Abstract
Langt størstedelen af massespektrometri (MS) -baseret protein analysemetoder involverer en enzymatisk spaltning trin før detektion, typisk med trypsin. Dette trin er nødvendigt for dannelsen af små molekylvægt peptider, generelt med MW <3.000-4.000 Da, der falder inden for det effektive scanning række massespektrometri instrumentering. Konventionelle protokollerne omfatter O / N enzymatisk nedbrydning ved 37 ºC. Nylige fremskridt har ført til udviklingen af en række forskellige strategier, der typisk involverer anvendelsen af en mikroreaktor med immobiliserede enzymer eller af en række supplerende fysiske processer, der reducerer den nødvendige tid til proteolytisk spaltning til et par minutter (f.eks mikrobølge eller høj- tryk). I dette arbejde, beskriver vi en enkel og omkostningseffektiv tilgang, der kan implementeres i alle laboratorier for at opnå hurtig enzymatisk fordøjelse af et protein. Proteinet (eller proteinblanding) adsorberes på C18-bundet omvendt fase performance væskekromatografi (HPLC) silicapartikler indlæst i en kapillarkolonne, og trypsin i vandig puffer infunderes over partiklerne for en kort periode. At muliggøre online MS detektion er de tryptiske peptider elueret med et opløsningsmiddelsystem med øget organisk indhold direkte i MS ionkilde. Denne fremgangsmåde undgår brugen af dyre immobiliserede enzym partikler og ikke nødvendiggør nogen støtte til at fuldføre processen. Protein fordøjelse og fuldstændig prøveanalyse kan gennemføres på mindre end ~ 3 min og ~ 30 min.
Introduction
Identifikationen og karakteriseringen af oprensede proteiner er ofte opnået ved hjælp af MS-metoder. Proteinet spaltes med et enzym og dets peptider yderligere analyseret ved MS ved hjælp af en simpel infusion forsøgsopstillingen. Proteolytisk fordøjelse er nødvendig til generering af små peptidfragmenter, der falder i den nyttige masseinterval fleste MS analysatorer, og som let kan fragmenteres ved lav energi kollision induceret dissociation at generere aminosyresekvens information. For isolerede proteiner eller simple proteinblandinger, der ikke længere behov for kromatografisk separation af peptider forud for MS-detektion. En blanding af 25-50 peptider kan let analyseres ved infusion prøven med en sprøjtepumpe direkte i MS ionkilde.
Massespektrometret kan udføre analysen og bekræfte sekvensen af et protein inden for en kort tidsramme. Med moderne datafangst metoder, kan denne proces ske wnden et par minutter eller endda sekunder. Den begrænsende faktor i at fuldføre hele processen på en kort tidshorisont er den proteolytiske fordøjelse trin. Typisk udføres dette over nogle få timer (eller O / N), i opløsning, ved 37 ºC, ved hjælp substrat: enzym-forhold på (50-100): 1. For at reducere den enzymatiske fordøjelse tid til minutter eller sekunder, immobiliserede enzym mikroreaktorer, i form af mikrofluide reaktorer eller kommercielt tilgængelige patroner, er beskrevet. 1-6 Typisk enzymet immobiliseret ved kovalent, ikke-kovalent / fysisk adsorption, kompleks dannelse eller indkapsling, idet 3,6 den forbedrede effektivitet af den enzymatiske proces aktiveret af den store overflade-til-volumen og enzym-til-substrat-forhold. Yderligere fordele ved immobiliserede reaktorer omfatter reduceret autolyse og interferens fra enzymet i MS-analyse, forbedret enzymstabilitet og genanvendelighed. En række metoder, ved hjælp af glas eller polymere microfabrikerede enheder er blevet beskrevet,anvendelse af enzymer immobiliseret på magnetiske perler af antistof-antigen interaktioner, 7,8 indfanget i guld nanopartikler netværk, 9 indkapslet i titaniumdioxid-aluminiumoxid sol-geler 10 og nanozeolites, 11 eller fanget gennem Ni-NTA eller His-Tag kompleksdannelse. 6 Alternativt , open-rørformede kapillærer med immobiliserede enzymer er blevet udviklet, så godt. 12. Desuden forbedret proteolytisk spaltning er blevet påvist ved hjælp af kontrolleret mikrobølge bestråling 13 eller tryk-assisteret eller tryk cykling teknologi (PCT) til at reducere reaktionstider til 30-120 min. 14
Trods de mange fordele ved immobiliseret enzym reaktorer, omkostningerne ved kommercielle patroner er høj, tilgængeligheden af mikrofluide anordninger til rutinemæssig anvendelse er begrænset og anvendelse af mikrobølgeovne eller PCT teknologier resulterer i behovet for yderligere instrumentering. Målet med dette arbejde var at udvikle en metode, circumvents disse ulemper, og som let kan implementeres i alle laboratorier at give forskere med en enkel og effektiv metode til udførelse af enzymatisk spaltning af proteiner som forberedelse til MS-analyse inden for få minutter. Tilgangen bygger på anvendelsen af hydrofobe, C18-partikler, som er forbelastet i en kapillær eller mikrovæskeanordning, og adsorptionen af protein (er) af interesse på disse partikler efterfulgt af enzymatisk fordøjelse under infusionen af enzymet over pakket leje og erobrede protein (er). I denne fremgangsmåde er substratet immobiliseres via ikke-kovalente interaktioner, og enzymet er infunderes over det immobiliserede protein. Den proteolytiske fordøjelse effektivitet forøges med de store partikel overfladearealer, som udsætter proteinet for enzymatisk behandling, reducerede afstande og diffusionstider til og fra overfladen af partikler, forbedret masseoverføring, ingen kovalent binding, som kan påvirke aktiviteten af enzymet, evne for hurtigt evaluate kombinationer af forskellige enzymer, disposability og multiplexing hvis processen udføres i en mikrofluid format. Denne fremgangsmåde er demonstreret ved anvendelse af en blanding af standard proteiner og trypsin-den mest almindeligt anvendte enzym til proteolytisk fordøjelse før ESI-MS-detektion. Et massespektrometer til påvisning i denne undersøgelse var en lineær fælde kvadrupol (LTQ) instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af Kapillær Mikroreaktor
- Skær 100 um indvendig diameter (ID) x 360 um ydre diameter (OD) kapillær til en længde på 7-8 cm, og 20 pm ID x 90 um OD kapillar til 3-5 cm med glaskapillar spaltekniven; kontrollere under mikroskopet, at begge kapillære ender har en ren, lige snit, uden fremspringende grater.
- Sæt 20 pm ID x 90 um OD kapillar ind i den ene ende af 100 um ID x 360 um OD kapillar, i en længde på ~ 6 mm; i tilfælde af behov, overholde denne operation under et mikroskop.
- Påfør en lille dråbe lim E6000 omkring krydset af de 90 um OD / 100 um id kapillærer med enden af en Q-tip, og lad limen kur O / N ved stuetemperatur.
- Skær det indsatte 20 um ID x 90 um OD kapillar til en længde på ~ 10-15 mm; dette vil være den elektrosprayionisering emitter.
- Pre-cut 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK og 1/16 "OD PTFE karbading i stykker af 4-5 cm i længden; disse vil være ærmerne anvendes i kapillære unioner for at tilvejebringe en lækfri forbindelse.
- Slut den modsatte ende af 100 um ID x 360 um OD kapillar til en PEEK union; bruge en 1/32 "PEEK ærmet for at levere en lækage-fri forbindelse.
- Indsæt / stramme et stykke ~ 5 cm lang 1/16 "PTFE slangen i den modsatte ende af fagforeningen.
- Der afvejes ~ 4 mg C18 (5 um) partikler i en forud renset / tørret 2 ml hætteglas; tilsættes 0,5 ml isopropanol, luk kuvetten og sprede gyllen i ultralydsapparat badet.
- Trække med en 250 pi sprøjte ca. 200 pi gylle, indsætte sprøjtens nål i 1/16 "PTFE-slange af PEEK union, og dispensere langsomt gyllen ind i 100 um ID x 360 um OD kapillar, observere under mikroskop som kapillar fyldes med partikler indtil en længde på 2-3 mm komprimering opnås, hvilket vil være den mikroreaktor (figur 1) 20 μ.m ID kapillar tilbageholder partiklerne i mikroreaktoren gennem en Keystone virkning. 15
- Skyl mikroreaktor med ~ 50 pi opløsning af H2O / CH3CN 50:50 volumen / volumen, og derefter med ~ 50 pi opløsning af H2O / CH3CN 98: 2 v / v.
2. Forberedelse af Sample Solutions
Bemærk: Operationer, der involverer håndtering af organiske opløsningsmidler og syrer og løsning forberedelse skal udføres i et stinkskab. Brug beskyttelsesbriller, handsker og beskyttelsesdragt.
- Skyl med CH3OH og tørre et par hætteglas (4 ml) og polypropylenrør (15 ml).
- Forbered 10 ml af en opløsning af H2O / CH3CN (98: 2 vol / vol) i et 15 ml polypropylenrør ved blanding 9,8 ml H2O med 200 pi CH3CN; blandes ved sonikering.
- Forbered 10 ml af en opløsning af H2O / CH3CN (50:50 vol / vol) i et 15 ml polypropylenrør ved blanding 5 ml H 2 </ sub> O med 5 ml CH3CN; blandes ved sonikering.
- Forbered 4 ml af en syrnet vandig opløsning (TFA 0,01% vol / vol) ved tilsætning af 4 pi TFA (10%) til 4 ml H2O / CH3CN (98: 2 v / v) i et 4 ml hætteglas; blandes ved sonikering.
- Forbered 4 ml af en syrnet organisk opløsning (TFA 0,01% vol / vol) ved tilsætning af 4 pi TFA (10%) til 4 ml H2O / CH3CN (50:50 v / v) i et 4 ml hætteglas; blandes ved sonikering.
- Afvej 16 mg NH4 HCO 3 med en analytisk mikrovægt i et 4 ml hætteglas; tilsættes 4 ml af H2O / CH3CN (98: 2 v / v) opløsning og dispergere ved lydbehandling; dette resulterer i en 50 mM opløsning af NH4 HCO 3 (pH ~ 7,8) i vandig puffer.
- Afvej 5 mg af et standard protein (fx bovint serumalbumin, hæmoglobin α / β, cytochrom C, kulsyreanhydrase, α-2-HS-glycoprotein, etc.) med en analytisk mikrovægt i et 4 ml hætteglas; tilsættes 4 ml DI water og sprede ved lydbehandling; dette resulterer typisk i en høj uM-niveau koncentration opløsning.
- Forbered 1 ml proteinopløsning (1-2 uM) ved fortynding af høj uM-niveau koncentration opløsning med en passende mængde af NH4 HCO 3 (50 mM) vandig puffer; blandes ved sonikering.
- Forbered trypsin-opløsning (5 uM) ved opløsning 20 ug sekventering-grade trypsin i 170 pi NH4 HCO 3 (50 mM) vandig puffer; dispergere ved sonikering.
3. Eksperimentel opsætning
Bemærk: Den LTQ-MS-system er udstyret med en modificeret ESI kilde der omfatter en hjemme-bygget XYZ-fase, som muliggør interfacing af massespektrometeret til forskellige sample input tilgange.
- Afbryd kapillær mikroreaktor fra PEEK union og oprette forbindelse til PEEK Tee.
- Indsætte en ~ 2 cm lang Pt wire i side-arm af PEEK Tee; bruge en 1/32 "PEEK ærme til at give enlækagefri forbindelse og til isolering Pt wire.
- Tilslut en 50 um ID x 360 um OD (~ 0,5 m lang) prøve overførsel kapillar til den modsatte ende af PEEK Tee; bruge en 1/32 "PEEK ærmet for at levere en lækage-fri forbindelse.
- Fastgør PEEK Tee på XYZ-scenen og placere ESI emitter ~ 2 mm væk fra massespektrometer indløb kapillær.
- Slut Pt ledning til strømforsyningen kilden til massespektrometer ESI.
- Slut den modsatte ende af prøven overføres kapillar til rustfrit stål union; bruge en 1/16 "PEEK ærmet for at levere en lækage-fri forbindelse.
- Tilslut en 4-5 cm lang 1/16 "PTFE-slange til den modsatte ende af rustfrit stål union og sæt 250 pi sprøjte nål i PTFE-slange, tænde for pumpen og indstille strømningshastigheden på den ønskede værdi (f.eks 2 pl / min).
- Input tandem MS data erhvervelse parametre ind i softwarepakke, der styrer MS instrument end gemme som en metode fil til klar opsætningen til at udføre analysen; for LTQ-MS-system, skal du bruge følgende data afhængige analyseparametre: dynamisk udelukkelse aktiveret for 180 sek med udelukkelse masse bredde ± 1,5 m / z; en MS scanning efterfulgt af en zoom og MS 2 scanninger på top 5 mest intense toppe, zoom scan bredde ± 5 m / z; kollision induceret dissociation (CID) parametre ved isolation bredde 3 m / z, normaliseret kollisionsenergi 35%, aktivering Q 0,25, og aktiveringstid 30 msek.
4. Mikrofluid Setup
- Forbered en mikrofluidanordning af glas eller polymere substrater; 16-18 layoutet af indretningen er tilvejebragt i figur 2A, består af en mikroreaktor (1) (0,13 mm bredde x 2 mm længde x 50 um dyb) forbundet til et indløb (2 ), udløb (3) og en sideport (4); de indbyrdes forbundne kanaler for fluide manipulationer er ~110 um brede og ~ 50 um dyb; en multikanal struktur (5), der består af ~ 1,5-2 um dyb x 10 um bred x 100 um lange mikrokanaler tilføjet 25 pm fra hinanden, vil fungere som et filter til tilbageholdelse af partiklerne i mikroreaktor.
- Aktiver væske-levering forbindelser til chippen ved at lime specialiserede stik til indgangsportene, eller ved at udforme en polymer stativ, der kan rumme fittings for væske levering (figur 2B). 16
- Forbered en opslæmning af C18-partikler (5 um) som beskrevet i trin 1.8; levere opslæmningen til mikroreaktor med en sprøjte ved hjælp 1/16 "PTFE-slange forbundet til chip sideporten (4); forsegle porten efter partikelbelastning med epoxy lim og helbredelse i 1 time i en ovn ved 90 ºC 16.
- Indsæt en kapillær (20 um ID x 90 um OD x 10 mm længde) i udløbsporten, forsegle med E6000 lim, og lad helbrede O / N; dette vil danne ESI emitter (
- Tilslut en 50 um ID x 360 um OD (~ 0,5 m lang) prøve overførsel kapillar til chip indløbsport (2); forbinde den modsatte ende af kapillarrøret til en 250 pi sprøjte og sprøjtepumpen som beskrevet i 3,6-3,7.
- Placer en letvægts PEEK Tee-stik på prøven transfer linje lige før indløbet (2) og sæt en Pt ledning på side-arm af Tee, som beskrevet i punkt 3.2; dette vil være ESI elektroden.
- Fastgør mikrofluidanordning på XYZ scenen med ESI emitter placeret ~ 2 mm væk fra massespektrometer indløb kapillar; forberede MS for analyse som beskrevet i 3.8.
5. Sample Loading, proteolytisk fordøjelse og Eluering til MS Analysis
Bemærk: Alle trin løsning / prøve transfer udføres ved hjælp af en sprøjte pumpe og bør give mulighed for et par ekstra minutter at udfylde, for at kompensere for de døde-volumes forbundet med overførsel linjer til og fra mikroreaktor; den nødvendige tid vil afhænge af de strømningshastigheder, der er involveret.
- Skyl mikroreaktor og forberede den til analyse ved infusion af en vandig opløsning af NH 4 HCO 3 (50 mM) i H2O / CH3CN (98: 2 vol / vol) ved 2 pl / min i 5 minutter; bruge en 250 pi sprøjte.
- Indlæse proteinprøven (1 uM) på mikroreaktoren ved infusion prøveopløsningen ved 2 pl / min i 5 minutter; bruge en 250 pi sprøjte.
- Tilføre trypsin-opløsning (5 uM) over adsorberet protein på mikroreaktoren ved 2 pl / min i 1-3 min.
- Stands proteolytisk fordøjelse processen ved at skylle mikroreaktor med en syrnet vandig opløsning af TFA (0,01% v / v) i H2O / CH3CN (98: 2 vol / vol) ved 2 pl / min i 5 minutter; bruge en 250 pi sprøjte.
- Start eluering af proteinet fordøje fra mikroreaktoren ved infusion en syrnet organisk opløsning af TFA (0,01%v / v) i H2O / CH3CN (50:50 vol / vol) ved 300 nl / min.
- Tænd MS datafangst processen og ESI spænding (~ 2.000 V); erhverve MS-data ved hjælp af datafangst parametre, i trin 3.8; observere eluering af tryptiske peptider.
6. Databehandling
- Behandle tandem MS-data med en søgemaskine kompatibel med den rå MS dataformat.
- Behandle LTQ-MS raw filer ved hjælp af en organisme specifik minimalt redundante protein database; uploade de rå data i søgemaskinen, indstille moder- og fragment ion masse tolerancer til 2 og 1 Da henholdsvis, og brug kun fuldt tryptiske fragmenter med op til to savnede spaltninger på søgeordet; giver ikke mulighed for posttranslationelle modifikationer; indstille de høje og mellemstore tillid falsk opdagelse satser (FDR) til 1% og 3%, henholdsvis, og ikke giver mulighed for posttranslationelle modifikationer.
- Filter data til at vælge kun høj selvtillidpeptid matcher til proteinerne i databasen; evaluere protein- og peptid-niveau resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt resultat af et proteolytisk fordøjelse proces udføres samtidigt på en blanding af proteiner, med de ovenfor beskrevne mikroreaktorer (figur 1 eller 2), er tilvejebragt i tabel 1. Tabellen omfatter de unikke peptidsekvenser, der identificerer et bestemt protein, korset korrelation score (Xcorr) (dvs. en score, der karakteriserer kvaliteten af det eksperimentelle-til-teoretisk match for den tilsvarende tandem massespektret), antallet af mistede spaltninger, peptid opladning tilstand (z), og massen / ladning ( m / z) af de protonerede peptider. På proteinniveauet, tabellen giver UniProt proteinidentificering, beskrivelsen (navn) af proteinet, proteinet score og proteinet dækning. Alle proteiner kunne identificeres ved multiple peptider, efter en proteolytisk spaltning udført i 90 sekunder.
Den nødvendige tid foreluering af alle peptider var afhængig af længden af overførslen kapillar, som leverede den forsurede organiske opløsning ved 300 nl / min, en strømningshastighed kompatibel med nano-ESI optimal drift. In-kapillær resulterede blanding af de vandige og organiske syrnede opløsninger i de tidlige eluering af et par peptider, men det store flertal elueret over adskillige minutter kun i den organiske opløsning. En massespektrum viser co-eluering af adskillige peptider repræsentative for de fem proteiner, frembragt med den kapillære mikroreaktor, er tilvejebragt i figur 3.
Tabel 1. Liste over tryptiske peptider genereret gennem proteolytisk fordøjelse af fem proteiner ved hjælp af kapillær mikroreaktor og O / N fordøjelse protokoller. Kun unikke sekvenser, med den højeste Xcorr, vises. Klik her for at downloade denne fil.
Figur 1. Kapillær mikroreaktor. (A) Eksperimentel opsætning til fremstilling af mikroreaktoren. (B) Kapillær mikroreaktor placeret i MS ionkilde. Den mikroreaktor er fyldt manuelt med C18-bundne silicapartiklerne og placeret på en XYZ-stage, der letter korrekt placering i ESI-MS kilde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Mikrofluid mikroreaktor. (A) Skematisk diagram af mikrofluid reaktor. (B) Mikrofluid reaktor fastgjort i en PEEK stativ. Den mikro reaktor and overføre linjer er fremstillet i et glas substrat, der kan fastgøres i en hjemmelavet polymere PEEK står for yderligere positionering i MS kilde med XYZ scenen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Massespektrum omfatter tryptiske peptider dannet fra proteinet blandingen underkastet proteolyse i mikroreaktor. De mest intense tryptiske peptidioner er mærket med sekvensen af aminosyrerne og det tilsvarende protein identifikator. Klik her for et større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den i dette arbejde mikroreaktor indeholder en nem at implementere forsøgsopstilling til udførelse enzymatisk fordøjelse af proteiner for at muliggøre MS-analyse og identifikation i mindre end 30 min. De forskellige fordele ved dette system i sammenligning med konventionelle metoder, indbefatter enkelhed, hastighed, lavt reagensforbrug og lave omkostninger. Især er der ikke behov for dyre immobiliserede trypsin perler og patroner. Forberedelsen af kapillære mikroreaktor er ligetil (figur 1A), og kan opnås inden for få minutter fra ensartede leverancer, der almindeligvis findes i en kromatografi laboratorium. Mens omvendt fase C18 partikler kan skylles med højt organisk-indhold opløsningsmiddel (CH3CN eller CH3OH) til fuldstændig fjernelse af adsorberede proteiner eller peptider, og mikroreaktoren kan genbruges, den nemme og omkostningseffektiv fremstillingsproces opfordrer til fremstilling af engangs enheder til engangsbrug APPLIKtioner. Kapillarrøret mikroreaktor kan monteres i et hjem indbygget ESI kilde, som vist i figur 1B, eller kan indsættes i en standard kommerciel ionkilde. Mens partiklen seng til prøve-opsamling og fordøjelse ikke behøver at være længere end ~ 1-2 mm, lige nok til at fange tilstrækkeligt materiale til optimal detektering af MS, kan længden af selve kapillær justeres til at passe til størrelsen af en bestemt ionkilde.
For laboratorier, der har kapacitet til at fremstille mikrofluidenheder, er et simpelt design (figur 2A), der kan fastgøres til et stativ til at lette interface til MS detektion (figur 2B), forudsat. Dimensionerne af mikroreaktor og overførsel kanaler kan tilpasses til kravene i et bestemt program, og enheden kan udvikles til en enkelt eller multiplekset format. For de fleste kommercielle massespektrometre ville imidlertid ion kilde behøver ændringer for at tillade the placering af enheden i kilden. Den fotomaske tegning til chip fabrikation blev henrettet med AutoCAD og fotomasken blev udarbejdet af MTV fotomaske. Fremstillingen af mikrochips blev udført ifølge protokollerne beskrevet tidligere: tilpasning af substratet med fotomasken, udsættelse for UV-lys (360 nm), fjernelse af det bestrålede fotoresist og underliggende krom lag, våd kemisk ætsning af kanaler med puffer 17,18 oxid etch, fjernelse af det resterende krom lag, boring af adgangsrettigheder huller, rengøring, hydrolyse af mikrochip overflade (NH4OH + H 2 O 2), termisk binding af substratet til dækpladen ved gradvis opvarmning til 550 * C. Både substrat og dækplade blev ætset, en for dybe kanaler for håndtering af prøver (~ 20-50 um), og den anden for lavvandede mikrokanalelementer filterelementer (1,5-2 um dyb). 16
Resultaterne genereret med den ovenfor beskrevne microreactor er sammenlignelige med resultaterne opnået blandt O / N, 19 konventionelle fordøjelse protokoller, der bruger substrat: enzym-forhold på (50-100): 1, efterfulgt af en peptid-infusion eksperiment med MS-detektion (300 nl / min, peptider opløst i H 2 O / CH3CN (50:50 v / v) forsuret med CH3COOH, 0,1% v / v). Både mikroreaktor og konventionelle protokoller muliggjort identifikation af alle proteiner af flere unikke peptider (tabel 1). Typisk en noget større antal unikke peptider pr protein var observerbare med mikroreaktor end med det konventionelle setup. Dette var et resultat af ufuldstændig enzymatisk spaltning på bestemte steder. Et par ekstra minutter af proteolytisk fordøjelse reduceres eller fjernes dette resultat. Også nogle enzymatiske peptider dannet med mikroreaktoren afveg fra dem, der oprettes i opløsning, på grund af det faktum, at for proteinerne adsorberet på C18 partikler forskellige steder blev udsat for enzymet tHan i homogene løsninger. 20. De Xcorr scoringer demonstrerer imidlertid, at kvaliteten af tandem massespektre genereret med mikroreaktoren var af høj kvalitet, og at en tilstrækkelig protein sekvens dækning (11-75%) er opnåeligt for entydige protein identifikationer .
Teknikken, som beskrevet, er begrænset til analysen af forholdsvis enkle proteinblandinger, der genererer højst ~ 25-50 peptider, der kan analyseres ved simple infusionsteknikker eksperimenter, og som ikke nødvendiggør væske kromatografisk separation forud for MS-analyse. Afgørende for succes er anvendelsen af frisk optøet og tilberedt trypsin løsninger, ikke at reducere eller miste aktiviteten af det proteolytiske enzym ved den operationelle pH mikroreaktoren (dvs. pH ~ 8). Desuden skal der findes en passende balance mellem de optimale strømningshastigheder for elektrospray ionisering (150-300 nl / min), og den maksimale flow, der kan tolereres af forsøgsopstillingen og som gør det muligthurtig peptid eluering fra mikroreaktoren (2-3 pl / min). Højere end optimale ESI flow medfører følsomhed tab og dårlige detektionsgrænser. Som følge heraf bør opretholdes så kort som muligt længden af overførslen kapillærer til at reducere den nødvendige tid til elueringen af peptider fra mikroreaktoren ved driftstemperaturer ≤300 nl / min. Alle komponenter, der blev anvendt til forsøgsopstillingen kan erstattes af komponenter fra andre producenter, der udfører lignende funktioner. Hvis de dimensionale kendetegn ved disse komponenter varierer (længde, diameter, volumen), optimering af eluent strømningshastigheder, prøvekoncentration, tid til at udføre visse trin og af ESI spænding kan være nødvendig for at opnå lignende resultater.
En unik fordel aktiveret af mikrofluid opsætningen er evnen på chippen til yderligere inkorporere et pumpesystem, f.eks en elektroosmotisk strømning drevet pumpe, 21,22 for at muliggøre stand-alen operation af platformen og integration af et yderligere separationstrin. Evnen til at udføre on-chip separationer af peptider genereres gennem proteolytisk fordøjelse vil resultere i forbedrede detektionsgrænser, og vil lette analysen af komplekse proteinblandinger fra cellulære ekstrakter. Dette vil yderligere muliggøre integrationen af teknikken i arbejdsgange, der gør brug af mikrofabrikerede platforme og højhastigheds-MS detektion til biomedicinske anvendelser. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µl) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µl) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 ml) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 ml) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 ml) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1,000 µl) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µl) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µl) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
