Summary
Опишем простой и быстрый экспериментальную процедуру для генерации первичных фибробластов из ушей и хвостов мышей. Процедура не требует специальной подготовки животных и может быть использован для генерации фибробластов культур от ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней.
Abstract
Первичные клетки получают непосредственно из тканей и, как считается, более представительным физиологического состояния клеток в естественных условиях, чем установленные клеточных линий. Тем не менее, первичных клеточных культур, как правило, имеют конечный срок службы, и их необходимо часто восстановлена. Фибробласты легко доступным источником первичных клеток. Здесь мы обсудим простой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Протокол может быть использован для установления первичных культур фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Когда протокол внимательно следил, загрязнения, вряд ли произойдет, несмотря на использование нестерильных ткани хранится в течение длительного времени в некоторых случаях. Фибробласты быстро размножаются в культуре и может быть расширена до значительного числа перед прохождением репликативной старение.
Introduction
Первичные клетки получают из живой ткани, и культивируют при условиях в пробирке. Это, как правило, предполагается, что первичные клетки больше напоминают физиологическое состояние и генетический фон ткани, из которой они возникли, чем иммортализованных или опухолевых клеточных линий 1. По этой причине, первичные клетки представляют собой полезную модель для изучения биологического вопросы 2,3. Однако, в отличие установленных клеточных линий, которые растут на неопределенный срок, в конце концов, первичные клетки претерпевают старение в культуре, и необходимо часто восстановлена.
Обычно используемые первичные клетки включают фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, Т-клетки, В-клетки, костный мозг, полученный макрофаги кости (BMDM) и костного мозга дендритные клетки кости (BMDC). Фибробласты часто используют в качестве модели первичной культуре клеток. Они предлагают основные преимущества по сравнению с другими первичными клетками. Клеточные культуры легко устанавливаются, легко поддерживается и не требуют purificaние клеток, предшествующих культуры. Они имеют быструю первоначальную пролиферацию и не требование для специализированных протоколов среднего или активации. Фибробласты могут быть эффективно трансфецировали использованием биологического, химического и физического протоколы 4,5. Существует возможность сохранять уши до 10 дней при комнатной температуре до установления клеточных культур. Фибробластов культур способствуют визуализации цитоплазматических процессов и подходит для перепрограммирования в индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток 6.
Фибробласты являются важными клетками соединительной ткани, которые секретируют коллаген протеины и внеклеточный матрикс 7. Они обеспечивают структурную основу во многих тканях 8 и играют важную роль в заживлении ран и восстановления тканей 9,10.
Здесь мы опишем простой и быстрый (<4 ч) протокол о создании фибробластов культур из ушей и хвостов мышей 11. Протокол требует минимального мышьопыт урожай тканей (в отличие от других протоколов 12,13) и может быть использован для установления культур из ушей, хранящихся в среде при комнатной температуре в течение до 10 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мышей содержали в свободных от патогенов условиях в соответствии с институциональными принципов вплоть до euthanization (институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) руководящих принципов в Национальном университете Сингапура и Национального консультативного комитета лабораторных животных исследований (NACLAR) руководящих принципов).
1. Мыши
- Заказать одну мышь соответствующего генетического фона. Этот протокол основан на ткани, полученной от одного C57BL / 6 мыши.
2. Подготовка полной среде
- Подготовка полной среды путем добавления следующих компонентов для Roswell Park Memorial института (RPMI 1640): 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкМ аспарагин, глутамин 2 мМ, 1% пенициллина-стрептомицина раствора.
3. Подготовка растворов фермента
- Подготовьте коллагеназы D раствора в 15 мл коническую пробирку нижней.
- Взвесьте 10 мг коллагеназы Д. Диssolve коллагеназы D в 4 мл полной среды.
- Подготовка проназой решение в 1,7 мл микроцентрифужных трубки.
- Взвесьте 10 мг проназой.
- Добавьте 5 мкл 1 М Трис-буфера (рН 8,0). Добавить 1 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
- Долить 494 мкл стерильной воды.
- Инкубируйте проназы раствора при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин.
4. Подготовка Коллагеназа Д-проназой Mix (≤2 хвосты)
Примечание: Выполните последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.
- Добавить 250 мкл раствора проназой 4 мл коллагеназы D раствора.
- Пропускают коллагеназы D-проназы смесь через шприц 0,2 мкм фильтр в стерильный 15 мл коническую пробирку нижней.
5. Добыча фибробластов от уха и хвост тканей
- Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
- Поместите автоклавного хирургические инструменты (ножницы и пинцет) в капот культуре клеток.
- Добавить 10 мл полной среды в двух чашки для культивирования клеток 10 см каждый.
- Сокращение уши (~ 1 см) радиуса и 5 см хвост (от кончика хвоста) мыши с ножницами и инкубировать в течение 5 мин в 40 мл 70% этанола в 50 мл стерильной коническим днищем трубки.
- Воздушно-сухой уши и хвост, помещая их в открытом 10 см клеточной культуры блюдо в капюшоне в течение 5 мин. После сушки передачи уха и хвост штук в двух культуральных чашках помечены "уши" и "хвост", содержащий 10 мл полной среды, как описано в шаге 5.3.
- Удалить волосы из ушей и хвоста с помощью ножниц.
- Вырезать уши и хвост на куски меньше, чем 3 мм в размере, используя ножницы.
- Перевести нарезанные ткани в 1,8 мл флаконах криоскопической меченых "уши" и "хвост" и добавить достаточно коллагеназы решение D-проназой по объему, чтобы достичь 1,8 мл знак на флаконе.
- пшнурок криоскопической флаконы по горизонтали на шейкере и встряхивают образцов при 200 оборотов в минуту в течение 90 мин при 37 ° С.
- Через 90 мин инкубации, удалить криоскопической флаконы из шейкера и поместите флаконы в капюшоне.
- Добавить 10 мл полной среды в двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост" друг, и положить 70 мкм ячейки фильтра в каждом блюде.
- Поместите усваивается уха и хвост ткани в 70 мкм ячейки фильтра в соответственно меченных блюд, приготовленных на стадии 5.11 и сильно растереть тканей с использованием 10 мл шприца для> 5 мин. Встряхнуть клеток фильтр иногда в среде мыть клетки из ячейки фильтра.
- Внесите суспензии клеток с каждого блюда в два 15 мл конических нижних труб помеченных "уши" и "хвост". Вымойте блюдо и фильтр с дополнительными 10 мл полной среды и добавить среду в соответствующие 15 мл конических нижних труб.
- Спин вниз ячейкуСуспензию в течение 7 минут при температуре ~ 580 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
- Удалить супернатант, добавить 10 мл полной среды к осадку клеток в 15 мл коническую нижнюю трубки и клетки вновь суспендируют.
- Повторите шаг 5.14 и 5.15.
6. Культивирование клеточной смеси
- Удалить супернатант. Убедитесь, что клеточный осадок остается нетронутой.
- Повторное приостановить клеток в 10 мл полной среды и добавить соответствующую смесь двух 10 см чашки для культивирования клеток, меченных "уши" и "хвост".
- Добавьте 10 мкл раствора амфотерицина В (исходный раствор: 250 мкг / мл) в культуру.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
- На третий день, заменить жидкость с 10 мл свежей полной среды, содержащей 10 мкл амфотерицина для удаления мусора (фиг.1 и 2).
7. Суб-культуры фибробластов
- Wheп культура достигает около 70% слияния (3-4 культуры день) удаления носителя и промыть клетки с 5 мл стерильного 1x фосфатным буферным раствором (PBS).
- Удалить PBS и добавить 2 мл стерильной 1x решение трипсина-EDTA к клеткам.
- Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе.
- Через 5 мин, осторожно нажмите культуры блюдо и добавить 6 мл полной среды к клеткам.
- Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку и нижней спина трубки в течение 5 мин при температуре ~ 450 мкг и 4 ° С с использованием охлажденного клеток центрифуги.
- Удалить супернатант и осторожно повторно приостанавливать осадок клеток в 5 мл полной среды.
- Семенной 2 х 10 5 клеток в клеточной культуральной чашке 10 см и инкубируют клетки при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе в течение 3-4 дней до повторяя шаги 7.1 до 7,6.
8. Подготовка к отгрузке уши
Примечание: Выполнение тон последующие шаги в стерильных капот культуре клеток.
- Эвтаназии мышей в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
- Поместите автоклавного ножницы и пинцет в капот культуре клеток.
- Добавить 50 мл полной среды в 50 мл коническую пробирку нижней.
- Вырезать уши (~ радиус 1 см) мыши с ножницами.
- Перевести уши в 50 мл коническую трубку нижней (как полученного на стадии 3) с помощью щипцов.
- Уплотнение 50 мл коническую трубку с нижней парафильмом перед отправкой в РТ в соответствующем поле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Добыча фибробластов ткани приводит к значительному количеству ткани мусора (Рисунок 1). В отличие от ткани мусора, фибробласты придерживаться тканевой культуре пластиковых поверхностей между день 1 и 3 культуры. Среда фибробластов культур может быть безопасно изменены в день 3 культуры, которые должны значительно уменьшить уровни мусора, присутствующего в культуре (рис 2). Фибробласты отображения удлиненную морфологию и четко видимый цитоплазму (1 и 2). Митотических клеток должны присутствовать от 3 день культуры года и клетки должны достигать 70-80% клеточного слияния в течение 3-4 дней культуры. Выход из уха и хвост ткани в 10 см культуры блюдо колеблется от 4 до 5 × 10 5 (уши) и от 5 до 6 х 10 5 клеток (хвостовой) на 3-й день культуры. После третьего дня изоляции фибробластов, клетки могут быть пассировать и высевают на 2 х 10 5 клеток на 10 см блюдо культуры.
Добыча фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней должны привести к 70-80% слияния клеток в 5 до 6 дней культуры (рис 3). Посев клеток при 2 х 10 5 клеток на 10 см чашки для культивирования, после 5-й день должны также приводить к примерно 1 × 10 6 клеток в течение 3-4 дней культивирования. Длительное хранение не влияет на время, необходимое для фибробластов, чтобы войти старение в нашем опыте (данные не показаны).
Чтобы проверить подлинность клеток после 3 дней культивирования клетки можно метить на фибробласты маркера виментина 14. Использование протокола выше, мы регулярно получаем чистые культуры фибробластов, как указано виментина окрашивания (рис 4).
Рисунок 1. культуре фибробластов на 3 день после извлечения до изменения среды.Представительства светлое поле изображения клеток мусора (белые стрелки), присутствующие на 3-й день культуры. Изображения были получены при 100-кратном увеличении с помощью светового микроскопа. Шкалы представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. культуре фибробластов на 3 день после извлечения после добавления новой среде. Типичные яркие полевые изображения фибробластов в день 3 в культуре. Изображения были получены при 100 × 320 × и увеличении с помощью светового микроскопа. Шкалы представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. культуре фибробластов на 3 день после извлечения из уха тканей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Типичные яркие полевые изображения фибробластов в день 3 в культуре. Изображения были получены при 100 × 320 × и увеличении с помощью светового микроскопа. Шкалы представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Маркировка фибробластов культур для виментина. Представитель конфокальной образ уха и хвост фибробластов на 3 день культуры. Фибробласты, извлеченные из тканей были помечены для виментина (красный) и DAPI (синий). Флуоресцентные изображения были получены с помощью конфокальной микроскопиикопия. Шкалы представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предлагаем простой, недорогой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Извлечение должно привести к адгезивных и быстро делящихся фибробластах в течение 3 дней после выделения ткани. Важным ограничением первичных клеток старение, постоянная задержка роста 15. Использование протокола, фибробластов культуры могут быть пассировать в течение 5 6 раз, прежде чем фибробласты стать стареющей, указывается уплощение клеток, увеличение размеров (2-3 раза) и неспособность расширить.
При выполнении изоляции из фибробластов, внимание должно быть уделено во время срыва тканей, как недостаточное резки или пищеварения приведет к низкой восстановления фибробластов. Можно объединить уха и хвост фибробласты, чтобы увеличить количество фибробластов. Дополнительное ткани в том числе брюшины и легочной ткани обработанной таким же образом могут быть добавлены к увеличению тон номер фибробластов. Хотя мусор присутствует в культуре фибробластов следующей добычи, рекомендуется изменить среду только после третьего дня, как фибробласты потребуется время, чтобы присоединиться к культуре клеток блюд.
Потенциальным ограничением протокола является использование нестерильных тканей и связанной возможности микробного загрязнения. Чтобы уменьшить риск заражения, уши и хвост инкубируют в 70% этанола до сбора урожая фибробласты. Кроме того, противогрибковые амфотерицин добавляется в первичной культуре, чтобы предотвратить разрастание дрожжей и грибов, общая проблема при создании фибробластов культур. Среда также содержит пенициллин и стрептомицин, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение. С помощью этих мер предосторожности, загрязнения наблюдаются редко, даже при установлении фибробласты от ушей и хвостов, которые хранились при комнатной температуре в течение нескольких дней.
Одним из ключевых преимуществ этого протокола является Абильность генерировать фибробласты из ушей, которые были сохранены в среде при комнатной температуре в течение до 10 дней, прежде чем изоляции фибробластов. Мы наблюдали незначительно снизилась эффективность в установлении уха культуре фибробластов после 10 дней хранения (70-80% слияния будет достигнута в течение 5-6 дней по сравнению с 3-4 дней для свежевыделенными ткани). Следовательно, уши мышей можно обменять исследователями с использованием стандартного груза, хотя экспресс-перевозка рекомендуется. По нашему опыту, простота использования, чтобы получить уши и тот факт, что ткань редко используется для экспериментальных процедур часто позволяет получить доступ к ткани генетически модифицированных мышей, которые могли бы быть времени, чтобы получить в противном случае. Для хвостов эффективность восстановления фибробластов после хранения может широко варьироваться и хвосты можно использовать только, если уши не доступны для отгрузки. Наконец, большинство людей должны быть в состоянии выполнить протокол, а урожай ткани требует минимального опыта и обучения в обработке мышей.
Протокол был протестирован только с помощью мыши ткани, но в теории должны позволить поколение фибробластов культур с использованием ткани других видов, хотя протокол может понадобиться дальнейшая оптимизация.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
