Summary
Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.
Abstract
Primärzellen werden direkt aus Gewebe gewonnen und sind gedacht, um mehr repräsentativ für den physiologischen Zustand der Zellen, die in vivo als etablierte Zelllinien sein. Jedoch weisen primäre Zellkulturen in der Regel eine begrenzte Lebensdauer und häufig wiedereingeführt werden müssen. Fibroblasten sind eine leicht zugängliche Quelle von Primärzellen. Hier diskutieren wir eine einfache und schnelle Versuchsdurchführung zu primären Fibroblastenkulturen von Ohren und Schwanz von Mäusen zu etablieren. Das Protokoll kann die primäre Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden, zu etablieren. Wenn das Protokoll genau befolgt, sind Verunreinigungen unwahrscheinlich, trotz der Verwendung für längere Zeit in einigen Fällen nicht gespeichert unsterilen Gewebe auftreten. Fibroblasten vermehren sich rasch in Kultur und kann zu einer beträchtlichen Zahl vor einer replikativen Seneszenz erweitert werden.
Introduction
Primärzellen werden von lebendem Gewebe und kultiviert unter in vitro Bedingungen abgeleitet sind. Es wird allgemein angenommen, dass primäre Zellen, die den physiologischen Zustand und der genetische Hintergrund des Gewebes, aus dem sie stammen, als immortalisierte oder Tumorzelllinien 1 stärker ähneln. Aus diesem Grund Primärzellen sind ein nützliches Modell für die Untersuchung biologischer Fragestellungen 2,3. Doch im Gegensatz zu etablierten Zelllinien, die auf unbestimmte Zeit zu wachsen, Primärzellen schließlich unterziehen Seneszenz in Kultur und häufig wiedereingeführt werden müssen.
Üblicherweise verwendete primäre Zellen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, T-Zellen, B-Zellen, Knochenmark-Makrophagen (BMDM) und Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC). Fibroblasten werden oft als primäre Zellkultur-Modell genutzt. Sie bieten entscheidende Vorteile gegenüber anderen Primärzellen. Die Zellkulturen werden leicht hergestellt, leicht aufrechterhalten und erfordern keine Purification der Zellen vor der Kultur. Sie haben schnellen anfänglichen Proliferation und keine Voraussetzung für die Fachmedium oder Aktivierungsprotokolle. Fibroblasten lassen sich effizient mit biologischen, chemischen und physikalischen Protokollen 4,5 transfiziert werden. Gibt es eine Möglichkeit, um die Ohren für bis zu 10 Tage bei RT vor der Etablierung von Zellkulturen zu speichern. Fibroblastenkulturen sind förderlich für die Visualisierung von zytoplasmatischen Prozesse und für die Neuprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 6.
Fibroblasten sind wichtige Zellen des Bindegewebes, die Kollagen-Proteine der extrazellulären Matrix 7 sekretieren. Sie stellen den strukturellen Rahmen in vielen Geweben 8 und spielen eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung und Gewebereparatur 9,10.
Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (<4 h) Protokoll, um Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse 11 zu etablieren. Das Protokoll erfordert nur minimale MausErfahrung, um das Gewebe (im Gegensatz zu anderen Protokollen 12,13) zu ernten und kann verwendet werden, um Kulturen von Ohren in Medium bei RT für bis zu 10 Tage gelagert zu etablieren.
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Protocol
Die Mäuse wurden in pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts bis Euthanasie (The Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien an der National University of Singapore und der National Advisory Committee für Labortierforschung (NACLAR) Richtlinien) untergebracht ist.
1. Mäuse
- Bestellen Sie eine Maus der entsprechenden genetischen Hintergrund. Dieses Protokoll basiert auf Gewebe von einer C57BL / 6-Mäusen abgeleitet wurden.
2. Herstellung von Komplettmedium
- Vorbereitung Komplettmedium durch Zugabe der folgenden Komponenten zu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium, 10% fötales Kälberserum (FCS), 50 uM 2-Mercaptoethanol, 100 uM Asparagin, 2 mM Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung.
3. Vorbereitung der Enzymlösungen
- Bereiten Kollagenase D-Lösung in einem 15 ml konischen Bodenrohr.
- Man wiegt 10 mg Kollagenase D. Dissolve Kollagenase D in 4 ml Vollmedium.
- Bereiten Pronase-Lösung in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Man wiegt 10 mg Pronase.
- Plus 5 ul 1 M Tris-Puffer (pH 8,0). 1 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0).
- Füllen Sie mit 494 & mgr; l sterilem Wasser.
- Inkubieren Pronaselösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min.
4. Herstellung von Collagenase D-Pronase Mix (≤2 Tails)
Hinweis: Führen Sie die nachfolgenden Schritte in einem sterilen Zellkultur Kapuze.
- Add 250 ul Pronase Lösung auf 4 ml Kollagenase D-Lösung.
- Übergeben Sie die Collagenase D-Pronase Mischung durch einen 0,2 um Spritzenfilter in ein steriles 15 ml konischen Bodenrohr.
5. Gewinnung von Fibroblasten von Ohr und Schwanz Tissues
- Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts.
- Zeigen autoklaviert chirurgische Instrumente (Schere und Pinzette) in der Zellkultur Kapuze.
- 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen je.
- Geschnitten Ohren (~ 1 cm Radius) und 5 cm des Schwanzes (von der Spitze des Schwanzes) einer Maus mit Schere und Inkubation für 5 min in 40 ml 70% igem Ethanol in einem sterilen 50 ml konischen Unterrohr.
- Luft trocknen Ohren und Schwanz, indem sie in einer offenen 10 cm Zellkulturschale in der Haube für 5 min. Einmal getrocknet, Transfer Ohr und Schwanzstücke, zwei Kulturschalen mit "Ohren" und "Schwanz", die 10 ml Vollmedium wie in Schritt 5.3 beschrieben.
- Entfernen Sie Haare aus den Ohren und Schwanz mit einer Schere.
- Schneiden Ohren und Schwanz in Stücke kleiner als 3 mm in der Größe mit einer Schere.
- Übertragen Sie die geschnittenen Gewebe in 1,8 ml Kryoröhrchen Fläschchen mit "Ohren" und "Schwanz" und fügen Sie eine ausreichende Kollagenase D-Pronaselösung für das Volumen, um das 1,8-ml-Markierung auf der Flasche zu erreichen.
- Pschnüren die Kryoröhrchen Fläschchen horizontal auf einem Shaker und schütteln Sie die Proben bei 200 Upm für 90 min bei 37 ° C.
- Nach 90 min Inkubation, entfernen Sie die Kryoröhrchen Vials aus dem Schüttler und legen Sie die Durchstechflaschen in der Kapuze.
- 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen, die mit "Ohren" und "Schwanz" jeder, und legte eine 70 & mgr; m Zellsieb in jedem Gericht.
- Legen Sie die verdaut Ohr und Schwanz Gewebe in der 70 & mgr; m Zellsieb in den entsprechend gekennzeichnet Gerichte in Schritt 5.11 vorbereitet und kraftvoll mahlen das Gewebe mit einer 10 ml Spritzenkolben für> 5 min. Schütteln Sie die Zellsieb gelegentlich in dem Medium, um Zellen aus der Zelle Sieb waschen.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension aus jeder Schale in zwei 15 ml konischen Boden Rohre mit "Ohren" und "Schwanz". Waschen Sie die Teller und Sieb mit zusätzlichen 10 ml Komplettmedium und fügen Sie das Medium in die entsprechenden 15 ml konischen Boden Rohre.
- Spin down die ZelleSuspension 7 min bei ~ 580 × g und 4 ° C unter Verwendung einer Kühlzelle Zentrifuge.
- Überstand entfernen, 10 ml Komplettmedium auf das Zellpellet in 15 ml konischen Boden Rohr und die Zellen resuspendieren.
- Wiederholen Sie Schritt 5.14 und 5.15.
6. Die Kultivierung des Zellgemisches
- Überstand entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet ungestört bleibt.
- Re-suspend-Zellen in 10 ml Vollmedium und fügen Sie die entsprechende Mischung auf zwei 10 cm Zellkulturschalen mit "Ohren" und "Schwanz".
- Zugabe von 10 & mgr; l Amphotericin B-Lösung (Stammlösung: 250 & mgr; g / ml) zu der Kultur.
- Zellen bei 37 ° C inkubieren in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator.
- Am dritten Tag, ersetzen Sie das Medium, das mit 10 ml frisches vollständiges Medium, das 10 & mgr; l von Amphotericin B, um Ablagerungen zu entfernen (Abbildung 1 und 2).
7. Sub-Kultur von Fibroblasten
- When Kultur erreicht etwa 70% Konfluenz (Tag 3-4 Kultur) Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit 5 ml sterile 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Entfernen PBS und 2 ml sterile 1x Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen.
- Die Zellen 5 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator.
- Nach 5 min, klopfen Sie leicht das Kulturschale und 6 ml Vollmedium zu den Zellen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Boden Rohr und drehen Sie das Rohr für 5 min bei ~ 450 xg und 4 ° C unter Verwendung eines Kühlzelle Zentrifuge.
- Überstand abnehmen und vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 5 ml Vollmedium.
- Samen 2 x 10 5 Zellen in einer 10 cm Zellkulturschale und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 3-4 Tage vor der Wiederholung der Schritte 7.1 bis 7.6.
8. Herstellung von Ohren für den Versand
Hinweis: Führen Sie ter nachfolgende Schritte in einer sterilen Zellkultur Kapuze.
- Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts.
- Zeigen autoklaviert Schere und Pinzette in die Zellkultur Kapuze.
- 50 ml vollständigem Medium in einem 50 ml konischen Unterrohr.
- Schneiden Sie die Ohren (~ 1 cm Radius) einer Maus mit einer Schere.
- Übertragen Sie die Ohren in die 50 ml konischen Bodenrohr mit einer Pinzette (wie in Schritt 3 hergestellt).
- Verschließen Sie die 50 ml konischen Bodenrohr mit Parafilm vor dem Versand bei RT in einer entsprechenden Box.
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Representative Results
Extraktion von Fibroblasten, die aus Gewebe in einer signifikanten Menge an Gewebetrümmer (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Gewebetrümmer, Fibroblasten haften an Gewebekulturkunststoffoberflächen zwischen Tag 1 und 3 der Kultur. Das Medium der Fibroblastenkulturen kann sicher an Tag 3 der Kultur, die die Pegel der vorliegenden Trümmer in der Kultur (2) signifikant verringern sollte verändert werden. Fibroblasten zeigen eine längliche Morphologie und eine deutlich sichtbare Zytoplasma (1 und 2). Mitotischen Zellen von Tag 3 der Kultur weiter vorhanden sein sollten und Zellen sollten 70-80% der Zellkonfluenz innerhalb von 3-4 Tagen der Kultur zu erreichen. Die Ausbeute von Ohr und Schwanz Geweben in einer 10 cm Kulturschale im Bereich von 4 bis 5 x 10 5 (ears) und 5 bis 6 x 10 5 Zellen (Schwanz) am Tag 3 der Kultur. Nach dem dritten Tag der Fibroblasten Isolation können die Zellen passagiert und ausgesät, auf 2 x 10 5 Zellen pro 10 cm-Kulturschale.
Extraktion von Fibroblasten, die aus den Ohren bei RT für 10 Tage gelagert werden, sollten in 70-80% Zellkonfluenz innerhalb 5-6 Tagen Kultur (Figur 3) führen. Aussäen der Zellen bei 2 × 10 5 Zellen pro 10 cm-Kulturschale für Tag 5 sollten ebenfalls auf ca. 1 x 10 6 Zellen in 3-4 Tagen Kultur. Langzeitlagerung hat keinen Einfluss auf die Zeit, die für Fibroblasten Seneszenz in unserer Erfahrung ein (Daten nicht gezeigt).
Um die Identität der Zellen nach 3 Tagen Kultur zu überprüfen, können Zellen, die für die Fibroblasten-Marker Vimentin 14. Unter Verwendung des obigen Protokolls markiert werden, wir routinemßig reinen Fibroblastenkulturen erhalten, wie von Vimentin Anfärbung (Figur 4) angedeutet.
Abbildung 1. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion vor der mittel ändern.Repräsentative Hellfeld Bilder von Zelltrümmern (weiße Pfeile) an Tag 3 der Kultur präsent. Bilder wurden bei 100-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion nach der Zugabe des neuen Mediums. Repräsentative Hellfeld Bilder von Fibroblasten am Tag 3 in der Kultur. Die Bilder wurden bei 100-facher und 320-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Fibroblastenkultur am Tag 3 nach der Extraktion aus bei RT für 10 Tage gespeichert Ohrgewebe. Repräsentative Hellfeld Bilder von Fibroblasten am Tag 3 in der Kultur. Die Bilder wurden bei 100-facher und 320-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop erfasst. Der Maßstab entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Kennzeichnung von Fibroblastenkulturen für Vimentin. Repräsentative konfokales Bild von Ohr und Schwanz Fibroblasten an Tag 3 der Kultur. Fibroblasten, die aus den Geweben extrahiert wurden Vimentin (rot) und DAPI (blau) markiert. Die Fluoreszenzbilder wurden durch konfokale micros erworbenKopie. Der Maßstab entspricht 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige und schnelle experimentelle Verfahren zur primären Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse zu etablieren. Die Extraktion sollte in haftende und sich schnell teilenden Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen nach der Trennung des Gewebes führen. Eine wichtige Einschränkung von Primärzellen ist Seneszenz, eine dauerhafte Wachstumsstillstand 15. Verwendung des Protokolls kann Fibroblastenkulturen für 5-6 mal passagiert werden, bevor Fibroblasten werden seneszenten, durch die Abflachung der Zellen angegeben, werden größer (2-3 mal Erhöhung) und Versagen zu erweitern.
Bei der Durchführung der Isolierung der Fibroblasten, muss die Aufmerksamkeit während der Unterbrechung der Gewebe zu bezahlen, als nicht ausreichend, Schneiden oder Verdauung werden in geringen Rückgewinnung von Fibroblasten zur Folge haben. Es ist möglich, das Ohr und Schwanz Fibroblasten zu bündeln, um die Anzahl der Fibroblasten erhöhen. Zusätzlichen Tissue einschließlich Peritonealdialyse und in der gleichen Weise verarbeitet Lungengewebe hinzugefügt werden, um t zu erhöhenEr Anzahl von Fibroblasten. Obwohl Trümmer in der Kultur folgenden Fibroblasten Extraktion vorhanden ist, wird es empfohlen, das Medium erst nach dem dritten Tag ändern Fibroblasten die Zeit nehmen, um die Zellkulturschalen haftet.
Eine potentielle Beschränkung des Protokolls ist die Verwendung von nicht-sterilen Gewebe und damit verbundenen Möglichkeit einer mikrobiellen Kontamination. Um das Risiko der Kontamination zu reduzieren, werden die Ohren und Schwanz in 70% Äthanol vor dem Ernten der Fibroblasten inkubiert. Weiterhin wird die antimykotische Amphotericin B auf der Primärkultur zugegeben, um den Auswuchs von Hefe und Pilzen, ein gemeinsames Problem zu vermeiden, wenn zur Festlegung Fibroblastenkulturen. Das Medium enthält auch Penicillin und Streptomycin, um bakterielle Kontamination zu verhindern. Mit diesen Vorkehrungen sind Kontaminationen selten beobachtet, auch bei der Festlegung von Fibroblasten von Ohren und Schwanz, die bei Raumtemperatur für mehrere Tage aufbewahrt wurden.
Einer der wichtigsten Vorteile dieses Protokolls liegt in dem abilkeit auf Fibroblasten von Ohren, die in Medium bei Raumtemperatur für bis zu 10 Tage vor Fibroblasten Isolierung gespeichert wurden, zu generieren. Wir beobachteten eine geringfügig verminderte Effizienz bei der Festlegung Ohr Fibroblastenkultur nach 10 Tagen Lagerung (70-80% Konfluenz wird innerhalb von 5-6 Tagen im Vergleich zu 3-4 Tage frisch isoliertem Gewebe erreicht). Daher kann die Ohren von Mäusen, die von den Forschern mit Standard-Versand ausgetauscht werden, wenn auch Express-Sendungen wird empfohlen. Nach unserer Erfahrung, die Benutzerfreundlichkeit, um die Ohren und die Tatsache, dass das Gewebe wird selten für experimentelle Verfahren verwendet erhalten können oft Zugang zu Gewebe von genetisch veränderten Mäusen, die zeitraubende, anders zu erhalten sein könnten. Für Schwänzen die Effizienz der Rückgewinnung von Fibroblasten nach der Lagerung kann stark variieren und Schwänzen sollten nur verwendet werden, wenn die Ohren sind nicht für den Versand zur Verfügung. Schließlich sollten die meisten Menschen in der Lage, um das Protokoll auszuführen, da die Ernte von Gewebe erfordert minimale Erfahrung und Ausbildung im Umgang mit Mäusen.
Das Protokoll nur mit Mausgewebe getestet, sollte aber in der Theorie ermöglicht die Erzeugung von Fibroblastenkulturen unter Verwendung von Gewebe anderer Spezies, obwohl das Protokoll kann eine weitere Optimierung benötigen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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