Abstract
Подавляющее большинство масс-спектрометрии (МС) основе методов анализа белка включают стадию переваривания ферментативная до обнаружения, как правило, с помощью трипсина. Этот шаг необходим для генерации малых пептидов молекулярной массой, как правило, с MW <3000-4000 Da, которые находятся в пределах эффективного диапазона сканирования масс-спектрометрии приборов. Обычные протоколы включают O / N ферментативного расщепления при 37 ° С. Последние достижения привели к разработке различных стратегий, как правило , связанных с использованием микрореакторе с иммобилизованными ферментами или целого ряда дополнительных физических процессов , которые уменьшают время , необходимое для протеолитического расщепления в течение нескольких минут (например, микроволновая печь или высоко- давление). В этой работе мы опишем простой и экономически эффективный подход, который может быть реализован в любой лаборатории для достижения быстрого ферментативного расщепления белка. Белок (или протеиновую смесь) адсорбируют на С18-скрепленные с обращенной фазой высокой перфорацияormance жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) частицы диоксида кремния, предварительно загруженные в капиллярной колонкой, и трипсина в водном буфере вливают над частицами в течение короткого периода времени. Чтобы включить он-лайн обнаружения MS, Триптические пептиды элюируют системой растворителей, с повышенным содержанием органических веществ непосредственно в источнике ионов МС. Такой подход позволяет избежать использования частиц дорогостоящих иммобилизованного фермента и не требует какой-либо помощи для завершения процесса. Переваривания белков и полный анализ образца может быть достигнуто менее чем за ~ 3 мин и ~ 30 мин, соответственно.
Introduction
Идентификация и характеристика очищенных белков часто достигается за счет использования методов масс-спектрометрии. Белок переваривается с ферментом и его пептиды дополнительно анализируются с помощью МС с помощью простого инфузионную экспериментальной установки. Протеолитическим расщеплением необходимо для генерации небольших пептидных фрагментов, которые попадают в полезном диапазоне масс большинства анализаторов MS, и которые могут быть легко фрагментированы с помощью низкой энергии соударения индуцированной диссоциации для генерирования информации о последовательности аминокислот. Для получения изолированных белков или простых смесей белков, нет необходимости в дальнейшем хроматографического разделения пептидов до обнаружения MS. Смесь 25-50 пептидов могут быть легко проанализированы путем инфузии образца с помощью шприца непосредственно в источнике ионов МС.
Масс-спектрометр может провести анализ и подтвердить последовательность белка в течение короткого периода времени. С помощью современных методов сбора данных, этот процесс может быть достигнуто шithin несколько минут или даже секунд. Сдерживающим фактором в завершении всего процесса на коротком временном масштабе является протеолитический стадия пищеварения. Как правило, это осуществляется в течение нескольких часов (или O / N) в растворе, при 37 ° С, с использованием субстрата: ферментные соотношения (50-100): 1. Для уменьшения ферментативной время пищеварения минут или секунд, иммобилизованных микрореакторы фермента, в виде микрофлюидальных реакторов или коммерчески доступные картриджи, которые были описаны. 1-6 Как правило, фермент иммобилизован ковалентным, нековалентная / физической адсорбции, комплекс формирование или инкапсуляция, 3,6 повышенная эффективность процесса ферментативного быть включен по большой поверхности к объему и соотношения фермент-к-подложке. Дополнительные преимущества иммобилизованных реакторов включают снижение автолиза и помех от фермента в анализе MS, улучшенную стабильность фермента и возможность многократного использования. Разнообразие подходов, с использованием стекла или полимерных микроизготовленном устройств были описаны,с использованием ферментов , иммобилизованных на магнитных шариков с помощью антиген-антитело взаимодействий, 7,8 захваченный в золотых наночастиц сетей, 9 воплощен в оксид титана-оксид алюминия золь-гелей 10 и nanozeolites, 11 или захвачены в плен через Ni-NTA или Его-Таг формирования комплекса. 6 В качестве альтернативы , открытой трубчатые капилляры с иммобилизованными ферментами были разработаны, а также. 12 Кроме того, повышенная протеолитическое расщепление было продемонстрировано с помощью контролируемого микроволнового излучения 13 или давления , при содействии или под давлением технологии непрерывной цикличности (РСТ) для уменьшения времени реакции до 30-120 мин. 14
Несмотря на многочисленные преимущества иммобилизованных реакторов фермента, стоимость коммерческих картриджей высока, наличие микрофлюидальных устройств для повседневного использования ограничено, а также использование результатов микроволновые или РСТ технологии нуждаются в дополнительной аппаратуры. Цель данной работы заключалась в разработке метода, который circumveNTS эти недостатки, и которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории, чтобы расширить возможности исследователей с простым и эффективным подходом для осуществления ферментативного расщепления белков в процессе подготовки к анализу MS в течение нескольких минут. Подход основан на использовании гидрофобных, С18-частиц, которые предварительно загружены в капилляре или микрожидком устройстве, и адсорбцию белка (ов), представляющие интерес на эти частицы с последующим ферментативным расщеплением во время инфузии фермента над уплотненный слой и захватили белок (белки). При таком подходе субстрат иммобилизованные через нековалентных взаимодействий, а фермент вливают над иммобилизованным белком. Эффективность протеолитического расщепления увеличивается на большой поверхности частиц областей, которые выставляют белок для обработки ферментативной, уменьшение расстояния и времени диффузии и из поверхности частиц, улучшается перенос массы, отсутствие ковалентное, которые могут влиять на активность фермента, способность быстро evaluatе комбинации различных ферментов, одноразовости и мультиплексированием, если процесс выполняется в микрожидком формате. Этот подход демонстрируется с использованием смеси стандартных белков и трипсин-наиболее часто используемым ферментом для протеолитического расщепления до обнаружения ESI-MS. Масс-спектрометр используется для обнаружения в данном исследовании была линейная ловушка квадрупольного (LTQ) инструмент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение капилляра микрореакторе
- Обрежьте внутренний диаметр 100 мкм (ID) х наружный диаметр (OD) капилляра 360 мкм в длину 7-8 см, а 20 мкм ID х 90 мкм OD капиллярную 3-5 см со стеклянной капиллярной скалывателе; проверить под микроскопом, что оба капиллярные концы имеют чистый, ровный срез, без каких-либо выступающих заусенцев.
- Вставьте 20 мкм ID х 90 мкм OD капилляр в один конец 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра, при длине ~ 6 мм; в случае необходимости, соблюдать эту операцию под микроскопом.
- Нанесите маленькую капельку клея E6000 вокруг стыке мкм ID капилляров 90 мкм OD / 100 с концом ватной палочкой, и пусть клей лечения O / N при комнатной температуре.
- Вырезать 20 мкм, вставленный ID х 90 мкм OD капилляр длиной ~ 10-15 мм; это будет ионизацией электрораспылением эмиттера.
- Предварительно сократить 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK и 1/16 "OD PTFE ваннаING на куски 4-5 см в длину; это будут рукава, используемые в капиллярных союзах для обеспечения подключения к герметичны.
- Подключите противоположный конец 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра к PEEK союза; использование 1/32 "PEEK рукав а для обеспечения подключения к герметичны.
- Вставить / затянуть кусок ~ 5 см длиной 1/16 "PTFE трубки в противоположный конец союза.
- Взвесить ~ 4 мг С18 (5 мкм) частиц в предварительно очищенный / сушат 2 пузырек мл стекл; добавляют 0,5 мл изопропанола, закройте пробирку и дисперсных суспензии в ванне ультразвукового дезинтегратора.
- Вывод с помощью 250 мкл шприца приблизительно 200 мкл суспензии, вставьте иглу шприца в "PTFE трубки из PEEK союза 1/16, и медленно дозировать суспензии в 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра, наблюдать под микроскопом, что и капиллярная заполняет с частицами до тех пор , длиной 2-3 мм упаковки достигается, это будет микрореактор (рис 1) 20 μ.м ID капиллярная удерживает частицы в микрореакторе через Keystone эффект. 15
- Ополосните микрореактор с ~ 50 мкл раствора H 2 O / CH 3 CN 50:50 об / об, а затем с ~ 50 мкл раствора H 2 O / CH 3 CN 98: 2 об / об.
2. Приготовление растворов образцов
Примечание: Операции, которые вовлекают обработки органических растворителей и кислот и приготовления раствора должны быть выполнены в вытяжном шкафу. Носите защитные очки, перчатки и защитную одежду.
- Ополосните CH 3 OH и высушить несколько стеклянных флаконах (4 мл) и полипропиленовые пробирки (15 мл).
- Приготовьте 10 мл раствора H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) в 15 мл полипропиленовую пробирку путем смешивания 9,8 мл H 2 O с 200 мкл CH 3 CN; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
- Приготовьте 10 мл раствора H 2 O / CH 3 CN (50:50 об / об) в 15 мл полипропиленовую пробирку путем смешивания 5 мл H 2 </ суб> O 5 мл CH 3 CN; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
- Приготовьте 4 мл подкисленного водного раствора (ТФУ 0,01% об / об) путем добавления 4 мкл TFA (10%) в 4 мл H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
- Приготовьте 4 мл подкисленного органического раствора (ТФУ 0,01% об / об) путем добавления 4 мкл TFA (10%) в 4 мл H 2 O / CH 3 CN (50:50 об / об) в стеклянную пробирку 4 мл; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
- Взвесить 16 мг NH 4 HCO 3 с аналитическим микровесов в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; добавить 4 мл H 2 O / CH 3 CN: раствор (98 2 об / об) и дисперсных с помощью ультразвука; это приводит к 50 мМ раствора NH 4 HCO 3 (рН ~ 7,8) в водном буфере.
- Взвесить 5 мг стандартного белка (например, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин α / β, цитохром С, карбоангидразы, α-2-HS-гликопротеина и т.д.) с аналитическим микровесов в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; добавить 4 мл ДИ Wateг и рассеивать с помощью ультразвука; Как правило, это приводит к концентрации раствора высокой мкМ уровня.
- Готовят 1 мл раствора белка (1-2 мкм) путем разбавления раствора высокой концентрации мкМ уровне с соответствующим объемом NH 4 HCO 3 (50 мМ) водного буфера; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
- Готовят раствор трипсина (5 мкМ) , при растворении 20 мкг секвенирование класса трипсина в 170 мкл NH 4 HCO 3 (50 мМ) водного буфера; рассеивать путем обработки ультразвуком.
3. Экспериментальная установка
Примечание: Система LTQ-МС оснащена модифицированным источником ESI, который включает самодельный XYZ-этап, который позволяет состыковка масс-спектрометр для различных входных выборок подходов.
- Отсоедините капиллярную микрореактор из PEEK союза и подключения к PEEK Tee.
- Вставьте долго ~ 2 см провод Pt в боковом плече PEEK Tee; используйте 1/32 "PEEK втулка дл обеспеченигерметичны соединения и для изоляции провода Pt.
- Подключение 50 мкм ID х OD 360 мкм (~ 0,5 м длиной) перенос образца капиллярную на противоположном конце PEEK Tee; использование 1/32 "PEEK рукав а для обеспечения подключения к герметичны.
- Закрепите PEEK тройник на XYZ-стадии и положение ESI эмиттер ~ 2 мм от масс-спектрометра на входе капилляра.
- Подключите провод Pt к источнику питания ESI масс-спектрометра.
- Подключите противоположный конец передачи образца капилляра к штуцеру из нержавеющей стали; использование 1/16 "PEEK втулка с для обеспечения подключения к герметичны.
- Подключение длиной 4-5 см 1/16 "PTFE трубки к противоположному концу союза из нержавеющей стали и вставьте 250 мкл иглу шприца в тефлоновой трубке, включите насос и установить скорость потока на необходимом уровне (например, 2 мкл / мин).
- Входные параметры тандем MS сбора данных в пакет программного обеспечения, который управляет прибором МСd сохранить в виде файла метода к готовой установки для выполнения анализа; для системы LTQ-MS, используйте параметры анализа зависимые следующие данные: динамическое исключение позволило в течение 180 сек с шириной исключения масс ± 1,5 м / г; один MS сканирование с последующим одним зумом и MS 2 сканирует на топ - 5 наиболее интенсивных пиков, увеличить ширину сканирования ± 5 м / г; столкновения индуцированной диссоциации (CID) параметры, установленные по ширине изоляции 3 м / г, нормированной энергии столкновения 35%, активации Q 0,25 и времени активации 30 мс.
4. Микрожидкостных Setup
- Подготовьте микрожидком устройство из стекла или полимерных подложек; 16-18 компоновка устройства обеспечивается на рисунке 2А, состоящий из микрореакторе (1) (0,13 мм длина х ширина 2 мм х 50 мкм , глубиной) , соединенную с входным отверстием (2 ), выходное отверстие (3) и боковое отверстие (4); соединительные каналы для жидкостных манипуляций ~110 мкм в ширину и ~ 50 мкм глубиной; многоканальная структура (5), состоящая из ~ 1.5-2 мкм глубиной х 10 мкм в ширину х 100 мкм длиной микроканалы помещены 25 мкм друг от друга, будут действовать в качестве фильтра для удержания частиц в микрореакторе.
- Включение соединения жидкости доставки к чипу склеиванием специализированные разъемы к портам на входе, или путем разработки полимерного стенд , который приспосабливает фитинги для подачи жидкости (рис 2В). 16
- Приготовьте суспензию частиц C18 (5 мкм), как описано в пункте 1.8; доставить суспензии до микрореакторе с помощью шприца с помощью 1/16 "PTFE трубки , соединенный с чипом порта (4); герметизировать отверстие после загрузки частиц с эпоксидным клеем и отверждения в течение 1 ч в печи при 90 ° С 16.
- Вставьте капилляр (20 мкм ID х 90 мкм длиной OD х 10 мм) в выходном отверстии, печать с E6000 клеем, и пусть лекарство O / N; это станет ESI эмиттер (
- Подключение 50 мкм ID х OD 360 мкм (~ 0,5 м длиной) перенос образца капиллярного к входному порту чипа (2); подсоедините противоположный конец капиллярной к 250 мкл шприца и шприцевой насос, как описано в 3,6-3,7.
- Поместите облегченной PEEK Tee разъем на линии передачи образца непосредственно перед впускным отверстием (2) и вставить провод Pt на боковой ручке тройника, как описано в пункте 3.2; это будет ESI электрод.
- Закрепите микрожидкостных устройств на этапе XYZ с эмиттером ESI, расположенной ~ 2 мм от впускного масс-спектрометра капилляра; подготовить МС для анализа, как описано в 3.8.
5. Образец Загрузка, протеолитическим расщеплением и элюирования для MS Analysis
Примечание: Все шаги передачи раствор / образец выполняются с помощью шприцевого насоса и должен позволить в течение нескольких дополнительных минут для завершения, чтобы компенсировать мертвой Volumэс, связанные с линиями передачи и из микрореакторе; необходимое время будет зависеть от скорости потока, участвующих.
- Ополосните микрореактор и подготовить его для анализа путем инфузии водного раствора NH 4 HCO 3 (50 ммоль) в H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) в 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
- Нагрузка образца белка (1 мкМ) на микрореакторе настаиванием раствор образца по 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
- Влить раствор трипсина (5 мкМ) в течение адсорбированного белка на микрореакторе в 2 мкл / мин в течение 1-3 мин.
- Гасят протеолитическую процесс пищеварения путем промывки микрореакторе с подкисленным водным раствором TFA (0,01% об / об) в H 2 O / CH 3 CN (98: 2 об / об) со скоростью 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
- Начать элюируют протеин переваривается из микрореакторе настаиванием подкисленного органического раствора TFA (0,01%об / об) в H 2 O / CH 3 CN (50:50 об / об) со скоростью 300 л / мин.
- Включите процесс сбора данных MS и напряжение ESI (~ 2000 В); сбор данных MS, используя параметры сбора данных, представленных в шаге 3.8; наблюдать элюцию триптических пептидов.
6. Обработка данных
- Процесс данные тандем MS с поисковой системой, совместимой с исходным форматом данных MS.
- Процесс исходных файлов LTQ-MS, используя организм определенной базы данных минимально избыточных белков; загрузить исходные данные в поисковой системе, установить массовые допуски родительских и ионных фрагментов до 2 и 1 Da, соответственно, и использовать только полностью триптические фрагменты до двух пропущенных расколы для поиска; не позволяют посттрансляционных модификаций; установить высокие и средние доверительный уровень ложных обнаружения (FDR) до 1% и 3%, соответственно, и не позволяют посттрансляционных модификаций.
- Фильтрация данных, чтобы выбрать только высокое довериепептид соответствует с белками в базе данных; оценить белковые и пептидные на уровне результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результатом протеолитического процесса пищеварения осуществляется одновременно на смеси белков, с описанными выше микрореакторы (фиг.1 или 2), представлена в таблице 1. Таблица содержит уникальные пептидные последовательности , которые идентифицируют конкретный белок, крест корреляция оценка (Xcorr) (т.е. балл , который характеризует качество экспериментального к теоретико-матч для соответствующего спектра масс тандем), количество пропущенных сколов, состояние пептида заряда (г), а масса / заряд ( м / г) протонированных пептидов. На уровне белка, таблица содержит белок ID UniProt, описание (имя) белка, счет белка и белка покрытия. Все белки были идентифицированы с помощью нескольких пептидов, после того, как в результате протеолитического расщепления проводили в течение 90 сек.
Время, необходимое дляВымывание всех пептидов зависит от длины передаточного капилляра, который доставил подкисленного органического раствора при 300 нл / мин, скорость потока, совместимого с нано-ESI оптимальной работы. В-капиллярный смешивание водных и органических растворов подкисленной привело к ранней элюции нескольких пептидов, но большинство элюировали в течение нескольких минут только в органическом растворе. Масс - спектр отображения со-элюции несколько пептидов представителя пяти белков, сгенерированных с помощью капиллярного микрореакторе, обеспечивается на рисунке 3.
Таблица 1. Список триптических пептидов , полученных путем протеолитического расщепления белков с использованием пяти капиллярную микрореактор и протоколы O / N с пищеварением. Только уникальные последовательности, с самой высокой Xcorr, показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Рисунок 1. Капиллярная микрореактор. (A) Экспериментальная установка для изготовления микрореакторе. (Б) Капиллярная Микрореактор расположенный в источнике ионов МС. Микрореактор загружается вручную с помощью С18-скрепленных частиц диоксида кремния и помещают на XYZ-стадии , которая облегчает правильное положение в источнике ESI-MS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Микрожидкостных микрореактор. (A) Принципиальная схема микрожидком реактора. (В) Микрожидкостных реактор закреплен в PEEK стенде. Микрожидкостных реакторй линии передачи изготовлены в стеклянной подложке , которая может быть закреплена в самодельной полимерного материала PEEK стенд для дальнейшего позиционирования в источнике MS со стадией XYZ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Масс - спектр , содержащий триптические пептиды , полученные от белковой смеси , подвергнутой протеолиза в микрореакторе. Наиболее интенсивные ионы триптические пептидные маркированы с последовательностью аминокислот и соответствующим идентификатором белка. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микрореактор описано в данной работе, обеспечивает простую в реализации экспериментальной установки для осуществления ферментативного расщепления белков для проведения анализа MS и идентификацию менее чем за 30 мин. Явные преимущества этой системы, по сравнению с традиционными подходами, включают простоту, скорость, низкий расход реагентов и низкие затраты. В частности, нет необходимости в дорогостоящих иммобилизованных бусин трипсина и патронов. Подготовка капиллярной микрореакторе проста (рис 1А), и может быть достигнуто в течение нескольких минут от стандартных источников, обычно встречаются в лаборатории хроматографии. В то время как частицы в качестве обращенной фазы С18 могут быть промыты высоким органическим содержанием растворителя (CH 3 CN или CH 3 OH) для полного удаления адсорбированных белков или пептидов, и микрореактор могут быть повторно использованы, простой и экономически эффективный процесс изготовления приглашает для изготовления одноразовых устройств для одноразового использования Applications. Капилляр Микрореактор может быть установлен в самодельный источник ESI, как показано на фиг.1В, или может быть вставлен в стандартный коммерческий источник ионов. В то время как слой частиц для захвата образца и пищеварения не должны быть длиннее, чем ~ 1-2 мм, просто достаточно, чтобы захватить достаточное количество материала для оптимального обнаружения с помощью МС, длина самого капилляра может быть скорректирована, чтобы соответствовать размеру какой-либо конкретной источник ионов.
Для лабораторий , которые имеют возможности для изготовления микрожидкостных устройств, простая конструкция (рисунок 2А) , который может быть закреплен на подставке для облегчения взаимодействия с MS обнаружения (Фигура 2В) предусмотрена. Размеры микрореакторе и передаточных каналов могут быть адаптированы к требованиям конкретного применения, и устройство может быть разработано в один или мультиплексном формате. Для большинства коммерческих масс-спектрометров, однако, источник ионов должны были бы изменения, чтобы разрешить юе размещение устройства в источнике. Фотошаблонов чертеж для изготовления чипов был выполнен с программным обеспечением AutoCAD и фотошаблонов были подготовлены HTA фотошаблона. Изготовление микрочипов проводили в соответствии с протоколами , описанными ранее: 17,18 выравнивание подложки с фотошаблона, воздействием УФ - света (360 нм), удаление облученного фоторезиста и подстилающей слоем хрома, мокрого химического травления каналов с буфером оксид травление, удаление оставшегося слоя хрома, сверление отверстий доступа, очистки, гидролиз поверхности микрочипа (NH 4 OH + H 2 O 2), и термическое соединение подложки к накладке путем постепенного нагрева до 550 ° с . Обе подложки и крышка были выгравированы, один для глубоких каналов для обработки образца (~ 20-50 мкм), а другой для мелких фильтрующих элементов микроканальных (1,5-2 мкм в глубину). 16
Результаты, полученные с помощью описанного выше миcroreactor сопоставимы с результатами , полученными из O / N, 19 обычных пищеварением протоколы , которые используют субстрат: фермент соотношения (50-100): 1, за которым следует пептид инфузионной эксперимента с обнаружением MS (300 нл / мин, пептиды , растворенного в H 2 O / CH 3 CN (50:50 об / об) подкисляют CH 3 COOH, 0,1% об / об). Оба микрореактор и обычные протоколы позволили идентифицировать все белки несколькими уникальными пептидов (таблица 1). Как правило, несколько большее количество уникальных пептидов на белок, наблюдаемым с микрореакторе, чем с обычной установкой. Это было результатом неполного ферментативного расщепления на определенных участках. Несколько дополнительных минут протеолитическим расщеплением уменьшить или устранить этот результат. Кроме того, некоторые ферментативные пептиды, полученные с микрореакторе отличались от тех, сгенерированных в растворе, из-за того, что для белков, адсорбированных на частицах С18 различных участков подвергались воздействию фермента тхань в гомогенных растворах. 20 Счет Xcorr показывают, однако, что качество спектров тандемной масс , генерируемый микрореакторе был высокого качества, а также о том , что охват достаточной последовательности белка (11-75%) достижима для однозначных белковых идентификаций ,
Методика, как это описано, ограничивается анализом довольно простых белковых смесей, которые генерируют в большинстве ~ 25-50 пептидов, которые могут быть проанализированы с помощью простых экспериментов для вливаний и что не требуют жидкого хроматографического разделения до анализа MS. Решающее значение для успеха является использование свеже размораживают и приготовленных растворов трипсина, чтобы не уменьшить или теряют активность протеолитического фермента при оперативном рН микрореактор (то есть, рН ~ 8). Кроме того, надлежащий баланс должен быть найден между оптимальных скоростей потока для ионизации электрораспылением (150-300 л / мин) и скоростей максимального потока, который может быть терпимо экспериментальной установки и которые позволяютбыстрый пептид элюирование из микрореактор (2-3 мкл / мин). Выше оптимальной скорости потока ESI приводят к потерям чувствительности и бедных пределов обнаружения. В результате, длина капилляров передачи должна поддерживаться как можно более коротким, чтобы сократить время, необходимое для элюирования пептидов из микрореакторе при работе при ≤300 Нл / мин. Все компоненты, которые были использованы для экспериментальной установки могут быть заменены компонентами других производителей, которые выполняют аналогичные функции. Если размерные характеристики этих компонентов различаются (длина, диаметр, объем), оптимизация элюентов скорости потока, концентрации пробы, время для выполнения определенных шагов и напряжения ESI может быть необходимо, чтобы получить аналогичные результаты.
Уникальное преимущество возможным благодаря микрожидком установки является возможность дальнейшего включения на чипе насосной системы, например, электроосмотического потока приводом насоса, 21,22 для включения стенд-альодна операция платформы и интеграция дополнительной стадии разделения. Возможность выполнять на чипе разделений пептидов, полученных путем протеолитического расщепления приведет к улучшению пределов обнаружения, и будет способствовать анализу сложных белковых смесей из клеточных экстрактов. Это расширит возможности интеграции техники в рабочих процессах , которые используют микроизготовленном платформ и высокоскоростного обнаружения MS для биомедицинских применений. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1,000 µl) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µl) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µl) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 ml) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 ml) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 ml) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1,000 µl) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µl) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µl) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
