Summary
Nous décrivons une procédure expérimentale simple et rapide pour générer des fibroblastes primaires des oreilles et de la queue de souris. Le procédé ne nécessite pas de formation spécifique des animaux et peut être utilisé pour la production de cultures de fibroblastes des oreilles stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.
Abstract
Les cellules primaires sont directement dérivées de tissus et sont pensés pour être plus représentatif de l'état physiologique des cellules in vivo que des lignées cellulaires établies. Cependant, des cultures de cellules primaires ont habituellement une durée de vie limitée et doivent être fréquemment rétablie. Les fibroblastes sont une source facilement accessible de cellules primaires. Ici, nous discutons d'une procédure expérimentale simple et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. Le protocole peut être utilisé pour établir des cultures de fibroblastes primaires de l'oreille stockées à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours. Lorsque le protocole est soigneusement suivie, les contaminations sont peu susceptibles de se produire malgré l'utilisation de tissus non stérile stocké pendant le temps prolongé dans certains cas. Fibroblastes prolifèrent rapidement dans la culture et peut être étendu à un nombre important avant de subir sénescence réplicative.
Introduction
Les cellules primaires sont obtenues à partir de tissu cultivé et vivant dans des conditions in vitro. Il est généralement admis que les cellules primaires ressemblent davantage à l'état physiologique et le fond génétique du tissu dont ils sont issus de lignées cellulaires tumorales immortalisées ou 1. Pour cette raison, les cellules primaires représentent un modèle utile pour étudier les questions biologique 2,3. Cependant, à la différence des lignées cellulaires établies qui poussent indéfiniment, cellules primaires éventuellement subir la sénescence dans la culture et doivent être fréquemment rétabli.
Les cellules primaires couramment utilisés comprennent les fibroblastes, les cellules epitheliales, les cellules endotheliales, les cellules T, les cellules B, les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) et des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (BMDC). Les fibroblastes sont souvent utilisés comme modèle de culture cellulaire primaire. Ils offrent des avantages clés par rapport aux autres cellules primaires. Les cultures de cellules sont faciles à établir, facilement maintenu et ne nécessitent aucune purification des cellules avant la culture. Ils ont la prolifération initiale rapide et aucune exigence pour les protocoles de moyennes ou d'activation spécialisées. Les fibroblastes peuvent être efficacement transfectées en utilisant des protocoles physiques 4,5 biologiques, chimiques, et. Il est possible de stocker les oreilles pour un maximum de 10 jours à la température ambiante avant d'établir des cultures de cellules. Cultures de fibroblastes sont propices à la visualisation des processus cytoplasmiques et adapté à la reprogrammation en cellules souches pluripotentes induites (iPS) 6.
Les fibroblastes sont des cellules importantes du tissu conjonctif qui sécrètent des protéines de la matrice extracellulaire de collagène et 7. Ils fournissent le cadre structurel dans de nombreux tissus 8 et jouent un rôle essentiel dans la cicatrisation et la réparation tissulaire 9,10.
Ici, nous décrivons un (<4 h) protocole simple et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes de les oreilles et la queue de souris 11. Le protocole nécessite un minimum de sourisl'expérience de récolter les tissus (contrairement à d'autres protocoles 12,13) et peut être utilisé pour établir des cultures de oreilles stockées dans un milieu à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours.
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Protocol
Les souris ont été hébergés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes en conformité avec les directives institutionnelles jusqu'à l'euthanasie (Le institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) des lignes directrices à l'Université nationale de Singapour et le Comité consultatif national de laboratoire de recherche animale (NACLAR) Lignes directrices).
1. Souris
- Commandez un clic de l'arrière-plan génétique approprié. Ce protocole est basé sur un tissu dérivé d'une souris C57BL / 6.
2. Préparation de milieu complet
- Préparer un milieu complet en ajoutant les composants suivants à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640: 10% de sérum de veau foetal (FCS), 50 uM de 2-mercaptoéthanol, 100 uM de l'asparagine, de la glutamine 2 mM, une solution de pénicilline-streptomycine 1%.
3. Préparation des solutions enzymatiques
- Préparer la solution de collagénase D dans un tube à fond conique de 15 ml.
- Peser 10 mg de collagénase D. Dissolve collagénase D dans 4 ml de milieu complet.
- Préparer la solution pronase dans un tube de 1,7 ml à centrifuger.
- Peser 10 mg de pronase.
- Ajouter 5 ul de tampon Tris 1 M (pH 8,0). Ajouter 1 pi d'EDTA 0,5 M (pH 8,0).
- Compléter avec 494 pi d'eau stérile.
- Incuber la solution de pronase à 37 ° C dans un bain-marie pendant 30 min.
4. Préparation de la collagénase D-Mix pronase (≤2 Tails)
Remarque: Effectuez les étapes suivantes dans une hotte de culture cellulaire stérile.
- Ajouter 250 ul de solution de pronase à 4 ml de solution de collagénase D.
- Faire passer le mélange de collagénase D-pronase à travers un filtre à seringue de 0,2 um dans un tube de 15 ml fond conique stérile.
5. Extraction des fibroblastes de l'oreille et la queue tissus
- Euthanasier les souris selon les directives institutionnelles appropriées.
- Placez autoclave instruments chirurgicaux (ciseaux et des pinces) dans la hotte de culture cellulaire.
- Ajouter 10 ml du milieu complet en deux boîtes de culture cellulaire de 10 cm chacune.
- Couper les oreilles (~ 1 cm de rayon) et de 5 cm de queue (à partir de la pointe de la queue) d'une souris avec des ciseaux et incuber pendant 5 min dans 40 ml 70% d'éthanol dans un tube de 50 ml à fond conique stérile.
- Oreilles séchées à l'air et la queue en les plaçant dans une boîte de 10 cm de culture de cellules ouvertes dans la hotte pendant 5 min. Une fois séchées, le transfert oreille et la queue des morceaux à deux boîtes de culture étiquetés "oreilles" et "queue" contenant 10 ml de milieu complet tel que décrit dans l'étape 5.3.
- Enlever les poils des oreilles et la queue avec des ciseaux.
- Couper oreilles et la queue en morceaux plus petits de 3 mm de diamètre à l'aide de ciseaux.
- Transférer les tissus coupés dans 1,8 ml des flacons de CryoTube étiquetés "oreilles" et "queue" et ajouter la solution D-pronase collagénase suffisante pour le volume pour atteindre la marque de 1,8 ml sur le flacon.
- Placer les flacons CryoTube horizontalement sur un agitateur et agiter les échantillons à 200 tours par minute pendant 90 min à 37 ° C.
- Après 90 minutes d'incubation, retirer les flacons de CryoTube du shaker et placer les flacons dans la hotte.
- Ajouter 10 ml de milieu complet en deux boîtes de 10 cm de culture cellulaire, étiquetés "oreilles" et "queue" chacun, et de mettre une passoire 70 um cellulaire dans chaque plat.
- Placer les tissus de l'oreille et de la queue digérés dans le tamis 70 um de la cellule dans les plats préparés en conséquence marqués à l'étape 5.11 et broyer les tissus de force au moyen d'un piston de seringue 10 ml de> 5 min. Agiter le tamis cellulaire occasionnellement dans le moyen de se laver les cellules de la crépine de la cellule.
- Introduire à la pipette la suspension de cellules de chaque plat dans des tubes de 15 ml de fond deux coniques étiquetés "oreilles" et "queue". Laver la capsule et la crépine avec supplémentaire de 10 ml de milieu complet et ajouter le support pour les tubes de 15 ml appropriées fond conique.
- Isoler la cellulesuspension pendant 7 minutes à 580 xg et ~ 4 ° C en utilisant une centrifugeuse réfrigérée cellulaire.
- Retirer le surnageant, ajouter 10 ml de milieu complet pour le culot cellulaire dans les 15 ml du tube de fond conique et remettre en suspension les cellules.
- Répétez l'étape 5.14 et 5.15.
6. La culture de la cellule Mélange
- Retirer le surnageant. Assurez-vous que le culot cellulaire reste intacte.
- Re-suspendre les cellules dans 10 ml de milieu complet et ajouter le mélange respectif pour deux boîtes de culture cellulaire de 10 cm étiquetés "oreilles" et "queue".
- Ajouter 10 ul solution d'amphotéricine B (solution stock: 250 pg / ml) à la culture.
- Incuber les cellules à 37 ° C dans une humidifié à 5% de CO 2 incubateur.
- Le troisième jour, remplacer le milieu par un milieu complet frais contenant 10 ml 10 pi de l'amphotéricine B pour enlever les débris (figures 1 et 2).
7. Sous-culture de fibroblastes
- When culture atteint environ 70% de confluence (3-4 jours de la culture) éliminer le milieu et laver les cellules avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée 5 ml stérile (PBS).
- Retirer le PBS et ajouter 2 ml de solution stérile 1x trypsine-EDTA pour les cellules.
- Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C dans une humidifié à 5% de CO 2 incubateur.
- Après 5 min, tapotez doucement la boîte de culture et ajoutez 6 ml de milieu complet pour les cellules.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube à fond conique de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 450 x g et ~ 4 ° C en utilisant une centrifugeuse réfrigérée cellulaire.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension doucement le culot de cellules dans 5 ml de milieu complet.
- Germe 2 x 10 5 cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm et incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié CO 2 à 5% pendant 3-4 jours avant de répéter les étapes 7.1 à 7.6.
8. Préparation des oreilles pour l'expédition
Remarque: Effectuez til étapes ultérieures dans une hotte de culture cellulaire stérile.
- Euthanasier les souris selon les directives institutionnelles appropriées.
- Placez ciseaux et des pinces autoclave dans la hotte de culture cellulaire.
- Ajouter 50 ml de milieu complet dans un tube à fond conique de 50 ml.
- Couper les oreilles (~ 1 cm de rayon) d'une souris avec des ciseaux.
- Transférer les oreilles dans le tube à fond conique de 50 ml (tel que préparé à l'étape 3) en utilisant une pince.
- Scellez le tube inférieur conique de 50 ml avec du parafilm avant d'expédier à température ambiante dans une case appropriée.
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Representative Results
Extraction à partir des résultats des fibroblastes de tissu dans une quantité importante de débris de tissu (Figure 1). Contrairement aux débris tissulaires, les fibroblastes adhèrent à des surfaces en plastique de culture de tissus entre 1 et 3 jours de culture. Le milieu de cultures de fibroblastes peut être modifié en toute sécurité le jour 3 de la culture, ce qui devrait réduire de manière significative les niveaux de débris présents dans la culture (Figure 2). Les fibroblastes présentent une morphologie allongée et un cytoplasme clairement visible (figures 1 et 2). Les cellules mitotiques doivent être présents dès le premier jour 3 de la culture et de partir de cellules doivent atteindre 70-80% de confluence des cellules dans les 3-4 jours de culture. Le rendement à partir de tissus de l'oreille et de la queue dans une boîte de culture de 10 cm varie de 4 à 5 x 10 5) et les oreilles (5 à 6 x 10 5 cellules (tail) sur trois jours de culture. En suivant le troisième jour de l'isolement de fibroblastes, les cellules peuvent être soumises à des passages et ensemencées à 2 x 10 5 cellules par boîte de 10 cm de culture.
Extraction à partir de fibroblastes oreilles stockées à température ambiante pendant 10 jours devrait se traduire par 70 à 80% de confluence des cellules en 5 à 6 jours de culture (Figure 3). Ensemencement des cellules à 2 x 10 5 cellules par boîte de 10 cm de culture après 5 jours devrait également donner lieu à environ 1 x 10 6 cellules dans les 3-4 jours de culture. Stockage à long terme ne modifie pas le temps qu'il faut pour les fibroblastes pour entrer dans la sénescence dans notre expérience (données non présentées).
Pour vérifier l'identité des cellules après 3 jours de culture, les cellules peuvent être marqués pour la vimentine fibroblastes marqueur 14. En utilisant le protocole ci-dessus, on obtient couramment des cultures de fibroblastes pures comme indiqué par la coloration de la vimentine (Figure 4).
Figure 1. fibroblastes culture au jour 3 extraction de poste avant de changer de milieu.Images de champ lumineux représentatifs de débris de cellules (flèches blanches) présents au jour 3 de la culture. Images ont été capturées à un grossissement de 100 à l'aide d'un microscope optique. La barre d'échelle représente 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. fibroblastes culture au jour 3 extraction de poste après l'addition de nouveau média. Des images de champ lumineux représentatifs de fibroblastes sur 3 jours dans la culture. Les images ont été capturées à 100 × 320 et un grossissement de l'aide d'un microscope optique. La barre d'échelle représente 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. culture des fibroblastes au jour 3 post-extraction à partir de tissus de l'oreille stockées à température ambiante pendant 10 jours. Images de champ lumineux représentatifs des fibroblastes à 3 jours en culture. Les images ont été capturées à 100 × 320 et un grossissement de l'aide d'un microscope optique. La barre d'échelle représente 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Étiquetage des cultures de fibroblastes pour la vimentine. D'image confocale Représentant des oreilles et de la queue des fibroblastes au jour 3 de la culture. Les fibroblastes extraites des tissus ont été marqués pour la vimentine (rouge) et DAPI (bleu). Les images fluorescentes ont été acquises par micros confocalecopie. La barre d'échelle représente 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici nous fournissons une procédure expérimentale simple, peu coûteux et rapide à mettre en place des cultures de fibroblastes primaires de oreilles et la queue de souris. L'extraction doit se traduire par des fibroblastes de division adhérentes et rapidement dans les 3 jours après l'isolement du tissu. Une limitation importante de cellules primaires est la sénescence, un arrêt de la croissance permanente 15. En utilisant le protocole, les cultures de fibroblastes peuvent être passées de 5 à 6 fois avant de fibroblastes sénescents deviennent, indiquée par l'aplatissement de cellules, augmenter la taille (2-3 fois augmentation) et l'échec à se développer.
Lors de l'exécution isolement des fibroblastes, l'attention doit être accordée pendant la perturbation des tissus, que la coupe ou la digestion insuffisante entraînera une faible récupération des fibroblastes. Il est possible de mettre en commun les oreilles et la queue fibroblastes d'augmenter le nombre de fibroblastes. Tissu peritoneal supplémentaires y compris le tissu pulmonaire et traité de la même manière peut être ajouté pour augmenter la til nombre de fibroblastes. Bien que les débris est présent dans la culture après l'extraction des fibroblastes, il est recommandé de changer le milieu seulement après le troisième jour que les fibroblastes prennent le temps d'adhérer à des boîtes de culture cellulaire.
Une limitation potentielle du protocole est l'utilisation de tissus non-stériles et associé possibilité de contamination microbienne. Pour réduire le risque de contamination, oreilles et la queue sont incubés dans 70% d'éthanol avant de récolter les fibroblastes. En outre, l'amphotéricine B antifongique est ajouté à la culture primaire pour empêcher l'excroissance de levures et de champignons, un problème courant lors de l'établissement des cultures de fibroblastes. Le milieu contient également pénicilline et de streptomycine pour empêcher la contamination bactérienne. Grâce à ces précautions, les contaminations sont rarement observés, même lors de l'établissement de fibroblastes oreilles et les queues qui ont été conservés à température ambiante pendant plusieurs jours.
Un des principaux avantages de ce protocole est l'ABILlité pour générer à partir de fibroblastes oreilles qui ont été stockées dans un milieu à température ambiante pendant jusqu'à 10 jours avant l'isolement des fibroblastes. Nous avons observé une efficacité modeste diminué dans l'établissement de la culture oreille des fibroblastes après 10 jours de stockage (70-80% de confluence est atteint dans les 5-6 jours, comparativement à 3-4 jours pour le tissu fraîchement isolés). Par conséquent, les oreilles de souris peuvent être échangés par des chercheurs utilisant expédition standard, bien que l'expédition express est recommandé. Dans notre expérience, la facilité d'utilisation pour obtenir les oreilles et le fait que le tissu est rarement utilisé pour des procédures expérimentales permet souvent l'accès aux tissus des souris génétiquement modifiées qui pourraient prendre beaucoup de temps à obtenir autrement. Pour queues l'efficacité des fibroblastes récupération après stockage peut varier largement et queues ne doit être utilisée que si les oreilles ne sont pas disponibles pour l'expédition. Enfin, la plupart des gens devraient être en mesure d'effectuer le protocole, comme la récolte des tissus nécessite une expertise minimale et de la formation dans la manipulation de la souris.
Le protocole a été testé en utilisant des tissus de la souris, mais devrait en théorie permettre la production de cultures de fibroblastes en utilisant des tissus d'autres espèces, bien que le protocole pourrait nécessiter une optimisation ultérieure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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