Summary
Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.
Abstract
As células primárias são derivadas directamente a partir de tecidos e pensa-se ser mais representativo do estado fisiológico das células in vivo do que as linhas de células estabelecidas. No entanto, as culturas de células primárias geralmente têm um tempo de vida finito e precisa de ser frequentemente restabelecida. Os fibroblastos são uma fonte facilmente acessível de células primárias. Aqui, discutimos um procedimento experimental simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. O protocolo pode ser utilizado para estabelecer culturas de fibroblastos primários de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias. Quando o protocolo seguido é cuidadosamente, as contaminações não são susceptíveis de ocorrer, apesar da utilização de tecido não-estéril armazenada por tempo prolongado, em alguns casos. Os fibroblastos proliferam rapidamente em cultura e pode ser expandido para um número substancial antes de se submeter a senescência replicativa.
Introduction
As células primárias são derivadas a partir de tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro. Geralmente assume-se que as células primárias mais se assemelham ao estado fisiológico e o fundo genético do tecido a partir do qual foram produzidos de linhas de células imortalizadas ou de tumor 1. Por essa razão, as células primárias representam um modelo útil para o estudo biológico perguntas 2,3. No entanto, ao contrário de linhas celulares estabelecidas que crescem indefinidamente, células primárias, eventualmente, submetidos a senescência em cultura e têm de ser frequentemente restabelecida.
Células primárias vulgarmente utilizados incluem fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, células T, células B, macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) e células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDC). Os fibroblastos são muitas vezes utilizadas como modelo de cultura celular primária. Eles oferecem vantagens sobre outras células primárias. As culturas celulares são facilmente estabelecida, facilmente mantido e não necessitam de purificação de células antes da cultura. Eles têm proliferação inicial rápida e sem exigência de protocolos de médio ou de activação especializados. Os fibroblastos podem ser eficientemente transfectadas utilizando protocolos físicos 4,5 biológicas, químicas, e. Existe uma possibilidade de armazenar as orelhas para até 10 dias à TA antes de estabelecer culturas de células. Culturas de fibroblastos são propícias para visualização de processos citoplasmáticos e adequado para reprogramação em tronco pluripotentes induzidas (iPS) células 6.
Os fibroblastos são importantes células do tecido conjuntivo que segregam proteínas de colagénio e na matriz extracelular 7. Eles fornecem o quadro estrutural em muitos tecidos e 8 desempenham um papel essencial na cicatrização de feridas e reparação de tecidos 9,10.
Aqui, descrevemos um (<4 h) protocolo simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos de orelhas e rabos de ratos 11. O protocolo exige rato mínimaexperiência para colher os tecidos (em contraste com outros protocolos 12,13) e pode ser utilizado para estabelecer culturas de orelhas armazenados em meio à temperatura ambiente durante até 10 dias.
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Protocol
Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos em conformidade com as diretrizes institucionais, até a eutanásia (The Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações na Universidade Nacional de Cingapura e do Comité Consultivo Nacional para a Research Laboratory Animal (NACLAR) orientações).
1. Ratos
- Peça um rato do fundo genético apropriado. Este protocolo baseia-se em tecido derivado de uma C57BL / 6 mouse.
2. Preparação de Meio Completo
- Prepare meio completo, adicionando as seguintes componentes a Roswell Instituto Memorial Park (RPMI) 1640: 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 50 uM de 2-mercaptoetanol, 100 uM asparagina, glutamina 2 mM, solução de penicilina-estreptomicina a 1%.
3. Preparação de soluções enzimáticas
- Prepare solução de colagenase D em um tubo de fundo cónico de 15 ml.
- Pesar 10 mg de colagenase D. Dissolve colagenase D em 4 ml de meio completo.
- Preparar a solução de pronase num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
- Pesar 10 mg de pronase.
- Adiciona-se 5 mL de tampão Tris 1 M (pH 8,0). Adicionar 1 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0).
- Complete com 494 mL de água estéril.
- Incubar a solução de pronase a 37 ° C num banho de água durante 30 min.
4. Preparação de colagenase D-Mix pronase (≤2 Tails)
Nota: Execute as etapas subsequentes em uma capa de cultura de células estéril.
- Adicionar 250 ul de solução de pronase a 4 ml de solução de colagenase D.
- Passe a mistura de colagenase D-pronase através de um filtro de seringa de 0,2 mm em um tubo de 15 ml fundo cônico estéril.
5. Extração de fibroblastos de orelha e da cauda Tecidos
- Euthanize ratos de acordo com as diretrizes institucionais adequadas.
- Coloque autoclavados instrumentos cirúrgicos (tesouras e pinças) na capa de cultura de célula.
- Adicionar 10 ml de meio completo em dois 10 cm cultura de células pratos cada.
- Cortar orelhas (~ 1 cm de raio) e 5 cm de cauda (a partir da ponta da cauda) de um ratinho com tesouras e incubar durante 5 min em etanol a 40% em 70 ml de um tubo de 50 ml de fundo cónico estéril.
- Orelhas Ar seco e cauda, colocando-os em um aberto 10 centímetros de cultura de células prato na capa por 5 min. Depois secou-se, orelha de transferência e os pedaços de cauda, com duas placas de cultura marcado "orelhas" e "cauda" contendo 10 ml de meio completo, como descrito na etapa 5.3.
- Remover pêlos das orelhas e da cauda com uma tesoura.
- Cortar orelhas e cauda em pedaços menores que 3 mm de tamanho, usando uma tesoura.
- Transfira os tecidos cortados em 1,8 ml frascos criotubo rotulados "orelhas" e "cauda" e adicionar solução D-pronase colagenase suficientes para o volume a atingir a marca de 1,8 ml do frasco para injectáveis.
- Pate os frascos criotubo horizontalmente num agitador e agitar as amostras a 200 rpm durante 90 min a 37 ° C.
- Após 90 minutos de incubação, retire os frascos criotubo do agitador e coloque os frascos na capa.
- Adicionar 10 ml de meio completo em duas de 10 cm de cultura de células pratos, identificado como "orelhas" e "cauda" cada, e colocar um filtro de 70 um celular em cada prato.
- Coloque os tecidos orelha e da cauda digerido no coador 70 um celular nos pratos preparados em conformidade marcados na etapa 5.11 e com força moer os tecidos usando a 10 ml êmbolo da seringa para> 5 min. Agite o filtro de células ocasionalmente a médio e lavar as células fora do filtro de células.
- Pipetar a suspensão de células de cada prato em tubos de 15 ml de fundo dois cônicos rotulados "orelhas" e "cauda". Lave o prato e filtro com mais 10 ml de meio completo e adicionar a médio e os apropriados tubos de 15 ml de fundo cónico.
- Girar a célulasuspensão durante 7 minutos a 580 xg ~ e 4 ° C utilizando uma célula de centrífuga refrigerada.
- Remover o sobrenadante, adicionar 10 ml de meio completo para a pelete de células em 15 ml de tubos de fundo cónico e ressuspender as células.
- Repita o passo 5.14 e 5.15.
6. Cultura de mistura de células
- Remover o sobrenadante. Assegure-se que o agregado de células permanece intacta.
- Re-suspender as células em 10 ml de meio completo e adicione a respectiva mistura de dois pratos de cultura de 10 cm de células rotuladas "orelhas" e "cauda".
- Adicionar 10 ul de solução de anfotericina B (solução de estoque: 250 ug / ml) à cultura.
- Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2.
- No terceiro dia, substituir o meio por meio completo fresco contendo 10 ml de 10 ml de anfotericina B para remover os resíduos (Figuras 1 e 2).
7. Sub-cultura de fibroblastos
- WheN cultura atinge cerca de 70% de confluência (3-4 dias de cultura) remover o meio e lava-se as células com 5 ml de fosfato estéril 1x solução salina tamponada (PBS).
- Remover PBS e adicionar 2 ml de solução tripsina-EDTA 1x estéril para as células.
- Incubam-se as células durante 5 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2.
- Após 5 min, toque suave da placa de cultura e adicionar 6 mL de meio completo para as células.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de fundo cónico de 15 ml e girar o tubo durante 5 minutos a ~ 450 x g e 4 ° C utilizando uma célula de centrífuga refrigerada.
- Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celular em 5 ml de meio completo.
- Semente 2 x 10 5 células em uma cultura de células de 10 cm de prato e incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 durante 3-4 dias antes de repetir os passos 7.1 a 7,6.
8. Preparação de orelhas para o embarque
Nota: Execute tele etapas subseqüentes em uma capa de cultura de células estéril.
- Euthanize ratos de acordo com as diretrizes institucionais adequadas.
- Coloque tesouras e pinças autoclavado na capa de cultura de célula.
- Adicionar 50 ml de meio completo em um tubo de fundo cónico de 50 ml.
- Corte ouvidos (~ 1 cm de raio) de um rato com uma tesoura.
- Transferir as orelhas para o tubo de 50 ml de fundo cónico (como preparado no passo 3) utilizando fórceps.
- Selar o tubo inferior 50 ml cônico com parafilm antes do envio à temperatura ambiente em uma caixa apropriada.
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Representative Results
Extracção de fibroblastos a partir de resultados de tecidos em uma quantidade significativa de restos de tecido (Figura 1). Em contraste com os restos de tecido, fibroblastos de tecidos aderir às superfícies de cultura de plástico entre o dia 1 e 3 de cultura. O meio de cultura de fibroblastos pode ser alterado de forma segura no dia 3 de cultura, o qual deve diminuir significativamente os níveis de detritos presentes na cultura (Figura 2). Fibroblastos exibir uma morfologia alongada e um citoplasma claramente visível (Figuras 1 e 2). Células mitóticas devem estar presentes desde o dia 3 de cultura em diante e células devem chegar a 70-80% de confluência celular no prazo de 3-4 dias de cultura. O rendimento a partir de tecidos do ouvido e da cauda num prato de cultura de 10 cm varia de 4 a 5 x 10 5 (orelhas) e de 5 a 6 x 10 5 células (cauda) no dia 3 de cultura. Após o terceiro dia de isolamento fibroblastos, as células podem ser repicadas e semeadas a 2 x 10 5 células por prato de cultura de 10 cm.
Extracção de fibroblastos de orelhas armazenados à temperatura ambiente durante 10 dias deve resultar em 70-80% de confluência de células dentro de 5 a 6 dias de cultura (Figura 3). Semear as células a 2 x 10 5 células por prato de cultura de 10 cm após o dia 5 também deve dar origem a cerca de 1 x 10 6 células dentro de 3-4 dias de cultura. O armazenamento a longo prazo, não afecta o tempo que leva para fibroblastos para entrar em senescência nossa experiência (dados não mostrados).
Para verificar a identidade das células ao fim de 3 dias de cultura, as células podem ser etiquetados para o marcador de fibroblastos vimentina 14. Usando o protocolo acima, nós rotineiramente obter culturas de fibroblastos puro como indicado por tingimento vimentina (Figura 4).
Figura 1. cultura de fibroblastos no dia 3 pós extração antes de mudar de forma.Representativos imagens de campo claro de detritos celulares (setas brancas) presentes no dia 3 de cultura. As imagens foram capturadas em 100 × ampliação usando um microscópio de luz. A barra de escala representa 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. cultura de fibroblastos no dia 3 pós extração após a adição do novo meio. Representativos imagens de campo brilhante de fibroblastos no dia 3 de cultura. As imagens foram capturadas em 100 × e 320 × ampliação usando um microscópio de luz. A barra de escala representa 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. cultura de fibroblastos no dia 3 pós-extracção a partir de tecidos do ouvido armazenados à temperatura ambiente durante 10 dias. Representativos de imagens de campo brilhante de fibroblastos no dia 3 em cultura. As imagens foram capturadas em 100 × e 320 × ampliação usando um microscópio de luz. A barra de escala representa 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Rotulagem de culturas de fibroblastos para vimentina. Image confocal Representante da orelha e da cauda fibroblastos no dia 3 de cultura. Os fibroblastos extraídos dos tecidos foram marcadas durante vimentina (vermelho) e DAPI (azul). As imagens fluorescentes foram adquiridas por micros confocalcópia. A barra de escala representa 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós fornecemos um procedimento experimental simples, barato e rápido para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. A extracção deve resultar em fibroblastos aderentes dividem rapidamente e dentro de 3 dias após o isolamento do tecido. Uma importante limitação de pilhas é senescência, uma parada do crescimento permanente 15. Usando o protocolo, culturas de fibroblastos podem ser passadas durante 5 a 6 vezes antes de se tornar fibroblastos senescentes, indicado pelo achatamento das células, aumentar de tamanho (aumento de 2-3 vezes) e a falta de expansão.
Ao realizar o isolamento dos fibroblastos, a atenção deve ser pago durante o rompimento dos tecidos, como o corte ou a digestão insuficiente resultará em baixa recuperação de fibroblastos. É possível agrupar os fibroblastos orelha e da cauda para aumentar o número de fibroblastos. Tecido adicionais, incluindo tecido de pulmão e peritoneal processados da mesma maneira podem ser adicionados para aumentar tele número de fibroblastos. Embora detritos está presente na cultura de fibroblastos após a extracção, é recomendado para alterar a forma apenas após o terceiro dia como fibroblastos ter tempo para aderir a pratos de cultura de células.
Uma limitação potencial do protocolo é a utilização de tecidos não-estéreis e associada possibilidade de contaminação microbiana. Para reduzir o risco de contaminação, orelhas e cauda são incubados em 70% de etanol antes da colheita dos fibroblastos. Além disso, o antifúngico anfotericina B é adicionada à cultura primária para evitar o crescimento de leveduras e fungos, um problema comum quando se estabelecer culturas de fibroblastos. O meio também contém penicilina e estreptomicina para prevenir a contaminação bacteriana. Usando essas precauções, contaminações são raramente observada mesmo quando estabelecer fibroblastos de orelhas e caudas que foram mantidos à temperatura ambiente durante vários dias.
Uma das principais vantagens deste protocolo é o abildade para gerar fibroblastos de orelhas que foram armazenados em meio à temperatura ambiente durante até 10 dias antes de fibroblastos isolamento. Observou-se uma modesta diminuição da eficiência no estabelecimento de cultura de fibroblastos da orelha depois de 10 dias de armazenagem (70-80% de confluência é alcançada dentro de 5-6 dias, em comparação com 3-4 dias para isolada de fresco de tecido). Assim, as orelhas de camundongos podem ser trocados por pesquisadores que utilizam o transporte padrão, apesar de remessa expressa é recomendado. Na nossa experiência, a facilidade de utilização para a obtenção ouvidos e o facto de que o tecido é raramente usado para procedimentos experimentais muitas vezes permite o acesso ao tecido de ratos geneticamente modificados que possam ser de outra forma para se obter demorado. Para caudas a eficiência dos fibroblastos em recuperação após o armazenamento pode variar amplamente e caudas só deve ser usado se os ouvidos não estão disponíveis para o transporte. Finalmente, a maioria das pessoas devem ser capazes de realizar o protocolo, como a colheita de tecidos requer experiência mínima e treinamento em manejo de ratos.
O protocolo só foi testado usando tecido mouse, mas deve, em teoria, permitir a geração de culturas de fibroblastos utilizando tecido de outras espécies, embora o protocolo pode precisar de uma maior optimização.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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