Abstract
الغالبية العظمى من قياس الطيف الكتلي (MS) القائم على أساليب تحليل البروتين وتشمل خطوة الهضم الأنزيمي قبل الكشف، وعادة مع التربسين. هذه الخطوة ضرورية لتوليد صغيرة الببتيدات الوزن الجزيئي، عموما مع MW <3،000-4،000 دا، التي تقع ضمن نطاق المسح الفعال للأجهزة قياس الطيف الكتلي. وتتضمن البروتوكولات التقليدية O / N الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية. وقد أدت التطورات الحديثة في تطوير مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات، وعادة ما تنطوي على استخدام microreactor مع الانزيمات يجمد أو مجموعة من العمليات الفيزيائية التكميلية التي تقلل من الوقت اللازم لهضم بروتين لبضع دقائق (على سبيل المثال، الميكروويف أو عالية الضغط). في هذا العمل، ونحن تصف مقاربة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن تنفيذها في أي مختبر لتحقيق الهضم الأنزيمي سريع للبروتين. وكثف البروتين (أو خليط من البروتين) على المستعبدين C18-عكس المرحلة الأداء الإقتصادي الأداء العاليormance السائل اللوني (HPLC) جسيمات السيليكا مسبقة في العمود الشعري، وغرست التربسين في المخزن مائي على جزيئات لفترة قصيرة من الزمن. لتمكين على خط للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، ومزال الببتيدات زيتية مع نظام المذيبات مع زيادة المحتوى العضوي مباشرة في مصدر MS أيون. هذا النهج يتجنب استخدام جزيئات الإنزيم يجمد مرتفعة الثمن ولا تتطلب أي مساعدات لإتمام العملية. هضم البروتين وتحليل عينة الكامل يمكن تحقيقه في أقل من 3 دقائق ~ و ~ 30 دقيقة، على التوالي.
Introduction
وكثيرا ما حقق تحديد وتوصيف تنقية البروتينات باستخدام تقنيات MS. يتم هضم البروتين مع انزيم ويتم تحليل الببتيدات إلى أبعد من مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام ضخ الإعداد التجريبية بسيط. الهضم بروتين ضروري لتوليد شظايا الببتيد الصغيرة التي تقع في نطاق كتلة مفيد لمعظم تحليل MS، والتي يمكن أن تكون مجزأة بسهولة من خلال الطاقة المنخفضة تصادم التفكك المستحث لتوليد الأحماض الأمينية تسلسل المعلومات. للبروتينات معزولة أو خليط من البروتين بسيطة، ليست هناك حاجة أخرى لفصل الكروماتوغرافي من الببتيدات قبل الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. مزيج من 25-50 الببتيدات يمكن تحليلها بسهولة عن طريق غرس العينة مع ضخ حقنة مباشرة في مصدر MS أيون.
مطياف الكتلة يمكن أن تؤدي في التحليل والتأكد من تسلسل البروتين داخل زمنية قصيرة. مع وسائل الحصول على البيانات الحديثة، وهذه العملية يمكن أن يتحقق ثithin بضع دقائق أو حتى ثواني. العامل المحدد في استكمال العملية برمتها على المدى الزمني القصير هو الخطوة الهضم بروتين. عادة، وهذا يتم تنفيذه خلال بضع ساعات (أو O / N)، في الحل، في 37 درجة مئوية، وذلك باستخدام الركيزة: نسب انزيم (50-100): 1. لتقليل الوقت الهضم الأنزيمي لدقائق أو ثواني، microreactors انزيم يجمد، في شكل مفاعلات الموائع الدقيقة أو خراطيش المتاحة تجاريا، وقد وصفت 1-6 عادة، يتم يجمد الانزيم من قبل التساهمية، غير التساهمية / الامتزاز الفيزيائي، مجمع تشكيل أو التغليف، 3،6 في تعزيز الكفاءة العملية الأنزيمية التي مكنت من كبير أرض- حجم ونسب انزيم إلى الركيزة. وتشمل مزايا إضافية من المفاعلات يجمد تخفيض انحلال ذاتي والتدخل من الانزيم في تحليل MS، وتحسين الاستقرار انزيم وإعادة استخدام. وقد وصفت مجموعة متنوعة من النهج واستخدام الزجاج أو أجهزة microfabricated البوليمرية،باستخدام الإنزيمات ثبتوا على حبات مغناطيسية بواسطة تفاعلات الضد مستضد، 7،8 شرك في شبكات جسيمات متناهية الصغر من الذهب، 9 مغلفة في تيتانيا الألومينا سول المواد الهلامية 10 و nanozeolites، 11 أو من خلال القبض على ني NTA أو صاحب الوسم تشكيل تعقيدا. 6 بدلا من ذلك ، وقد وضعت الشعيرات الدموية مفتوح أنبوبي مع الإنزيمات ثبتوا، وكذلك 12 وعلاوة على ذلك، وقد تجلى تعزيز الانقسام بروتين باستخدام تسيطر الميكروويف إشعاع 13 أو بمساعدة ضغط أو الضغط تكنولوجيا الدراجات (PCT) للحد من أوقات رد الفعل إلى 30-120 دقيقة 14
على الرغم من المزايا المتعددة للمفاعلات انزيم يجمد، تكاليف خراطيش التجارية عالية، وتوافر الأجهزة ميكروفلويديك للاستخدام الروتيني محدودة، واستخدام نتائج تقنيات الميكروويف أو معاهدة التعاون بشأن البراءات في الحاجة إلى أجهزة إضافية. وكان الهدف من هذا العمل هو تطوير طريقة التي circumveNTS هذه العيوب، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في كل مختبر لتمكين الباحثين مع نهج بسيط وفعال لأداء الانقسام الأنزيمية للبروتينات في التحضير لتحليل MS في غضون دقائق. يعتمد المنهج على استخدام مسعور، C18 الجسيمات التي هي محملة مسبقا في الشعيرات الدموية أو الجهاز ميكروفلويديك، وامتصاص البروتين (ق) من الفائدة على هذه الجسيمات تليها الهضم الأنزيمي خلال ضخ الانزيم على عمود معبأ والبروتين القبض على (ق). في هذا النهج، وثبتوا الركيزة من خلال التفاعلات غير التساهمية، وغرست الانزيم على البروتين وظائفها. وزيادة كفاءة بروتين الهضم من خلال المناطق سطح الجسيمات الكبيرة التي تعرض البروتين لمعالجة الأنزيمية، وخفض المسافات والأوقات نشر من وإلى السطح من الجزيئات، وتحسين نقل الجماعي، أي مرفق التساهمية التي قد تؤثر على نشاط الإنزيم، والقدرة بسرعة evaluatتركيبات (ه) من الإنزيمات المختلفة، disposability، ومضاعفة إذا تم تنفيذ هذه العملية في شكل ميكروفلويديك. ويتجلى هذا النهج مع استخدام خليط من البروتينات القياسية والتربسين- الأكثر شيوعا انزيم لبروتين الهضم قبل الكشف ESI-MS. كان مطياف الكتلة المستخدمة للكشف في هذه الدراسة فخ رباعي (LTQ) أداة الخطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد شعري Microreactor
- قطع قطرها الداخلي 100 ميكرون (ID) × 360 ميكرون القطر الخارجي (OD) الشعرية لمدة 7-8 سم، و 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية إلى 3-5 سم مع الساطور الزجاج الشعرية. تحقق تحت المجهر أن طرفي الشعرية لها نظيفة، وقطع على التوالي، دون أي نتوءات بارزة.
- إدراج 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية إلى واحدة من نهاية 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية، على طول ~ 6 مم؛ في حالة الضرورة، ومراقبة هذه العملية تحت المجهر.
- تطبيق قطرة صغيرة من الغراء حول E6000 تقاطع 90 ميكرون OD / 100 الشعيرات الدموية معرف ميكرون مع نهاية * نصيحة، والسماح للالغراء علاج O / N في RT.
- قطع إدراج 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية على طول ~ 10-15 ملم. وسيكون هذا التأين باعث electrospray.
- قبل قطع 1/32 "OD نظرة خاطفة، 1/16" نظرة خاطفة OD و1/16 حوض PTFE OD "جي في قطعة من 4-5 سم في الطول. وستكون هذه الأكمام المستخدمة في النقابات الشعرية لتوفير اتصال خالية من تسرب.
- قم بتوصيل الطرف الآخر من 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية لاتحاد نظرة خاطفة. استخدام كم 1/32 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
- إدراج / تشديد قطعة من ~ 5 سم 1/16 "أنابيب PTFE في الطرف الآخر من الاتحاد.
- تزن ~ 4 ملغ من C18 (5 ميكرون) الجسيمات في مرحلة ما قبل تنظيفها / المجففة 2 مل قارورة زجاجية. إضافة 0.5 مل الأيزوبروبانول، أغلق القارورة وتفريق الطين في الحمام ultrasonicator.
- سحب مع حقنة 250 ميكرولتر ما يقرب من 200 الطين ميكرولتر، تضاف إبرة الحقنة في "أنابيب PTFE 16/01 للاتحاد نظرة خاطفة، والاستغناء ببطء الطين إلى 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية، مراقبة تحت المجهر باسم شعري يملأ مع جزيئات حتى يبلغ طوله 2-3 ملم التعبئة ويتحقق، وهذا سوف يكون microreactor (الشكل 1) وμ 20.الشعرية م معرف يحتفظ الجزيئات في microreactor من خلال تأثير كيستون. 15
- شطف microreactor مع ~ الحل 50 ميكرولتر من H 2 O / CH 3 CN 50:50 ت / ت، وبعد ذلك مع ~ الحل 50 ميكرولتر من H 2 O / CH 3 CN 98: 2 ت / ت.
2. إعداد حلول عينة
ملاحظة: العمليات التي تنطوي على التعامل مع المذيبات والأحماض العضوية وإعداد الحل هي التي يتعين القيام بها في غطاء الدخان. ارتداء النظارات والقفازات والملابس الواقية.
- شطف مع CH 3 OH ويجف بضع قوارير زجاجية (4 مل)، وأنابيب البولي بروبلين (15 مل).
- إعداد 10 مل من محلول H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في أنبوب 15 مل البولي بروبلين عن طريق خلط 9.8 مل H 2 O مع 200 ميكرولتر CH 3 CN. مزيج من قبل صوتنة.
- إعداد 10 مل من محلول H 2 O / CH 3 CN (50:50 ت / ت) في أنبوب 15 مل البولي بروبلين من خلال خلط 5 مل H 2 </ دون> O مع 5 مل CH 3 CN. مزيج من قبل صوتنة.
- إعداد 4 مل من محلول مائي المحمض (TFA 0.01٪ ت / ت) وذلك بإضافة 4 ميكرولتر TFA (10٪) إلى 4 مل H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في قارورة زجاجية 4 مل. مزيج من قبل صوتنة.
- إعداد 4 مل من محلول عضوي المحمض (TFA 0.01٪ ت / ت) وذلك بإضافة 4 ميكرولتر TFA (10٪) إلى 4 مل H 2 O / CH 3 CN (50:50 ت / ت) في كوب قارورة 4 مل. مزيج من قبل صوتنة.
- تزن 16 ملغ NH 4 HCO 3 مع توازن دقيق التحليلي في قارورة زجاجية 4 مل. إضافة 4 مل من H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) حل وتفريق صوتنة. وهذا يؤدي إلى حل 50 ملم من NH 4 HCO 3 (الرقم الهيدروجيني ~ 7.8) في المخزن المائي.
- تزن 5 ملغ من البروتين القياسية (على سبيل المثال، زلال المصل البقري، الهيموجلوبين α / β، السيتوكروم C، الأنهيدراز الكربونيك، α-2-HS-بروتين سكري، الخ) مع توازن دقيق التحليلي في قارورة زجاجية 4 مل. إضافة 4 مل DI توفير المياهص وتفريق صوتنة. هذا ينتج عادة في محلول بتركيز عال على مستوى ميكرومتر.
- إعداد 1 مل من محلول البروتين (1-2 ميكرومتر) عن طريق تمييع الحل تركيز عالية المستوى ميكرومتر مع حجم مناسب من NH 4 HCO 3 (50 ملم) عازلة مائي. مزيج من قبل صوتنة.
- إعداد الحل التربسين (5 ميكرومتر) عن طريق إذابة 20 ميكروغرام التسلسل الصف التربسين في 170 ميكرولتر NH 4 HCO 3 (50 ملم) عازلة مائي. تفريق صوتنة.
3. إعداد التجريبية
ملاحظة: تم تجهيز نظام LTQ-MS مع مصدر ESI تعديل يتضمن XYZ المرحلة محلي الصنع والتي تمكن تفاعل من مطياف الكتلة لمختلف النهج إدخال العينة.
- فصل microreactor الشعرية من النقابة نظرة خاطفة والاتصال إلى نظرة خاطفة المحملة.
- إدراج سلك حزب العمال ل~ 2 سم في الجانب ذراع من نظرة خاطفة المحملة. استخدام 1/32 "كم نظرة خاطفة لتوفيراتصال ولعزل السلك حزب العمال خالية من تسرب.
- توصيل 50 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD (~ 0.5 مترا) نقل عينة الشعرية إلى الطرف الآخر من نظرة خاطفة المحملة. استخدام كم 1/32 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
- تأمين المحملة نظرة خاطفة على XYZ المرحلة ووضع ESI باعث ~ 2 ملم بعيدا عن الإعلام الشعرية مطياف مدخل.
- قم بتوصيل سلك حزب العمال إلى مصدر التيار الكهربائي ESI من مطياف الكتلة.
- قم بتوصيل الطرف الآخر من شعري نقل العينة إلى الاتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدام كم 1/16 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
- توصيل 4-5 سم 1/16 "أنابيب PTFE إلى الطرف الآخر من اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ وإدراج إبرة حقنة 250 ميكرولتر في أنابيب PTFE؛ بدوره على مضخة وتحديد معدل التدفق في القيمة المطلوبة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر / دقيقة).
- مدخلات جنبا إلى جنب المعلمات الحصول على البيانات MS في مجموعة من البرامج التي تسيطر على أداة لمرض التصلب العصبي المتعددد حفظ كملف طريقة لتجهيز الإعداد لإجراء التحليل؛ لنظام LTQ-MS، استخدم المعلمات تحليل تعتمد البيانات التالية: استبعاد الديناميكي تمكين 180 ثانية مع عرض استبعاد كتلة ± 1.5 م / ض. واحد MS تفحص تليها التكبير واحد وMS 2 يمسح على رأس 5 القمم على أشده، وتكبير العرض الضوئي ± 5 م / ض. تصادم التفكك المستحث (CID) المعايير المحددة في عرض العزلة 3 م / ض، تطبيع الاصطدام الطاقة 35٪، وتفعيل س 0.25، ووقت التنشيط 30 ميللي ثانية.
4. إعداد ميكروفلويديك
- إعداد جهاز ميكروفلويديك من الزجاج أو ركائز البوليمرية، 16-18 وتقدم تخطيط للجهاز في الشكل 2A، ويتكون من microreactor (1) (0.13 ملم طول عرض × 2 مم × 50 ميكرون العميق) متصلة مدخل (2 )، منفذ (3) ومنفذ الجانب (4)؛ قنوات ربط للتلاعب الموائعية هي ~110 ميكرون واسع و~ 50 ميكرون عميقة. بنية متعددة القنوات (5)، تتكون من ~ 1.5-2 ميكرون عميق × 10 ميكرون يوسع x 100 ميكرون microchannels طويلة وضعت 25 ميكرون وبصرف النظر، سيكون بمثابة مرشح للإبقاء على الجزيئات في microreactor.
- تمكين الاتصالات السائل التسليم إلى الرقاقة عن طريق الإلتصاق الموصلات المتخصصة إلى الموانئ مدخل، أو عن طريق ابتكار موقف البوليمر الذي يتسع التجهيزات للتسليم السائل (الشكل 2B). 16
- إعداد الطين الجسيمات C18 (5 ميكرون) كما هو موضح في الخطوة 1.8. تقديم الطين إلى microreactor مع حقنة باستخدام 1/16 "أنابيب PTFE موصولة إلى منفذ الجانب رقاقة (4)؛ ختم الميناء بعد تحميل الجسيمات مع الغراء الايبوكسي وعلاج لمدة 1 ساعة في الفرن على 90 درجة مئوية (16).
- إدراج الشعرية (20 ميكرون معرف × 90 ميكرون طول OD × 10 ملم) في ميناء منفذ، وختم مع الغراء E6000، والسماح علاج O / N؛ هذا وسوف تصبح باعث ESI (
- توصيل 50 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD (~ 0.5 مترا) نقل عينة الشعرية إلى ميناء رقاقة مدخل (2)؛ ربط الطرف الآخر من الشعيرات الدموية إلى حقنة ميكرولتر 250 و ضخ حقنة، كما هو موضح في 3،6-3،7.
- وضع خفيفة الوزن نظرة خاطفة المحملة الموصل على خط نقل عينة فقط قبل مدخل الميناء (2) وادخال سلك حزب العمال على الجانب ذراع المحملة، كما هو موضح في 3.2. وسيكون هذا القطب ESI.
- تأمين جهاز ميكروفلويديك على مرحلة XYZ مع باعث ESI وضع ~ 2 ملم بعيدا عن الشعرية مطياف الكتلة مدخل. إعداد MS للتحليل كما هو موضح في 3.8.
5. تحميل عينة، متعلق ب التحلل البروتيني الهضم وشطف لتحليل MS
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات نقل الحل / عينة مع المعونة من ضخ حقنة وينبغي أن يسمح لبضع دقائق إضافية لاستكمال، لتعويض القتلى نظام القبولوفاق المرتبطة خطوط نقل من وإلى microreactor. الوقت اللازم سوف تعتمد على معدلات تدفق المعنية.
- شطف microreactor وإعدادها للتحليل عن طريق غرس محلول مائي من NH 4 HCO 3 (50 ملم) في H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
- تحميل عينة بروتين (1 ميكرومتر) على microreactor عن طريق غرس محلول العينة في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
- يبث في حل التربسين (5 ميكرومتر) على البروتين كثف على microreactor في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 1-3 دقيقة.
- إخماد عملية الهضم بروتين وذلك بدهن microreactor مع محلول مائي المحمض من TFA (0.01٪ ت / ت) في H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
- بدء يبلغ حجمه البروتين هضم من microreactor عن طريق غرس حل العضوية المحمض من TFA (0.01٪ت / ت) في H 2 O / CH 3 CN (50:50 ت / ت) في 300 نيكولا لانغ / دقيقة.
- بدوره على عملية الحصول على البيانات MS والجهد ESI (~ 2000 V)؛ الحصول على البيانات MS باستخدام المعلمات الحصول على البيانات المنصوص عليها في خطوة 3.8. مراقبة شطف من الببتيدات زيتية.
6. معالجة البيانات
- معالجة البيانات جنبا إلى جنب MS مع محرك بحث متوافقة مع تنسيق البيانات MS الخام.
- معالجة الملفات الخام LTQ-MS باستخدام كائن قاعدة بيانات محددة بروتين زائدة الحد الأدنى. تحميل البيانات الخام في محرك البحث، تعيين الأم والأيونات جزء التحمل كتلة إلى 2 و 1 دا، على التوالي، واستخدام أجزاء فقط زيتية تماما مع ما يصل الى اثنين غاب الانشقاقات للبحث. لا تسمح التعديلات posttranslational. تعيين العالية والمتوسطة الثقة الزائفة معدلات اكتشاف (فرانكلين روزفلت) إلى 1٪ و 3٪ على التوالي، وعدم السماح للتعديلات posttranslational.
- تصفية البيانات لتحديد الوحيدة الموثوقةالببتيد مباريات للبروتينات في قاعدة البيانات؛ تقييم البروتين ومستوى الببتيد النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونتيجة تمثيلية لعملية الهضم بروتين أداء في وقت واحد على مزيج من البروتينات، مع microreactors المذكورة أعلاه (الشكلان 1 أو 2)، وتقدم في الجدول 1. ويتألف جدول تسلسل الببتيد الفريدة التي تحدد بروتين معين، والصليب درجة الارتباط (Xcorr) (أي النقاط التي تميز نوعية مباراة تجريبية لالنظرية للجنبا إلى جنب الطيف الكتلي المقابلة)، وعدد الانشقاقات لم يرد عليها، ولاية تهمة الببتيد (ض)، وكتلة / تهمة ( م / ض) من الببتيدات البروتونية. على مستوى البروتين، ويوفر الجدول معرف البروتين يونيبروت، وصف (اسم) من البروتين، والنتيجة البروتين والتغطية البروتين. وكانت جميع البروتينات يمكن تحديدها الببتيدات المتعددة، بعد تنفيذ عملية الهضم بروتين لمدة 90 ثانية.
الوقت اللازم لكان شطف جميع الببتيدات تعتمد على طول شعري نقل أن ألقى حل العضوية المحمض في 300 NL / دقيقة، وهو معدل تدفق متوافق مع نانو ESI التشغيل الأمثل. في والشعرية أدى خلط المحاليل المائية والعضوية المحمضة في شطف المبكر لبعض الببتيدات، ولكن الغالبية العظمى مزال على مدى عدة دقائق فقط في حل العضوي. وهناك طائفة الشامل عرض المشارك شطف العديد من الببتيدات ممثل من البروتينات خمسة، ولدت مع microreactor الشعرية، وترد في الشكل (3).
الجدول 1. قائمة الببتيدات زيتية ولدت من خلال عملية الهضم بروتين من خمسة البروتينات باستخدام microreactor الشعرية والبروتوكولات الهضم O / N. فقط تسلسل فريدة من نوعها، وفقا لأعلى Xcorr، ترد. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل 1. شعري microreactor. (A) الإعداد تجريبي لتصنيع وmicroreactor. (ب) شعري microreactor المتمركزة في مصدر MS أيون. يتم تحميل microreactor يدويا مع جزيئات السيليكا المستعبدين C18 وضعت على المرحلة XYZ أن يسهل تحديد المواقع المناسبة في مصدر ESI-MS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. microreactor ميكروفلويديك. (A) رسم تخطيطي لمفاعل ميكروفلويديك. (ب) مفاعل ميكروفلويديك مؤمنة في موقف نظرة خاطفة. وميكروفلويديك مفاعل لالثانية هي ملفقة خطوط نقل في الركيزة الزجاج التي يمكن تأمينها في نظرة خاطفة البوليمرية الصنع الترشح للمزيد من المواقع في مصدر MS مع المرحلة XYZ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. كتلة الطيف تضم الببتيدات زيتية الناتجة عن خليط من البروتين تعرض لالتحلل البروتيني في microreactor. وصفت أيونات الببتيد زيتية على أشده مع تسلسل الأحماض الأمينية والبروتين معرف المقابلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وmicroreactor وصفها في هذا العمل يوفر سهلة لتنفيذ الإعداد التجريبية لأداء الهضم الأنزيمي من البروتينات لتمكين تحليل التصلب العصبي المتعدد وتحديد الهوية في أقل من 30 دقيقة. مزايا واضحة لهذا النظام، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، وتشمل البساطة والسرعة، وانخفاض استهلاك كاشف وتكاليف منخفضة. على وجه الخصوص، ليست هناك حاجة لتكلفة الخرز التربسين يجمد والخراطيش. إعداد microreactor الشعرية واضح وصريح (الشكل 1A)، ويمكن تحقيق ذلك في غضون دقائق من الإمدادات القياسية، توجد عادة في المختبر اللوني. بينما الجزيئات C18 مرحلة عكس يمكن أن تشطف مع مذيب عالية العضوية والمحتوى (CH 3 CN أو CH 3 OH) لإزالة كاملة من البروتينات كثف أو الببتيدات، ويمكن للmicroreactor إعادة استخدامها، وعملية التصنيع سهلة وفعالة من حيث التكلفة تدعو لتصنيع وحدات المتاح للاستخدام مرة واحدة، تطبيق صحيفةبالجمع. وmicroreactor الشعرية يمكن تركيبه في مصدر ESI محلي الصنع، كما هو مبين في الشكل 1B، أو يمكن إدراجها في مصدر أيون التجاري القياسي. بينما السرير الجسيمات لالتقاط عينة والهضم لا تحتاج إلى أن تكون أطول من ~ 1-2 ملم، ما يكفي للقبض على مادة كافية للكشف عن الأمثل من قبل MS، طول شعري نفسها يمكن تعديلها لتتناسب مع حجم أي على وجه الخصوص مصدر أيون.
للمختبرات التي لديها قدرات لصنع أجهزة ميكروفلويديك، يتم توفير تصميم بسيط (الشكل 2A) التي يمكن ضمانها في موقف لتسهيل التواصل لكشف مرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل 2B). أبعاد القنوات microreactor ونقل يمكن تعديلها لمتطلبات تطبيق معين، ويمكن وضع الجهاز في شكل واحد أو المضاعفة. بالنسبة لمعظم الطيف كتلة تجارية، ومع ذلك، سوف تحتاج إلى مصدر أيون تعديلات للسماح عشره وضع الجهاز في المصدر. أعدم الرسم الضوئية الرئيسية للرقاقة تلفيق مع برنامج أوتوكاد وتم بواسطة HTA الضوئية الرئيسية أعد الضوئية الرئيسية. تم إجراء تصنيع والرقائق وفقا لبروتوكولات وصفت في وقت سابق: 17،18 محاذاة الركيزة مع الضوئية الرئيسية، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (360 نانومتر)، وإزالة مقاوم الضوء المشع وطبقة الكروم الأساسية، والرطب الحفر الكيميائي للقنوات مع العازلة حفر أكسيد، وإزالة طبقة الكروم المتبقية، حفر ثقوب الوصول، والتنظيف، والتحلل من سطح رقاقة (NH 4 OH + H 2 O 2)، وارتباط حراري الركيزة لوحة الغلاف التي كتبها التسخين التدريجي إلى 550 درجة مئوية. حفرت على حد سواء الركيزة ولوحة الغلاف، واحدة للقنوات عميقة لعينة التعامل مع (~ 20-50 ميكرون)، وأخرى لتصفية العناصر قناة صغيرة ضحلة (1.5-2 ميكرومتر عميق). 16
والنتائج التي تم إنشاؤها مع ميل المبين أعلاهcroreactor قابلة للمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من O / N، 19 البروتوكولات الهضم التقليدية التي تستخدم الركيزة: نسب انزيم (50-100): 1، تليها تجربة الببتيد ضخ مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد (300 نيكولا لانغ / دقيقة، والببتيدات الذائبة في H 2 O / CH 3 CN (50:50 ت / ت) المحمضة مع CH 3 COOH، 0.1٪ ت / ت). كلا microreactor والبروتوكولات التقليدية تمكين تحديد جميع البروتينات التي الببتيدات فريدة متعددة (الجدول 1). عادة، فإن عددا أكبر إلى حد ما من الببتيدات فريدة من نوعها في البروتين يمكن ملاحظتها مع microreactor من مع الإعداد التقليدية. وكان هذا نتيجة لانشقاق الأنزيمية ناقصة في بعض المواقع. وبعد دقائق قليلة إضافية الهضم بروتين خفض أو القضاء عليها هذه النتيجة. أيضا، بعض الببتيدات الأنزيمية ولدت مع microreactor تختلف عن تلك التي ولدت في الحل، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن تعرضوا لالبروتينات كثف على جزيئات C18 مواقع مختلفة لر انزيمهان في حلول متجانسة. 20 وعشرات Xcorr تثبت، مع ذلك، أن نوعية الأطياف جنبا إلى جنب كتلة ولدت مع microreactor كانت ذات جودة عالية، وأن تغطية كافية تسلسل البروتين (11-75٪) قابل للتحقيق لتحديد الهوية البروتين لا لبس فيها .
هذه التقنية، كما وصفها، يقتصر على تحليل خليط من البروتين بسيطة إلى حد ما أن تولد في معظم ~ 25-50 الببتيدات التي يمكن تحليلها من خلال التجارب ضخ بسيطة والتي لا تستلزم الفصل الكروماتوغرافي السائل قبل تحليل MS. حاسمة لنجاح هو استخدام حلول التربسين إذابة طازجة وأعدت، للا يقلل أو تفقد نشاط انزيم بروتين في درجة الحموضة التشغيلية للmicroreactor (أي، ودرجة الحموضة ~ 8). وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من إيجاد التوازن الصحيح بين معدلات أفضل تدفق للتأين بالإرذاذ الإلكتروني (150-300 نيكولا لانغ / دقيقة) ومعدلات التدفق القصوى التي يمكن أن تكون مقبولة من قبل الإعداد التجريبية والتي تمكنالببتيد شطف سريع من microreactor (2-3 ميكرولتر / دقيقة). أعلى من معدلات تدفق ESI المثلى يؤدي إلى خسائر الحساسية وحدود الكشف الفقيرة. ونتيجة لذلك، ينبغي الحفاظ على طول الشعيرات الدموية نقل قصيرة قدر الإمكان لتقليل الوقت اللازم لشطف من الببتيد من microreactor عندما تعمل على ≤300 NL / دقيقة. كل المكونات التي استخدمت من أجل الإعداد التجريبية يمكن الاستعاضة عن مكونات من الشركات المصنعة الأخرى التي تؤدي وظائف مماثلة. إذا كانت الخصائص الأبعاد من هذه المكونات تختلف (طول وقطر، وحدة التخزين)، وتعظيم الاستفادة من معدلات تدفق شاطف، تركيز العينة، والوقت لأداء بعض الخطوات والجهد ESI قد تكون ضرورية للحصول على نتائج مماثلة.
وهناك ميزة فريدة مكنت من إعداد ميكروفلويديك هي القدرة على مواصلة إدماج على رقاقة نظام ضخ، على سبيل المثال، مضخة تدفق electroosmotic مدفوعة، 21،22 لتمكين الاحتياطية اللهعملية واحدة من منصة والتكامل من خطوة فصل إضافية. القدرة على أداء على رقاقة فصل من الببتيدات ولدت من خلال هضم بروتين سيؤدي في حدود الكشف المحسنة، وسوف تسهل تحليل خليط من البروتين المعقدة من مقتطفات الخلوية. وهذا من شأنه تمكين دمج التقنية في سير العمل التي تعتمد على الاستفادة من منصات microfabricated عالية السرعة والكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد للتطبيقات الطبية الحيوية. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µl) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µl) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 ml) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 ml) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 ml) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1,000 µl) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µl) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µl) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
