Abstract
La grande maggioranza di spettrometria di massa (MS) a base di metodi di analisi di proteine implicano un'attività digestione enzimatica prima della rivelazione, tipicamente con tripsina. Questo passo è necessario per la generazione di piccoli peptidi peso molecolare, generalmente con MW <3000-4000 Da, che rientra nell'intervallo di scansione effettiva della strumentazione di spettrometria di massa. protocolli convenzionali coinvolgono O / N digestione enzimatica a 37 ° C. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di una varietà di strategie, tipicamente coinvolge l'uso di un microreattore con enzimi immobilizzati o di una serie di processi fisici complementari che riducono il tempo necessario per proteolitica digestione per alcuni minuti (per esempio, microonde o ad alta pressione). In questo lavoro, si descrive un approccio semplice e conveniente che può essere implementato in qualsiasi laboratorio per la realizzazione rapida digestione enzimatica di una proteina. La proteina (o miscela di proteine) è adsorbito sulla alta perf C18-bonded fase inversaormance particelle di silice cromatografia liquida (HPLC) precaricate in una colonna capillare, e tripsina in tampone acquoso viene infusa in particelle per un breve periodo di tempo. Per attivare il rilevamento on-line MS, i peptidi triptici vengono eluite con un sistema solvente con maggiore contenuto organico direttamente nella sorgente MS ioni. Questo approccio consente di evitare l'uso di particelle ad alto prezzo degli enzimi immobilizzati e non richiede alcun aiuto per il completamento del processo. Protein digestione e l'analisi del campione completo può essere realizzato in meno di ~ 3 min e ~ 30 minuti, rispettivamente.
Introduction
L'identificazione e la caratterizzazione di proteine purificate si ottiene spesso utilizzando tecniche MS. La proteina viene digerito con un enzima e dei suoi peptidi sono ulteriormente analizzato da MS utilizzando un semplice apparato sperimentale infusione. digestione proteolitica è necessaria per la generazione di piccoli frammenti peptidici che rientrano nel range di massa utile della maggior parte degli analizzatori MS, e che può essere facilmente frammentato attraverso bassa energia di collisione di dissociazione indotta per generare aminoacido informazioni sulla sequenza. Per proteine isolate o semplici miscele proteiche, non vi è alcuna ulteriore necessità di separazione cromatografica dei peptidi prima della rivelazione MS. Una miscela di 25-50 peptidi può essere facilmente analizzato infondendo il campione con una pompa a siringa direttamente nella sorgente MS ioni.
Lo spettrometro di massa può eseguire l'analisi e confermare la sequenza di una proteina in un breve lasso di tempo. Con i moderni metodi di acquisizione dati, questo processo può essere realizzato well'ambito pochi minuti o addirittura secondi. Il fattore limitante nel completare l'intero processo in un breve lasso di tempo è la fase di digestione proteolitica. In genere, questa viene eseguita nell'arco di alcune ore (o O / N), in soluzione, a 37 ° C, con substrato: rapporti di enzimi di (50-100): 1. Per ridurre il tempo di digestione enzimatica a minuti o secondi, microreattori enzima immobilizzato, in forma di reattori microfluidici o cartucce disponibili in commercio, sono stati descritti. 1-6 Tipicamente, l'enzima è immobilizzato da covalente, non covalente / adsorbimento fisico, complesso formazione o incapsulamento, 3,6 la maggiore efficienza del processo enzimatico viene abilitato dalla grande superficie-volume e rapporti enzima-to-substrato. Ulteriori vantaggi di reattori immobilizzate comprendono la riduzione autolisi e interferenze da parte dell'enzima in analisi MS, una migliore stabilità enzimatica e riutilizzabilità. Una varietà di approcci, utilizzando il vetro o dispositivi microfabbricate polimerici sono stati descritti,utilizzando enzimi immobilizzati su sfere magnetiche da interazioni antigene-anticorpo, 7,8 intrappolati nelle reti di nanoparticelle d'oro, 9 incapsulato in titanio-allumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 o catturati attraverso Ni-NTA o His-Tag formazione del complesso. In alternativa 6 , sono stati sviluppati capillari aperti tubolari con enzimi immobilizzati, pure. 12 Inoltre, maggiore segmentazione proteolitica è stata dimostrata utilizzando controllata irradiazione a microonde 13 o tecnologia cicli di pressione assistita o pressione (PCT) per ridurre i tempi di reazione a 30-120 min. 14
Nonostante i molteplici vantaggi dei reattori enzima immobilizzato, i costi delle cartucce commerciali è alto, la disponibilità di dispositivi microfluidici per uso di routine è limitato, e l'uso di tecnologie microonde o PCT risultati in necessità di strumentazione aggiuntiva. L'obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo che circumveNTS questi svantaggi, e che può essere facilmente implementato in ogni laboratorio per potenziare ricercatori un approccio semplice ed efficace per l'esecuzione di scissione enzimatica di proteine in preparazione per l'analisi MS in pochi minuti. Questo approccio si basa sull'uso di idrofobici, C18-particelle che sono pre-caricate in un capillare o dispositivo microfluidica, e l'adsorbimento della proteina (s) di interesse nelle particelle seguita da digestione enzimatica durante l'infusione dell'enzima sul letto impaccato e proteine catturato (s). In questo approccio, il substrato viene immobilizzato attraverso interazioni non covalenti, e l'enzima è infuso proteina immobilizzata. L'efficienza proteolitica digestione viene aumentata dalle grandi superfici di particelle che espongono la proteina per la trasformazione enzimatica, distanze e tempi di diffusione da e verso la superficie delle particelle ridotta, migliorato trasferimento di massa, nessun legame covalente che possono influenzare l'attività dell'enzima, capacità rapidamente evaluate combinazioni di diversi enzimi, disponibilità, e multiplexing se il processo viene eseguito in un formato microfluidica. Questo approccio è dimostrato con l'uso di una miscela di proteine standard e tripsina-enzima più comunemente usato per la digestione proteolitica prima della rilevazione ESI-MS. Lo spettrometro di massa utilizzato per la rilevazione in questo studio era uno strumento lineare trappola quadrupolo (LTQ).
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Protocol
1. Preparazione del capillare microreattore
- Tagliare il diametro interno 100 micron (ID) x 360 micron di diametro esterno (OD) capillare ad una lunghezza di 7-8 cm, e 20 micron ID x 90 micron OD capillare per 3-5 cm con il coltello capillare di vetro; verifica al microscopio che entrambe le estremità capillari hanno un taglio netto, diritta, senza bave sporgenti.
- Inserire il 20 um ID x 90 micron OD capillare in un'estremità del 100 micron ID x 360 micron OD capillare, per una lunghezza di ~ 6 mm; in caso di necessità, osservare questa operazione al microscopio.
- Applicare una piccola goccia di colla E6000 attorno alla giunzione dei 90 micron OD / 100 micron capillari ID con la fine di un Q-tip, e lasciare che la colla cura O / N a temperatura ambiente.
- Tagliare il inserita 20 micron ID x 90 micron OD capillare ad una lunghezza di ~ 10-15 mm; questo sarà l'emettitore Elettrospray.
- Pre-tagliare il 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK e 1/16 "PTFE vasca ODzione in pezzi di 4-5 cm di lunghezza; questi saranno i manicotti utilizzati nei sindacati capillari per la fornitura di una connessione senza perdite.
- Collegare l'estremità opposta del 100 micron ID x 360 micron OD capillare per un'unione PEEK; usare un manicotto 1/32 "PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite.
- Inserire / serrare un pezzo di ~ 5 cm di lunghezza 1/16 "tubo PTFE nella estremità opposta del raccordo.
- Pesare ~ 4 mg di C18 (5 micron) particelle in un pre-pulito / secca 2 ml flacone di vetro; aggiungere 0,5 ml di isopropanolo, chiudere la fiala e disperdere il liquame nella vasca da bagno ultrasonicatore.
- Prelevare con una siringa 250 microlitri di circa 200 pl liquami, inserire l'ago della siringa nel "tubo 1/16 PTFE dell'unione PEEK, e dispensare lentamente l'impasto in 100 micron ID x 360 micron OD capillare, osservare al microscopio come capillare riempie di particelle fino una lunghezza di 2-3 mm di imballaggio è realizzato; questo sarà il microreattore (Figura 1) il 20 μ.m ID capillare trattiene le particelle nel microreattore con un effetto Keystone. 15
- Risciacquare microreattore con ~ soluzione 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, e poi con soluzione ~ 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v.
2. preparazione di soluzioni campione
Nota: Le operazioni che comportano la manipolazione di solventi organici e acidi e la preparazione della soluzione devono essere eseguite in una cappa aspirante. Indossare occhiali, guanti e indumenti protettivi.
- Risciacquare con CH 3 OH e asciugare alcune fiale di vetro (4 ml) e tubi di polipropilene (15 ml).
- Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 9,8 ml H 2 O con 200 microlitri CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni.
- Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 5 ml H 2 </ sub> O con 5 ml di CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni.
- Preparare 4 ml di una soluzione acquosa acidificata (TFA 0,01% v / v) con l'aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni.
- Preparare 4 ml di una soluzione organica acidificata (TFA 0,01% v / v) con l'aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni.
- Pesare 16 mg di NH 4 HCO 3 con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml di H 2 O / CH 3 CN: soluzione (98 2 v / v) e disperdere per sonicazione; questo si traduce in una soluzione 50 mM di NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in tampone acquoso.
- Pesare 5 mg di proteina standard (ad esempio, albumina di siero bovino, emoglobina α / β, citocromo C, anidrasi carbonica, α-2-HS-glicoproteina, etc.) con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml DI wateR e disperdere mediante ultrasuoni; questo genere si traduce in una soluzione ad elevata concentrazione di livello pM.
- Preparare 1 ml di soluzione proteica (1-2 mM) diluendo la soluzione a concentrazione alto livello mM con un volume adeguato di NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; mescolare mediante ultrasuoni.
- Preparare la soluzione di tripsina (5 mM) sciogliendo 20 mg sequenziamento grado tripsina in 170 microlitri NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; disperdere mediante ultrasuoni.
3. apparato sperimentale
Nota: Il sistema LTQ-MS è dotato di una sorgente ESI modificato che comprende un XYZ stadi casa costruzione che abilita l'interfacciamento dello spettrometro di massa a vari approcci ingresso campione.
- Scollegare il microreattore capillare dall'unione PEEK e connettersi al PEEK Tee.
- Inserire lunga ~ 2 centimetri di filo Pt nel braccio laterale del PEEK Tee; utilizzare un "manicotto 1/32 PEEK per fornire un-Perdita di connessione e per isolare il filo Pt.
- Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare all'estremità opposta del PEEK Tee; usare un manicotto 1/32 "PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite.
- Fissare il Tee PEEK sul XYZ-stage e posizionare la ESI emettitore ~ 2 millimetri di distanza dal capillare di ingresso spettrometro di massa.
- Collegare il filo Pt alla sorgente di alimentazione ESI dello spettrometro di massa.
- Collegare l'estremità opposta del capillare trasferimento del campione all'unione di acciaio inossidabile; usare un manicotto 1/16 "PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite.
- Collegare un lungo 4-5 cm 1/16 "tubo in teflon all'estremità opposta del raccordo in acciaio inox e inserire l'ago della siringa 250 microlitri nel tubo PTFE, accendere la pompa e impostare la portata al valore desiderato (ad esempio, 2 microlitri / min).
- tandem Input parametri di acquisizione dati MS nel pacchetto software che controlla lo strumento un MSd salvare come file il metodo per preparare la messa a punto per l'esecuzione di analisi; per il sistema LTQ-MS, utilizzare i parametri di analisi dipendenti seguenti dati: l'esclusione dinamica abilitato per 180 sec con larghezza di massa esclusione ± 1,5 m / z; uno Stato membro scan seguito da uno zoom e MS 2 scansioni su i primi 5 picchi più intensi, zoom larghezza di scansione ± 5 m / z; dissociazione indotta da collisione (CID) parametri impostati in larghezza isolamento 3 m / z, energia di collisione normalizzato del 35%, l'attivazione Q 0.25, e il tempo di attivazione di 30 msec.
4. Configurazione Microfluidic
- Preparare un dispositivo microfluidico in vetro o substrati polimerici; 16-18 il layout del dispositivo è fornito in Figura 2A, consistente in un microreattore (1) (0,13 mm Lunghezza larghezza x 2 mm x 50 micron di profondità) collegato ad un ingresso (2 ), uscita (3) e una porta laterale (4); i canali comunicanti per le manipolazioni fluidica sono ~110 micron di larghezza e ~ 50 micron in profondità; una struttura multicanale (5), costituito da ~ 1,5-2 micron profondo x 10 micron di larghezza x 100 micron lunghi microcanali posti 25 micron a parte, fungerà da filtro per trattenere le particelle nel microreattore.
- Attiva connessioni fluido consegna al chip incollando connettori specializzati verso le luci di entrata, o escogitando un supporto polimerico che ospita raccordi per la consegna fluido (Figura 2B). 16
- Preparare una sospensione di particelle di C18 (5 micron), come descritto al punto 1.8; consegnare la sospensione al microreattore con una siringa utilizzando 1/16 "tubo in teflon collegato alla porta lato di chip (4); chiudere la porta dopo il caricamento delle particelle con colla epossidica e la cura per 1 ora in stufa a 90 ° C 16.
- Inserire un capillare (20 micron ID x 90 micron di lunghezza OD x 10 mm) nel porto di uscita, sigillare con la colla E6000, e lasciare che la cura O / N; questo diventerà l'emettitore ESI (
- Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare alla porta di ingresso del circuito integrato (2); collegare l'estremità opposta del capillare ad un microlitri siringa 250 e la pompa a siringa, come descritto in 3.6-3.7.
- Collocare un leggero connettore PEEK Tee sulla linea di trasferimento del campione appena prima luce di ingresso (2) e inserire un filo di Pt sul braccio laterale della T, come descritto in 3.2; questo sarà l'elettrodo ESI.
- Fissare il dispositivo microfluidica sul palco XYZ con l'emettitore ESI posizionato ~ 2 mm di distanza dal capillare spettrometro di massa in ingresso; preparare la MS per l'analisi come descritto in 3.8.
5. Campione Caricamento, proteolitica Digestione e eluizione per MS Analysis
Nota: Tutte le fasi di trasferimento soluzione / campione vengono eseguite con l'ausilio di una pompa a siringa e dovrebbe consentire per alcuni minuti supplementari per completare, per compensare la dead-volumes associati alle linee di trasferimento da e per il microreattore; il tempo necessario dipenderà dalle portate coinvolti.
- Risciacquare microreattore e prepararla per analisi infondendo una soluzione acquosa di NH 4 HCO 3 (50 mM) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri.
- Caricare il campione di proteine (1 pM) sul microreattore infondendo la soluzione campione a 2 microlitri / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri.
- Infondere la soluzione di tripsina (5 mM) sopra la proteina adsorbita sul microreattore a 2 microlitri / min per 1-3 min.
- Quench il processo di digestione proteolitica risciacquando il microreattore con una soluzione acquosa acidificata di TFA (0,01% v / v) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri.
- Avviare eluendo la proteina digerire dal microreattore infondendo una soluzione organica acidificato di TFA (0,01%v / v) in H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) a 300 Nl / min.
- Accendere il processo di acquisizione dei dati MS e la tensione ESI (~ 2.000 V); acquisire i dati MS utilizzando i parametri di acquisizione dati forniti al punto 3.8; osservare l'eluizione dei peptidi trittico.
6. Elaborazione dati
- Elaborare i dati in tandem MS con un motore di ricerca compatibile con il formato di dati di MS crudo.
- Elaborare i file RAW LTQ-MS utilizzando un organismo specifico database di proteine minimamente ridondante; caricare i dati grezzi nel motore di ricerca, impostare le tolleranze di massa genitore e ioni frammento di 2 e 1 Da rispettivamente, e utilizzare frammenti completamente solo triptici con un massimo di due perse spaccature per la ricerca; non consentono modifiche post-; fissare i tassi di rilevamento di alta e media fiducia falsi (FDR) a 1% e il 3%, rispettivamente, e non consentono modifiche post-traduzionali.
- Filtrare i dati per selezionare solo di alta fiduciapeptide corrisponde alle proteine presenti nel database; valutare i risultati proteine e livello peptide.
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Representative Results
Un risultato rappresentativo di un processo di digestione proteolitica eseguito contemporaneamente su una miscela di proteine, con le microreattori sopra descritti (figure 1 e 2), è fornita in Tabella 1. La tabella comprende le sequenze peptidiche uniche che identificano una proteina particolare, la croce punteggio correlazione (Xcorr) (ossia, un punteggio che caratterizza la qualità della partita sperimentale-to-teorico per lo spettro di massa tandem corrispondente), il numero di divisioni perse, lo stato di carica peptide (z), e la massa / carica ( m / z) dei peptidi protonati. A livello proteico, la tabella fornisce l'ID proteine UniProt, la descrizione (nome) della proteina, il punteggio di proteine e la copertura proteine. Tutte le proteine sono identificabili da più peptidi, dopo una digestione proteolitica eseguita per 90 sec.
Il tempo necessario per laeluizione di tutti i peptidi era dipendente dalla lunghezza del capillare di trasferimento che ha fornito la soluzione organica acidificata a 300 Nl / min, una portata compatibile con nano-ESI funzionamento ottimale. In-capillare miscelazione delle soluzioni acquose e organiche acidificata portato nella prima eluizione di alcuni peptidi, ma la maggior parte eluito per diversi minuti solo in soluzione organica. Uno spettro di massa visualizzazione della co-eluizione di diversi peptidi rappresentativi dei cinque proteine, generati con il microreattore capillare, è fornita in figura 3.
Tabella 1. Elenco dei peptidi triptici generati attraverso la digestione proteolitica di cinque proteine che utilizzano il microreattore capillare e protocolli di digestione O / N. Solo sequenze uniche, con la più alta Xcorr, sono mostrati. Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura 1. capillare microreattore. (A) configurazione sperimentale per la fabbricazione del microreattore. Microreattore (B) capillare posizionate a sorgente MS ioni. Il microreattore viene caricato manualmente con particelle di silice C18-incollati e posto su una XYZ-fase che facilita il corretto posizionamento nella sorgente ESI-MS. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. microreattore Microfluidic. (A) Schema del reattore microfluidica. (B) del reattore Microfluidic fissato in uno stand PEEK. Il reattore microfluidica unND linee di trasferimento sono fabbricati in un substrato di vetro che può essere fissato in un PEEK polimerico fatto in casa riposare per ulteriori posizionamento nella sorgente di MS con la fase di XYZ. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Spettro di massa che comprende peptidi tryptic generati dalla miscela di proteine sottoposte a proteolisi nel microreattore. Le più intense ioni peptidici tryptic sono etichettati con la sequenza degli aminoacidi e l'identificativo della proteina corrispondente. Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.
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Discussion
Il microreattore descritto in questo lavoro fornisce un facile da implementare apparato sperimentale per mineralizzazione enzimatica delle proteine per permettere l'analisi MS e identificazione in meno di 30 min. I vantaggi di questo sistema, rispetto agli approcci convenzionali, comprendono semplicità, velocità, basso consumo di reagenti e bassi costi. In particolare, non vi è alcuna necessità di costosi perline tripsina immobilizzati e cartucce. La preparazione del microreattore capillare è semplice (Figura 1A), e può essere realizzato in pochi minuti dal forniture standard, si trovano comunemente in un laboratorio cromatografia. Mentre le particelle C18 a fase inversa possono essere risciacquati con solvente organico contenuto (CH 3 CN o CH 3 OH) per la rimozione completa di proteine adsorbite o peptidi, e microreattore possono essere riutilizzati, il processo di fabbricazione semplice e conveniente invita per la produzione di unità monouso per monouso appliczioni. Il microreattore capillare può essere montato in una sorgente ESI casa costruita, come mostrato nella Figura 1B, o può essere inserito in una sorgente di ioni commerciale standard. Mentre il letto di particelle per la cattura e la digestione del campione non deve essere superiore a ~ 1-2 mm, quanto basta per catturare materiale sufficiente per il rilevamento ottimale MS, la lunghezza del capillare stesso può essere regolato per adattarsi alle dimensioni di un particolare sorgente di ioni.
Per i laboratori che hanno capacità di fabbricare dispositivi microfluidici, è fornito un disegno semplice (Figura 2A) che può essere fissato in base per facilitare l'interfacciamento a MS rilevamento (Figura 2B). Le dimensioni dei canali microreattore e trasferimento possono essere adattate alle esigenze di una particolare applicazione, e il dispositivo può essere sviluppato in un formato singolo o multiplato. Per la maggior parte spettrometri di massa commerciali, tuttavia, la fonte di ioni dovrebbe modifiche per consentire the il posizionamento del dispositivo sorgente. Il disegno photomask per fabbricazione di chip è stato eseguito con il software AutoCAD e fotomaschera sono stati preparati da HTA Photomask. La fabbricazione dei microchip è stata eseguita secondo i protocolli descritti in precedenza: 17,18 allineamento del substrato con fotomaschera, esposizione alla luce UV (360 nm), la rimozione del fotoresist irraggiato e strato di cromo sottostante, bagnato attacco chimico di canali con tampone etch ossido, la rimozione dello strato di cromo residuo, perforazione di fori di accesso, la pulizia, l'idrolisi della superficie microchip (NH 4 OH + H 2 O 2), e termosaldatura del substrato per la piastra di copertura mediante riscaldamento graduale a 550 ° C. Sia piastra di substrato e la copertura sono stati inciso, una per profondi canali per il campione movimentazione (~ 20-50 micron), e l'altro per elementi filtranti superficiale micro-canali (1,5-2 micron di profondità). 16
I risultati ottenuti con la sopra descritta microreactor sono confrontabili con i risultati ottenuti da O / N, 19 protocolli digestione convenzionali che utilizzano substrato: rapporti enzimatici (50-100): 1, seguito da un esperimento peptide infusione con MS rilevamento (300 nl / min, peptidi sciolto in H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) acidificata con CH 3 COOH, 0,1% v / v). Sia microreattore e protocolli convenzionali hanno consentito l'identificazione di tutte le proteine da parte di più peptidi unici (Tabella 1). Tipicamente, un numero alquanto maggiore di peptidi unici al proteina era osservabile con microreattore che con la configurazione convenzionale. Questo era un risultato di taglio enzimatico incompleta in certi siti. A pochi minuti supplementari di proteolitica digestione ridotto o eliminato questo risultato. Inoltre, alcuni peptidi enzimatici generati con il microreattore differivano da quelli generati in soluzione, a causa del fatto che per le proteine adsorbite sulle particelle C18 siti diversi stati esposti all'enzima than in soluzioni omogenee. 20 I punteggi Xcorr dimostrano tuttavia che la qualità degli spettri di massa tandem generato con il microreattore era di alta qualità, e che una copertura sufficiente sequenza proteica (11-75%) è ottenibile per identificazioni proteine inequivocabili .
La tecnica, come descritto, è limitato all'analisi di piuttosto semplici miscele proteiche che generano al massimo ~ 25-50 peptidi che possono essere analizzati mediante semplici esperimenti infusione e che non necessitano liquido separazione cromatografica prima dell'analisi MS. Fondamentale per il successo è l'uso di soluzioni di tripsina appena scongelati e preparati, di non ridurre o perdere l'attività dell'enzima proteolitico al pH operativa del microreattore (cioè, pH ~ 8). Inoltre, un giusto equilibrio deve essere trovato tra i tassi ottimali di flusso per elettrospray ionizzazione (150-300 NL / min) e le portate massime che possono essere tollerati dal setup sperimentale e che consentonopeptide eluizione veloce dal microreattore (2-3 ml / min). Superiore a tassi ottimali di flusso ESI portare a perdite di sensibilità e limiti di rilevabilità poveri. Come risultato, la lunghezza dei capillari di trasferimento deve essere mantenuto il più breve possibile per ridurre il tempo necessario per l'eluizione dei peptidi dal microreattore operando a ≤300 nl / min. Tutti i componenti che sono stati utilizzati per l'apparato sperimentale possono essere sostituiti da componenti di altri produttori che svolgono funzioni simili. Se le caratteristiche dimensionali di queste componenti differiscono (lunghezza, diametro, volume), l'ottimizzazione delle portate dell'eluente, concentrazione del campione, il tempo per eseguire determinate operazioni e della tensione ESI può essere necessario per ottenere risultati simili.
Un vantaggio unico abilitato dal setup microfluidico è la capacità di incorporare ulteriormente sul chip un sistema di pompaggio, ad esempio, una pompa flusso elettroosmotico guidato, 21,22 per consentire lo stand-aluna operazione della piattaforma e l'integrazione di un ulteriore stadio di separazione. La capacità di effettuare separazioni on-chip dei peptidi generati mediante digestione proteolitica comportino una migliore limiti di rilevamento e faciliterà l'analisi di miscele complesse di proteine da estratti cellulari. Ciò consentirà ulteriormente l'integrazione della tecnica in flussi di lavoro che fanno uso di piattaforme microfabbricati e rilevazione MS ad alta velocità per applicazioni biomediche. 23
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µl) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µl) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 ml) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 ml) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 ml) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1,000 µl) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µl) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µl) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
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