke-kanonisk Wnt signalveien, også kjent som den plane celle polaritet (PCP) pathway > 3. Denne signalkaskade først identifisert i Drosophila, er kritisk for embryogenese; spesielt for konvergens og forlengelse prosesser og for den korrekte orientering av celler i planet av epitel 4. Den sekvensielle signalisering av en kjerne satt av regulatoriske proteiner settes retningsbestemte signaler som til slutt fører til cytoskeletal omordninger og resultere i den koordinerte polarisasjonen av epitel-celler i et plan 5. Prosessen med konvergens og forlengelse er absolutt nødvendig for cochlea kanalen langstrakt og for riktig cellulær mønster 6. Ettersom dette er regulert via aktivering av PCP-reaksjonsveien, er en av de mest slående fenotypene av cochlea PCP mutanter et forkortet cochlea kanal med uorganisert sensorisk epithelia 7. Tilsvarende mus mutanter, som mangler flimmerhårene, også oppvise en slik konvergens og forlengelse fenotype 8,9, men nøyaktig hvordan dette er regulert gjenstår å bli belyst.

ve_content "> Fordi konvergens og forlengelses prosesser er avgjørende for utvekst av sneglehuset duct, og cellulær mønster av sensorisk epitel i cochlea kanalen, er den tredje cochlea et ideelt organ der å undersøke PCP signale under virveldyr utvikling. Orgelet av Corti, betegnelsen på den spesialiserte sensorisk epitel som linjer cochleakanalen, består av ikke-sanse støtte celler og mechanosensory hårceller som må være jevnt orientert for sneglehuset skal fungere 10. de mechanosensory hårcellene er så kalt på grunn av stereociliary bunter som strekker seg fra cuticular plate (apikale overflaten) av hver sanse hår celle 11. Disse fungerer som primær transdusere av mechanosensation og til tross for sin nomenklatur som stereocilia, faktisk består av modifiserte aktin filament-baserte microvilli. Innenfor hver vinkelformet hår bunt, blir tre rader med stereocilia organisert på en meget ordnet og regulert pattern i en trapp sak-lignende måte. Ekte microtubule baserte flimmerhårene, betegnes kinocilia, er nødvendig for utvikling og orientering av stereociliary bunter 12. Ved hvert hår cellen, blir en enkelt kinocilium fysisk festet til stereocilia bunten, som ligger sentralt i tilknytning til den høyeste rekke av stereocilia. Den nøyaktige funksjonen til kinocilium er uklart, og en hypotese er at kinocilium "trekker" den stereocilia i form som de modnes fra microvilli 12. I virveldyr, kinocilia i sneglehuset er bare til stede forbigående og trekke fra hårcellene i mus før utbruddet av å høre 11,13,14.

Fullstendig tap av flimmerhårene i utviklings cochlea resulterer i alvorlig forkortede cochlea kanaler, mis-formet og mis-orientert stereociliary bunter, samt mis-plassert basal organer 8,9. En funksjonell cilium er ikke bare består av ciliary axoneme. Mange proteiner forbundet med ciliafunksjon oppstå i komplekser lokalisert til cilia-relaterte underdomener som basal kropps, overgangssone, eller ciliare axoneme 15. Den basale kropps, avledet fra moren centriole av sentrosomen, er også en mikrotubuli-organiserende senter for mikrotubuli som strekker seg bort fra cilium inn i cellelegemet og kan regulere intracellulær handelen, så vel som ciliare handel. Ciliary overgangssone er et annet område hvor stråle funksjon er regulert i form av organisering import og eksport av ciliary forbindelser 16.

Flere studier har identifisert en sammenheng mellom flimmerhårene og ikke-kanoniske Wnt (PCP signal), selv om den nøyaktige mekanismen er uklar 17. Redundans av ciliare og PCP gener og følsomheten av cellen polaritet til genercelleforandringer, gjør det vanskelig å direkte koble en mutasjon til PCP-spesifikke underskudd. En av de leste ut av PCP signalering er plasseringen av basal legemet og Primary cilium derfor segregerende primær fra sekundærskader er utfordrende. Noen studier i sebrafisk og mus mutanter har antydet noen forbindelse mellom flimmerhårene og Wnt signale 18-20. Avvik i dataene kan gjenspeile arter, vev, eller temporal-avhengige forskjeller i ciliary bidrag til Wnt signalering. Videre kan normalt Wnt respons beholdes hvis basale kropper forbli funksjonelle. En dypere innsikt i rollen som ciliary proteiner i cellulære signalveier og andre biologiske fenomener er avgjørende for vår forståelse av cellulære og utviklingsbiologi, samt for utvikling av målrettede behandlingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruk og avlive alle dyr i henhold til institusjonelle og statlige retningslinjer og regler, oftest via CO 2 innånding og halshugging.

1. Utarbeidelse av reagenser

MERK: Før begynnelsen, forberede alle reagenser som bruker analytiske grade kjemikalier. Gjør løsninger ved hjelp av molekylære klasse destillert og avionisert vann med mindre annet er spesifisert.

  1. Fosfatbufret saltvann (1 x PBS): Lag 1 liter av 1 x PBS ved å oppløse 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2 HPO 4 og 0,24 g KH 2PO 4 i 1 liter H2O Juster pH til 7,4 med HCl. PBS trenger ikke å være sterile og kan lagres ved romtemperatur. Legg merke til at denne bufferen er laget uten CaCl2 eller MgCl2.
  2. Paraformaldehyde (4% PFA): Forbered en 4% løsning av PFA i 1x PBS i et ventilert avtrekkshette. Legg 40 g paraformaldehyd pulver til 1 liter av 1 x PBS. For å oppløse, rør og oppvarm til ca. 60 ° C,og sakte legge NaOH slippe lurt å heve pH. Når pulveret er oppløst, juster pH til 7,4 med HCl. Filtrer gjennom et 0,45 um filter og fryse alikvoter. Tine en frisk delmengde for hvert forsøk.
  3. Triton-buffer: Fremstill en 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 oppløsning ved å oppløse 8,77 g NaCl i 1 liter 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Tilsett 1 ml Triton X-100. Rør for å oppløse. Oppbevares Triton buffer ved RT.
  4. Triton blokk: Forbered 10% geit serum i Triton buffer ved å legge til 1 ml av geit serum til 9 ml Triton buffer. Oppbevar ved 4 ° C. Ved bruk av primære antistoffer dannet i mus, tilsett geit-anti-mus-IgG Fab-fragmentene i en fortynning på 1 i 200 med Triton blokken til blokkeringstrinn.
    MERK: Hvis du planlegger å bruke prøver for scanning elektronmikroskopi (SEM), forberede ytterligere reagenser som er nevnt nedenfor.
  5. Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med kalsium og magnesium: Lag en 1x løsning av HBSS ved å fortynne fra en stamløsningi sterilt destillert H 2 O. Som HBSS buffer er komplisert å lage, og det er risiko involvert, er det lurt å bestille en forhåndslagde 10x stamløsning. Den endelige konsentrasjonen av HBBS buffer rutinemessig anvendes er følgende: 1.26 mM CaCl2, 0.49 mM MgCl2 -6H2O, 0,41 mM MgSO4 -7H2O, 5,33 mM KCl, 0,44 mM KH 2PO 4, 4,17 mM NaHCO3, 137,93 mM NaCl , 0,34 mM Na 2 HPO 4, 5,56 mM Druesukker.
  6. Hepes buffer: Forbered en 0,1 M Hepes løsning i 1x HBSS, ved oppløsning av 23,8 g HEPES i en L 1x HBSS buffer.
  7. Scanning elektronmikroskopi fiksativ (SEM Fix): Fremstill fiksativ for SEM ved fortynning av elektronmikroskopi grad glutaraldehyd (2,5%) og paraformaldehyd (4%) i Hepes-buffer. Legg CaCl2 til en sluttkonsentrasjon på 10 mM.
  8. 1% osmiumtetroksyd (OsO 4) i Hepes-buffer; 1% osmiumtetroksyd i vann: Fortynn en stamløsning av osmiumtetroksyd i Hepes-buffer, og separately i sterilt destillert H2O, til en sluttkonsentrasjon på 1%. Osmiumtetroksyd er meget giftig, og er mest solgt som en 4% løsning.
  9. 1% (vekt / volum) Garvesyre: Oppløs 0,5 g garvesyre i 50 ml sterilt destillert H2O Filtersteriliser ved filtrering gjennom en 0,45 porestørrelse filter.
  10. Graderte etanolløsning serie: Fortynn 200 proof etanol med sterilt destillert H2O for å lage 30, 50, 70, 90 og 95% etanol-løsninger. For de endelige etanolskyllinger, er 100% etanol 200 dokumentasjon. Bruk en nyåpnet flaske 200 etanol for de siste skyllinger.

2. Valg av Tissue

  1. Ideelt undersøke befruktede egg eller små unger i alderen embryonale dag 16,5 (E16.5) og postnatal dag 3 (P3).
    MERK: Forbening av den benete labyrinten og tidsmessige bein gjør disseksjon stadig mer utfordrende som mus modne. Også kinocilia, den eneste sanne microtubule baserte cilium funnet på cochlea hårceller,trekkes under utvikling og er ikke lenger til stede i voksne mus.
  2. Etter fiksering, avkalke voksen cochleae. Plasser dissekert (se punkt 3) benete labyrinter, i 2 ml EDTA (4,13% i PBS), pH 7,3, i en mikro rør i 3 - 4 dager med rotasjon. Etterfyll EDTA daglig. Etter vev har myknet, skyll i 1,5 ml eller mer PBS 3 ganger for 5 min på en nutator med økt uro.

3. Cochlea Dissection

  1. Post euthanization via halshugging eller CO 2 innånding (100% CO 2), fjerne hodet. Bruke et skalpellblad eller liten saks, avhengig av størrelsen av dyret, for å dissekere hodet langs den sagittale midt linje som begynner ved nesen og utvide kaudalt. Fjern hjernen fra hver halvdel av hodet med en pinsett. Identifisere tidsmessige bein, som inneholder utviklings benete labyrinter av det indre øret (se pil i figur 1A).
  2. Bruk et par forsteinsopp å nøye isolere benete labyrinter fra skallen (timelige bein). Gjør dette under et dissekere mikroskop. Prise bort benete vev fra hodeskallen ved å kjøre pinsett forsiktig under benete labyrinter. Hos dyr opp til P4 bein labyrintene er fortsatt brusk og kan enkelt fjernes uten å bryte.
  3. Etter disseksjon, bruke tuppen av dissekere pinsett til å fjerne den ovale og runde vinduer og lage et lite hull i toppen av cochlea spiral. Fest benete labyrintene før videre disseksjon av cochlea kanalen. Å tillate for enkel fjerning av tectorial (se 3.7), fikse benete labyrinter i 1,5 ml 4% PFA i 5 min på is.
    MERK: Hvis fjerning av tectorial ikke er nødvendig, er lengre fiksering anbefales (se 04.01 til 04.03). Kort fiksering av tidsmessige bein før disseksjon av cochlea kanalen hjelpemidler disseksjon prosessen og fjerning av tectorial. Post disseksjon og eksponering av orgelet i Corti, furthennes fiksering er nødvendig.
  4. Videre dissekere benete labyrinter å eksponere cochlea sensorisk epitel som følger. Plasser benete labyrinter i en svart silikon elastomer belagt dissekere fatet inneholder PBS å lette disseksjon. Bruk minutien pins å immobilisere vev hvis nødvendig. For å bruke minutien pins, plasserer dem gjennom vestibular del av benete labyrinter med ventral aspekt av cochlea spiral vendt oppover.
    MERK: Sort silikon elastomer parabolen: Bland silikon elastomer basiskomponent med kull for å få en ugjennomsiktig svart farge. Tilsett herdemidlet og hell over i en eller flere av petriskåler (glass eller plast). Tørr under vakuum for å fjerne luftbobler. Tørre retter helt før bruk.
  5. Bruk fine tang (# 5) for å fjerne den ytre brusken utsette cochlea kanalen. Start med det ovale vinduet; Sett bunnen tuppen av tang i det ovale vinduet og forsiktig lirke åpne brusk, sakte beveger seg oppover mottoppunkt.
  6. Etter eksponering av sneglehuset duct, fjerne ventral overflaten, Reissner membran. Bruk en fin pinsett til å klemme Reissner membran i bunnen av cochlea-kanalen og skrelle den av i en oppadgående bevegelse. Visualrygg aspekt av sneglehuset duct, inkludert sensorisk epitel.
  7. Fjern tectorial som beskrevet nedenfor (valgfritt). For SEM eller immunhistokjemi av kinocilium eller stereociliary bunter fjerne tectorial.
  8. Bruk en veldig fin pinsett (# 55 eller finere) å klemme tectorial ved foten av sneglehuset og skrell oppover mot toppen.
    MERK: tectorial er optisk klar som gjør det vanskelig å identifisere. Oftere enn ikke membranen løsner i ett stykke, og selv om det ikke er lett visualisert, kan man føle motstanden som det er trukket ut fra konkurranseutsatt organ Corti.
  9. Etter å utsette organ Corti, ytterligere fikse vev som described nedenfor. Behold det vestibulære regionen for å hjelpe videre utarbeidelse av vev.

4. Fixation

  1. For vanlig immunhistokjemi fikse dissekert benete labyrinter i 1,5 ml 4% PFA ved 4 ° C på en nutator i 2 timer.
    MERK: På grunn av følsomheten av forskjellige antistoffer og antigener, variasjoner i lengden og sammensetningen av fiksering kan være nødvendig, og bør være optimalisert for hvert antistoff.
  2. Etter fiksering vaskes prøvene ved skylling i 1,5 ml PBS eller flere 3 ganger i 5 minutter på en nutator med økt omrøring. Prøvene kan lagres i PBS ved 4 ° C i flere uker før behandlingen.
  3. Hvis forberede prøver for SEM, fikse dissekert messige bein i SEM fix (se 1.7) for 2 timer ved RT. Vask etter skylling i 1,5 ml eller flere Hepes buffer 3 ganger i 5 min på en nutator med økt omrøring. Lagres i Hepes-buffer ved 4 ° C inntil videre behandling. Lagring i mer enn et par ukes er ikke anbefalt.

5. Immunohistokjemi

  1. Utfør immunhistokjemi på dissekerte prøver i en brønn i en flatbunnet 96-brønners plate. Alternativt kan du bruke en PCR eller mikrosentrifugerør. Det anbefales å beholde vestibulære delen av den benete labyrinten for å forenkle behandlingen.
  2. Permeabilize vev ved inkubering i 1,5 ml Triton-buffer i 1 time ved romtemperatur på en nutator med forsiktig omrøring.
  3. Blokker vev ved inkubering i 0,5 ml Triton blokken i minst 1 time ved RT. Ved bruk av primære antistoffer dannet i mus, tilsett anti-mus IgG Fab-fragmenter til blokken ved en fortynning på 1 i 200 (se avsnitt 1.4). Dette reduserer i stor grad ikke-spesifikk binding av anti-muse-IgG til mus vev.
  4. Inkuber vevet med primære antistoffer fortynnet i Triton blokk O / N ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Antistoff fortynning avhenger av antistoffer som brukes (se pkt 6.1). Alternativt ruge primære antilegemers i 2 timer ved RT. Ideelt bruke et minimalt volum på 0,5 ml primært antistoff-fortynning. Dersom antistoff er begrenset, kan du bruke den minste volum av antistoff fortynning som fullstendig omslutter vevet.
  5. Vask vev ved skylling i 1,5 ml eller flere Triton buffer, et minimum av 3 ganger i 15 min, på en nutator med økt omrøring.
  6. Inkuber vevet med fluorescerende fargestoff-konjugerte sekundære antistoffer utvannet ved produsentens anbefalte konsentrasjon (vanligvis 1: 200 til 1: 1000) i Triton blokk i 1 time ved romtemperatur på en nutator. Bruker et minimum volum på 0,5 ml sekundært antistoff-fortynning.
    1. Sentrifuger den fortynnede sekundære antistoff ved 13 000 xg i 3 min før anvendelse for å minimalisere ikke-spesifikk binding av sekundære antistoff aggregater. Beskytt vev fra lyset fra dette trinnet og utover for å unngå fotobleking de fluorescerende fargestoffer.
  7. Som i trinn 5.5, vaskes vevet ved skylling i 1,5 ml eller mer Triton buffer, minst 3 ganger i 15 min, på ennutator med økt uro. Oppbevar prøver i PBS ved 4 ° C til den er klar til å montere.

6. Antistoff Selection

MERK: Kilden anbefalte antistoffer og deres fortynninger er oppført i tabellen over spesifikke materialer og utstyr. Utfør antistoff inkubasjoner som beskrevet i kapittel 5.

  1. For å visualisere microtubule baserte kinocilium, bruk en stråle axoneme markør slik som anti-Arl13b (1: 1000) eller anti-acetylert-α-tubulin (1: 800). Visual basal kroppen ved hjelp av et antistoff mot γ-tubulin (1: 200) eller hvilken som helst annen centrosomal markør.
  2. For å visualisere de actin filament-rik stereociliary bunter, tilsett phalloidin (1: 300 - 1 000) konjugert til en av flere forskjellige fluoroforer til det sekundære antistoff inkubering. Phalloidin etiketter også andre trådformede aktin strukturer, inkludert de kortikale aktin filamenter rundt omkretsen av hver epitelial celle hår. Dette er nyttig for å bestemmeomrisset av hvert hår celle. Bruke en alternativ membran markør, slik som anti-Zo-en (1: 500), hvis nødvendig.
  3. Merk cochlea hårcellene som bruker antistoffer mot Myosin VI (1: 1000) eller Myosin VIIa (1: 1000). Disse kan brukes hvis vurdering av cochlea lengde.

MERK: Bruk passende fluorescerende fargestoff-konjugert sekundære antistoffer optimalisert til mikroskopet krav.

7. Montering og bildebehandling

  1. Plasser prøven i en svart silikon elastomer tallerken med PBS. Bruke fin pinsett, fjerner det vestibulære regionen fra cochlea spiral.
  2. Veldig forsiktig fjerne den underliggende brusk og mesenchyme fra cochlea spiral. De resterende cochlea spiral inneholder den indre sulcus, organ Corti og ytre sulcus.
  3. Overfør cochlea spiral i en dråpe av PBS lagt på et objektglass. Om ønskelig skille cochlea spiral i biter som tilsvarer en sving. Dette trinnet er ikke nødvendig men, og kan føre til lOss av vevet. Den apikale overflaten (stereocilia side) av cochlea hårcellene skal vende oppover mot dekkglass.
  4. Wick bort PBS med en adsorbent vev eller stykke filter papir og forsiktig flytte cochlea spiral hvis epitel har flyttet og overlapper på seg selv.
  5. Tilsett en dråpe monterings media direkte på cochlea prøven og legg forsiktig en dekkglass på toppen, ta vare å unngå luftbobler. Ingen avstandsstykker er nødvendig; plassere dekk direkte på prøven. En vann-løselige, ikke-fluorescerende, semi-permanent montering medium som ikke krever ytterligere trinn for å holde dekkglass på plass anbefales. Monterings media og dekktykkelse bør matches mikroskop spesifikasjoner.
  6. Bruk en epifluorescent eller laser-scanning confocal mikroskop utstyrt med høy forstørrelse (63 - 100X), høy numerisk apertur (01.02 til 01.04) mål å ta bilder av den apikale overflaten av cochlea hår celle. bruk lower mål (5 - 20X) til å ta overlappende bilder av cochlea spiral å kvantifisere lengden på cochlea kanalen. Match eksitasjon lasere og emisjonsfiltre til fluorophores brukes for sekundære antistoffer.

8. Scanning elektronmikroskopi

  1. Fortsett fra punkt 4.3. Etter vask SEM faste prøver i Hepes buffer, utføre følgende trinn i henhold til ventilasjon. Følgende protokoll fungerer godt for sneglehuset vev og unngår bruk av frese belegg med et ledende metall.
  2. Post-løsning i 1% OsO 4 i Hepes-buffer i 1 time, etterfulgt av 3 vaskinger med 1 ml destillert vann i 5 minutter hver. Den minste volum av OsO 4 som fullstendig omslutter vevet bør brukes for å minimalisere giftig avfall. Ingen omrøring er nødvendig.
  3. Inkuber prøvene ved RT i hver av de følgende løsninger i 1 time med 3 vaskinger med 1 ml destillert vann i 5 minutter hver i mellom trinnene: 1% Garvesyre rykende i vann og filholds før bruk; 1% OsO 4 i vann, 1% Garvesyre i vann, 1% OsO 4 i vann.
  4. Dehydrere prøvene gjennom en gradert etanolserie ved inkubering i 10 minutter i hvert av de følgende fortynninger: 30, 50, 70, 90 og 95%. Ingen omrøring er nødvendig.
  5. Overføring av prøver gjennom tre endringer, 5 min hver gang, og med 100% etanol (fra en nyåpnet flaske 200 proof etanol).
  6. Kjør prøvene skjønt et kritisk punkt tørrere følgende produsentens instruksjoner.
  7. Monter prøver ved hjelp av ledende karbonklebemiddel på toppen av en SEM stump før avbildning på et elektronmikroskop. Under en stereomikroskop, bruke et par fine tang og en pensel til å forsiktig plassere prøven med cochlea epithelia vendt opp. Bruk det vestibulære del av prøven for å anker vevet til stussen. Oppbevar prøver i en eksikator før bildebehandling. Utfør SEM bildebehandling som beskrevet i Jones (2012) 21.

9.kvantifisering

  1. Etter immunhistokjemi forberedelse, hente bilder ved hjelp av en epifluorescent eller laser-scanning confocal mikroskop. Etter forberedelse til SEM, bruk en scanning elektronmikroskop for å image prøvene. Bilde den apikale overflaten av organ Corti med synlige cochlea hårcellene og mellomlag støtteceller.
  2. Definere bestemte posisjoner langs cochlea kanalsystem, slik som 25, 50, og 75% fra bunnen og bruke disse til å sammenligne cochlea regionene mellom muterte og kontrollprøver. Analysere og sammenligne cilia mutanter med sine kull kontroller, som forskjeller i genetisk bakgrunn kan endre cochlea fenotype.
    MERK: organ Corti utvikler seg i en gradient som strekker seg fra midten av basen mot både apex og basen. I mus, er utviklingen ikke komplett før P14, så det er viktig å sammenligne regioner på lignende utviklingsstadier og posisjoner.
  3. Ta bilder ved hjelp av programvare som følger med mikroskop som allow for kvantifisering av den spesielle fenotype som kreves (se nedenfor). Bruk bildeanalyse programvare, for eksempel Bilde J eller programvare som følger med mikroskop for å måle lengder, telle celler og bestemme protein lokalisering som beskrevet nedenfor. Graf disse dataene som et søylediagram, spredningsplott, boks blot eller histogram, sammenligne mutant vs. kontroll.
  4. Total lengde på cochlea kanalen (figur 3A):
    1. Ved hjelp av et hår celle markør eller phalloidin, (som markerer stereociliary bunter), bestemme og måle hvor sensorisk epitel begynner og slutter. Lengden på cochlea kanalen er ofte forkortet i cilia mutanter.
  5. Stereociliary bundle abnormaliteter (figur 3B, D, E, G):
    1. Mål bunt konveksitet (høyde) som den korteste avstanden mellom topp-punktet av bunten og den linje som strekker seg gjennom begge ender av bunten "armer" som vist i figur 3G, venstre. Alternativt kvantifisere områdetomfattes av armene av ytre hårcelle stereociliary bunt som vist på figur 3G, rett. Hvis hårcellene med sirkulære stereociliary bunter kan identifiseres telle disse som en prosentandel av det totale hårceller.
      MERK: I mange ciliary mutanter bundle avvik kan observeres uavhengig av bunt orientering. Det er vanskelig å nøyaktig kvantifisere stereociliary bunt abnormiteter.
  6. Orientering av stereociliary bunter (figur 3B, C, G):
    1. Vurdere orienteringen av hver enkelt bunt i forhold til en linje som strekker seg vinkelrett på rekken av søyler av celler som skiller de indre og ytre hårcellene. Celler med en normal orientering er innrettet langs denne vinkelrett akse, og så ha en dreining på 0 °. Bestem vinklene rotasjon ved hjelp av enten en 360 ° notasjon eller som absolutte avvik fra 0 °.
  7. Kinocilia posisjonering eller stereociliary bunt posisjonering (Figur3B, F, H):
    1. Telle prosentandelen av celler i hvilke kinocilia mangler. Mål avstanden fra kinocilium til "toppunkt" eller midten av bunten. Den 'toppunktet' av bunten kan ikke være lett å definere om buntene er unormal, og dermed blir midten av bunten kan brukes i stedet.
  8. Kvantifisere stilling kinocilia og stereociliary bunter på den apikale hår celleoverflaten, ved å legge over en posisjons gitter på hver hår celle og markerer plasseringen av enten bunnen av kinocilium eller toppunktet / midten av stereociliary bunten. Vise data som en prosentandel av hver kategori som ligger innenfor en bestemt region av nettet, og ved å legge over plasseringen av hver merke på en posisjonell rutenett.
    MERK: I kontroll vev, kinocilia er alltid knyttet til toppunktet på stereociliary bunten. I cilia mutanter, er kinocilia ofte mangler, mislocalized men fortsatt festet, eller helt løsrevet fra stereociliary bunt.
  9. Kinocilia lengde (figur 3I):
    1. Måle lengden av den kinocilium ved merking med en ciliare axoneme markør. Bare måle kinocilia som ligger flatt i en 1,5 mikrometer confocal planet. Bekreft at flimmerhårene ligger flatt ved å observere et tverrsnitt av det skannede vev. Sammenligne alderen matchet prøver fra samme region av sneglehuset siden kinocilium trekkes under utvikling.
  10. Mislocalization av polaritet proteiner:
    1. Etter immunhistokjemi bruker antistoffer mot polaritet proteiner som Vangl2 og Gαi3, bestemme lokalisering via bildebehandling.

MERK: I noen cilia mutanter, er lokalisering av polaritet proteiner forstyrret. Disse inkluderer Vangl2 og Gαi3, som har vist seg å bli forstyrret i Ift20, Bbs8 og Bbs6 mutant cochlea.

MERK: Ytterligere eksempler for hvordan å kvantifisere og vise håret celle polarity kan finnes i følgende papirer. Curtin, et al. (2003) Current Biology 22, Montcouquiol, et al. (2003) Nature 7, Wang et al (2006) The Journal of Neuroscience 23, Montcouquiol, et al. (2008) Metoder i Molecular Biology 24, May-Simera, et al. (2012) Metoder i Molecular Biology 25, Yin et al (2012) PLoS ONE 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cochlea Dissection og Tissue Forberedelse

Etter fjerning av hjernen, post midtlinje sagittale disseksjon av en P0 mus hode, bony labyrinten, sett bakfra, kan visualiseres (figur 1A, hvit pil) og fjernet. Figur 1B viser de isolerte benete labyrintene med cochlea hår vendt oppover, ventral, (til venstre) og bakfra, dorsal (til høyre). Den hvite pilen peker på det ovale vinduet hvor man kan begynne å fjerne den ytre brusk. Når den ytre brusken har blitt fullstendig fjernet, den eksponerte cochlea duct, fortsatt intakt, kan observeres (figur 1C). Plassering av en pinne gjennom vestibular regionen for å hjelpe disseksjon vises. To tapper som er lagt inn under forskjellige vinkler kan også brukes for å forankre vev. Figur 1D viser cochlea kanalen etter fjerning av Reissner '; S membran og tectorial (venstre) og det isolerte cochlea epiteliale spiral når det har blitt isolert fra det vestibulære region i forberedelse for montering av immunhistokjemi (høyre). For å gi et generelt inntrykk av hva den eksponerte cochlea hår ser ut som, et intakt SEM Fremstillingen er vist i figur 1E.

Morfologi og immunfluorescens i kontroll Cochlea

Etter utarbeidelsen av cochlea vev, er rygg overflaten av cochlea kanalen inneholder organ Corti eksponert og kan blitt sett via SEM eller immunofluorescent farging. Sett på som en hel-mount forberedelse, kan de fire rader med mechanosensory hårceller (en rad av indre hårceller og tre rekker med ytre hårceller) skilles. Figur 2A viser en lav forstørrelse visning av basal sving fra en embryonale mus cochlea , utarbeidet feller SEM. Legg merke til uniform orientering og justering av aktin-baserte stereociliary bunter. I tillegg morfologi av stereociliary bunter er konsekvent, hver bunt har den klassiske ")" (på indre hårcellene) eller "W" (på ytre hårcellene) form. Ved nærmere forstørrelse i denne alderen ekstra microvilli kan sees ikke bare på den apikale overflaten av hårceller, men også i mellom hårceller på støtte celler (figur 2B). Disse vil falle slik at bare tre rader med stereociliary bunter på de ytre hårcellene og to på de indre hårcellene i voksne. Som kan sees i figur 2C (hvit pil), blir en enkelt mikrotubuli-baserte kinocilium (en sann primær cilium) plassert ved siden av den høyeste rekke av stereocilia ved toppunktet av hvert stereociliary bunt. Disse er festet til bunten via kinocilia koblinger.

Fluorescent merking med phalloidin, som labels aktin, understreker uniform orientering og form av bunter i kontroll vev (figur 2D). Kortikale aktin er også merket, som er nyttig for å bestemme den apikale omkretsen av hver enkelt celle hår. Co-merking med phalloidin og et antistoff mot Myosin 7a (figur 2E), et hår celle markør, bidrar også til å skille mellom hårceller og støtteceller. Myosin 7a er også en nyttig markør for måling cochlea kanalnummer (se figur 3A). Et antistoff mot acetylert-α-tubulin er vanlig å identifisere den mikrotubul-baserte kinocilium (figur 2F). Som støtteceller også havn primær flimmerhårene, er det viktig å skille mellom flimmerhårene som kommer fra hårcellene vs. innføyings støtteceller. En ytterligere membran markør, slik som antistoffer mot ZO-1 (Zona okkludens 1), som klart skisserer mosaikk fordelingen av den apikale membran av sneglehuset kanalen, er derfor nyttig (<strong> Figur 2F). Av nærmere vurdering er at antistoffer mot acetylert-α-tubulin også merke interne mikrotubuli og så forsiktighet bør tas når tenkelig å fokusere på håret celle apikale overflaten. Mikrotubuli i pilar cellene er spesielt tett (figur 2G, hvit stjerne). En kombinasjon av phalloidin og anti-acetylert-α-tubulin merking blir ofte brukt for samtidig å identifisere stereociliary bunter og nabo kinocilia (figur 2G, hvit pil).

Cochlear Phenotype i Cilia Mutants

Forlengelse av cochlea-kanalen er en av de beste lese outs av konvergens og forlengelses defekter, og forkortede cochlea kanaler er ofte observert i klassiske PCP mutanter. Sneglehuset i ciliary mutanter har ofte forkortet cochlea kanaler og viser en markert utvidelse av sanse epithelia på toppen, som kan blitt sett i Ift20 CKO / CKO mus (figur 3A). En annen klassisk PCP-feilen er avbrudd i ensartet orientering av cochlea hårceller, som kan ses i Bbs8 - / - mus både med immunhistokjemi (figur 3B, rett pil) og med SEM (figur 3C). I tillegg til mis-orienterte bunter, flat og misdannede pakker er også ofte observert (Figur 3B, midt pil, figur 3D). Ofte sirkulære bunter, som kan blitt sett i figur 3E, er til stede, spesielt i hårcellene helt blottet for kinocilia. Mis-lokalisering av kinocilium er også vanlig.

Den mis-lokaliserte kinocilium kan eller ikke kan være festet til stereociliary bunt (figur 3B, pil venstre, figur 3F). Eksempler på hvordan å kvantifisere bundle orientering og kinocilia eller bunt posisjonering er vist på figur 3G og 3H. Orienteringen av hver enkelt bunt kan deretter bli vurdert ved å bestemme rotasjonen av den av bunten i forhold til en linje som strekker seg vinkelrett på rekken av søyler av celler som skiller de indre og ytre hårcellene. Celler med en normal orientering er innrettet langs denne vinkelrett akse, og så ha en dreining på 0 ° (figur 3G). Posisjonen til kinocilium, eller sentrum av stereociliary bunten, kan plottes ved å legge over en posisjons rutenett på lumenal overflaten av hårceller og deretter bestemme plasseringen av kinocilia eller pakke i grid (figur 3I). Mutasjoner i cilia gener påvirker ofte cilia lengde, og slik at lengden av kinocilium kan vurderes. I Cep290 rd16 / rd16 mutanter, kinocilia er lengre enn i kontrollgruppen (figur 3J). Som cilium retracts,er det avgjørende å ha alders matchet søsken og å ta målinger fra samme region av sneglehuset. For å få gode bilder for analyse og kvantifisering, både immunhistokjemi og SEM, er det viktig å fjerne tectorial. Figur 3F viser et SEM-mikros der tectorial ikke har blitt helt fjernet.

Figur 1
Figur 1. Disseksjon av en Developing Mouse Cochlea (P0). (A) Mid-line sagittal disseksjon av P0 mus hode med hjerne fjernet. Den hvite pilen peker på plasseringen av den benete labyrinten. (B) Ventralt (til venstre) og rygg (høyre) utsikt over dissekert bein labyrinter. Sneglehuset ligger mot toppen med vestibular del på de nederste hvite pilen peker på det ovale vinduet. (C) Den benete labyrinten akteruter fjernelse av den ytre brusken i sneglehuset. En nål er lagt gjennom det vestibulære systemet. (D) Venstre, samme vis som i C etter fjerning av Reissner membran og tectorial. Høyre, isolert cochlea duct klar for montering. (E) Scanning-elektronmikrofotografi av en intakt, eksponert cochlea spiral utsette gulvet i sneglehuset kanalen, inkludert den sensoriske epitel. Scale bar er 100 mikrometer. . (A - D) tilpasset fra mai-Simera et al, 2012 25 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Morfologi og Immunofluorescence i kontrollsneglehuset (A - C). Scanning elektronmikroskopibilder av den basale turn i embryonale (E18.5) villtype cochleae. En rad av indre hårceller (nederst) og tre rader med ytre hårcellene (øverst) blir separert og Pilgrim av støtteceller. Chevron-formede stereociliary bunter jevnt orientere mot sidekanten av hvert hår celle (den øvre kant av bildet). Ved E18.5 ytterligere mikrovilli dekke apikale overflate av hårceller, under de stereociliary bunter, og interkalerte støtte-celler (B). (C) En enkelt mikrotubulus-baserte kinocilium (hvit pil), er plassert på toppunktet av bunten, som er vist her fra sidekanten. (D - G) Immunofluorescent farging av basal sving postnatal dag 1 (P1) villtype cochleae. Phalloidin etiketter trådformede aktin i stereocilia og kortikale aktin på celle periferien (D, E, G). Myosin-7a er en markør for indre og ytre hårceller (E). Zo_1 etiketter trange veikryss i mellom celler, noe som gjør det til et flott markør for å skille celle boundaRies (F). Acetylerte α-tubulin brukes som en markør for den kinocilium ved toppunktet av bunten (F, G hvit pil). Interne mikrotubuli er også merket av acetylert α-tubulin, som er spesielt rik på søyle celler (G hvit asterix). Scale barer A: 10 mm, B: 5 pm, C: 1 mikrometer, DG. 5 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Cochlear Phenotype i Cilia Mutants. (A) Merket forkorting av Ift20 CKO / CKO cochlea kanaler i forhold til kontroll. Dissekert cochlea kanaler på E18.5 farget med acetylert tubulin. (B Bbs8 - / - mutant (P0). Phalloidin-merket trådformede aktin, stereocilia (rød), acetylert tubulin, kinocilia (grønn). Stereociliary bunter i Bbs8 - / - cochleae er variabelt roteres (pil høyre), flat og / eller mislocalized (midten pil). Kinocilia er mislocalized eller axonemes mangler (pil venstre). (C - F) Høyere forstørrelse SEM av stereociliary bunter og kinocilia i Bbs8 - / - OHCs. I C, roteres bunter i D, flat pakke, i E, sirkulære bunter og i F mislocalized kinocilia. (G - I) skjematiske fremstillinger av bunt abnormitet kvantifisering. (G) Venstre, pakke konveksitet (høyde); den korteste avstanden mellom topp-punktet av bunten og den linje som strekker seg gjennom begge ender av bunten armer '. som depicted av solid svart linje. Høyre, området under bunt; området. (H) skjematiske fremstillinger av kriteriene som brukes for å kvantifisere orientering stereociliary bunter. Rotasjonsvinkelen av bunten er beregnet i forhold til en linje som strekker seg vinkelrett i forhold til raden av pilar celler. (I) Skjematisk fremstilling av kriteriene for posisjon analyse av kinocilia og stereociliary bunter. En segmentert risten er lagt over omkretsen av hår cellen og den posisjon notert. (J) Høyere forstørrelse bilde av phalloidin-merket stereocilia bunter (rød) og acetylerte tubulin-merket kinocilia (grønn) av ytre hårcellene i P0 cochlea. I den tilstøtende monokromatisk panel, røde linjer identifisere kinocilia, som er lengre i Cep29 rd16 / rd16 mutanter sammenlignet med kontrollgruppen (hvite piler). (K) SEM micrograph av embryonale cochlea med ufullstendig fjerning av tectorial. Scalebarer A: 100 mikrometer, B: 5 pm, C - F: 2,5 mikrometer, jeg: 5 mikrometer, J: 50 mikrometer. (A - F)... Endret fra mai-Simera et al, 2015 8, J opptrykk med tillatelse fra Rachel et al, 2012 27 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når du forbereder cochlea vev for analyse, er det noen viktige punkter å huske på. For det første, kan forskjeller i genetisk bakgrunn endre cochlea fenotype, noe som gjør det nødvendig å analysere og sammenligne bare kullbror kontroller. Dernest er fullstendig fjerning av tectorial nødvendig for å oppnå de beste bildene med immunhistokjemi og er avgjørende for SEM. Den tectorial er en ugjennomsiktig struktur og kan skjule cellene i sensorisk epitel rett under den, slik bildebehandling mer utfordrende. Av og til under behandlingen, kan tectorial krympe tilbake, avdekke hårcellene. Selv i disse tilfellene fjerning på det sterkeste. Dette trinnet krever tålmodighet og praksis. For det tredje kan immunhistokjemi ved hjelp av antistoffer mot ciliare proteiner, spesielt de som lokaliserer til den høyt sammenpressede basal legeme, være vanskelig og kreve optimalisering. Vurdere å utføre antigen henting, intensiverer permeabilvisualisering trinn, eller redusere konsentrasjonen eller tidspunktet for fiksering. Til slutt, når bildebehandling kinocilium (primær cilium funnet på cochlea hårcellene) husk at det begynner å trekke fra P0 - P1 og utover i en base-til-apex gradient. Derfor, ved måling av lengden av kinocilium er det viktig å sammenligne hårcellene fra den samme regionen i sneglehuset og i alders matchet dyr. De interkalerte støtte Cellene har også primærflimmerhårene, som ikke trekkes inn. Hensyn må tas for å skille mellom støtte celle flimmerhårene og håret celle kinocilia.

Som mus modnes, blir det stadig vanskeligere å utføre en ren isolere cochlea sensorisk epitel, på grunn av forkalkning i timelige bein og bein labyrinter. Avkalking av vevet er nødvendig, noe som ikke alltid er forenlig med ytterligere immunolocalization teknikker, men tillater for undersøkelse av brutto fenotype og er også kompatibel med SEM preparat. Innavlet muse strains viser ofte auditive defekter som hår celle tap eller forhøyede auditive hjernestammen respons (abrs), på grunn av mutasjoner i kjente auditive gener eller endrings gener. Derfor er det viktig å sammenligne alders matchet kull kontroller eller avle på en alternativ genetisk bakgrunn.

En av begrensningene i denne analysen er at i mus, begynner kinocilium å trekke post fødselen og er ikke lenger til stede på voksen hårcellene. Av denne grunn kinocilia målinger kan bare gjøres i utviklingen av vev. Også er det nødvendig å nøye velge alders matchet kontroller for sammenligninger mellom mutant og kontrollprøver. En annen begrensning er at ciliary mutant mus analysert så langt viser ikke alvorlige hørselsfunksjon (ie., Auditive hjernestammen respons, abrs eller otoakustisk emisjon, OAEs) selv når cochlea utvikling er svekket. I samsvar med dette, hørselsskader er ikke et vanlig menneske ciliopathy fenotype. Eksepsjonelt, tap av hearing er en av de primære funksjonene til Alström syndrom, forårsaket av mutasjoner i den basale kroppsprotein ALMS1 28,29. Dette tyder på at stereociliary bunt morfologi ikke nødvendigvis er knyttet til auditiv dysfunksjon i cilia mutanter, sannsynligvis på grunn av korrigerende reorientering av bunter senere i utvikling som har blitt rapportert for Vangl2 CKO mutanter 30. Hvis ciliopathy spekteret er utvidet til å omfatte Usher syndrom, den vanligste medfødt årsak til døvblindhet, så hørselsfunksjon blir svært relevant. Nyere data har vist at flere proteiner knyttet til Usher syndrom også lokalisere til cilium og er involvert i ciliary relaterte prosesser 31, men om disse proteinene forholde seg til PCP signale har ennå ikke blitt undersøkt.

Inntil nå har de fleste stråle mus mutanter analysert for cochlea PCP defekter har bare blitt vagt undersøkt. Teknikkene beskrevet i dette manuskriptet tillater en omfattende detaljering avcochlea fenotype, som utvilsomt vil føre til en mer presis forståelse av stråle engasjement i å etablere virveldyr PCP signalering. Til tross for det store antallet ciliopathy musemodeller tilgjengelig, har overraskende få blitt analysert i forhold til cochlea PCP defekter. En vanlig fallgruve i forbindelse med disse modellene er embryonale dødelighet. Imidlertid, siden det fremkallende sneglehuset kan undersøkes embryonically rollen av flimmerhårene i PCP i den tredje øre kan fremdeles undersøkes. Videre kan veldig tidlig embryodødelighet omgås ved hjelp av betinget knockouts. Foxg1 Cre 32 mus, tilgjengelig fra JacksonLaboratories, blir ofte brukt til å inactivategenes av interesse i thedeveloping indre øret fra E8.To Hittil har arbeidet fokusert primært på å undersøke sykdomsfremkall ciliopathy gener men utforskning av andre cilia relaterte proteiner og hvordan disse påvirker PCP signale under utvikling kan gi større innsikt i cilia biologi og funksjon.

Hvis en auditiv fenotype er mistenkt i musemodeller blir analysert, mulige videre analyser inkluderer audiometrisk testing av abrs 33 eller OAEs 34. Cochlea eksplantat forlengelses analyser (som beskrevet i May-Simera et al., 2012 25), kan også utføres, og gir mulighet for identifisering av konvergerende forlengelse defekter ved tidligere utviklingsmessige tidspunkter. Dyrking av cochlea explants gir også mulighet for behandling med ulike signalaktivatorer eller hemmere, som kan endre explant forlengelse, og dermed bidra til mekanistisk forståelse av utviklingsmessige prosessene som er involvert. Selv om det er kjent at kinocilium trekkes etter fødselen 11,13,14, dette tilbaketrekning har ikke blitt grundig behandlet i sammenheng med ciliary mutanter. Det ville være av interesse å ta tidsbestemte målinger av kinocilia veksten og tilbaketrekkingen i cilia mutants.Considering at en primær rolle for stråle proproteiner er bevegelse av gods langs mikrotubuli, er det svært sannsynlig at disse proteinene kan også regulere sider ved intracellulær trafficking langs cytoskjelettet 35-37. En undergruppe av flimmerhårene proteiner har vist seg å påvirke menneskehandel og asymmetrisk lokalisering av PCP molekyler 8. Lokalisering av immunhistokjemi av PCP molekyler, spesielt membranassosierte proteiner som Vangl2, Frz3 og Dsh, anbefales derfor å etablere hvis PCP molekyler mislocalized. Etablering av polaritet synes å være en mangefasettert affære, og det er bevis på for en ekstra celle autonom vei, som også er nødvendig for riktig PCP i sensoriske hårcellene 38. En nyere artikkel viste at G-protein-avhengig signalisering kontrollerer vandringen av cilium i en celle-autonome måte 39. I overensstemmelse med en rolle for ciliare proteiner i lokalisering av polaritet molekyler, heterotrimeric G-protein a-subenhet i 3 (Gαi3) localization blir forstyrret i Bbs8 og Bbs6 knockout cochlea 8,39.

Skille rollen individuelle ciliary komponenter og deres forskjellige effekter på PCP signale vil gi oss større innsikt i rollen som cilium i å etablere riktig polaritet. Av særlig betydning er å skille mellom ciliare proteiner fungerer i en stråle sammenheng, sammenlignet med ikke-ciliare funksjoner av tradisjonelt ansett ciliare proteiner, slik som deres rolle i regulering av ikke-ciliare relaterte intracellulær handel. Den høye grad av regularitet i mange aspekter av cochlea-struktur, herunder cellular mønster og stereociliary bunt orientering, gjør det mulig å oppdage subtile endringer i utviklingen av PCP i respons til enten genetisk eller molekylære forstyrrelser i cilia relaterte proteiner. Tatt i betraktning at det er mange strålemusemodeller tilgjengelig, og at utviklings mus sneglehuset er en av de beste stedene å undersøke PCPsignalering, er det av stor interesse for å lære i hvilken grad den enkelte protein mutasjoner forstyrre cochlea utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatteren ønsker å takke Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer og Zoe Mann og for deres kritisk vurdering av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Sofja Kovalevskaya Award (Humbodlt Foundation) og Johannes-Gutenberg-universitetet, Mainz, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Silicone elastomere - Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761028-5EA See Note 2
Micro dissecting scissors-straight blade Various
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps Various
Dissecting microscope. Various
Uncoated glass microscope slides Various
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) Various
Transfer pipettes Various
Minutien pins  Fine Science Tools 26002-10
SEM sample holder tousimis 8762
Scanning electron microscopy studs TED PELLA 16111
PELCO Tabs: Carbon adhesive TED PELLA 16084-3
Fluorescent Microscope Various
Critical Point Dryer Various
Scanning Electron Microscope Various
Glass microscope slides Various
Glass coverslips Various
Kimwipe Tissue  Various
Fine Paint Brush
Reagents
1× Phosphate buffered saline (PBS) Gibco/Life Technologies 10010023
Paraformaldehyde  (PFA) (EM Grade Required for EM) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM.
2.5% Glutaraldehyde Grade1 Sigma-Aldrich G5882
Tris-HCl (pH 7.5) Various
NaCl Various
CaCl 2 Various
Triton X-100 Various
Normal Goat Serum Various
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-007-003
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Technologies 14065
Hepes Gibco/Life Technologies 15630-080
Osmium tetroxide (OsO4 ) Sigma-Aldrich/Fluka Analytical 75632
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Ethanol 200 proof Various
Antibodies
anti Arl13b Protein Tech 17711-1-AP Suggested concentration 1:1,000
anti acetylated tubulin (611-B1) Sigma-Aldrich T6793 Suggested concentration 1:800
anti gamma tubulin (GTU-88) Sigma-Aldrich T6557 Suggested concentration 1:200
anti Zo_1  Invitrogen 40-2300 Suggested concentration 1:500
Myosin VI Proteus Biosciences 25-6791 Suggested concentration 1:1000
Myosin VIIa Proteus Biosciences 25-6790 Suggested concentration 1:1,000
anti Vangl2 Merk Millipore ABN373 Suggested concentration 1:250
anti Gαi3 Sigma-Aldrich G4040 Suggested concentration 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:300 - 1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  2. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7 (2012).
  3. Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).
  4. Ezan, J., Montcouquiol, M. Revisiting planar cell polarity in the inner ear. Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).
  5. Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways. Cell. 131, 1378 (2007).
  6. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37, 980-985 (2005).
  7. Montcouquiol, M., et al. Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals. Nature. 423, 173-177 (2003).
  8. May-Simera, H. L., et al. Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea. Development. 142, 555-566 (2015).
  9. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nat Genet. 40, 69-77 (2008).
  10. Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hearing research. 22, 117-146 (1986).
  11. Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Development of the hair bundle and mechanotransduction. The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).
  12. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse. J. Neurocytol. , 821-835 (1999).
  13. Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates. Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).
  14. Denman-Johnson, K., Forge, A. Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse. Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).
  15. van Dam, T. J., et al. The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium. Cilia. 2, 7 (2013).
  16. Blacque, O. E., Sanders, A. A. Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease. Organogenesis. 10, 126-137 (2014).
  17. Wallingford, J. B., Mitchell, B. Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia. Genes & development. 25, 201-213 (2011).
  18. Borovina, A., Ciruna, B. IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development. Cell reports. 5, 37-43 (2013).
  19. Huang, P., Schier, A. F. Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia. Development. 136, 3089-3098 (2009).
  20. Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo. PloS one. 4, e6839 (2009).
  21. Jones, C. G. Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM. Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).
  22. Curtin, J. A., et al. Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse. Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).
  23. Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).
  24. Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).
  25. May-Simera, H., Kelley, M. W. Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea. Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).
  26. Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development. PloS one. 7, e31988 (2012).
  27. Rachel, R. A., et al. Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis. J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).
  28. Jagger, D., et al. Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity. Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).
  29. Collin, G. B., et al. The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway. PloS one. 7, e37925 (2012).
  30. Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).
  31. Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies. Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).
  32. Hebert, J. M., McConnell, S. K. Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures. Dev Biol. 222, 296-306 (2000).
  33. Willott, J. F. Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B (2006).
  34. Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions. Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C (2006).
  35. Finetti, F., et al. Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse. Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).
  36. Sedmak, T., Wolfrum, U. Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina. J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).
  37. Yuan, S., Sun, Z. Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia. Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).
  38. Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells. Developmental cell. 27, 88-102 (2013).
  39. Ezan, J., et al. Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton. Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).

Tags

Medisin Primær Cilia Kinocilium Planar Cell polaritet Cochlea mus hårceller stereocilia Wnt signal
Evaluering av Planar-Cell-polaritet fenotyper i Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

May-Simera, H. Evaluation of… More

May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. J. Vis. Exp. (108), e53559, doi:10.3791/53559 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter