Summary
Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.
Abstract
Cellule primarie derivano direttamente dal tessuto e si pensa di essere più rappresentativo dello stato fisiologico delle cellule in vivo di linee cellulari stabilizzate. Tuttavia, colture cellulari primarie di solito hanno una durata di vita limitata e devono essere frequentemente ristabilita. I fibroblasti sono una fonte facilmente accessibile di cellule primarie. Qui, si discute una procedura semplice e rapida sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. Il protocollo può essere utilizzato per stabilire colture primarie di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Quando il protocollo è attentamente seguita, contaminazioni sono improbabili nonostante l'uso di tessuti non sterile immagazzinato per tempo prolungato in alcuni casi. I fibroblasti proliferano rapidamente in coltura e possono essere espanse per un numero considerevole prima di subire la senescenza replicativa.
Introduction
Cellule primarie sono derivati da tessuti e coltivate che vivono in condizioni in vitro. Si ritiene generalmente che le cellule primarie avvicinano maggiormente lo stato fisiologico e background genetico del tessuto da cui sono derivati di linee cellulari immortalizzate o tumorali 1. Per questo motivo, cellule primarie rappresentano un modello utile per studiare le domande biologica 2,3. Tuttavia, a differenza di linee cellulari stabilizzate che crescono indefinitamente, pile infine subiscono senescenza nella cultura e devono essere frequentemente ristabilita.
Pile comunemente usati includono fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, cellule T, cellule B, i macrofagi del midollo osseo (BMDM) e le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC). I fibroblasti sono spesso utilizzati come cellula primaria modello di coltura. Essi offrono vantaggi chiave rispetto ad altre cellule primarie. Le colture cellulari sono facilmente stabiliti, prontamente mantenuto e non richiedono purificazione di cellule precedenti alla cultura. Hanno rapida proliferazione iniziale e nessun requisito per i protocolli di media o di attivazione specializzate. I fibroblasti possono essere efficacemente trasfettate utilizzando protocolli fisici 4,5 biologici, chimici, e. C'è la possibilità di memorizzare le orecchie fino a 10 giorni a temperatura ambiente, prima di stabilire colture cellulari. Colture di fibroblasti sono favorevoli alla visualizzazione dei processi citoplasmatici e adatto per la riprogrammazione in staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 6.
I fibroblasti sono importanti cellule del tessuto connettivo che secernono proteine collagene e della matrice extracellulare 7. Essi costituiscono il quadro strutturale in molti tessuti 8 e svolgono un ruolo fondamentale nella guarigione delle ferite e la riparazione dei tessuti 9,10.
Qui, descriviamo un protocollo (4 ore <) semplice e veloce per creare colture di fibroblasti da orecchie e le code di topo 11. Il protocollo richiede una minima del mouseesperienza per raccogliere i tessuti (a differenza di altri protocolli 12,13) e può essere utilizzato per stabilire culture di orecchie memorizzati nel mezzo a temperatura ambiente per 10 giorni.
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Protocol
I topi sono stati alloggiati in condizioni di assenza di patogeni in conformità con le linee guida istituzionali fino euthanization (La cura istituzionale degli animali e del Comitato uso (IACUC) le linee guida presso l'Università Nazionale di Singapore e del Comitato consultivo nazionale per Research Laboratory Animal (NACLAR) le linee guida).
1. Topi
- Ordinare un mouse del background genetico appropriato. Questo protocollo è basato sul tessuto derivato da uno C57BL / 6 del mouse.
2. Preparazione del terreno completo
- Preparare terreno completo aggiungendo le seguenti componenti al Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: siero fetale bovino al 10% (FCS), 50 mM 2-mercaptoetanolo, 100 micron asparagina, glutammina 2 mM, soluzione di penicillina-streptomicina 1%.
3. Preparazione di enzima Solutions
- Preparare la soluzione collagenasi D in un tubo da 15 ml fondo conico.
- Pesare 10 mg di collagenasi D. Dissolve collagenasi D in 4 ml di terreno completo.
- Preparare la soluzione pronasi in una provetta 1,7 ml microcentrifuga.
- Pesare 10 mg di Pronasi.
- Aggiungere 5 ml di 1 M tampone Tris (pH 8,0). Aggiungere 1 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0).
- Rabboccare con 494 ml di acqua sterile.
- Incubare la soluzione pronase a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti.
4. Preparazione di Collagenasi D-pronasi Mix (≤2 Tails)
Nota: Eseguire le fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare.
- Aggiungere 250 microlitri di soluzione pronase a 4 ml di soluzione di collagenasi D.
- Passare il composto collagenasi D-pronasi attraverso un filtro siringa da 0,2 micron in una sterile 15 ml tubo fondo conico.
5. Estrazione di fibroblasti da tessuti dell'orecchio e coda
- Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate.
- Mettere in autoclave chirurgici strumenti (forbici e pinze) nel cofano coltura cellulare.
- Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm piatti di coltura di cellule ciascuno.
- Tagliare orecchie (~ 1 cm raggio) e 5 cm di coda (dalla punta della coda) di un topo con le forbici e incubare per 5 minuti in 40 ml di etanolo 70% in una provetta sterile da 50 ml a fondo conico.
- Orecchie con aria secca e la coda di collocarli in un 10 centimetri piatto di coltura cellulare aperta nel cappuccio per 5 min. Una volta essiccati, trasferimento orecchio e pezzi di coda a due piatti della cultura etichettati "orecchie" e "coda" che contiene 10 ml di terreno completo come descritto al punto 5.3.
- Eliminare i peli dalle orecchie e forbici coda utilizzando.
- Tagliare orecchie e la coda in pezzi più piccoli di 3 mm di dimensioni con le forbici.
- Trasferire i tessuti tagliati in 1,8 ml fiale cryotube etichettate "orecchie" e "coda" e aggiungere collagenasi sufficiente soluzione D-pronasi per il volume di raggiungere i 1,8 ml sul flacone.
- Pallacciare le fiale cryotube orizzontalmente su un ed agitare i campioni a 200 rpm per 90 min a 37 ° C.
- Dopo 90 minuti di incubazione, rimuovere le fiale cryotube dal shaker e posizionare le fiale nella cappa.
- Aggiungere 10 ml di terreno completo in due 10 cm di colture cellulari piatti, con l'etichetta "orecchie" e "coda" ciascuno, e mettere un filtro 70 micron cella in ogni piatto.
- Posizionare le orecchie e coda tessuti digeriti nel colino 70 micron cella nei piatti di conseguenza etichettati previste al punto 5.11 e con forza macinare i tessuti con una siringa da 10 ml stantuffo per> 5 min. Agitare il filtro cellule occasionalmente nel mezzo per lavare le cellule fuori del filtro cella.
- Pipetta la sospensione cellulare da ogni piatto in provette fondo due 15 ml coniche etichettati "orecchie" e "coda". Lavare il piatto e il filtro con l'aggiunta di 10 ml di terreno completo e aggiungere il supporto per le appropriate da 15 ml provette fondo conico.
- Spin giù la cellasospensione per 7 minuti a 580 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 ml di mezzo completo per il pellet cellulare in 15 ml tubo fondo conico e risospendere le cellule.
- Ripetere il passaggio 5.14 e 5.15.
6. Coltura di miscela cellulare
- Rimuovere il surnatante. Assicurarsi che il pellet di cellule rimane indisturbato.
- Risospendere le cellule in 10 ml di terreno completo e aggiungere il relativo composto per due 10 cm piatti di coltura di cellule etichettate "orecchie" e "coda".
- Aggiungere 10 ml soluzione amfotericina B (soluzione madre: 250 mg / ml) per la cultura.
- Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
- Al terzo giorno, sostituire il mezzo con terreno completo contenente 10 ml fresco 10 ml di amfotericina B per rimuovere detriti (figure 1 e 2).
7. Sotto-cultura della fibroblasti
- Whecultura n raggiunge circa il 70% di confluenza (giorno 3-4 della cultura) rimuovere il supporto e lavare le cellule con 5 ml sterile 1x tampone fosfato salino (PBS).
- Rimuovere PBS e aggiungere 2 ml di soluzione sterile 1x tripsina-EDTA per le cellule.
- Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
- Dopo 5 minuti, delicatamente toccare il piatto cultura e aggiungere 6 ml di terreno completo alle cellule.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml conica fondo e girare il tubo per 5 minuti a 450 xg ~ e 4 ° C utilizzando una centrifuga cella frigorifera.
- Rimuovere il surnatante, e delicatamente risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo completo.
- Seed 2 x 10 5 cellule in un piatto di coltura cellulare 10 cm e incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore per 3-4 giorni prima di ripetere passaggi da 7.1 a 7.6.
8. Preparazione di orecchie per la spedizione
Nota: eseguire tegli fasi successive in una cappa sterile coltura cellulare.
- Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali appropriate.
- Posizionare forbici e pinze in autoclave nel cofano coltura cellulare.
- Aggiungere 50 ml di terreno completo in un tubo da 50 ml fondo conico.
- Tagliare le orecchie (~ 1 cm di raggio) di un mouse con le forbici.
- Trasferire le orecchie nel tubo da 50 ml a fondo conico (come preparato al punto 3) con pinze.
- Sigillare il tubo da 50 ml fondo conico con parafilm prima della spedizione a temperatura ambiente in una scatola appropriata.
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Representative Results
Estrazione di fibroblasti da risultati tessuto in una notevole quantità di frammenti di tessuto (Figura 1). In contrasto con i residui di tessuto, fibroblasti aderire a superfici di plastica coltura dei tessuti tra il giorno 1 e 3 della cultura. Il mezzo di colture di fibroblasti può essere modificato in modo sicuro il giorno 3 di coltura, che dovrebbe ridurre significativamente i livelli di detriti presenti nella cultura (Figura 2). I fibroblasti mostrano una morfologia allungata e un citoplasma chiaramente visibile (figure 1 e 2). Cellule mitotiche dovrebbero essere presenti fin dal primo giorno 3 della cultura in poi e cellule devono raggiungere il 70-80% di confluenza delle cellule entro 3-4 giorni di coltura. La resa di orecchio e coda tessuti in un piatto di coltura 10 cm varia da 4 a 5 x 10 5 (orecchie) e da 5 a 6 x 10 5 cellule (coda) il giorno 3 di coltura. Dopo il terzo giorno di isolamento fibroblasti, le cellule possono essere diversi passaggi e seminate a 2 x 10 5 cellule per 10 cm piatto di coltura.
Estrazione di fibroblasti da orecchie conservati a temperatura ambiente per 10 giorni dovrebbe comportare 70-80% di confluenza cella entro 5 a 6 giorni di coltura (Figura 3). Semina le cellule a 2 x 10 5 cellule per 10 centimetri piatto di coltura dopo giorno 5 dovrebbe anche dare origine a circa 1 x 10 6 cellule entro 3-4 giorni di coltura. Stoccaggio a lungo termine non influenza il tempo necessario per i fibroblasti di entrare nella nostra esperienza senescenza (dati non mostrati).
Per verificare l'identità delle cellule dopo 3 giorni di coltura, le cellule possono essere etichettati per il marcatore fibroblasti vimentina 14. Utilizzando il protocollo sopra, routine ottenere colture di fibroblasti puri come indicato da vimentina colorazione (Figura 4).
Figura cultura 1. Fibroblast il giorno 3 dopo l'estrazione prima di cambiare di media.Immagini rappresentative in campo chiaro di detriti cellulari (frecce bianche) presenti il giorno 3 di cultura. Le immagini sono state catturate a 100 × ingrandimenti utilizzando un microscopio ottico. La barra della scala rappresenta il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura cultura 2. Fibroblast il 3 ° giorno dopo l'estrazione dopo l'aggiunta del nuovo mezzo. Immagini in campo chiaro rappresentativi di fibroblasti il giorno 3 di cultura. Le immagini sono state catturate a 100 × 320 × ingrandimento e utilizzando un microscopio ottico. La barra della scala rappresenta il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. cultura Fibroblast il giorno 3 dopo l'estrazione dai tessuti dell'orecchio conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Le immagini in campo chiaro rappresentativi di fibroblasti a giorno 3 di cultura. Le immagini sono state catturate a 100 × 320 × ingrandimento e utilizzando un microscopio ottico. La barra della scala rappresenta il 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. L'etichettatura di colture di fibroblasti per vimentina. Immagine confocale rappresentante di orecchio e coda fibroblasti il giorno 3 di cultura. I fibroblasti estratti dai tessuti sono stati etichettati per vimentina (rosso) e DAPI (blu). Le immagini fluorescenti sono stati acquisiti da micros confocalecopia. La barra della scala rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui forniamo una procedura semplice, economico e veloce sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. L'estrazione dovrebbe risultare in fibroblasti divisorie aderenti e rapidamente entro 3 giorni post-isolamento del tessuto. Un importante limite di pile è senescenza, una crescita arresto permanente 15. Utilizzando il protocollo, colture di fibroblasti possono essere diversi passaggi da 5 a 6 volte prima fibroblasti diventano senescente, indicato dalla appiattimento delle cellule, aumentare di dimensioni (2-3 volte aumento) e la mancata espansione.
Quando si esegue isolamento dei fibroblasti, occorre prestare attenzione durante la rottura dei tessuti, come il taglio insufficiente o digestione si tradurrà in basso recupero dei fibroblasti. È possibile raggruppare le orecchio e coda fibroblasti di aumentare il numero dei fibroblasti. Tessuto supplementare compresi peritoneale e tessuto polmonare trattati nello stesso modo può essere aggiunto per aumentare tha il numero di fibroblasti. Sebbene detriti è presente nella coltura dopo estrazione fibroblasti, si raccomanda di cambiare il mezzo solo dopo il terzo giorno fibroblasti prendono tempo per aderire ai piatti di coltura cellulare.
Un potenziale limitazione del protocollo è l'uso di tessuti non sterili e possibilità di contaminazione microbica associata. Per ridurre il rischio di contaminazione, orecchie e coda sono incubate in 70% di etanolo prima della raccolta dei fibroblasti. Inoltre, l'amfotericina B antimicotico viene aggiunto alla coltura primaria per impedire la conseguenza di lieviti e funghi, un problema comune quando stabilire colture di fibroblasti. Il terreno contiene anche la penicillina e streptomicina per prevenire la contaminazione batterica. Utilizzando queste precauzioni, contaminazioni sono raramente osservati anche quando si stabilisce fibroblasti da orecchie e code che sono stati tenuti a temperatura ambiente per diversi giorni.
Uno dei vantaggi principali di questo protocollo è la Abillità per generare fibroblasti da orecchie che sono stati memorizzati in mezzo a temperatura ambiente per un massimo di 10 giorni prima fibroblasti isolamento. Abbiamo osservato una efficienza modesta diminuzione nella creazione di cultura di fibroblasti orecchio dopo 10 giorni di conservazione (70-80% di confluenza è raggiunto entro 5-6 giorni rispetto ai 3-4 giorni per il tessuto fresco isolato). Quindi, le orecchie di topi possono essere scambiati dai ricercatori che utilizzano il trasporto standard, anche se si consiglia di spedizione espressa. Nella nostra esperienza, la facilità d'uso per ottenere orecchie e il fatto che il tessuto è raramente utilizzato per le procedure sperimentali spesso consente l'accesso ai tessuti di topi geneticamente modificati che potrebbe essere di ottenere altrimenti richiede tempo. Per informazioni dettagliate l'efficienza dei fibroblasti recupero dopo lo stoccaggio può variare ampiamente e code deve essere utilizzato solo se le orecchie non sono disponibili per la spedizione. Infine, la maggior parte delle persone dovrebbero essere in grado di eseguire il protocollo, come la raccolta di tessuto richiede competenze minime e la formazione nella gestione dei topi.
Il protocollo è stato testato solo utilizzando tessuti mouse, ma dovrebbe in teoria permettere la generazione di colture di fibroblasti utilizzando tessuti di altre specie sebbene il protocollo possa essere successivamente ottimizzata.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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