Fast Enzymatisk Behandling av proteiner for MS Detection med en Gjennomstrømning mikroreaktor

Abstract

De aller fleste av massespektrometri (MS) -baserte protein analysemetoder involvere en enzymatisk fordøyelse skritt før deteksjon, typisk med trypsin. Dette trinnet er nødvendig for generering av små peptider molekylvekt, vanligvis med molekylvekt <3,000-4,000 Da, som faller innenfor det effektive skanne utvalget av massespektrometri instrumentering. Konvensjonelle protokollene omfatter O / N enzymatisk fordøyelse ved 37 ºC. Nylige fremskritt har ført til utviklingen av en rekke strategier, typisk involverer bruk av en mikroreaktor med immobiliserte enzymer eller av en rekke komplementære fysiske prosesser som reduserer den tiden som er nødvendig for proteolytisk spaltning til noen få minutter (f.eks mikrobølgeovn eller høy- trykk). I dette arbeidet, beskriver vi en enkel og kostnadseffektiv tilnærming som kan implementeres i en hvilken som helst laboratorium for å oppnå rask enzymatisk nedbrytning av et protein. Proteinet (eller proteinblanding) blir adsorbert på C18-bundet revers-fase høy performance flytende kromatografi (HPLC) silikapartikler forhåndslagret i en kapillær kolonne, og trypsin i vandig buffer blir infusert i løpet av de partikler for en kort periode. For å muliggjøre on-line MS deteksjon, blir de tryptiske peptidene ble eluert med et oppløsningsmiddelsystem med øket organisk innhold direkte i MS ionekilden. Denne tilnærmingen unngår bruk av dyre immobiliserte enzym partikler og ikke nødvendiggjøre noen hjelpemiddel for å fullføre prosessen. Proteinfordøyelsen og fullstendig analyse av prøver kan utføres på mindre enn ~ 3 min og ~ 30 min, respektivt.

Introduction

Identifiseringen og karakteriseringen av rensede proteiner blir ofte oppnådd ved hjelp av MS-teknikker. Proteinet blir spaltet med et enzym og dets peptider blir ytterligere analysert ved MS ved hjelp av en enkel tilførsel eksperimentelt oppsett. Proteolytisk fordøyelse er nødvendig for generering av små peptidfragmenter som faller i det nyttige massen utvalget av de fleste MS analysatorer, og som lett kan fragmenteres ved lav energi kollisjon indusert dissosiasjon for å generere aminosyresekvens informasjon. For isolerte proteiner eller enkle proteinblandinger, er det ikke lenger behov for kromatografisk separasjon av peptider før MS deteksjon. En blanding av 25-50 peptider kan lett analyseres ved infusjonen av prøven med en sprøytepumpe direkte i MS ionekilden.

Massespektrometer kan utføre analyse og bekreftet sekvensen til et protein innenfor en kort tidsramme. Med moderne datainnhentingsmetoder, kan denne prosessen gjøres wTVen på noen minutter eller sekunder. Den begrensende faktor i å fullføre hele prosessen på en kort tidsskala er den proteolytiske spaltning trinnet. Vanligvis er dette utføres i løpet av noen få timer (eller O / N), i oppløsning, ved 37 ° C, ved hjelp av substrat: enzymforhold på (50-100): 1. For å redusere den enzymatiske fordøyelse tid til å minutter eller sekunder, immobiliserte enzymmikroreaktorer, i form av microfluidic reaktorer eller kommersielt tilgjengelige patroner, har blitt beskrevet. ^1-6 er typisk enzymet immobilisert ved kovalent, ikke-kovalent / fysisk adsorpsjon, kompleks dannelse eller innkapsling, ^3,6 den forbedrede effektivitet av den enzymatiske prosess som blir aktivert av den store overflate-til-volum og enzym-til-substrat-forhold. Ytterligere fordeler av immobiliserte reaktorer inkluderer redusert autolyse og interferens fra enzymet i MS-analysen, forbedret enzymstabilitet og gjenbruk. En rekke tilnærminger, bruk av glass eller polymere microfabricated enheter har blitt beskrevet,ved hjelp av enzymer immobilisert på magnetiske kuler med antistoff-antigen interaksjoner, ^7,8 fanget i gullnanopartikkel-nettverk, ⁹ innkapslet i Titania-alumina sol-gels ¹⁰ og nanozeolites, ¹¹ eller fanget gjennom Ni-NTA eller His-tag kompleks formasjon. ⁶ Eventuelt åpen rørformede kapillærer med immobiliserte enzymer har blitt utviklet, så vel. ¹² Videre har forbedret proteolytisk spaltning har blitt demonstrert ved hjelp av kontrollert mikrobølgestråling ¹³ eller trykkassistert eller trykk sykling teknologi (PCT) for å redusere reaksjonstiden til 30-120 min. ¹⁴

Til tross for de mange fordelene med immobilisert enzymreaktorer, vil kostnadene ved kommersielle patroner er høy, er tilgjengeligheten av microfluidic enheter for rutinemessig bruk begrenset, og bruk av mikrobølgeovn eller PCT teknologier medfører behov for ekstra instrumentering. Målet med dette arbeidet var å utvikle en metode som circumvents disse ulemper, og som enkelt kan implementeres i alle laboratorier for å styrke forskere med en enkel og effektiv metode for å utføre enzymatisk spaltning av proteiner i forberedelse for MS-analyse i løpet av minutter. Tilnærmingen er avhengig av bruk av hydrofobe, C18-partikler som er forhåndsinstallert i en kapillær eller mikrofluid enhet, og adsorpsjonen av protein (er) av interesse på disse partiklene, fulgt av enzymatisk nedbrytning under infusjonen av enzymet over hele pakket seng og fanges protein (er). I denne fremgangsmåten blir substratet immobilisert gjennom ikke-kovalente interaksjoner, og enzymet blir tilført over immobilisert protein. Den proteolytiske spaltning effektivitet blir øket ved de store partikkeloverflatearealer som eksponerer protein for enzymatisk behandling, redusert avstander og diffusjon ganger til og fra overflaten av partiklene, forbedret masseoverføring, ikke kovalent binding som kan påvirke aktiviteten av enzymet, evne til raskt evaluate kombinasjoner av forskjellige enzymer, disposability og multipleksing hvis prosessen utføres i et mikrofluid format. Denne tilnærmingen er demonstrert ved bruk av en blanding av standard proteiner og trypsin-de mest brukte enzym for proteolytisk fordøyelse før ESI-MS deteksjon. Massespektrometer som brukes for deteksjon i denne studien var en lineær felle kvadrupol (LTQ) instrument.

Protocol

1. Klargjøring av Capillary mikroreaktor

1. Skjær 100 um indre diameter (ID) x 360 um ytre diameter (OD) kapillær til en lengde på 7-8 cm, og den 20 um ID x 90 um OD kapillær til 3-5 cm med glasskapillar spalte; verifisere under mikroskopet at begge kapillær ender har en ren, rett snitt, uten utstikkende grader.
2. Sett 20 um ID x 90 um OD kapillært inn i en ende av 100 um ID x 360 um OD kapillar, i en lengde på ~ 6 mm; ved behov, observere denne operasjonen under et mikroskop.
3. Påfør en liten dråpe lim E6000 rundt krysset av 90 mikrometer OD / 100 mikrometer ID kapillærer med enden av en Q-tip, og la limet kur O / N på RT.
4. Kutt 20 mikrometer ID x 90 mikrometer OD kapillær satt til en lengde på ~ 10-15 mm; Dette vil være den electrospray ionisering emitter.
5. Pre-kutt 1/32 "OD kikk, 1/16" OD PEEK og 1/16 "OD PTFE badekaring i stykker på 4-5 cm i lengde; disse vil være hylsene brukes i kapillært tilslutninger for å tilveiebringe en lekkasjefri forbindelse.
6. Koble den motsatte ende av 100 um ID x 360 um OD kapillar til en PEEK forening; Bruk en 1/32 "PEEK ermet for å gi en lekkasjefri tilkobling.
7. Sett inn / stramme et stykke ~ 5 cm lang 1/16 "PTFE slangen inn i den motsatte enden av unionen.
8. Veie ~ 4 mg av C18 (5 um) partikler i et pre-renset / tørket 2 mL hetteglass; tilsett 0,5 ml isopropanol, lukk flasken og spre slammet i ultrasonicator bad.
9. Trekk med en 250 mL sprøyte ca 200 mL slurry, sette sprøytespissen i 1/16 "PTFE slange av PEEK union og dispensere sakte slammet inn i 100 mikrometer ID x 360 mikrometer OD kapillær, observere under mikroskop som kapillær fylles med partikler inntil en lengde på 2-3 mm pakking oppnås, og dette vil være den mikroreaktor (figur 1) 20 μ.m ID kapillær beholder partiklene i mikroreaktoren gjennom en Keystone virkning. ¹⁵
10. Skyll mikroreaktor med ~ 50 pl oppløsning av _H2O / _CH3CN 50:50 volum / volum, og deretter med ~ 50 pl oppløsning av _H2O / _CH3CN 98: 2 volum / volum.

2. Utarbeidelse av Sample Solutions

Merk: Operasjoner som involverer håndtering av organiske løsemidler og syrer og løsning forberedelse skal utføres i et avtrekksskap. Bruk vernebriller, hansker og verneklær.

1. Skyll med _CH3OH og tørke noen få hetteglass (4 ml) og polypropylenrør (15 ml).
2. Fremstille 10 ml av en oppløsning av _H2O / _CH3CN (98: 2 volum / volum) i et 15 ml polypropylenrør ved å blande 9,8 ml _H2O med 200 pl _CH3CN; bland ved ultralydbehandling.
3. Forbered 10 ml av en oppløsning av _H2O / _CH3CN (50:50 volum / volum) i et 15 ml polypropylenrør ved å blande 5 ml H _{2 <}/ sub> O med 5 ml _CH3CN; bland ved ultralydbehandling.
4. Fremstille 4 ml av en surgjort vandig løsning (TFA 0,01% v / v) ved å tilsette 4 ul TFA (10%) til 4 ml _H2O / _CH3CN (98: 2 v / v) i en 4 ml glassflaske; bland ved ultralydbehandling.
5. Fremstille 4 ml av en surgjort organisk oppløsning (TFA 0,01% v / v) ved å tilsette 4 ul TFA (10%) til 4 ml _H2O / _CH3CN (50:50 v / v) i en 4 ml glassflaske; bland ved ultralydbehandling.
6. Veie 16 mg NH ₄ HCO ₃ med en analytisk mikro i en 4 ml glassflaske; Tilsett 4 ml av _H2O / _CH3CN (98: 2 v / v) løsning og dispergere ved ultralydbehandling; dette resulterer i en 50 mM løsning av NH ₄ HCO ₃ (pH ~ 7,8) i vandig buffer.
7. Veie 5 mg av en standard-protein (for eksempel bovint serum albumin, hemoglobin α / β, cytokrom C, karbonsyreanhydrase, α-2-HS-glykoprotein, etc.) med en analytisk mikro i en 4 ml glassflaske; legge 4 ml DI water og spre ved ultralydbehandling; dette vanligvis resulterer i et høyt nivå pM-konsentrasjon løsning.
8. Fremstille en ml proteinløsning (1-2 uM) ved fortynning av den høye pM-nivå konsentrasjon oppløsning med et passende volum av NH ₄ HCO ₃ (50 mM) vandig buffer; bland ved ultralydbehandling.
9. Klargjør trypsin løsning (5 mm) ved å oppløse 20 mikrogram sekvense-grade trypsin i 170 mL NH ₄ HCO ₃ (50 mm) vandig buffer; spre ved ultralyd.

3. Forsøksoppsett

Merk: LTQ-MS-systemet er utstyrt med en modifisert ESI kilde som inkluderer en hjemme-inne XYZ-fasen som muliggjør tilkopling av massespektrometer til ulike eksempelinngangs tilnærminger.

1. Koble kapillær mikroreaktor fra PEEK union og koble til PEEK Tee.
2. Sette inn en ~ 2 cm lang Pt tråd i sidearmen av PEEK Tee; Bruk en 1/32 "PEEK ermet for å gi enlekkasjefri tilkobling og for å isolere Pt wire.
3. Koble en 50 um ID x 360 um OD (~ 0,5 m lang) prøveoverførings kapillær til den motsatte ende av PEEK Tee; Bruk en 1/32 "PEEK ermet for å gi en lekkasjefri tilkobling.
4. Fest PEEK Tee på XYZ-scenen og posisjonere ESI emitter ~ 2 mm unna massespektrometer innløpet kapillær.
5. Koble Pt ledningen til ESI strømkilden massespektrometer.
6. Å koble den andre enden av prøven overføring kapillær til det rustfrie stålet forening; Bruk en 1/16 "PEEK ermet for å gi en lekkasjefri tilkobling.
7. Koble en 4-5 cm lang 1/16 "PTFE-røret til den motsatte enden av den rustfrie stål union og sett 250 pl sprøytespissen i den PTFE-rør, skru på pumpen og angir strømningshastigheten ved den ønskede verdi (f.eks 2 mL / min).
8. Input tandem MS datainnsamling parametere i programvarepakken som styrer MS instrument end lagre som en metode fil til ferdig oppsett for å utføre analysen; for LTQ-MS system, bruker du følgende data avhengige analyseparametere: dynamisk eksklusjon aktivert for 180 sek med utelukkelse masse bredde ± 1,5 m / z; en MS skanne etterfulgt av en zoom og MS ² skanninger på de 5 mest intense toppene, zoome skanning bredde ± 5 m / z; kollisjon indusert dissosiasjon (CID) parametre satt på isolasjon bredde 3 m / z, normalisert kollisjonsenergi 35%, aktivering Q 0,25, og aktiveringstiden 30 ms.

4. microfluidic Setup

1. Fremstille et mikrofluidanordning av glass eller polymere substrater, ^16-18 utformingen av anordningen er gitt i figur 2A, som består av en mikroreaktor (1) (0,13 mm bredde x 2 mm lengde x 50 um dypt) forbundet med et innløp (2- ), utløp (3) og en sideåpning (4); de sammenkoblede kanaler for fluidic manipulasjoner er ~110 mikrometer brede og ~ 50 mikrometer dyp; en flerkanals struktur (5), bestående av ~ 1,5-2 mikrometer dyp x 10 mm bred x 100 um lange mikrokanaler som er lagt inn 25 mikrometer fra hverandre, vil fungere som et filter for å holde tilbake partiklene i mikroreaktoren.
2. Aktiver væske-levering forbindelser til brikken ved å lime spesialiserte kontakter til innløpsåpningene, eller ved å utarbeide en polymer stativ som har plass beslag for væskestrømmen (figur 2B). ¹⁶
3. Fremstille en oppslemming av C18-partikler (5 uM) som beskrevet i trinn 1.8; levere slurryen til mikroreaktor med en sprøyte ved hjelp av 1/16 "PTFE-slange som er koblet til brikken sideporten (4), forsegle porten etter andel av partikler med epoxylim og herding i 1 time i en ovn ved 90 ° C ^16.
4. Sett inn en kapillær (20 mikrometer ID x 90 mikrometer OD x 10 mm lengde) i utløpsåpningen, forsegle med E6000 lim, og la kur O / N; Dette vil bli den ESI emitter (
5. Koble en 50 um ID x 360 um OD (~ 0,5 m lang) prøveoverførings kapillær til brikken innløpsåpningen (2); kobler den motsatte ende av kapillaren i en 250 mL sprøyte og sprøytepumpen, som beskrevet i 3.6 til 3.7.
6. Plasser en lett-vekt PEEK Tee-kontakten på prøveoverføringsledningen like før innløpsåpningen (2) og sette inn en Pt tråd på den side-arm av Tee, som beskrevet i 3.2; dette vil være ESI elektroden.
7. Fest microfluidic enhet på XYZ scenen med ESI emitter plassert ~ 2 mm unna massespektrometer innløpet kapillær; forberede MS for analyse som beskrevet i 3.8.

5. Prøve Laster, proteolvtiske Fordøyelse og Elution for MS analyse

Merk: Alle oppløsning / prøveoverføringstrinn utføres ved hjelp av en sprøytepumpe og bør gi rom for noen flere minutter for å fullføre, for å kompensere for de døde volum-es forbundet med overføringsledninger til og fra mikroreaktoren; den nødvendige tid vil være avhengig av strømningshastighetene som er involvert.

1. Skyll mikroreaktor og gjør den klar for analyse ved infusjon av en vandig oppløsning av NH ₄ HCO ₃ (50 mM) i _H2O / _CH3CN (98: 2 v / v) i 2 mL / min i 5 min; bruke en 250 mL sprøyte.
2. Installering av proteinprøven (1 uM) på mikroreaktor ved infusjonen av prøveoppløsningen ved 2 mL / min i 5 min; bruke en 250 mL sprøyte.
3. Sette mot trypsin-oppløsning (5 uM) over det adsorberte protein på mikroreaktor på 2 mL / min i 1-3 min.
4. Slukke proteolytiske nedbrytningsprosess ved å skylle den mikroreaktor med en surgjort vandig oppløsning av TFA (0,01% v / v) i _H2O / _CH3CN (98: 2 v / v) i 2 mL / min i 5 min; bruke en 250 mL sprøyte.
5. Begynn å eluere proteinet fordøye fra mikroreaktoren ved infusjonen et surgjort organisk oppløsning av TFA (0,01%v / v) i _H2O / _CH3CN (50:50 v / v) ved 300 nl / min.
6. Slå på MS datainnsamling prosessen og ESI spenning (~ 2000 V); anskaffe MS-data ved hjelp av datainnsamlings parametrene gitt i trinn 3.8; observere elueringen av de tryptiske peptider.

6. Behandling av data

1. Behandle tandem MS data med en søkemotor kompatibel med rå MS dataformat.
   1. Behandle LTQ-MS rå filer ved hjelp av en organisme bestemt minimal overflødig protein database; laste rådata i søkemotoren, setter de overordnede og fragment ion massetoleranser til to og en Da henholdsvis, og bruker bare fullt tryptiske fragmenter med opptil to savnet konfliktlinjer for søke; tillater ikke for posttranslational modifikasjoner; inn de høye og middels tillit falske funnrate (FDR) til 1% og 3%, henholdsvis, og tillater ikke for posttranslational modifikasjoner.
2. Filtrere dataene for å velge bare høy selvtillitpeptid passer til proteiner i databasen; evaluere protein og peptid-nivå resultater.

Representative Results

Et representativt resultat av et proteolytisk fordøyelse prosess utføres samtidig på en blanding av proteiner, med de ovenfor beskrevne mikroreaktorer (figurene 1 eller 2), er gitt i tabell 1. Tabellen omfatter de unike peptidsekvensene som identifiserer et bestemt protein, korset korrelasjon score (Xcorr) (dvs. en poengsum som karakteriserer kvaliteten på den eksperimentelle til teoretisk kamp for tilsvarende tandem massespekteret), antall tapte skillelinjer, peptid ladetilstand (z), og massen / kostnad ( m / z) av de protonerte peptider. På proteinnivå, gir tabellen Uniprot protein-ID, beskrivelse (navn) av protein, protein score og proteindekning. Alle proteiner som var identifiserbare av multiple peptider, etter at en proteolytisk spaltning utføres i 90 sek.

Den tid som er nødvendig foreluering av alle peptider var avhengig av lengden av overførings kapillær som leverte den surgjorte organiske oppløsning ved 300 nl / min, en strømningshastighet er kompatibel med nano-ESI optimal drift. I-kapillær blanding av vandige og organiske løsninger surgjort resulterte i tidlig eluering av noen peptider, men det store flertall eluert i løpet av flere minutter bare i den organiske oppløsning. Et massespektrum som viser co-eluering av flere peptider som representerer de fem proteiner, som er generert med den kapillære mikroreaktor, er gitt i figur 3.

Tabell 1. Liste over tryptiske peptider generert gjennom proteolytisk fordøyelse av fem proteiner ved hjelp av kapillær mikroreaktor og O / N fordøyelsen protokoller. Bare unike sekvenser, med høyest Xcorr, vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur 1. Capillary mikroreaktor. (A) Forsøks oppsett for fabrikasjon av mikroreaktor. (B) Capillary mikroreaktor plassert i MS ion kilden. Den mikroreaktor er lastet manuelt med C18-bundet silikapartiklene og plassert på en XYZ-scenen som forenkler riktig posisjonering i ESI-MS kilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. mikrofluidmikroreaktor. (A) Skjematisk fremstilling av mikrofluidreaktor. (B) mikrofluid reaktor sikret i en PEEK stand. Den microfluidic reaktoren ennd overføringslinjene er fabrikkert i et glass substrat som kan sikres på en hjemmelaget polymer PEEK stå for videre posisjonering i MS kilde med XYZ scenen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Mass spekteret bestående tryptiske peptider generert fra proteinblandingen utsatt for proteolyse i mikroreaktor. De mest intense tryptiske peptid ioner er merket med sekvensen av aminosyrer og det tilsvarende protein identifikator. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den mikroreaktor som er beskrevet i dette arbeidet gir en lett-å-implementere eksperimentelle oppsett for å utføre enzymatisk fordøyelse av proteiner for å aktivere MS analyse og identifikasjon i mindre enn 30 min. De klare fordelene med dette system, i forhold til konvensjonelle tilnærminger inkluderer enkelhet, hastighet, lav reagens forbruk og lave kostnader. I særdeleshet er det ikke behov for kostbare immobilisert trypsin, perler og patroner. Utarbeidelsen av kapillær mikroreaktor er grei (figur 1A), og kan gjøres i løpet av minutter fra standard utstyr, som vanligvis finnes i en kromatografi laboratorium. Selv om reversert fase C18-partikler kan vaskes bort med høyt organisk innhold løsningsmiddel _(CH3 CN eller CH ₃ OH) for fullstendig fjerning av adsorberte proteiner eller peptider, og den mikroreaktor kan brukes om igjen, den enkle og kostnadseffektive fabrikasjonsprosess inviterer for produksjon av engangs enheter for engangsbruk applicsjoner. Den kapillære mikroreaktor kan monteres i en hjemme-bygget ESI kilde, slik som vist i figur 1 B, eller kan settes inn i en standard kommersiell ionekilde. Mens den partikkelseng for prøven opptak og nedbrytning ikke trenger å være mer enn ~ 1-2 mm, akkurat nok til å fange opp tilstrekkelig materiale for optimal deteksjon av MS, kan lengden av kapillaren i seg selv kan justeres til å passe størrelsen av enhver spesiell ionekilde.

For laboratorier som har evner til å dikte microfluidic enheter, er en enkel design (figur 2A) som kan festes til et stativ for å tilrettelegge for tilkopling til MS deteksjon (figur 2B) forutsatt. Dimensjonene av mikroreaktoren og overføringskanaler kan tilpasses til de krav som en spesiell anvendelse, og anordningen kan bygges inn i en enkelt eller multiplekset format. For de fleste kommersielle massespektrometre, men ville ionekilden trenger modifikasjoner for å tillate the plassering av enheten i kilden. Fotomasken tegning for chip fabrikasjon ble utført med AutoCAD og fotomasken ble utarbeidet av HTA fotomaske. Fabrikasjonen av mikrobrikker ble utført i henhold til protokollen beskrevet tidligere: ^17,18 justering av substratet med den fotomaske, eksponering for UV-lys (360 nm), fjernelse av det bestrålte fotoresist og den underliggende kromsjikt, våt kjemisk etsing av kanaler med buffer oxide etch, fjerning av det gjenværende krom lag, boring av adkomsthull, rengjøring, hydrolyse av mikrochip flaten _(NH4OH + H ₂ O _2), og termisk binding av substratet til dekkplaten ved gradvis oppvarming til 550 ° C. Både substratet og dekkplate ble etset, en for dype kanaler for prøvehåndtering (~ 20-50 um), og den andre for grunne mikro-kanalfilterelementer (1,5-2 um dypt). ¹⁶

Resultatene som er generert med den ovenfor beskrevne microreactor er sammenlignbare med resultatene oppnådd fra O / N og ¹⁹ konvensjonelle fordøyelse protokoller som bruker substrat: enzymforhold på (50-100): 1, etterfulgt av en infusjon peptid eksperiment med MS-deteksjon (300 nl / min, peptider oppløst i H ₂ O / _CH3CN (50:50 v / v) surgjort med _CH3COOH, 0,1% v / v). Både mikroreaktor og konvensjonelle protokoller aktivert identifisering av alle proteiner av flere unike peptider (tabell 1). Vanligvis et noe større antall unike peptider pr protein opptrådte med mikroreaktor enn med konvensjonelle oppsett. Dette var et resultat av ufullstendig enzymatisk spalting på visse områder. Noen få ytterligere minutter av proteolytisk fordøyelse reduseres eller elimineres dette utfallet. Også noen enzymatiske peptider dannet med mikroreaktoren var forskjellig fra de som genereres i løsning, på grunn av det faktum at for proteinene som er adsorbert på partiklene C18 forskjellige steder ble utsatt for enzym tHan i homogene løsninger. ²⁰ De Xcorr score viser imidlertid at kvaliteten på tandem massespektra generert med mikroreaktor var av høy kvalitet, og at et tilstrekkelig proteinsekvens dekning (11-75%) er oppnåelig for entydige protein identifikasjoner .

Teknikken, som beskrevet, er begrenset til analyse av ganske enkle proteinblandinger som genererer på de fleste ~ 25-50 peptider som kan analyseres ved hjelp av enkle eksperimenter infusjon, og som ikke nødvendiggjør væske kromatografisk separasjon før MS-analyse. Avgjørende for suksess er bruken av nylig tinte og tilberedte trypsin løsninger, for å ikke redusere eller mister aktiviteten til det proteolytiske enzym på det operative pH i mikroreaktor (dvs. pH ~ 8). I tillegg må en riktig balanse bli funnet mellom optimale strømningsrater for electrospray ionisering (150-300 nl / min) og de maksimale strømningshastigheter som kan tolereres av det eksperimentelle oppsettet og som gjør det muligrask peptid eluering fra mikroreaktor (2-3 mL / min). Høyere enn optimale ESI strømningsrater medføre sensitivitets tap og dårlige deteksjonsgrenser. Som et resultat, bør lengden av overførings kapillarene holdes så kort som mulig for å redusere den tid som er nødvendig for eluering av peptider fra mikroreaktoren ved drift ved ≤300 nl / min. Alle komponenter som ble brukt for den eksperimentelle oppsettet kan erstattes av komponenter fra andre produsenter som utfører lignende funksjoner. Dersom de dimensjonale karakteristika for disse komponentene er forskjellige (lengde, diameter, volum), optimalisering av elueringsmiddel-strømningshastigheter, prøvekonsentrasjon, tid for å utføre visse trinn, og av den ESI spenningen kan være nødvendig for å oppnå lignende resultater.

En unik fordel aktiveres av mikrofluidoppsettet er muligheten til å inkorporere ytterligere på brikken et pumpesystem, for eksempel en electroosmotic strømningsdrevet pumpe, ^21,22 for å muliggjøre den fritt alen operasjon av plattformen og integrering av et ytterligere separasjonstrinn. Evnen til å utføre on-chip separasjoner av peptidene er generert via proteolytisk fordøyelse vil føre til bedre påvisningsgrenser, og vil lette analyse av komplekse proteinblandinger fra cellulære ekstrakter. Dette vil ytterligere muliggjøre integrering av teknikken i arbeidsflyter som gjør bruk av microfabricated plattformer og høyhastighets MS deteksjon for biomedisinske anvendelser. ²³

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion trap ESI-MS	Thermo Electron	LTQ	The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage	Newport	Multiple parts	The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope	Edmund optics	G81-278	The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler	VWR	46600-204	The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson	VWR	33995-540	The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22	Harvard Apparatus	552222	The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system	EMD Millipore	ZD5311595	The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl)	VWR	53513-410	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl)	VWR	53513-406	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl)	VWR	53513-402	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP100375	This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP020090	This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP050375	This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver	Supelco	23740-U	This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue	Eclectic Products	E6000 Craft	This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue	Epo-Tek	353NDT	This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm)	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18	These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl)	Hamilton	81130-1725RN	The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”)	Valco	ZRU1.5FPK	This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”)	Valco	ZU1XC	The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”)	Valco	MT.5XCPK	The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight)	Valco	C-NTXFPK	This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm)	VWR	66260-126	The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD)	Valco	TTF115-10FT	The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD)	Upchurch Scientific	1565	The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD)	Valco	TPK.515-25	The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter	Valco	JR-797	This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml)	Agilent	HP-5183-2069	The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry
Amber vial (4 ml)	VWR	66011-948	The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml)	Fisher	12-565-286D	The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml)	VWR	24710-463	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml)	VWR	24710-441	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl)	VWR	83007-386	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl)	VWR	53503-781	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl)	VWR	53511-681	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates	Nanofilm	B270 white crown, 3” x 3”	These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”)	Upchurch	P203X	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly	Upchurch	N-122H	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards	Sigma	Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher	A955
Methanol, HPLC grade	Fisher	A452
Isopropanol, HPLC grade	Sigma	650447
Trifluoroacetic acid	Sigma	302031
Ammonium bicarbonate	Aldrich	A6141
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111