Protocol
İn Vitro deasetilasyonu Tahlili 1.
- SIRT2 saflaştırılması
- % 10 FBS ve antibiyotikler olan 8 ml DMEM içinde kültürlenir ve yaklaşık% 70 konfluent ertesi gün için 37 ° C,% 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe yetiştirilen HEK 293T hücreleri 10 cm'lik kültür çanağı hazırlayın.
- Ertesi gün, ko-transfeksiyonu 4 ug pCDH-puro-GFP SIRT2-Bayrak (laboratuarımızda yapılan Lentivector), 4 ug pCMV- dR8.2 dvpr (ambalaj vektör) ve 0.5 ug pCMV-VSV-G (zarf vektör) 3 ul PEİ / ug DNA arasında bir oranda 18 kullanılarak polietilenimin (PEI).
- 12 saat sonra ortam değiştirin.
- 36-48 saat sonra süpernatant toplayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile çöpleri çıkarın.
- 0.22 um filtre aracılığıyla süzüldükten sonra SIRT2 lentivirüs 1 ml'lik eş payları yapabilir ve -80 ° C'de saklayın.
- Virüs kullanılmadığında buz üzerinde çözülme SIRT2 lentivirüs (-80 ° C'de virüs depolamak önemlidir).
- 8 ug / ml polibren mevcudiyetinde lentivirüs 1 ml% 80-90 ortak akışlı HEK 293T hücreleri, 6 gözlü bir plaka Infect.
- Bir sonraki gün (24 saat kadar), 37 ° C kuluçka makinesi içinde, virüs ile enfekte olmuş hücreler yerleştirin.
- 24 saat sonra orta değiştirin.
- enfeksiyondan 48 saat sonra, bir floresan mikroskop altında GFP pozitif hücrelerini tespit ederek enfeksiyon verimliliğini kontrol edin.
- Enfeksiyon etkinliği iyi ise (en az% 40-50 enfekte olmuş hücreler), kültür ortamı hücreleri ifade eden stabil SIRT2 seçmek için 2 ug / ml puromisin içeren orta yerine.
Not: Bu yaklaşık 2 hafta sürer ve orta her 3-4 günde bir değiştirilir. Enfekte olmayan hücreler SIRT2 lentivirüs büyümesi ile seçim süresi ve sadece enfekte olmuş hücreler üzerinde ölmektedir. - Purif başlamadan önce,% 10 SDS-PAGE jeli üzerinde toplam proteinin 40 ug çalıştırdıktan sonra (1000 sulandırma 1) bir anti-Flag antikor kullanılarak western blotting ile Flag-işaretli SIRT2 ekspresyonunu analizication işlemi (önerilir) 19,20.
- 1. aktif SIRT2, bölünmüş hücrelerinin saflaştırılması için: kararlı bir şekilde aşırı eksprese eden Flag-SIRT2 HEK 293T hücrelerinin yeterli yemekler için, tripsinizasyon ile 3 oranında (on 10 cm'lik kaplar, daha sonraki deneyler için yeterli proteinin saflaştırılmasını sağlar).
- , Hücreleri tripsinize kültür ortamı çıkarın ve steril DPBS ile hücrelerin durulanarak artık serum ortadan kaldırmak için. Yavaşça, hücre tekli tabakası kapsayan 30-45 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe için% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 2.5 ml. hücreleri ayırmak için başlayana kadar Tripsin-EDTA çözeltisi uzaklaştırıldıktan sonra, 37 ° C'de inkübe edin. Sonra kültür ortamı eklemek ve yeni yemekler hücreleri aktarmak.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleme ile, ardından tripsinizasyon ile hücreler PBS içinde iki kez hücreleri yıkama ve toplama, kültür ortamı çıkarın.
- 500 ul liziz tamponu A (20 mM HEPES pH 7.9, 18 mM KCI, 0.2 mM EGTA, 1.5 mM MgCl2 içinde Hücre topağınıBir proteaz önleyicileri kokteyli ve sürekli dönme altında 4 ° C'de 30 dakika boyunca 1 uM TSA içeren% 20 gliserol,% 0.1 NP-40).
- yeni bir tüpe 15, 4 ° C'de dakikada transfer süpernatan 14,000 x g'de santrifüjleyin.
- Aşağıda tarif edildiği gibi boncuklar agaroz konjuge edilmiş bir anti-Flag antikor kullanılarak imüno gerçekleştirin.
- Protein lizat (10-20 mg toplam protein) için boncuk agaroz konjüge anti-Flag antikor 200-300 ul ekle.
- sabit çalkalama ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile imüno-toplayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de pelet 10 mi liziz tamponu A ile 5 kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, boncuklar pelet ve tampon A ile süpernatant yerine
- (Proteaz inhibitörleri kokteyl ve 1 PBS uM TSA dahil) 1x Bayrak peptid çözeltisi hazırlayın.
- 1x Bayrak peptidi 500 ul ekleyinagaroz tanelerine e çözeltisi ve sabit bir dönme altında 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj ile yüzer toplayın.
- önceki iki adımı tekrarlayın.
- 4 ° C'de 1 dakika boyunca 15,000 x g'de filtre tüpleri ve santrifüjleme ile süpernatandan boncuk çıkarın.
- Nihai protein konsantrasyonu 1 ug kadar / bir ultrafiltrasyon membranı kullanılarak ul elüt örneğini konsantre edilir.
- Ekstrakte edilen örnek 1 ug kullanılarak gerçekleştirilmiştir elektroforez ile saflaştırma işlemi kontrol edin.
- Bir ticari olarak temin edilebilen boyama solüsyonu ile Leke jeli SIRT2 arıtma teyit etmek için.
- -80 ° C'de saflaştırılmış SIRT2 tutun.
- Asetile protein alt-tabaka saflaştırılması
- yaklaşık% 70 konfluent ertesi gün için HEK 293T hücreleri ile 10 cm x 10 cm kültür tabaklarında hazırlayın.
- Bir Bayrağın 5 mikrogram ile ertesi gün, ko-transfeksiyonu hücreleri plazmid vektörü İfade Eden etiketliG-protein alt-tabaka ve 3 ul PEİ / ug DNA arasında bir oranda PEI kullanarak proteini asetillenmesi belirli asetil-transferaz 5 ug.
Not: Belirli bir asetil transferaz bilinmiyorsa, örneğin P300, CBP, GCN5, Tip60 ve PCAF şekilde bilinmektedir histon asetil-transferaz (şapkalar) oluşan bir karışım ile birlikte transfekte edilmesi. - 12 saat sonra orta değiştirin.
- gün hücrelerini parçalayan önce, deasetilazları inhibe ederek protein substrat asetilasyon seviyelerini en üst düzeye çıkarmak için TSA / NAM içeren ortamı ile kültür ortamı değiştirerek gecede 1 uM TSA ve 2 mM nikotinamid (NAM) ile hücre tedavisi.
- Transfeksiyondan 48 saat sonra, kültür ortamı çıkarın, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleme ile, ardından tripsinizasyon ile hücreler PBS içinde iki kez hücreleri yıkama ve toplar.
- çanak başına 500 ul liziz tamponu A Hücre topağını, (20 mM HEPES pH 7.9, 18 mM KCI, 0.2 mM EGTA, 1.5 mM MgCl2,% 20 gliserol,% 0.1 NP-40), bir proteaz I dahil olmak üzerenhibitors kokteyli, 1 uM TSA ve sürekli dönme altında 4 ° C'de 30 dakika süre ile 2 mM Cum.
- yeni bir tüpe 15, 4 ° C'de dakikada transfer süpernatan 14,000 x g'de santrifüjleyin.
- Aşağıda tarif edildiği gibi boncuklar agaroz konjuge edilmiş bir anti-Flag antikor kullanılarak imüno gerçekleştirin.
- Protein lizat (10-20 mg toplam protein) için boncuk agaroz konjüge anti-Flag antikor 200-300 ul ekle.
- sabit çalkalama ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile imüno-toplayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de pelet 10 mi liziz tamponu A ile 2 kez yıkanır. Her yıkamadan sonra, boncuklar pelet lisiz tampon A ile süpernatant yerine
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de NAM olmayan pelet 10 mi liziz tamponu A ile 3 kez yıkanır. Her yıkamadan sonra, boncuk pelet ve bu importa olan lizis tamponu A ile süpernatant yerinent deasetilasyon reaksiyona herhangi NAM üzerine taşımak için değil.
- (Proteaz inhibitörleri ve PBS içinde 1 uM TSA dahil) 1x Bayrak peptid çözeltisi hazırlayın.
- agaroz tanelerine 1x Bayrak peptid çözeltisinin 500 ul ilave edin ve sabit dönme altında 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj ile yüzer toplayın.
- önceki iki adımı tekrarlayın.
- 4 ° C'de 1 dakika boyunca 15,000 x g'de filtre tüpleri ve santrifüjleme ile süpernatandan boncuk çıkarın.
- Protein konsantrasyonu 1 mg / ul kadar bir ultrafiltrasyon membranı kullanılarak, yıkanmış numune konsantre edilir.
- % 4-12 SDS-PAGE jeli üzerinde elüt örnek 1 ul çalıştırarak elektroforez gerçekleştirin.
- (: 1000 sulandırma 1) ve protein-alt-tabaka (dilüsyon kullanılan spesifik antikor bağlıdır) Western Ac-K karşı antikorlar kullanılarak blotting ile protein alt-tabakanın asetilasyonu teyit edin.
- puri tutunğı -80 ° C'de protein alt-tabakanın asetile.
- İn Vitro deasetilasyonu Reaksiyon
- Deasetilasyon tamponu B hazırlama (50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 150 mM NaCI, 1 mM MgCI2, 0.5 uM TSA)
- 20 | il son hacme (Tablo 1) farklı tüplerinde 3 farklı tepkilere hazırlayın.
- (Isteğe bağlı) SIRT2 protein-substrat entasetilleştirmeyi onaylamak için ek reaksiyonlar ekleyin. (NAM yerine deasetilaz aktif SIRT2 reaksiyonu (a pCDH-Puro-GFP SIRT2 H187Y -Flag Lentivector kullanılarak sonra 1.1'de tanımlanan protokol kullanılarak yapılabilir) saflaştırılmış deasetilasyonu boş mutant SIRT2 2 ug ekleme ya da 10 mM nikotinamid ekleme ) SIRT2 deasetilasyonu aktivitesini inhibe etmek üzere reaksiyona (Tablo 1).
- sabit bir ajitasyon altında 30 ° C de 3 saat süre ile reaksiyonlar inkübe edin.
- f 2x numune tampon maddesi 20 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun ve örnekleri kaynatınveya 95 ° C'de 10 dakika.
- % 4-12 SDS-PAGE jeli üzerinde reaksiyon karışımının çalıştırarak elektroforez gerçekleştirmek ve bir anti Ac-K antikoru (1: 1000 seyreltme) kullanan western blotting ile protein alt-tabaka ile asetilleme durumu tespit 19,20.
İn Vivo deasetilasyonu Tahlili 2.
- Kültürlenmiş Hücrelerde SIRT2 aşırı ekspresyonu
- HEK 293T hücreleri ile 10 cm kültür tabaklarında stabil olarak pCDH-Puro-GFP boş vektör aşırı ifade hazırlayın pCDH-Puro-GFP SIRT2-Flag ve pCDH-Puro-GFP SIRT2 H187Y -Flag (1.1'de tarif edildiği gibi) yaklaşık 70 olmak % konfluent.
- Seçenek olarak ise, hücreler, yaklaşık% 70 konfluent 10 cm kültür tabaklarında hazırlama ve 3 ul PEİ / ug DNA arasında bir oranda PEI ile Yukarıda zikredilen vektörlerin 5 ug kullanarak geçici aşırı ekspresyonunu gerçekleştirmek.
- Flag-t aşırı ekspresyonu göstermek için: (1000 seyreltme 1) bir anti-Flag antikor kullanılarak toplam hücresel ekstrelerinin Western blotting işleminin gerçekleştirilmesiSIRT2 19 agged.
- Kültür Hücrelerde demonte SIRT2 RNA Girişim
- yaklaşık% 70 konfluent ertesi gün için HEK 293T hücreleri 10 cm'lik kültür çanağı hazırlayın.
- Sonraki gün, birlikte transfekte 4 ug pLKO1-Puro-SH SIRT2 (Lentivector) 19, 4 ug pCMV- dR8.2 dvpr (ambalaj vektör) ve 0.5 ug pCMV-VSV-G (kaplama vektör) 18 kullanılarak polietilenimin (PEI) 3 ul PEİ / ug DNA arasında bir oranda.
Not: SIRT2 aşağı vurma için, RNAi Konsorsiyumu (TRC) tarafından tasarlanan pLKO.1 lentiviral vektör basit saç tokası shRNAs kullanın. - ShSIRT2 lentivirüs üretmek SIRT2 demonte hedef hücreleri enfekte etmek için 1.1 'de tarif edilen prosedür takip edin.
- % 10 SDS-PAGE jeli üzerinde toplam proteinin 40 ug çalıştırdıktan sonra etkin SIRT2 demonte göstermek için: (1000 sulandırma 1) bir anti-SIRT2 antikoru kullanılarak toplam hücresel ekstrelerinin Western blotting işleminin gerçekleştirilmesi.
- Seçenek olarak ise,Hücreler yaklaşık% 70 konfluent ile 10 cm kültür yemekleri hazırlamak ve üreticinin talimatlarına siRNA'lara kullanarak SIRT2 geçici demonte yaparlar.
- % 10 SDS-PAGE jeli üzerinde toplam proteinin 40 ug çalıştırdıktan sonra etkin SIRT2 demonte göstermek için: (1000 sulandırma 1) bir anti-SIRT2 antikoru kullanılarak toplam hücresel ekstrelerinin Western blotting işleminin gerçekleştirilmesi.
- Immunoprecipitation ve Bağışıklık Kültürlü Hücrelerde Asetillendirilmiş Seviyeleri Detect
- 12 saat SIRT2 fazla sentezleyen ya da hücrelerden hücre pelletleri elde edilmesinden önce olmayan Sınıf III histon deasetilazların inhibe etmek için kültür ortamına 1 uM TSA ekleyin (yukarıdaki 2.1) ya da SIRT2 hücreleri (yukarıda 2.2) nakavt.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleme ile, ardından tripsinizasyon ile hücreler PBS içinde iki kez hücreleri yıkama ve toplama, kültür ortamı çıkarın.
- 10 mi liziz tamponu A (20 mM HEPES pH 7.9, 18 mM KCI, 0.2 mM EGTA, 1.5 eklememM MgCl2,% 20 gliserol, bir proteaz inhibitörleri kokteyli, 1 uM TSA ve 2 mM NAM içeren% 0.1 NP-40).
- Sabit dönme altında, 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj ile süpernatantlar toplayın.
- Bir Bradford protein tahlili kullanılarak protein konsantrasyonu hesaplanır.
- Bir referans olarak liziz tamponu A kullanarak Tablo 2 kullanılarak 1 ml lik bir nihai hacim içinde Aktarım yeni tüplere toplam proteinin, 1 mg ya da aşırı ifade SIRT2 ya SIRT2 demonte sonra hücrelerden protein örnekleri hazırlanır.
- Protein A / G ile birlikte belirli bir protein alt-tabakaya karşı bir antikor kullanılarak bir imüno-gerçekleştirme (40 ul boncuk çamurunun önerilir). Seçenek olarak ise, bütün asetile proteinleri immünopresipitasyon boncuk agaroz konjuge edilmiş bir anti Ac-K antikoru (20 ul boncuk çamuru genellikle yeterlidir) kullanın.
- Consta altında 4 ° C'de inkübe edinnt rotasyon gecede.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile imüno-toplayın.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1000 x g'de boncuk 1 ml tampon A ile 5 kez yıkayın.
- 2x numune tampon 40 ul yeniden süspanse boncuk.
- 95 ° C'de 10 dakika boyunca kaynatılır örnekleri.
- elüt örnekleri aktarırken boncuk bozmadan% 4-12 SDS-PAGE jeli üzerinde elüt örnekleri (aşama 2.3.12 40 ul) çalıştırarak elektroforez gerçekleştirin.
- bir protein alt-tabaka-özel antikor immüno-çökeltme için kullanıldı halinde (1.000 sulandırma 1), ya da protein alt-tabakaya karşı spesifik bir antikor (tavsiyeler izleyin, bir anti-Ac-K antikoru kullanılarak Western blotting ile protein alt-tabaka asetillenmiş düzeylerini algılar Anti Ac-K boncuklar immüno-çökeltme için kullanıldı, spesifik bir antikor ile ilgili seyreltme).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir proteini için, in vitro ve in vivo deasetilasyonu deneylerde, her ikisi de deasetilasyon aktivitesi olan herhangi bir enzim için yasal bir deasetilasyon hedef olarak dikkate alınması gereken deasetilaz ve alt-tabaka arasındaki etkileşimi kurmak için yapılması gerekir. Deney yapılmadan daha önce in vitro olarak deasetilaz deneyi için, deasetilaz ve asetillenmiş protein substrata hem de saflaştırma gereklidir. Burada spesifik deasetilaz çalışılacak olan sitoplazmik Sirtuin SIRT2 kullanımı. SIRT2 yüksek deasetilasyon deneyi için bir negatif kontrol olarak önerilen bir deasetilaz enzimi deasetilaz aktivitesi yoksun bir mutant kullanılmasıdır. 1.1'de tarif edilen saflaştırma prosedürü kullanarak, SIRT2 ve SIRT2 H187Y iki başarılı 1 ug / ml bir son konsantrasyonda saflaştırılabilir. Bu boyama ile izlenen bir jel üzerinde saflaştırılmış protein çalıştırdıktan sonra teyit edilebilirGibi SIRT2 ve SIRT2 H187Y hem Bayrak peptid (Şekil 2A, daha düşük) ile etiketlenmiş çünkü Western blot sonra, bir anti-Flag antikor kullanılarak (üst Şekil 1A). Aynı saflaştırma işlemi bazı modifikasyonlar ile, protein alt-tabaka saflaştırılması için takip edilebilir. proteinin belirli asetil transferaz veya protein asetillenmesi mümkün şapkalar bir karışımının aşırı eksprese eden hücrelere saflaştınlabilir ihtiyacı var demektir deasetilasyon deneyi için kullanılmadan önce asetile edilmesi gerekmektedir. 1.2 açıklanan pürifikasyon prosedürlerini kullanarak, asetillenmiş proteini (üst Şekil 1B) saflaştırılabilir. Protein Gerçekten asetile ve in vitro deasetilasyonu deneyi için kullanılabileceğini teyit etmek için, bir anti Ac-K antikoru kullanılarak Western blot asetil-transferaz (Şekil 1B aşırı eksprese eden hücrelere saflaştırılmış proteininin artan asetile seviyelerini göstermek için gerekli olan, lower).
Başarılı bir protein saflaştırma işleminden sonra, in vitro deasetilasyon tahlili gerçekleştirilebilir. SIRT2 dahil güncellik kazanırken, onların enzimatik fonksiyonu için NAD + gerektiren diğer Deasetilazları farklıdır sınıf III histon lizin deasetilazlar vardır. Buna uygun olarak, herhangi bir deasetilasyonu, NAD + yokluğunda anti Ac-K antikoru kullanılarak Western blot ile tespit edilebilir bağımsız olarak, katalitik olarak aktif SIRT2 varlığı (vs, Şekil 2, bölme 2 1). Aksine, SIRT2 NAD + her iki reaksiyonda Protein SIRT2 bir deasetilasyon hedef olarak kabul edilebilir olduğunu göstermektedir asetillenmiş protein asetillenmiş düzeyleri azalmıştır. Bu sonuçları teyit etmek için, farklı negatif kontroller de kullanılabilir. Örneğin protein deasetilasyon seviyelerinde hiçbir fark tespit edilebilir zaman deasetilasyonu eksikliği SIRT2 (SIRT2 H187Y)) 4 vs yerine katalitik olarak aktif vahşi tip SIRT2 (Şekil 2, şerit 5 kullanılır. iyi kurulmuş bir Sirtuin inhibitörü, NAM proteinin asetilatlı seviyelerinde azalma SIRT2 arasında deasetilaz aktivitesi aracılık ettiğini ima reaksiyon karışımına ilave edildiği zaman benzer bir etki görülebilir.
Anormal deasetilasyon, çeşitli hücresel işlemleri ve yaş ile ilgili hastalıklar yer almaktadır. Böylece, bir deasetilaz ve alt tabaka arasındaki etkileşim ile ilgili bilgimizi derinleştirmek çok önemli bir adım, bu olgu fizyolojik etkisi olabilir hücrelerde bu arabağlantı kurmaktır. Ayrıca, in vivo hücre kültür sistemlerinde bir entasetilleştirmeyi kontrol daha kolay belirli bir fenotip veya sonuca bağlanabilen bir hücre ya da dokuya özgü bir bağlamda deasetilasyon olayın çalışma sağlar. Bu in vitro DEAC tespit dışı bırakıretylation aktivitesi, hücrelerin normal fizyolojik koşullar altında meydana asla deasetilaz ve aynı zamanda tüp içinde substratına, hem varlığı yapaydır. In vivo deasetilasyon deneyi için, SIRT2 ve SIRT2 H187Y yanı sıra protein alt-tabakanın her iki aşırı eksprese eden hücrelere 2.1 ve 2.2'de tarif edilen yöntemler kullanılarak da kullanılabilir. Bu hücrelerden hazırlanmış hücre ekstreleri SIRT2, SIRT2 H187Y ifade teyit edilebilir ve western blotting ile protein alt-tabaka özel antikorlar kullanılarak. Burada tarif edilen deneyde tüm Eksojen ifade proteinler (HA-etiketli SIRT2 / SIRT2 H187Y ve orta panel Bayrak-etiketli protein substratı tespit algılamak için Şekil 3'te, alt panel) gerçekleştirilen deneyler kolaylığı için etiketlenir. Hedef proteini SIRT2 bir deasetilasyon alt-tabaka olup olmadığını belirlemek için, immüno hedef protein f aşağı çekmek için, bir anti-Flag antikor kullanılarak gerçekleştirilirBir anti Ac-K antikoru kullanılarak Batı beneklemesi ile ollowed. SIRT2 ifade eden hücrelerde protein asetillenmiş seviyelerinde azalma olduğunu göstermektedir (3 v Şekil 3, üst panel, şerit 4) (Şekil 3, üst panel, şerit 3 ve 2) ve hücrelerde asetillenmiş seviyelerini etkilediği yetmezliği deasetilaz eksikliği SIRT2 mutantını ifade asetillenmiş protein in vivo spesifik deasetilaz bir deasetilasyonu hedef olabilir. SIRT2 aracılı deasetilasyonu çalışılan hücrelerde (Şekil 3, üst panel, şerit 5 v 3) NAM spesifik deasetilaz substrat ekseni kuran hücrelerin tedavi sonrası inhibe edilir, bu daha da doğrulanabilir.
Şekil 1: deasetilaz ve asetillenmiş protein alt-tabakanın her iki saflaştırma in vitro deasetilasyon deneyi için kullanılacak(A). SIRT2 ve SIRT2 H187Y (deasetilasyon hatalı mutan) her ikisinin de 1 ug 1.1 de tarif edildiği gibi saflaştırma protokolü izlenerek jeli üzerinde çalıştırıldı. Jel ticari olarak temin edilebilen boyama solüsyonu ile lekenin sonra lekeli, hem saflaştırılmış proteinler (üst) tespit edilebilir. Proteinler, bir anti-Bayrak antikor (alt) kullanılarak PVDF membran ve Batı beneklenmesinde aktarıldıktan sonra tespit edilebilir. (B) protein alt-tabaka ve hiper asetile protein substrata 1 ug 1.2 de tarif edildiği gibi saflaştırma protokolü takip edilerek, bir jel üzerinde yürütülmüştür (alfa-enolaz laboratuarımızda oluşturulan kütle spektrometrisi yayınlanmamış verilere dayalı bir SIRT2 alt-tabaka olarak kullanılmıştır). Jel ticari olarak temin edilebilen boyama solüsyonu ile boyandı ve lekenin sonra, saflaştırılmış protein, alt-tabaka (üst) tespit edilebilir. Asetilasyon, bir anti-Ac-K antikoru (orta) kullanılarak PVDF membran ve Batı beneklenmesinde aktarıldıktan sonra tespit edilebilir. Toplam p roteinler bir anti-Bayrak antikor (alt) kullanılarak tespit edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Nitro deasetilasyon deneyinde Saflaştırılmış asetillenmiş protein alt-tabakası (a-enolaz) NAD + varlığında SIRT2 ya SIRT2 H187Y (deasetilasyon hatalı mutan) ile inkübe edildi (kulvarlar 4 ve 5). Azalmış asetillenmiş seviyeleri SIRT2 mevcudiyetinde ancak SIRT2 H187Y mevcudiyetinde (şerit 4 ve 5) bir anti Ac-K antikoru kullanılarak Western blot ile tespit edilir. NAD + 'Reaksiyon karışımı dahil edildiğinde Resim deasetilasyon aktivitesi görülmektedir (şerit 2 v 4) veya NAM reaksiyon karışımına eklendiğinde, (hat 6 v 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Kararlı biçimde SIRT2 ya SIRT2 H187Y da aşırı ifade in vivo deasetilasyon deney HEK293T hücrelerinde protein (şerit 2 v 1) asetillenmiş düzeylerini artırmak için protein alt-tabaka (alfa-enolaz) ve şapkalar ile birlikte transfekte edildi. Deasetilasyonu, bir anti Ac-K antikoru kullanılarak protein alt-tabakanın ve Batı lekeleme aşağı çekmek için, bir anti-Flag antikor kullanılarak immüno sonra in vivo kontrol edildi. Asetilasyon, önemli ölçüde aşırı eksprese eden hücrelere SIRT2 H187Y karşılaştırıldığında SIRT2 aşırı eksprese eden hücrelere azalmıştır (yol 3 v 4). SIRT2 aracılı deasetilasyonuHücreler NAM. (3 vs kulvar 5) ile tedavi edildiğinde, protein alt tabakanın engellenir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Tepkiler | 1 | 2 | 3 | 4 (isteğe bağlı) | 5 (isteğe bağlı) |
| Saflaştırılmış asetillenmiş protein alt-tabaka (10 ug) | + | + | + | + | + |
| tampon B | + | + | + | + | + |
| Saflaştırılmış SIRT2 (2 ug) | - | + | + | - | + |
| NAD + (1 mΜ) | - | - | + | + | + |
| Saflaştırılmış SIRT2 H187Y (2 ug) | - | - | - | + | - |
| NAM (10 mM) | - | - | - | - | + |
Tablo 1: Reaksiyon bileşenleri.
| numuneler | aşırı ifadesi | yere sermek |
| 1 | pCDH-Puro-GFP boş vektör | pLKO1 boş vektör veya si ctr |
| 2 | pCDH-Puro-GFP-SIRT2-Flag | pLKO1 SH SIRT2 1 ya da Si SIRT2 1 |
| 3 | pCDH-Puro-GFP SIRT2 H187Y -Flag | pLKO1 SH SIRT2 2 ya da Si SIRT2 2 |
Tablo 2: Protein örnekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz istiyoruz AV Lefkofsky Aile Vakfı / Liz ve Eric Lefkofsky Yenilik Araştırma Ödülü - Burada anlatılan proje NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) bir hibe ile yanı sıra Robert H. Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi tarafından desteklenen eleştirel okuma ve bu taslağın düzenlenmesi için laboratuvara üyeleri (Carol O'Callaghan ve Elizabeth Anne Wayne) teşekkür etmek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture dishes | Denville Scientific Inc. | T1110 and T1115 | |
| pCDH-puro-GFP lentiviral vector | System Biosciences | CD513B-1 | |
| pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) | Addgene | 8455 | |
| pCMV-VSV-G (envelope vector) | Addgene | 8454 | |
| polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 24885 | other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells |
| 0.22 μm filters | Denville Scientific Inc. | F5512 | |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| fluorescent microscope | Carl Zeiss MicroImaging Inc. | Axiovert 200 | |
| puromycin | Invivogen | A11138-03 | |
| PBS | Corning | 21-031-CM | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F3165 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| EGTA | Sigma | 34596 | |
| protease inhibitors coctail 100x | Biotool | B14001 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | T8552 | selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins) |
| anti-Flag agarose beads | Sigma | A2220 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| rotator | Thermo Scientific | 415220Q | |
| filter tubes | Millipore | UFC30HV00 | |
| Flag peptide | Sigma | F3290 | |
| Vivaspin Centrifugal Concentrator | Sartorius Stedim Biotech S.A. | VS0102 | |
| SimplyBlue SafeStain solution | Invitrogen | LC6060 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Techologies | NP0007 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | T5941 | |
| NAD+ | Sigma | N0632 | required cofactor for sirtuins |
| nicotinamide (NAM) | Sigma | 72340 | selective inhibitor class III HDACs (sirtuins) |
| pLKO.1 lentiviral vector | Addgene | 8453 | |
| SIRT2 si RNA | Qiagen | GS22933 | |
| anti-SIRT2 antibody | Proteintech | 15345-1-AP | |
| Bradford protein assay | BIO-RAD | 500-0006 | |
| anti Ac-K agarose beads | Immunechem | ICP0388 |
References
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
- Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
- Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
- Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
- L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
- Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
- Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
- Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
- Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
- Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
- Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
- Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
- Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
- Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
- Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
- Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
- Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
- Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
- Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
- Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e51682 (2014).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).
