Summary
Vi presenterar en metod för att isolera den vuxna organ Corti som tre intakta cochlea varv (apex, mellersta och bas). Vi visar också ett förfarande för immunfärgning med fluorescerande taggade antikroppar. Tillsammans har dessa tekniker möjliggör studiet av hårceller, stödjande celler och andra celltyper som finns i snäckan.
Introduction
Den spiralformade snäckan i innerörat, som finns i temporalbenet, inrymmer Cortis organ, hörsel sensoriska änden organ i däggdjur. Snäckan är tonotopically organiserade och ofta delas in i apikal, mitten och basal vänder motsvarar olika frekvensområden med högfrekvent ljud upptäckt i botten och låg detektionsfrekvens i spetsen 1. Hårceller, de mechanosensory celler i organ Corti, kör längden på snäckan, vilket är cirka 6 mm långt i möss 2,3. Dessa celler omvandlar den mekaniska energin i ljudvågor, som sänds genom den vätskefyllda membranös labyrint, till neurala signaler som behandlas av centrala hörsel strukturer. Den teknik som beskrivs här ger en metod för att framställa hela monteringar av organ Corti efter förkalkning av cochlea är klar (för prover som sträcker sig från en veckas ålder till vuxen ålder). Vi presenterar också en metod för immunostaining alltsammans monterat cochlea vävnaden. Cochlear hela fästen är avgörande för visualisering av alla hårceller och omgivande stödjande celler i deras naturliga rumsliga arrangemang och möjliggöra analys i tre dimensioner med hjälp av konfokalmikroskopi.
Drs. Hans Engström och Harlow Ades beskrev ursprungligen en hel montera cochlea dissekeringsmetod 1966. De detaljerade en teknik för att snabbt fixa och dissekera förkalkad hörselsnäckor nedsänkt i vätska från en mängd olika däggdjur, bevara korta intakta delar av organ Corti för mikroskopisk analys 4. Dissektion av en ofixerade, förkalkad råtta snäckan har också visats i en instruktionsvideo 5. Drs. Barbara Bohne och Gary Harding vid Washington University gjort flera viktiga ändringar till denna metod. I sin version av cochlea hela berget metod, tinningbenet var avkalkades, inbäddad i plast, och fem halvvarv eller tio kvartsvarv var dissecTed 6,7. Dr Charles Liberman och kollegor på Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts öga och öra Infirmary, ändrat denna teknik så att plast inbäddning inte krävdes 8. Ytterligare modifiering av tekniken inträffade i Dr Jian Zuo labb vid St Jude Barnens Research Hospital 9-12 som informerade dissektion metod som presenteras här. Vi använder en annan strategi för att få tillgång till organ Corti än Bohne och Liberman, vilket möjliggör isolering av fullständig apikala, mitten och basala varv. Dissekerade vävnaden är alltså större och mindre benägna att förloras eller skadas under dissekering eller immunfärgning processer. Dessutom underlättar den nuvarande metoden mätning av avståndet från den apikala spetsen eller basala krok för att identifiera ett frekvensområde.
Även om många laboratorier utför immunfärgning av cochlea vävnad, är det oklart om detta förfarande har sitt ursprung. Som ett resultat finns det olika recept för att blockera buffers och antikropps inkubationsbuffertar som kan påverka resultatet för enskilda primära antikroppar. Här presenterar vi en metod för immunfärgning med fluorescerande taggade antikroppar som är tillämplig på de vanligaste antikroppar i hörselområdet.
Den komplexa formen av snäckan, delikat struktur organ Corti, och beniga inneslutning ger en utmaning för histologisk och biokemisk analys. En mängd olika tekniker används för närvarande i förhöret området att övervinna dessa svåra funktioner och visualisera celler i organ Corti, varje teknik med sina egna fördelar och nackdelar. Protokollet presenteras här möjliggör hela berget dissekering av den vuxna musen snäckan och med liten ändring, kan potentiellt användas för att undersöka de kritiska strukturer inom hörselsnäckor från en mängd andra modellorganismer som används inom området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Southern Illinois University School of Medicine.
1. Utvinning av Temporal Bones
- Identifiera tidsmässiga ben i basen av musen skallen 13 och skrapa bort kranialnerverna användning av standardmönster pincett.
- Placera standardmönster pincett vid spetsen av öron kapseln och med tummen på den andra handen trycker ner på den bakre halvcirkelformade kanalen för att få bort den inkapslade snäckan.
- Frigör den nedre halvan av tinningbenet från skallen manuellt med tummen och pekfingret eller genom användning av 10,5 cm fina saxar.
2. Post-fix Temporal Bones
- Placera tidsmässiga ben i 2 ml mikrocentrifugrör innehållande 250 - 500 | j, l 4% paraformaldehyd (PFA) utspädd i 10 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,4 och incubåt vid RT i två - 20 h.
OBS: Det behövs ingen öppning av apikala lock eller injektion av PFA i runda eller ovala fönstret. Rekommenderar användning av metanol fri, ultrarent, elektronmikroskopi (EM) betyg PFA som kan köpas på en 16% koncentration i glasflaskor. När en injektionsflaska öppnas och späddes 1: 4 i PBS, vilket gör en 4% lösning, kan den användas i upp till 2 veckor vid förvaring vid 4 ° C (Vissa antikroppar kräver kort fixering och andra kan tolerera O / N (O / N) fixering).
3. Avkalka Temp Bones
- Efter fixering, ta bort PFA med hjälp av en pipett och ersätta med 120 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), drygt 2 ml. Se till att fylla hela 2 ml mikrocentrifugrör att förhindra luftbubblor när röret är stängd.
- Om inte avkalkning omedelbart byta PFA med 10 mM PBS pH 7,4 och lagra prover vid 4 ° C
OBS: Efter fixering kan temporal ben lagras för variable mängder av tid innan avkalkning beroende på antigenerna som undersöks.
- Om inte avkalkning omedelbart byta PFA med 10 mM PBS pH 7,4 och lagra prover vid 4 ° C
- Placera rören i sträck-over-end rotator och rotera vid 4 rpm vid RT. Ändra EDTA-lösning dagligen med hjälp av en pipett. Längd av avkalkning beroende på ålder av provet och preferens för forskare att göra dissekering.
- Inkubera tids ben i EDTA enligt följande riktlinjer för inkubationstider:
För prover postnatal dag (P) 8 till P15: 2-4 h; För prover P15 till P21: O / N; För prover P21 till P30: 2 O / N; För prover som är äldre än P30: 3 eller fler O / N.
OBS: avkalkning tider är föremål för användarnas önskemål och kan utökas efter behov. Avkalkning tiden kan minskas genom att ändra EDTA-lösningen två gånger om dagen, ungefär 8 h mellanrum. Vissa labs tillsätt 1% PFA till EDTA-lösning när avkalkning längre än 3 dagar att förhindra kontaminering.
- Inkubera tids ben i EDTA enligt följande riktlinjer för inkubationstider:
- För att bestämma om provet är tillräckligt avkalkas, placera tids ben ona silikonelastomerbelagda dissektion skålen och tryck försiktigt pincett på snigelformade snäckan. Om vävnaden är spongey, då urkalkning är klar.
- När urkalkning är klar, ta bort EDTA med hjälp av en pipett och tillsätt 500 -1000 pl 10 mM PBS pH 7,4. Förvara proverna vid 4 ° C tills redo att dissekera.
4. Skapa Silikon Elastomer belagda Dissection Dish
- Kombinera bas och härdare av en silikonelastomer inkapslings kit enligt tillverkarens anvisningar och blanda väl.
- Tillsätt cirka 2 - tre matskedar kolpulver tills lösningen är svart och blanda väl.
OBS: Flytande bläck eller flytande kol kommer inte blandas med lösningen och kan inte användas. Silikon elastomer encapsulant kit kan köpas i svart, vilket gör att steg 4,2 utelämnas. - Häll lösningen i 60 mm glas eller plastpetriskålar, fyller tillräckligt att belägga botten. Om BUbbles är närvarande, puff med luft på ytan. Låt stå i minst 24 timmar vid RT för att ställa in.
OBS: Silikon impregnerade med elastomer rätter kan användas flera gånger i år. Men använd inte etanol för rengöring, eftersom detta kommer att orsaka silikonelastomeren att knäcka.
5. Hela Mount Dissekering av Cochlea (för P7 och äldre prover)
- Separera basala tur från mitten / apikala varv
- Placera en avkalkades tinningbenet i en silikonelastomerbelagd dissektion skål fylld två tredjedelar med 10 mM PBS pH 7,4 och använda en stereo dissektion mikroskop för följande steg.
- Håll tinningbenet i vestibulära region med # 4 eller # 5 raka juvelerare pincett och använda 5 mm Vannas-Tübingen våren sax, skär bort överflödigt öron kapsel vävnad längs sidorna och ovanför spetsen.
- Använda 2,5 mm Vannas våren sax, sätta ett blad i ovala fönstret och göra flera små snitt längs spiral ligament / lateralvägg av den basala tur.
- Användning av 5 mm Vannas-Tübingen våren sax, sätta ett blad i regionen bara klippa och placera det andra bladet på utsidan tinningbenet, mediala till ovala fönstret. Denna nedskärning separerar den basala varv från mitten och apikala svängar.
- Komplett dissektion av den basala tur.
- Använda 2,5 mm Vannas våren sax, klippa spiral ganglionnervfibrer som ansluter till modiolus att släppa spänningen i den basala tur och skär under basala tur att separera från vestibulära organ.
- Använda 2,5 mm Vannas våren sax, göra en serie små nedskärningar för att ta bort spiral ligament / sidovägg från både över och under organ Corti. Använd # 4 eller # 5 raka juvelerare pincett för att styra vävnaden. Nåla fast spiral ganglion nervfibrerna till silikonelastomeren belagda dissektion maträtt, men inte hålla fast denna region som vävnaden kommer att riva.
- Under de tidigare stegen, några av Reissner s membrane kommer ofta bort. Om någon fortfarande, ta tag i Reissner membran med # 4 eller # 5 raka juvelerare pincett och dra bort från organ Corti.
OBS! Takhinnan är sällan synliga och vanligtvis flyter bort utan att kräva en viss steg bort. - Slutligen göra flera snitt för att minska tjockleken av spiralganglion axoner, för att göra tur så platt som möjligt och använda # 4 eller # 5 rak jeveleraraffärer pincett för att överföra dissekeras basala tur, genom att gripa de återstående axonerna hos spiralganglion, till en 48-brunnsplatta (eller kammare slid) innehållande ~ 500 | il av 10 mM PBS, pH 7,4.
- Separat mitten och apikala varv
- Placera de återstående två tredjedelar av snäckan, apikala sidan nedåt.
- Använda 2,5 mm Vannas våren sax, sätta ett blad i scala media där mittre används för att anslutas till basala tur och göra flera små snitt längs spiral ligament / sidovägg the mittre.
- Användning av 5 mm Vannas-Tübingen våren sax, sätta ett blad i regionen bara klippa med mittre placeras ovanpå bladet och placera det andra bladet på utsidan benlabyrinten, vid en 90 ° vinkel från den apikala spetsen. Detta skiljer mittre från apikala tur.
- Komplett dissektion av mittre på ett liknande sätt till den basala varv (se steg 5.2.2 till 5.2.4).
- Komplett dissektion av apikala tur.
- Använda 2,5 mm Vannas våren sax, öppna locket som täcker apikala tur. Komplett dissektion på ett liknande sätt till den basala varv (se steg 5.2.2 till 5.2.4).
OBS: Dissekerade cochlear svängar kan lagras i 10 mM PBS, pH 7,4 i en 48-brunnsplatta (eller kammare slid) vid 4 ° C under flera veckor före immunfärgning. PBS kommer emellertid avdunsta och måste periodiskt fyllas och lagring längre än 2 - 3 veckor kan resultera i bakteriell eller svamptillväxt påvävnad som kan minska kvaliteten på bilden. Vi rekommenderar långsiktig lagring av prover som undissected tids ben.
- Använda 2,5 mm Vannas våren sax, öppna locket som täcker apikala tur. Komplett dissektion på ett liknande sätt till den basala varv (se steg 5.2.2 till 5.2.4).
6. Immunofärgning med fluorescensmärkta antikroppar
- Efter dissektion, lagra varje kokleär varv i en separat brunn i en 48-brunnsplatta (eller kammare glida), nedsänkt i ~ 500 | il av 10 mM PBS, pH 7,4. För vart och ett av följande steg Cochlear sin tur bör vara nedsänkt i vätska, inte flyter ovanpå eller fastnat på sidan av brunnen.
OBS: När du tar bort vätska från varje brunn, är det lätt att förlora cochlea svängar eller suga upp i pipettspetsen. Ändra lösningar med 200 mikroliter pipettspets med hjälp av en dissektion omfattning kommer att bidra till att förhindra detta. - Med hjälp av en pipett, ta bort PBS från varje brunn och ersätt med ~ 200-300 il per brunn av blockerings / permeabilization lösning (1% Triton X-100, 1% bovinserumalbumin (BSA), och 10% normalt getserum (NGS) utspädd i 10 mM PBS pH 7,4). Inkubera 1 h vid RT på en 3D-rotator.
OBS: Om någon primär antikropp som användes gjordes i en get värd, sedan en sekundär anti-getantikropp kommer att behövas och NGS skall INTE användas för något av stegen. Normalt hästserum kan användas som en ersättning för NGS. - Avlägsna blockerings / permeabilization lösningen med en pipett och ersätta med ~ 100 | il per brunn av primär antikroppslösning (0,1% Triton X-100, 1% BSA, och 5% NGS utspädda i 10 mM PBS, pH 7,4). Utspädningsfaktorn för varje primär antikropp varierar. Inkubera O / N (minst 14 timmar) vid 4 ° C på en 3D-rotator.
OBS: Om mer än en primär antikropp används, allt kan kombineras till samma lösning för inkubation, bara se till att varje primär antikropp har en annan värd. - Ta bort primära antikroppen lösningen med en pipett och utföra 3 tvättar av 10 mM PBS pH 7,4 vid ~ 500 l per brunn. Varje tvätt ruvar minst 5 minuter vid RT på en 3D-rotator.
- Ta bort sista PBS tvätta med hjälp av en pipett och ersätt med ~ 100 | il per brunn av sekundär antikroppslösning (0,1% Triton X-100, 1% BSA och 5% NGS utspätt i 10 mM PBS pH 7,4). Utspädningsfaktorn för varje fluorescensmärkta sekundära antikroppen är vanligen 1: 500 eller 1: 1000. Placera 48-brunnar i en svart låda för att skydda fluorescerande taggade sekundära antikroppar från ljus. Inkubera 2-3 h vid RT på en 3D-rotator.
OBS: Om det behövs mer än en sekundär antikropp, kan de kombineras i samma lösning för inkubation. Se till att det inte finns någon möjlighet för kors märkning (t.ex.., Med användning av get anti-kanin och kyckling anti-get sekundära antikroppar) - Ta bort sekundär antikropp lösningen med en pipett och utföra 3 tvättar av 10 mM PBS pH 7,4 vid ~ 500 l per brunn. Inkubera varje tvätt i minst 5 minuter vid RT på en 3D-rotator. Håll 48-brunnar i en svart låda för att skydda mot ljus.
- Ta bort sista PBS wash med en pipett och ersätt med ~ 100 | il per brunn av Hoechst 33.342 (utspädd 1: 2000 i 10 mM PBS, pH 7,4) för att märka cellkärnor. Inkubera 15 - 20 min vid RT på en 3D-rotator. Håll 48-brunnar i en svart låda för att skydda mot ljus. INTE inkubera längre än 20 minuter.
- Ta Hoechst lösningen med en pipett och utföra 3 tvättar av 10 mM PBS pH 7,4 vid ~ 500 l per brunn. Inkubera varje tvätt i minst 5 minuter vid RT på en 3D-rotator. Håll 48-brunnar i en svart låda för att skydda mot ljus.
- Alla steg kan förlängas, utom Hoechst inkubation, med flera timmar om det behövs. För att pausa reaktionen vid något skede, bara dränka prover i ~ 500 ul av 10 mM PBS pH 7,4 och lagra 48 -Ja plattan (eller kammare bild) vid 4 ° C tills redo att återuppta protokoll timmar eller 1 - 2 dagar senare .
7. Montera Cochlear Slår på diabilder
- Etikett glider med relevant information om provet och antikroppar som används.
- Pipett ~ 50 il monterings media på varje bild och var försiktigför att förhindra bubblor. Centrifugera röret med monterings media för att avlägsna eventuella bubblor.
- Använda # 4 eller # 5 raka juvelerare pincett, ta tag i axoner av spiralganglion att försiktigt överföra en cochlea varv från 48-brunnar till bilden och placera i monterings media. Mount ett cochlea varv per bild för att förhindra ljusexponering och fotoblekning under avbildningsprocessen.
- Använd en stereo dissektion mikroskop för att se till att cochlea tur inte är vikt, vridet, eller i närheten av en luftbubbla. Om något av detta inträffar, använd # 4 eller # 5 raka juvelerare pincett omplacera cochlea tur.
- Placera en ände av ett täckglas på objektglaset och släpp försiktigt för att låta täck falla.
- Använd en stereo dissektion mikroskop för att se till att cochlea tur inte är vikt, vridet, eller i närheten av en luftbubbla. Om något av dessa inträffar, försiktigt flytta täck och tillbaka för att flytta cochlea tur.
- Placera objektglaseni en bild mapp, så att de ligga platt. Låt montering media bota O / N vid RT (håll i mörker)
- Seal täck med genomskinligt nagellack och förvara vid RT eller -20 ° C tills avbildas. Diabilder kan lagras i ett bildspel mapp eller bild box.
OBS: Diabilder kan lagras på lång sikt vid -20 ° C eller -80 ° C och fluorescens kommer att upprätthållas under flera månader. - Bild glider med hjälp av en konfokalmikroskop med lämplig våglängd baserad på de sekundära antikroppar som används under immunfärgning förfarandet. Ljusstyrka och kontrast justeringar kan utföras med hjälp av bildbehandlingsprogram som tillhandahålls av konfokala säljaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar en metod för att isolera organ Corti som tre intakta cochlea varv (apex, mellersta och bas) från cochlea vävnad som är förkalkad, med viktiga dissektion steg som presenteras i figur 1. Under första postnatal veckan i utveckling, förkalkning av mus snäckan är ofullständig och ett enklare dissektion metod kan användas 13. Använda neonatal hela berget dissekeringsmetod med cochlea från P7 och äldre möss resulterar i tårar och fragmentering av organ Corti. Spiral ligament / sidovägg är nu mer ordentligt fastsatt och inte kan skalas bort från det sensoriska epitel utan att orsaka skada. Således behövs "vuxna" hela berget dissekeringsmetod för prover som är äldre än P6. Vi presenterar ett exempel på mittre av en P15 mus cochlea som har dissekeras och immun med hårceller och stödjande cellmarkörer (Figur 2). Optiska Tvärsnitt cen också erhållas med hela berget tekniken (figur 3).
Flera problem kan uppstå under hela berget dissektion eller vid montering av cochlea slår på objektglas. Under avlägsnandet av spiral ligamentet / sidovägg, det finns ett smalt fönster mellan skärning för mycket eller inte tillräckligt. Cuts som inträffar intill den sista raden av yttre hårceller kan orsaka hårcellerna i denna sista raden att montera vid olika vinklar (Figur 4A). Nedskärningar som är för stora kan ta bort delar av organ Corti (Figur 4B). Hantering av provet med pincett tar stor omsorg och ofta finns det hål i organ Corti där tång var missriktade (Figur 4C). Slutligen vid montering av cochlea varv, kan organ Corti vik som skymmer bilden (Figur 4D).
Figur 1. viktiga steg i hela Mount Dissekering av "Adult" Mus Cochlea. (A) efter protokoll steg 5.1.4, är den basala sekelskiftet snäckan separeras från mitten / apikala svängar, men fortfarande sitter i vestibulära regionen. (B) Efter protokollsteg 5.3.3 är den mittre separeras från apikala tur. (C) Exempel på den färdiga dissekering av en mittre där spiral ligament / sidovägg tas bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Confocal Skiva Bild av USAVänd Isolerad från en P15 mus. Fyra 20x bilder överlagras för att rekonstruera hela mittre. Hårcellerna är märkta med en kanin-anti-myosin VIIa primär antikropp (1: 200 spädning) i kombination med en åsna anti-kanin-Alexa 488-konjugerad sekundär antikropp (1: 1000 utspädning) (magenta). Stödjande celler märks med en get-anti-Sox2 primär antikropp (1: 500 spädning) i kombination med en åsna anti-get Alexa 568-konjugerad sekundär antikropp (1: 1000 utspädning) (grönt). Hoechst (blå) etiketter alla kärnor. Bilden togs med hjälp av en Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop med 405, 488 och 555 våglängder. Skala bar = 100 um. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Optisk Tvärsnitt av medel Turn Isolerad från en 6-veckors gamla mus. (A) Confocal skiktbild av hela beredningen fästet (botten) och optisk tvärsnitt i XZ-planet (överst). (B) En ökad förstoring av den övre panelen i (A), med hårkorset borttagna. Hårcellerna är märkta med en kanin-anti-myosin VIIa primär antikropp (1: 200 spädning) i kombination med en åsna anti-kanin-Alexa 647-konjugerad sekundär antikropp (1: 1000 utspädning) (magenta). Stödjande celler märks med en get-anti-Sox2 primär antikropp (1: 500 spädning) i kombination med en åsna anti-get Alexa 568-konjugerad sekundär antikropp (1: 1000 utspädning) (grönt). Bilden togs med hjälp av en Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop med 405, 555 och 647 våglängder. Skala barer = 20 um Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
Figur 4. Exempel på problem som kan uppstå under hela Mount Dissection eller vid montering Cochlear Sätter på diabilder. (A) på den vänstra sidan av bilden, var cochlea vävnaden skär bredvid den sista raden av yttre hårceller orsakar många av dessa celler för att monteras vid olika vinklar. (B) En del av Cortis organ på den vänstra sidan av bilden har skurits av. (C) Det finns ett hål stansas i den yttre hårceller regionen i mitten av den image. (D), är det organ Corti vikta på flera ställen. Bilder togs 4-8 veckor gamla mus hörselsnäckor. Hårcellerna är märkta med en kanin-anti-myosin VIIa primär antikropp (1: 200 spädning) i kombination med en get-anti-kanin-Alexa 488-konjugerad sekundär antikropp (1: 1000 spädning), eller ett åsne-anti-kanin-Alexa 488-konjugerad sekundär antikropp (1: 1000 utspädning) (magenta). I C yttre hår cells är märkta med en get-anti-Prestin primär antikropp (1: 200 spädning) i kombination med en åsna anti-kanin-Alexa 568-konjugerad sekundär antikropp (1: 1000 utspädning) (grönt). Bilder togs med hjälp av en Leica SP5 konfokalmikroskop med 405, 488 och 555 nm våglängd. Skalstrecken: i AB = 20 pm; CD = 40 pm. klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga steg för en framgångsrik hela montera dissekering och immunfärgning. Men innan någon av dessa metoder utförs, krävs korrekt fixering av cochlea vävnaden. Vi rekommenderar användning av metanol fri, ultrarent, EM klass PFA. PFA gjord av pulvret kan ha spår av metanol och en instabil pH som minskar kvaliteten på immunofluorescens. Andra grupper har också visat att liknande dissektioner är möjligt med fixatives som inte innehåller formaldehyd 14-16. Längden av fixering är också viktig och är antikropp specifik. Vissa antikroppar kan tolerera en O / N fixering, medan andra inte fungerar bra med bara en timme i PFA (men detta är sällsynt). Enligt fixerad vävnad kan vara problematiskt för dissekering förfarandet som vävnaden faller isär. Enligt vår erfarenhet en 3 - 4 h fixering ger tillräcklig fixering och stör inte majoriteten av primära antikroppar som vanligen används i utfrågningen fältet.
jove_content "> Det är också möjligt att EDTA kan störa primära antikroppar,. därmed vissa antikroppar kommer att fungera bra i neonatal vävnad, men inte i P7 eller äldre vävnad som avkalkas Efter fixering kan temporal ben lagras för varierande mängder av tid före avkalkning beroende på antigenerna undersöks. Vissa antigener kräver avkalkning och dissektion inom några dagar till veckor efter fixering, medan andra kan lagras i flera år (antingen före eller efter avkalkning) utan att minska kvaliteten på immunfärgning. Vi rekommenderar att lagra prover som temporal ben på grund av risken för avdunstning av lagringsmedia (PBS) från 48-brunnar och eventuella föroreningar med svamp eller bakterier. Vi utför vanligtvis hela berget dissektion mindre än en vecka i förväg för att immunfärgning.När fasta och dekalcifierades, är hela monterings dissektion utfördes med tinningbenet nedsänkt i vätska. Avlägsnande av överskott av ben och mjukvävnad som omger labyrinten tidigt i dissektion kommer bidra till att avlägsna spiral ligamentet / sidovägg i senare skeden genom att underlätta manipulering av vävnaden och åstadkomma en mindre dold vy av kritiska strukturer. När du utför de första stegen, kan pincett användas för att hålla vävnaden i vestibulära regionen. Men när varven är isolerade, är det viktigt att undvika att placera pincett på organ Corti eller spiral ligament / sidovägg. Istället hålla tången stängt och stift spiralganglionnervfibrerna till silikonelastomeren belagda dissektion maträtt. Håll inte på denna region som vävnaden kommer att riva. I allmänhet, när vävnaden har delats in i tre varv, gripa och dra manövrar kan leda till oförutsägbara resultat, som ofta skadar organ Corti och bör undvikas. Vävnad från yngre djur (P7-P21) tenderar att vara mer förlåtande än vävnad från djur äldre än P21. Dessutom cochlea prover med hårceller dAmage är svårare att dissekera. Om musen fått bullerexponeringen vävnaden är särskilt ömtålig. Oavsett tillståndet i vävnaden, är dissektion presenterar vi tekniskt krävande och kräver många övningsförsök för kunskaper.
Under immunofärgning, är det viktigt att varje cochlea tur är nedsänkt i vätska, inte flytande ovanpå eller fastnat på sidan av brunnen. Detta möjliggör mer fullständig penetration av triton och antikroppar in i vävnaden. När du tar bort vätska från varje brunn, är det lätt att förlora cochlea tur eller rita upp den i pipettspetsen. Ändra lösningar med 200 mikroliter pipettspets med hjälp av en dissektion omfattning kommer att bidra till att förhindra detta. Sakta extrahera vätskan och flytta pipettspetsen om cochlea tur kommer för nära. Även pipetteting avfallslösning i ett rent rör kan vara en bra strategi eftersom detta avfall röret kan sökas om en sväng av misstag dras upp i pipetten. Om svängen har fastnat i pipettspetsen, than tips kan skäras upp med ett rakblad, men ofta organ Corti kommer att skadas om detta inträffar.
När felsökning antikroppar för immunfärgning, kan ytterligare steg såsom antigenåtervinning eller signalförstärkning tillsättas. Det finns lågt pH och högt pH antigen avslöjande reagens som kan köpas. Om en antikropp inte fungerar med den här beskrivna metoden, är det första protokollet förändring att prova en av dessa antigenåtervinning metoder. Alternativt kan du använda en signal förstärkare. Det finns kommersiellt tillgängliga lösningar för användning före immunfärgning, eller tyramide förstärkningssatser som kan användas för att förstärka signalen från den sekundära antikroppen.
Betydelsen av den teknik som vi presenterar är förmågan att bibehålla den tre-dimensionella strukturen av Cortis organ och att visualisera alla celler inom organet. Hela längden av snäckan separeras i endast tre varv under det att andra liknande tekniker, nämligen: ee Bohne och Liberman metoder kräver uppdelning i 5 - 10 stycken 6-8, öka antalet prover för att manövrera i immunfärgning och avbildningsprocesser. Cochlear sidovägg dissektion som utvecklats av Cosgrove och Gratton kräver en liknande nivå av skicklighet och är möjligt i ofixerad, frisk vävnad, liksom i avkalkat vävnad, men organ Corti skalas bort och förstörs i processen att isolera sidovägg 17. En annan grupp har utfört liknande dissektioner i ofixerade, färska cochlear vävnad från tre veckor gamla råttor där spiralligament / sidovägg gripes och strippad bort från Cortis organ, som lämnar organ intakt. Detta var dock bara uppnåtts i apikala tur 5. Metoden för avskalning spiralligament / sidovägg bort från organ Corti är rutin för dissektion av fixerad vävnad i en ung mus (<P7) 13. Men i vår erfarenhet med möss äldre än P6, efter fixering ettd avkalkning, tårar denna manöver ofta organ Corti i en otillförlitlig sätt. Dessutom det förfarande som beskrivs här tillåter isolering av mellersta och basal vänder också.
Kryosektioner och sektioner som erhållits efter paraffininbäddning används också ofta i hörselområdet. Dessa metoder tillåter visualisering av andra strukturer, såsom stria vascularis, Reissner membran, och takhinnan, men varje avsnitt tillåter endast visualisering av en liten region av organ Corti i varje cochlea tur. Således för att undersöka händelser som inträffar i ett mosaikmönster, såsom cellförlust eller celldelning, med snittningsmetoden, 50 eller flera bilder måste färgas och avbildas för att fånga hela längden av snäckan. Däremot har hela berget dissektion protokoll fördelen att förbereda hela organ Corti på bara tre stycken. Förutom fördelen med att bevara den längs arkitekturen i Cortis organ, denna technique möjliggör insamling och lagring förenklad data. En begränsning av hela berget dissektion är att det förstör omgivande strukturer såsom spiral ligament, stria vascularis, Reissner membran, och takhinnan. En annan begränsning är den tekniska svårigheten och längden av tid för en enda dissektion. Detta beror främst på den bräckliga karaktären av organ Corti och liten marginal för misstag när du tar bort spiral ligament / sidovägg. När behärskar, kan utföras hela berget dissektion av ett snäckan i ca 20 - 30 minuter.
Även om ovanstående protokoll beskriver en hela berget dissektion metod för vuxna möss, hoppas vi att tillämpa denna teknik till andra modellorganismer som används i hörselområdet. Vårt laboratorium är nu ändra denna teknik för dissekering av rått snäckan. Ju större cochlea av råttan är innesluten i en tjockare öron kapsel som är tätare förkalkade än musen. Tinningbenet måste således excised med stora saxar. Före fixering och urkalkning med EDTA, bör öronkapseln öppnas med sax för att möjliggöra bättre tillgång till cochlea vävnaden. Även avkalkning processen är längre och kan ta upp 3 veckor beroende på ålder av provet. För hela berget dissektion, storleken på den benlabyrinten påverkar tekniken. Den ökade storleken på råtta snäckan ger ett något större avstånd mellan spiral ligament / sidovägg och organ Corti, vilket ger en större felmarginal för enskilda nedskärningar. Men medan den större vävnaden kan ge mer material att förstå för manipulering av provet, kräver också ett större antal nedskärningar för att avlägsna hela längden av spiral ligament / sidovägg. Vi tror att liknande modifieringar kan göras för dissekering av hörselsnäckan från chinchilla, ökenråtta, och marsvin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
