Summary
We beschrijven een eenvoudige en snelle experimentele procedure voor het genereren van primaire fibroblasten uit de oren en staarten van muizen. De werkwijze vereist geen speciale dierendressuur en kan worden gebruikt voor het genereren van fibroblast cultures van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen.
Abstract
Primaire cellen zijn direct afgeleid uit weefsel en men denkt dat meer representatief voor de fysiologische toestand van cellen in vivo dan gevestigde cellijnen. Echter, primaire celculturen hebben meestal een beperkte levensduur en moeten worden vaak hersteld. Fibroblasten zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van primaire cellen. Hier bespreken we een eenvoudige en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. Het protocol kan worden gebruikt om primaire fibroblast kweken vaststellen van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen. Wanneer het protocol nauwkeurig gevolgd, verontreinigingen waarschijnlijk optreden, ondanks het gebruik van niet-steriele opgeslagen voor langere tijd in sommige gevallen. Fibroblasten vermenigvuldigen zich snel in de cultuur en kan worden uitgebreid tot aanzienlijke aantallen voor het ondergaan van replicatieve veroudering.
Introduction
Primaire cellen zijn afkomstig van levende weefsels en gekweekt onder in vitro omstandigheden. Algemeen wordt aangenomen dat primaire cellen meer lijken op de fysiologische toestand en de genetische achtergrond van het weefsel waaruit ze afkomstig zijn dan geïmmortaliseerde of tumorcellijnen 1. Om die reden, primaire cellen vormen een bruikbaar model voor het bestuderen van biologische vraagstukken 2,3. Anders dan gevestigde cellijnen die oneindig groeien primaire cellen uiteindelijk ondergaan senescentie in kweek en moeten vaak hersteld.
Algemeen gebruikte primaire cellen omvatten fibroblasten, epitheelcellen, endotheelcellen, T-cellen, B-cellen, beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) en beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC). Fibroblasten worden vaak gebruikt als primaire celcultuur model. Ze bieden belangrijke voordelen ten opzichte van andere primaire cellen. Celculturen worden gemakkelijk vastgesteld, gemakkelijk onderhouden en vereisen geen Purificatie van de cellen voorafgaand aan de cultuur. Ze hebben een snelle initiële proliferatie en geen vereiste voor specialistische middelgrote of activering protocollen. Fibroblasten kunnen efficiënt worden getransfecteerd met behulp van biologische, chemische en fysische protocollen 4,5. Er is een mogelijkheid om de oren slaan voor maximaal 10 dagen bij kamertemperatuur voorafgaand aan vaststelling van celculturen. Fibroblastculturen bevorderlijk zijn voor visualisatie van cytoplasmatische processen en geschikt voor het herprogrammeren in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen 6.
Fibroblasten zijn belangrijke cellen van het bindweefsel dat collageen eiwitten en extracellulaire matrix 7 uitscheiden. Zij bieden de structureel kader in vele weefsels 8 en spelen een essentiële rol in de wondgenezing en weefselherstel 9,10.
Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle (<4 uur) protocol om fibroblast culturen uit oren en staarten van muizen 11 vast te stellen. Het protocol vereist minimale muiservaring om de weefsels te oogsten (in tegenstelling tot andere protocols 12,13) en kan worden gebruikt om kweken van oren opgeslagen in medium bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen vast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden in overeenstemming met de institutionele richtlijnen tot euthanization (De Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen aan de Nationale Universiteit van Singapore en de Nationale Adviescommissie voor Laboratory Animal Research (NACLAR) richtlijnen).
1. Muizen
- Bestel een muis van de juiste genetische achtergrond. Dit protocol is gebaseerd op weefsels afkomstig van een C57BL / 6 muis.
2. Bereiding van compleet medium
- Bereid compleet medium door toevoeging van de volgende componenten aan Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium: 10% foetaal kalfsserum (FCS), 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 uM asparagine, 2 mM glutamine, 1% penicilline-streptomycine oplossing.
3. Bereiding van enzymoplossingen
- Bereid collagenase D oplossing in een 15 ml conische bodem buis.
- Weeg 10 mg collagenase D. Dissolve collagenase D in 4 ml compleet medium.
- Bereid pronase oplossing in een 1,7 ml microcentrifugebuis.
- Weeg 10 mg pronase.
- Voeg 5 ul van 1 M Tris-buffer (pH 8,0). Voeg 1 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0).
- Bijvullen met 494 ul steriel water.
- Incubeer de pronase oplossing bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min.
4. Voorbereiding van de Collagenase D-pronase Mix (≤2 Tails)
Opmerking: Voer de volgende stappen in een steriele celkweek kap.
- Voeg 250 ul van pronase oplossing van 4 ml collagenase D oplossing.
- Passeer de collagenase D-pronase mengsel door een 0,2 um spuit filter in een steriele 15 ml conische bodem buis.
5. Winning van fibroblasten van oor en Tail Tissues
- Euthanaseren muizen volgens de passende institutionele richtlijnen.
- Plaats geautoclaveerd chirurgische instrumenten (schaar en pincet) in de celkweek kap.
- Voeg 10 ml compleet medium in twee 10 cm celcultuurschalen elk.
- Knip oren (~ 1 cm straal) en 5 cm van de staart (vanaf de punt van de staart) van een muis met een schaar en incubeer gedurende 5 min in 40 ml 70% ethanol in een steriele 50 ml conische bodem buis.
- De lucht drogen oren en staart door ze in een open 10 cm celkweek schotel in de kap 5 min. Eenmaal gedroogd, overdracht oor en staartstukken twee kweekschalen label "oren" en "staart" met 10 ml compleet medium zoals beschreven in stap 5.3.
- Haal haar uit de oren en staart met een schaar.
- Snijd oren en staart in stukken kleiner dan 3 mm groot met een schaar.
- Breng de snede weefsels in 1,8 ml cryotube flesjes label "oren" en "staart" en voeg voldoende collagenase D-pronase oplossing voor het volume van de 1,8 ml markering op de flacon te bereiken.
- Pkant de cryotube flesjes horizontaal op een shaker en schud de monsters bij 200 rpm gedurende 90 min bij 37 ° C.
- Na 90 min incubatie, verwijder de cryotube flacons uit de shaker en plaats de flacons in de kap.
- Voeg 10 ml compleet medium in twee 10 cm celkweek gerechten, het label "oren" en "staart" elk, en zet een 70 um cel zeef in elk gerecht.
- Plaats de verteerde oor en staart weefsels in de 70 micrometer cel zeef in de dienovereenkomstig geëtiketteerd gerechten bereid in stap 5.11 en krachtig maal de weefsels met behulp van een 10 ml spuit zuiger> 5 min. Schud de cel zeef af en toe op de middellange tot de cellen te wassen uit de cel zeef.
- Pipet de celsuspensie uit elk gerecht in twee 15 ml conische bodem buizen label "oren" en "staart". Was de schaal en zeef met extra 10 ml compleet medium en voeg het medium om de juiste 15 ml konische buisjes.
- Spin down de celsuspensie gedurende 7 min bij ~ 580 xg en 4 ° C met een koelcel centrifuge.
- Verwijder supernatant, voeg 10 ml compleet medium aan de celpellet in 15 ml conische bodem buis en resuspendeer de cellen.
- Herhaal stap 5.14 en 5.15.
6. Opkweek celmengsel
- Verwijder supernatant. Zorg ervoor dat de cel pellet blijft ongestoord.
- Resuspendeer cellen in 10 ml compleet medium en voeg het mengsel respectievelijke twee 10 cm celcultuurschalen label "oren" en "staart".
- Voeg 10 ul amfotericine B oplossing (voorraadoplossing: 250 ug / ml) aan de kweek.
- Incubeer cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
- Op de derde dag vervangen door het medium 10 ml vers compleet medium bevattende 10 ui van amfotericine B om vuil te verwijderen (Figuren 1 en 2).
7. Sub-cultuur van fibroblasten
- When cultuur bereikt ongeveer 70% confluentie (dag 3-4 van de cultuur), verwijder het medium en was de cellen met 5 ml steriel 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder PBS en voeg 2 ml steriel 1x trypsine-EDTA-oplossing aan de cellen.
- Incubeer de cellen gedurende 5 min bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
- Na 5 minuten, tik de cultuur schotel en voeg 6 ml compleet medium aan de cellen.
- Breng de celsuspensie om een 15 ml conische bodem buis en spin de buis gedurende 5 minuten bij ~ 450 xg en 4 ° C met een koelcel centrifuge.
- Verwijder supernatant en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 5 ml compleet medium.
- Seed 2 x 10 5 cellen in een 10 cm celkweekschaal en incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 3-4 dagen voor het herhalen van stappen 7,1-7,6.
8. Voorbereiding van de Oren voor verzending
Opmerking: Voer thij volgende stappen in een steriele celkweek kap.
- Euthanaseren muizen volgens de passende institutionele richtlijnen.
- Plaats geautoclaveerd schaar en pincet in de celkweek kap.
- Voeg 50 ml compleet medium in een 50 ml conische bodem buis.
- Knip oren (~ 1 cm straal) van een muis met een schaar.
- Breng de oren in de 50 ml conische bodem buis (zoals bereid in stap 3) onder gebruikmaking van een tang.
- Verzegeling van de 50 ml conische bodem buis met parafilm voor de scheepvaart bij RT in een geschikte doos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Extractie van fibroblasten uit weefsel resulteert in een significante hoeveelheid weefsel resten (figuur 1). In tegenstelling tot weefselafval, fibroblasten zich aan weefselkweek kunststof oppervlakken tussen dag 1 en 3 van de cultuur. Het medium fibroblast cultures kunnen veilig worden veranderd op dag 3 van de cultuur, die aanzienlijk de niveaus van vuil in de kweek (figuur 2) moet verminderen. Fibroblasten tonen een langwerpige morfologie en een duidelijk zichtbare cytoplasma (figuren 1 en 2). Mitotische cellen moet aanwezig zijn van dag 3 van de cultuur verder en cellen moet 70-80% van de mobiele confluentie bereiken binnen 3-4 dagen van de cultuur. De opbrengst van oor en staart weefsels in een 10 cm cultuur schotel varieert 4-5 x 10 5 (oren) en 5-6 x 10 5 cellen (staart) op dag 3 van de cultuur. Na de derde dag van isolatie fibroblasten, kunnen de cellen worden gepasseerd en geënt bij 2 x 10 5 cellen per 10 cm kweekschaal.
Extractie van fibroblasten uit aren bewaard bij kamertemperatuur gedurende 10 dagen moet leiden tot 70-80% confluentie cel binnen 5-6 dagen kweken (figuur 3). Zaaien van de cellen bij 2 x 10 5 cellen per 10 cm cultuur schotel na dag 5 moet ook leiden tot ongeveer 1 x 10 6 cellen binnen 3-4 dagen van cultuur. Langdurige opslag laat de tijd waarin fibroblasten tot senescentie voeren in onze ervaring (gegevens niet getoond).
Om de identiteit van de cellen te controleren na 3 dagen kweken kunnen cellen fibroblasten marker vimentine 14. Met de bovengenoemde protocol worden gemerkt, we routinematig pure fibroblast cultures te verkrijgen zoals aangegeven door vimentine kleuring (Figuur 4).
Figuur 1. Fibroblast cultuur op dag 3 na de winning voorafgaand aan verandering van medium.Representatieve heldere gebied beelden van de cel puin (witte pijlen) aanwezig op dag 3 van de cultuur. Beelden werden vastgelegd op 100 × vergroting met behulp van een lichtmicroscoop. De schaal bar vertegenwoordigt 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Fibroblast cultuur op dag 3 na extractie na toevoeging van het nieuwe medium. Vertegenwoordiger heldere gebied beelden van fibroblasten op dag 3 in de cultuur. Beelden werden vastgelegd op 100 × en 320 × vergroting met behulp van een lichtmicroscoop. De schaal bar vertegenwoordigt 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Fibroblast cultuur op dag 3 na de extractie van oor weefsels opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende 10 dagen. Vertegenwoordiger heldere gebied beelden van fibroblasten op dag 3 in de cultuur. Beelden werden vastgelegd op 100 × en 320 × vergroting met behulp van een lichtmicroscoop. De schaal bar vertegenwoordigt 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Etikettering van fibroblast culturen vimentine. Vertegenwoordiger confocale beeld van oor en staart fibroblasten op dag 3 van de cultuur. Fibroblasten geëxtraheerd uit de weefsels werden gelabeld voor vimentine (rood) en DAPI (blauw). De fluorescerende beelden werden overgenomen door confocale microskopiëren. De schaal balk geeft 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier geven we een eenvoudige, goedkope en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. De extractie moet resulteren in hechtende en snel delende fibroblasten binnen 3 dagen na isolatie van het weefsel. Een belangrijke beperking van primaire cellen veroudering, een permanente groeistop 15. Met behulp van het protocol kan fibroblast kweken worden doorgekweekt gedurende 5 tot 6 keer vóór fibroblasten worden senescente, aangegeven door de afvlakking van de cellen in omvang toe (2-3 keer toename) en het niet uitbreiden.
Bij het uitvoeren van isolatie van de fibroblasten, moet aandacht worden besteed tijdens de verstoring van weefsels, zoals onvoldoende snijden of vertering zal resulteren in een laag herstel van de fibroblasten. Het is mogelijk om het oor en staart fibroblasten bundelen om het aantal fibroblasten te verhogen. Aanvullende tissue omvattende peritoneaal en longweefsel verwerkt op dezelfde wijze kunnen worden toegevoegd aan t stijgenHij aantal fibroblasten. Hoewel puin aanwezig in de cultuur volgende fibroblasten extractie is, is het raadzaam om het medium te veranderen pas na de derde dag als fibroblasten de tijd nemen om zich te houden aan celkweek gerechten.
Een mogelijke beperking van het protocol is het gebruik van niet-steriele weefsels en bijbehorende mogelijkheid van microbiële contaminatie. Om het risico van verontreiniging te verminderen, zijn oren en staart geïncubeerd in 70% ethanol voor het oogsten van de fibroblasten. Verder wordt de antifungale amfotericine B toegevoegd aan de primaire kweek met de uitgroei van gist en schimmels, een veelvoorkomend probleem bij vaststelling fibroblastculturen voorkomen. Het medium bevat ook penicilline en streptomycine om bacteriële contaminatie te voorkomen. Met behulp van deze voorzorgsmaatregelen zijn verontreinigingen zelden waargenomen, zelfs bij de vaststelling van fibroblasten van oren en staarten die bij kamertemperatuur werden gehouden voor meerdere dagen.
Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de Ability fibroblasten van oren die werden bewaard in medium bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen vóór fibroblasten isolatie genereren. We zagen een bescheiden afname van de efficiëntie bij het vaststellen van het oor fibroblast cultuur na 10 dagen opslag (70-80% samenvloeiing wordt bereikt binnen 5-6 dagen in vergelijking met 3-4 dagen voor vers geïsoleerde weefsel). Daarom kan de oren van de muizen worden uitgewisseld door onderzoekers met behulp van standaard verzending, hoewel express zending wordt aanbevolen. In onze ervaring, het gebruiksgemak oren en het feit dat het weefsel zelden gebruikt voor experimentele procedures vinden vaak geeft toegang tot weefsel van genetisch gemodificeerde muizen die tijdrovend wijze te verkrijgen zou zijn. Voor staarten van de efficiëntie van het herstellen van fibroblasten na opslag kan sterk variëren en staarten mag alleen worden gebruikt wanneer de oren zijn niet beschikbaar voor verzending. Tenslotte moet de meeste mensen in staat zijn om het protocol uit te voeren, omdat de oogst weefsel vereist minimale training en deskundigheid in de afhandeling van muizen.
Het protocol is alleen getest met behulp van de muis weefsel, maar moet in theorie kan de generatie van fibroblast culturen met behulp van weefsel van andere soorten, hoewel het protocol kan verder moet worden geoptimaliseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
