Summary
Vi beskriver en enkel og rask eksperimentelle fremgangsmåte for å generere primære fibroblaster fra ører og hale i mus. Fremgangsmåten krever ikke spesiell opplæring dyr, og kan brukes for generering av fibroblastkulturer fra ørene som er lagret ved romtemperatur i opp til 10 dager.
Abstract
Primære celler som er avledet direkte fra vev, og er antatt å være mer representativ for den fysiologiske tilstanden til cellene in vivo enn etablerte cellelinjer. Imidlertid primære cellekulturer som regel har en begrenset levetid og må ofte reetablert. Fibroblaster er en lett tilgjengelig kilde til primære celler. Her har vi diskuterer en enkel og rask Fremgangsmåten for å etablere primære fibroblastkulturer fra ører og hale i mus. Protokollen kan brukes til å etablere primære fibroblastkulturer fra ørene som er lagret ved romtemperatur i opp til 10 dager. Når protokollen blir fulgt nøye, forurensninger er lite sannsynlig å oppstå til tross for bruk av ikke-sterilt vev lagres i lengre tid i noen tilfeller. Fibroblaster sprer seg raskt i kultur og kan utvides til et betydelig antall før under replicative senescence.
Introduction
Primære celler som er avledet fra levende vev og dyrket under in vitro betingelser. Det er generelt antatt at primærceller ligner nærmere den fysiologiske tilstand og genetisk bakgrunn av vev hvorfra de stammer enn immortaliserte cellelinjer eller tumor 1. Av den grunn primære celler representerer en nyttig modell for å studere biologiske spørsmål 2,3. Men i motsetning til etablerte cellelinjer som vokser i det uendelige, primære celler til slutt gjennomgår alderdom i kultur og må ofte reetablert.
Vanlig anvendte primære celler omfatter fibroblaster, epitelceller, endotelceller, T-celler, B-celler, benmarg-avledede makrofager (BMDM) og benmarg-avledede dendrittceller (BMDC). Fibroblaster blir ofte brukt som primærcellekultur modell. De tilbyr viktige fordeler fremfor andre primære celler. Cellekulturer kan lett etableres, opprettholdes lett og krever ingen purificasjon av celler før kultur. De har rask innledende spredning og ingen krav til spesialiserte middels eller aktiverings protokoller. Fibroblaster kan effektivt transfektert bruker biologiske, kjemiske og fysiske protokoller 4,5. Det er en mulighet for å lagre ører for opp til 10 dager ved RT forut for etablering av cellekulturer. Fibroblast kulturer er bidrar til visualisering av cytoplasmatiske prosesser og egnet for omprogrammering til induserte pluripotente stamceller (iPS-celler) 6.
Fibroblaster er viktige celler i bindevevet som kollagen utskiller proteiner og ekstracellulær matriks 7. De gir den strukturelle rammer i mange vev 8 og spiller en viktig rolle i sårheling og vev reparasjon 9,10.
Her beskriver vi en enkel og rask (4-t <) protokoll for å etablere fibroblastkulturer fra ører og hale i mus 11. Protokollen krever minimal muserfaring for å høste de vev (i motsetning til andre protokoller 12,13) og kan brukes til å etablere kulturer fra ørene som er lagret i mediet ved romtemperatur i opp til 10 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus ble plassert i patogenfrie vilkår i samsvar med de institusjonelle retningslinjer inntil euthanization (The Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer ved National University of Singapore og National Advisory Committee for Forsøksdyrforskning (NACLAR) retningslinjer).
1. Mus
- Bestill ett muse av den aktuelle genetiske bakgrunn. Denne protokollen er basert på vev avledet fra en C57BL / 6 mus.
2. Utarbeidelse av komplett medium
- Forbered fullstendig medium ved å tilsette følgende bestanddeler til Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium: 10% føtalt kalveserum (FCS), 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 mM asparagin, 2 mM glutamin, 1% penicillin-streptomycin-løsning.
3. Utarbeidelse av Enzym Solutions
- Forbered kollagenase D oppløsning i et 15 ml konisk bunn rør.
- Veie 10 mg kollagenase D. Dissolve kollagenase D i 4 ml komplett medium.
- Forbered pronase oppløsning i et 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Veie 10 mg pronase.
- Tilsett 5 ul av 1 M Tris-buffer (pH 8,0). Tilsett 1 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0).
- Fyll på med 494 mL sterilt vann.
- Inkuber pronase oppløsning ved 37 ° C i et vannbad i 30 min.
4. Utarbeidelse av Kollagenase D-pronase Mix (≤2 Tails)
Merk: Utfør de påfølgende trinnene i et sterilt cellekultur hette.
- Tilsett 250 ul av pronase løsning på 4 ml collagenase D-løsning.
- Bestå kollagenase D-pronase blandingen gjennom en 0,2 um sprøytefilter i en sterilt 15 ml konisk bunn rør.
5. Utvinning av fibroblaster fra øre og hale Vev
- Avlive mus i henhold til de aktuelle institusjonelle retningslinjer.
- Plasser autoklaveres kirurgiske instrumenter (saks og pinsett) i panseret cellekultur.
- Tilsett 10 ml fullstendig medium i to 10 cm cellekulturskåler hver.
- Skjær ører (~ 1 cm radius) og 5 cm av halen (fra spissen av halen) i mus med saks og inkuberes i 5 minutter i 40 ml 70% etanol i et sterilt 50 ml konisk bunn rør.
- Luft tørre ører og hale ved å plassere dem i en åpen 10 cm cellekultur rett i panseret for 5 min. Når tørket, overføring øre og halestykker til to kulturskåler som er merket "ører" og "hale" som inneholdt 10 ml komplett medium som beskrevet i trinn 5.3.
- Fjern hår fra ørene og hale med saks.
- Klipp ører og hale i biter mindre enn 3 mm i størrelse ved hjelp av saks.
- Overfør kutte vev i 1,8 ml kryorør ampuller merket "ører" og "hale" og legge tilstrekkelig kollagenase D-pronase løsning for volumet for å nå 1,8 ml merket på flasken.
- Psnøre de kryorør ampullene horisontalt på en ristemaskin og rist prøvene ved 200 rpm i 90 min ved 37 ° C.
- Etter 90 min inkubasjon, fjerne kryorør ampuller fra shaker og plassere hetteglassene i panseret.
- Tilsett 10 ml komplett medium i to 10 cm cellekultur retter, merket "ører" og "hale" hver, og sette en 70 mikrometer celle sil i hver tallerken.
- Plasser fordøyd øre og hale vev i 70 mikrometer celle sil i tilsvarende merket retter tilberedt i trinn 5.11 og kraftig slipe vev ved hjelp av en 10 ml sprøytestempelet for> 5 min. Rist celle sil av og til på mellom å vaske cellene ut av cellen sil.
- Pipetter cellesuspensjonen fra hver rett inn i to 15 ml konisk bunn rør merket "ører" og "hale". Vask fatet og sil med ytterligere 10 ml komplett medium og tilsett medium til de aktuelle 15 ml konisk bunn rør.
- Spinne ned cellensuspensjon i 7 minutter ved ~ 580 xg og 4 ° C ved anvendelse av en avkjølt sentrifuge celle.
- Fjern supernatant, tilsett 10 ml fullstendig medium til cellepelleten i 15 ml konisk bunn rør og resuspender cellene.
- Gjenta trinn 5.14 og 5.15.
6. Dyrking av Cell Blanding
- Fjern supernatant. Sørg for at cellepellet forblir uforstyrret.
- Re-suspen celler i 10 ml komplett medium og legge den respektive blandingen til to 10 cm cellekultur retter merket "ører" og "hale".
- Tilsett 10 ul amfotericin B-løsning (forrådsoppløsning: 250 ug / ml) til kulturen.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator.
- På den tredje dagen, erstatte mediet med 10 ml frisk komplett medium som inneholder 10 mL av amfotericin B for å fjerne rusk (figur 1 og 2).
7. Under kultur Fibroblaster
- When kulturen når omkring 70% konfluens (dag 3-4 i kultur) fjern mediet og vask cellene med 5 ml steril 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fjern PBS og tilsett 2 ml sterilt 1x trypsin-EDTA-oppløsning til cellene.
- Cellene inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator.
- Etter 5 min, banke forsiktig på kultur fatet og legg 6 ml komplett medium til cellene.
- Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml konisk rør og bunn spinne røret i 5 min ved ~ 450 xg og 4 ° C ved anvendelse av en avkjølt sentrifuge celle.
- Fjern supernatant og forsiktig re-suspen cellepelleten i 5 ml fullstendig medium.
- Seed 2 x 10 5 celler i en 10 cm cellekulturskål og cellene inkuberes ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator i 3-4 dager før gjenta trinn 7.1 til 7.6.
8. Utarbeidelse av Ears for forsendelse
Merk: Utfør tHan etterfølgende trinn i en steril cellekultur hette.
- Avlive mus i henhold til de aktuelle institusjonelle retningslinjer.
- Plasser autoklaveres saks og pinsett i panseret cellekultur.
- Tilsett 50 ml fullstendig medium i et 50 ml konisk bunn rør.
- Klipp ører (~ 1 cm radius) av en mus med saks.
- Overfør ørene inn i 50 ml konisk bunn rør (som fremstilt i trinn 3) ved hjelp av tang.
- Tett 50 ml konisk bunn rør med Parafilm før frakt ved RT i en passende boks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvinning av fibroblaster fra vev resulterer i en betydelig mengde vevsrester (figur 1). I motsetning til vev rusk, fibroblaster holde vev kultur plastflatene mellom dag 1 og 3 av kultur. Mediet av fibroblastkulturer trygt kan endres på dag tre av kulturen, som skal betydelig redusere nivåene av rusk som er tilstede i kulturen (figur 2). Fibroblaster viser en langstrakt morfologi og en klart synlig cytoplasma (figur 1 og 2). Mitotiske celler bør være til stede fra dag 3 av kultur og utover, og cellene skal nå 70-80% av celle confluency innen 3-4 dager kultur. Utbyttet fra øre og hale vev i en 10 cm kultur tallerken varierer fra 4 til 5 x 10 5 (ører) og 5 til 6 x 10 5 celler (halen) på dag 3 av kulturen. Etter den tredje dagen av fibroblaster isolasjon, kan cellene bli passert og sådd på 2 x 10 5 celler per 10 cm kultur parabolen.
Utvinning av fibroblaster fra ørene som er lagret ved romtemperatur i 10 dager, bør resultere i 70-80% konfluens celle innen 5 til 6 dagers dyrking (figur 3). Såing av cellene ved 2 x 10 5 celler pr 10 cm kulturskål etter dag 5 skal også gi opphav til omtrent 1 x 10 celler i løpet av 3-4 6 dagers dyrking. Langtidslagring påvirker ikke den tiden det tar for fibroblaster å angi senescens i vår erfaring (data ikke vist).
For å bekrefte identiteten til celler etter 3 dager med kultur, kan cellene merkes for fibroblaster markør vimentin 14. Bruke de ovennevnte protokoll, vi rutinemessig få rene fibroblast kulturer som indikert av vimentin farging (figur 4).
Figur 1. Fibroblast kultur på dag 3 stolpe ekstraksjon før skifte av medium.Representative lyse feltet bilder av celleavfall (hvite piler) til stede på dag 3 av kulturen. Bilder ble tatt til fange ved 100 × forstørrelse ved hjelp av et lysmikroskop. Målestokk representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fibroblast kultur på dag 3 innlegg utvinning etter tilsetting av nytt medium. Representative lyse feltet bilder av fibroblaster på dag 3 i kultur. Bilder ble tatt til fange på 100 × og 320 × forstørrelse ved hjelp av et lysmikroskop. Målestokk representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fibroblast kultur på dag 3 stolpe ekstraksjon fra øret vev lagres ved romtemperatur i 10 dager. Representative sterke feltbilder av fibroblaster på dag 3 i kultur. Bilder ble tatt til fange på 100 × og 320 × forstørrelse ved hjelp av et lysmikroskop. Målestokk representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Merking av fibroblast kulturer for vimentin. Representant konfokalt bilde av øre og hale fibroblaster på dag 3 av kulturen. Fibroblaster ekstrahert fra vevene ble merket for vimentin (rød) og DAPI (blå). Fluorescerende bildene ble kjøpt opp av konfokale microskopiere. Målestokk representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi tilveiebringe en enkel, billig og hurtig Fremgangsmåten for å etablere primære fibroblastkulturer fra ører og hale i mus. Ekstraksjonen bør resultere i adherente og raskt delende fibroblaster i løpet av 3 dager etter isolering av vevet. En viktig begrensning av primære celler er senescence, en permanent vekst arrest 15. Ved hjelp av protokollen, kan fibroblast kulturer skal passeres i 5 til 6 ganger før fibroblaster bli senescent, indikert av utflating av cellene, øker i størrelse (2-3 ganger økning) og unnlatelse av å utvide.
Når du utfører isolering av fibroblaster, må det tas hensyn under avbrudd av vev, som utilstrekkelig skjæring eller fordøyelsen vil føre til lav utvinning av fibroblaster. Det er mulig å samle øret og halen fibroblaster å øke antall fibroblaster. Ytterligere vev inkludert peritoneal og lungevev behandlet på samme måte, kan tilsettes for å øke tHan antall fibroblaster. Selv om avfall er til stede i kulturen følgende fibroblaster ekstraksjon, er det anbefalt å endre mediet bare etter den tredje dag som fibroblaster ta seg tid til å følge cellekulturskåler.
En potensiell begrensning av protokollen er bruk av ikke-sterile vev og tilhørende mulighet for mikrobiell kontaminasjon. For å redusere risikoen for smitte, er ører og hale inkuberes i 70% etanol før høsting av fibroblaster. Videre er anti-sopp amfotericin B tilsatt til den primære kultur for å hindre utvekst av gjær og sopp, et vanlig problem ved etablering fibroblastkulturer. Mediet inneholder også penicillin og streptomycin for å forhindre bakteriell forurensning. Ved hjelp av disse forholdsreglene, er forurensninger sjelden observert selv ved etablering av fibroblaster fra ører og haler som ble holdt ved RT i flere dager.
En av de viktigste fordelene med denne protokollen er ABILligheten for å generere fibroblaster fra ørene som er lagret i mediet ved romtemperatur i opp til 10 dager før fibroblaster isolert. Vi observerte et beskjedent redusert effektivitet i å etablere øre fibroblast kultur etter 10 dagers lagring (70-80% konfluens nås innen 5-6 dager i forhold til 3-4 dager for ferske isolert vev). Derfor kan ørene på mus byttes av forskere ved hjelp av standard shipping, selv om ekspress forsendelse anbefales. I vår erfaring, til brukervennlighet få ører og det faktum at vevet blir sjelden brukt for eksperimentelle prosedyrer gir ofte tilgang til vev av genmodifiserte mus som kan være tidkrevende å få på annen måte. For haler effektivisere utvinne fibroblaster etter lagring kan variere mye og haler bør bare brukes hvis ører er ikke tilgjengelig for forsendelse. Endelig bør de fleste mennesker være i stand til å utføre den protokoll, som høsting av vev krever minimal ekspertise og trening i behandling av mus.
Protokollen er bare testet ved hjelp av musen vev, men skal i teorien gi generering av fibroblast kulturer som bruker vev fra andre arter selv om protokollen kan trenge ytterligere optimalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
