Introduction
التركيز الرئيسي من هذه الورقة هو للتدليل على التصوير الضوئي التغيرات في إمكانات غشاء في المختبر باستخدام البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا. التغييرات التصوير في غشاء المحتملة توفر إمكانية مثيرة لدراسة نشاط الدوائر العصبية. عندما التغيرات في غشاء نتيجة المحتملة في تغير كثافة مضان، كل بكسل للكاميرا يصبح القطب البديل تمكين قياسات نونينتروسيفي من نشاط الخلايا العصبية. لأكثر من أربعين سنة، كانت الأصباغ الحساسة الجهد العضوية مفيدة لرصد التغيرات في غشاء المحتملة 1-4. ومع ذلك، هذه الأصباغ تفتقر إلى التحديد الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض أنواع الخلايا صعبة وصمة عار. مؤشرات الجهد المشفرة وراثيا (GEVIs) التغلب على هذه القيود من خلال وجود الخلايا لدراستها على وجه التحديد تعبر عن الفلورسنت التحقيق الحساسة الجهد.
هناك ثلاث فئات من GEVIs. الطبقة الأولى من GEVI تستخدم فوltage الاستشعار المجال من الفوسفاتيز الاستشعار الجهد إما مع البروتين واحد فلوري (FP) 5-9 أو فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) زوج 10-12. الطبقة الثانية من أجهزة الاستشعار وتستخدم الجراثيم رودوبسين كمؤشر الفلورسنت مباشرة أو عن طريق 13-15 الحنق كهربائيا 16،17. الطبقة الثالثة تستخدم عنصرين، عنصر وراثي كونه غشاء الراسية FP والعنصر الثاني كونه غشاء ملزمة تبريد صبغ 18-20. في حين أن الطبقات الثانية والثالثة هي مفيدة لفي المختبر، وشريحة التجارب 19،20، فقط أول دفعة من أجهزة الاستشعار مفيدة في الجسم الحي يحلل 6 حاليا.
في هذا التقرير سوف نظهر التصوير من غشاء المحتملة باستخدام الدرجة الأولى من GEVIs (الشكل 1) في المختبر. هذه الطبقة الأولى من أجهزة الاستشعار الجهد هو أسهل للانتقال إلى التصوير في الجسم الحي. منذ GEVIs شtilizing مجال الاستشعار الجهد تنصهر إلى FP وحوالي 50 أضعاف أكثر إشراقا من الدرجة رودوبسين من أجهزة الاستشعار، ويمكن تصويرها باستخدام مصباح قوس الإضاءة بدلا من طلب ليزر قوية للغاية. نتيجة أخرى من التفاوت في السطوع هي أن الطبقة الأولى من GEVIs يمكن أن تتجاوز بسهولة لصناعة السيارات في مضان من الدماغ. لا يمكن للتحقيقات القائم على رودوبسين. الطبقة الثالثة من أجهزة الاستشعار هو مجرد مشرق مثل الدرجة الأولى ولكنها تتطلب إضافة فاكهه تقضي المادة الكيميائية التي يصعب إدارتها في الجسم الحي.
ونحن، بالتالي، تدليل على الاستحواذ على التحقيق مع FP واحد (Bongwoori) 8 والتحقيق المكونة من زوج الحنق (النبي 2) 12. الحنق يبني في هذا التقرير هي إصدارات فراشة VSFP-CR (البروتينات الفلورية الحساسة الجهد - البرسيم-mRuby2) 11 تتألف من المانحين الفلورية الخضراء، البرسيم، ومتقبل أحمر فلوري، mRuby2، واسمه النبي 2.242 و 2.244 النبي 
الشكل 1. نوعان من المؤشرات مشفرة وراثيا الجهد (GEVIs) تصوير في هذا التقرير (A) وFP أحادية أساس GEVI وجود مجال الاستشعار الجهد العابرة للغشاء والبروتين الفلوري. (ب) وGEVI أساس الحنق تتألف من عبر غشاء مجال الاستشعار الجهد، مانحا الحنق ومتقبل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تمت الموافقة على بروتوكول التجربة الحيوانية رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في بروتوكول الحيوان KIST 2014-001.
1. إعداد المعدات
- الإعداد والتصوير
- وضع المجهر مضان مقلوب على طاولة الاهتزاز العزلة. استخدام عالية التكبير (60X عدسة الغمر النفط مع 1.35 الفتحة العددية) عدسة موضوعية ومكعب مرشح مجهزة مرآة مزدوج اللون والمرشحات مناسبة لالبروتينات الفلورية المستخدمة في التصوير الجهد.
ملاحظة: يستخدم هذا الإعداد مجهر مقلوب، من أجل توظيف أهداف مع ارتفاع NA، ولكن يمكن أيضا المجاهر تستقيم استخدامها. في الواقع، المجهر المقلوب هو فقط للتنمية التحقيق منذ ارتفاع الفتحة العددية (NA) عدسة الهدف يجمع مزيدا من الضوء من واحد مع NA منخفضة وبالتالي تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR، ويمكن وصفها بأنها إشارة ضوئية الذروة مقسوما على الانحراف المعياري من خط الأساسمضان) من التسجيل. وبالنسبة لغير المطورين، فإننا نوصي المجهر تستقيم لتطبيقات مثل شريحة أو في التسجيلات الجسم الحي. - إعداد مصدر للضوء، على سبيل المثال، زينون مصباح قوس، ومجهزة مع مفتاح ميكانيكي لepifluorescence كفاءة التصوير واسعة المجال. توجيه الضوء إلى مجهر عن طريق دليل ضوء جبل. وعلى ضوء تمر عبر فلتر الإثارة وينعكس من خلال أول مرآة مزدوج اللون في المكعب التصفية. محاذاة ضوء لإلقاء الضوء على عينة بالتساوي مع شدة الضوء مكبر أكثر من مجال الرؤية 21.
ملاحظة: تقليديا، تم استخدام مصباح قوس 75 واط منذ ارتفاع المصابيح القوة الكهربائية خلق أكبر ولكن لا مجال الإضاءة أكثر إشراقا. الليزر يمكن استخدام ولكن تقتصر على الطول الموجي واحد. أصبحت المصابيح أكثر إشراقا، وربما يكون في الواقع مصدر الضوء من خيار تقديم موجات متعددة ولا تتطلب مفتاح ميكانيكي. - تركيب كاميرات CCD اثنين إلى fluorescسينعقد المجهر كما هو مبين في الشكل 2D.
ملاحظة: اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا الأولى ديها قرار مكانية عالية، ويستخدم لتحديد خلية معربا عن GEVI في الغشاء البلازمي لفحصها. لإجراء تغييرات التصوير في غشاء المحتملة، تأكد من أن كاميرا CCD الثانية لديها ارتفاع معدل إطار مثل 1000 إطار في الثانية (FPS). استخدام مزدوج كاميرا محول ميناء (الشكل 2D- (3)) للتبديل مسار التصوير بين كاميرات CCD اثنين. في هذا الإعداد، يتم استخدام demagnifier لتتناسب مع صورة من عدسة الهدف على رقاقة CCD في الكاميرا CCD الثانية. - تثبيت الخائن صورة بين الأول (بطيئة) والثانية (سريع) كاميرات CCD للتصوير من GEVI الحنق القائم. إدراج مكعب تصفية وجود مرآة مزدوج اللون (560 نانومتر) والمرشحات الانبعاثات اثنين (520 نانومتر / 40 و 645 نانومتر / 75) في التقسيم الصورة. وسيؤدي هذا في حقلين للعرض، واحد لمضان المانحة والآخر يمثل مضان متقبل. إزالة هذا قecond مرشح مكعب عند التصوير في GEVI مع FP واحد.
ملاحظة: GEVI FP واحد على أساس اختبار في هذا الأسلوب هو Bongwoori الذي يستخدم FP، سوبر مسير الشمس pHluorin A227D (SE A227D). وقد تم اختيار مرشح الإثارة (472 نانومتر / 30)، مرشح الانبعاثات (497 نانومتر / تمريرة طويلة) ومرآة مزدوج اللون (495 نانومتر) على أساس لها الإثارة وانبعاث أطياف 5. عموما، يجب أن يكون الإثارة وانبعاث المرشحات أكبر تداخل مع كل أطياف fluorophore للحصول على صورة مشرقة بينما الكتل مرآة مزدوج اللون أي ضوء الإثارة تنتقل من خلال تصفية الانبعاثات. اختيار المرشحات والمرايا مزدوج اللون لتسجيل GEVI أساس الحنق الزوج 11 يتبع نفس المبدأ إلا أنه يتطلب مكعب مرشح الثاني في الخائن صورة للمراقبة المتزامنة من الجهات المانحة ومتقبل مضان. أول مكعب مرشح وضعها في خانة تصفية المجهر يحتاج الى عملية تصفية الإثارة (475 نانومتر / 23) لالبرسيم. ثم المنبعثة ووستحال luorescence من كل ضباط الإتصال إلى المكعب مرشح الثاني من خلال أول مرآة مزدوج اللون (495 نانومتر). المكعب مرشح الثاني له مرآة مزدوج اللون (560 نانومتر) والمرشحات الانبعاثات اثنين (520 نانومتر / 40 لالبرسيم و 645 نانومتر / 75 mRuby2) لأنه هكذا كل FP فصل مضان من اثنين من مختلف ضباط الإتصال.
- وضع المجهر مضان مقلوب على طاولة الاهتزاز العزلة. استخدام عالية التكبير (60X عدسة الغمر النفط مع 1.35 الفتحة العددية) عدسة موضوعية ومكعب مرشح مجهزة مرآة مزدوج اللون والمرشحات مناسبة لالبروتينات الفلورية المستخدمة في التصوير الجهد.
| واحد GEVI FP مقرها (Bongwoori) | الحنق GEVI تقوم على أزواج (النبي 2.42 و 2.44 النبي) | ||
| الفلتر الأول مكعب وضعها في المجهر | مرشح الإثارة | 472 نانومتر / 30 | 475 نانومتر / 23 |
| مرآة مزدوج اللون | 495 نانومتر | 495 نانومتر | |
| تصفية الانبعاثات | 497 نانومتر / تمريرة طويلة | - | |
| مرشح مكعب الثاني وضعت في الحزمة الخائن | مرآة مزدوج اللون | - | |
| تصفية الانبعاثات 1 | - | 520 نانومتر / 40 | |
| تصفية الانبعاثات 2 | - | 645 نانومتر / 75 |
الجدول 1. اثنان تصفية مجموعات مختلفة تستخدم لGEVI FP وبناء واحد وGEVI تسجيلات الحنق القائم
- عزل الاهتزاز
- عدم تحميل أي معدات مع تحريك المكونات على جدول عزل الاهتزاز. تأكد من أن الكابلات التي تعلق على معدات غير معزولة هي فضفاضة لتجنب اهتزاز من العينة.
- التصحيح غرفة المشبك
- ختم الجزء السفلي من الغرفة المشبك التصحيح مع رقيقة # 0 غطاء زجاجي منذ المسافة عمل الهدف صغيرة نسبيا. هذا هو العيب من الإعداد المجهر المقلوب.
ملاحظة: كما المقايضة وجود ارتفاع NA العدسة الشيئية، يقلل من المسافة العمل. من أجل وضع specimأون ضمن مسافة عمل قصيرة جدا، والزجاج غطاء وساترة (الخطوة 2) تحتاج إلى أن تكون رقيقة قدر الإمكان.
- ختم الجزء السفلي من الغرفة المشبك التصحيح مع رقيقة # 0 غطاء زجاجي منذ المسافة عمل الهدف صغيرة نسبيا. هذا هو العيب من الإعداد المجهر المقلوب.
- التحكم في درجة الحرارة
- ضمان تدفق حل حمام من خلال وحدة تحكم في درجة الحرارة للحفاظ على خلايا مصححة حوالي 33 درجة مئوية في كافة مراحل التجربة.
- معدات اتصالات
- توصيل مكبر للصوت المشبك التصحيح ومفتاح ميكانيكي من مصدر الضوء إلى مربع القيادة حربة نيل-Concelman (BNC) من اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا سرعة عالية. وسيمكن هذا البرنامج التصوير للسيطرة على مكبر للصوت، وكاميرا، ومصدر الضوء في وقت واحد.
ملاحظة: المكونات الكهربائية والتصوير تحتاج إلى أن تكون متزامنة من أجل توفير التسجيلات الكهربائية والبصرية في وقت واحد من النشاط الكهربائي.
- توصيل مكبر للصوت المشبك التصحيح ومفتاح ميكانيكي من مصدر الضوء إلى مربع القيادة حربة نيل-Concelman (BNC) من اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا سرعة عالية. وسيمكن هذا البرنامج التصوير للسيطرة على مكبر للصوت، وكاميرا، ومصدر الضوء في وقت واحد.
الشكل 2. تجهيزاتيتم تصفية إعداد منة التصوير الجهد مع GEVIs سير العمل التالية مسار الضوء، (A) 75W زينون مصباح قوس، (ب) ضوء الإثارة من مصباح قوس بواسطة عامل تصفية الإثارة وثم تنعكس من خلال أول مرآة مزدوج اللون قبل أن تصل إلى المرحلة العينة، أقحم في الزاوية اليمنى العليا معارض التكوين كله خلية، (C) يتم استخدام بطء سرعة الكاميرا CCD لمساعدة كل من اختيار الخلية والمشبك التصحيح، (D) الجزء الحصول على الصور. (1) ارتفاع كاميرا CCD سرعة، (2) الخائن صورة لكل من الحنق الزوج وأحادية FP GEVIs، (3) demagnifier لتناسب الصورة على رقاقة CCD في الكاميرا CCD عالي السرعة، (4) والمنفذ المزدوج محول كاميرا للتبديل مسار التصوير و (5) من بطء سرعة الكاميرا CCD مع قرار مكانية عالية لتحديد الخلية إلى التصحيح، (E & F) الحصول على الصور مع واحد-FP أساس GEVI (E) وGEVI القائم على الحنق(F). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. التعبير عن GEVIs
- في الجنينية البشرية الكلى 293 الخلايا
- ثقافة الجنينية البشرية الكلى 293 (كلوة 293) الخلايا مع Dulbecco ومتوسطة النسر المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 (5٪ CO 2). استخدام صحن زراعة الأنسجة بقطر 100 ملم و 20 ملم الارتفاع. بدء الثقافة مع 2 × 03-06 أكتوبر × 10 3 خلية / سم 2 واحتضان حتى تصل إلى 80-90٪ confluency لترنسفكأيشن لاحق.
- يوم ترنسفكأيشن، نضح في وسائل الإعلام خلية وغسل بلطف مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و. تفريق الخلايا كلوة 293 مع 0.25٪ حل التربسين-EDTA لمدة 1-2 دقائق، ونضح الحل والاستفادة بلطف جانب طبق لفصل جملتعلمي اللغة اإلنكليزية. إضافة DMEM جديدة (10٪ FBS) وفصل الخلايا تجمعت من قبل pipetting. تحديد تركيز خلية باستخدام عدادة الكريات.
- وضع 0،08-0،13 مم، مم 10 coverslips مع بولي-L-يسين في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا المغلفة مسبقا. البذور الخلايا كلوة 293 coverslips على على 1 × 10 5 خلية / سم 2 كثافة الخلية.
ملاحظة: منذ كلوة 293 الخلايا قادرة على تشكيل تقاطعات الفجوة مع بعضها البعض، وعدد البذور يحتاج لانتاج الخلايا المعزولة. - عابر transfect الخلايا مع بناء الجين المناسب ترميز GEVI باستخدام كاشف lipofection التالية تعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: بنيات الجينات المستخدمة لهذه الخطوة الاستفادة pcDNA3.1 (Bongwoori) وpUB2.1 (النبي 2.242) كما ناقلات العمود الفقري. كان المبلغ من استخدام الحمض النووي 100 نانوغرام لكل ساترة. ومع ذلك، تحتاج شروط ترنسفكأيشن أن يكون تصميما تجريبيا لكل GEVI لفحصها.
- في الورك الماوس نأتالخلايا العصبية الأولية pocampal
- تشريح الحصين من اليوم الجنينية 17 الفئران C57BL6 / N ثم فصل الخلايا العصبية قرن آمون كما هو موضح سابقا 22،23.
- لوحة الخلايا العصبية نأت على بولي-D-يسين المغلفة 0،08-0،13 مم، 10 coverslips مم في 1 × 10 5 خلية / مل كثافة الخلية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 (5٪ CO 2).
- Transfect الخلايا العصبية فصل عابر في 6-7 أيام في المختبر (DIV) مع بناء الجين ترميز GEVI باستخدام فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن الكاشف كما هو موضح سابقا (24).
ملاحظة: بنيات الجينات المستخدمة لهذه الخطوة الاستفادة pcDNA3.1 (Bongwoori) وpUB2.1 (النبي 2.244) كما ناقلات العمود الفقري. وكانت كمية الحمض النووي المستخدمة 1 ميكروغرام لكل ساترة. مرة أخرى، لا بد الظروف ترنسفكأيشن أن يكون تصميما تجريبيا لكل GEVI اختبارها.
- التحقق من مستوى التعبير قبل الجهد معهد العالم العربيجينج
- تأخذ لوحة زراعة الأنسجة من الحاضنة CO 2 ومراقبة مضان من الخلايا transfected تحت المجهر epifluorescence.
- بعد التأكد من مضان من الغشاء، ونقل ساترة إلى غرفة الترقيع للتصوير الجهد في القسم 3.
ملاحظة: يتم إجراء التصوير الجهد 16-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. لكن، وكما لها البروتينات الفلورية مختلفة مرات نضوج مختلفة، بعض GEVIs بحاجة الى مزيد من الوقت في مرحلة ما بعد ترنسفكأيشن. على سبيل المثال، أزواج الحنق التي تحتوي على mRuby2 في هذا البروتوكول قد يستغرق وقتا أطول للتعبير منذ نضوج mRuby2 يأخذ فترة أطول كثيرا من البرسيم 11. يجب فحص مضان من كل من الجهات المانحة ومتقبل.
3. بروتوكول التصوير الجهد
- اختيار الخلية الصحيحة مع التعبير غشاء جيد
- باستخدام المجهر، والعثور على الخلايا السليمة (الشكل 4B) أن يظهر قويامضان المحلية غشاء مقارنة مضان الداخلي. ليس محاولة لرأب الصدع خلايا مدورة. خلايا دائرية إما تقسيم أو يموتون ويصعب التصحيح. تطبيق نبض اختبار من 5.0 فولت في ميللي ثانية السعة و 5.0 في مدة لمساعدة التجارب المشبك التصحيح اللاحقة.
- إعداد خلية للتصوير الجهد
- بعد اختيار الخلية إلى التصحيح، وضع ماصة التصحيح المشبك فوق الخلية. جلب ماصة أسفل حتى يلمس بلطف غشاء الخلية. في هذه الخطوة، ومراقبة 1 MΩ - 2 ارتفاع MΩ في مقاومة الغشاء على المشبك التصحيح برنامج 25.
ملاحظة: أحيانا، يمكن أن يحدث جيد ختم جيجا أوم ببساطة عن طريق لمس غشاء الخلية. طالما أن ختم جيجا أوم مستقرة، وينبغي أن تكون على ما يرام. - إنشاء ختم جيجا أوم عن طريق تطبيق بلطف ضغط سلبي من خلال ماصة. تعيين إمكانات ماصة في إمكانية عقد المرجوة.
- مع الحفاظ على ختم جيجا أوم، صورة عشرخلية ه مع كاميرا CCD عالية السرعة والتركيز على منطقة الغشاء.
- تمزق غشاء الخلية من خلال تطبيق نبضات شفط عن طريق الفم أو حقنة برفق لجعل تكوين خلية كاملة 26.
- صورة التصحيح فرضت خلية ضمن تكوين خلية المشبك كله وفقا لتصميم تجريبي باستخدام برامج التصوير
- بدء برامج التصوير. انقر على [يكتسب] - القائمة [SciMeasure كاميرا] لفتح "CCD الحصول على 'صفحة.
- إنشاء ملف بيانات جديد لحفظ الصور.
- انقر [التماثلية إخراج] ثم [اقرأ على ASCII] لفتح ملف بروتوكول النبض لإجراء التصوير. انقر على 'المتوسط التكرار الداخلية "إذا كان يحتاج البيانات إلى أن متوسط. ثم أغلق "التماثلية إخراج 'صفحة.
ملاحظة: هذا البروتوكول نبض يحتاج إلى أن تكون مصممة وحفظها كملف ". TXT" وفقا للغرض من كل تجربة قبل هذه الخطوة. - تعيين مكتسبات معينةالمعلمات ition من صفحة "CCD اكتساب". إدخال القيم المحددة ل 'عدد من الإطارات لاقتناء "و" عدد من التجارب ".
ملاحظة: يتم تحديد عدد الإطارات من سرعة اكتساب وتوقيت بروتوكول النبض. على سبيل المثال، إذا التصوير في 1 كيلو هرتز، 1000 إطارات يساوي 1 ثانية من وقت التسجيل. - انقر على [أخذ البيانات (بصريات + BNC)] الزر لبدء التسجيل. في حين أن التصوير الجهد يجري، مشاهدة نافذة الذبذبات من برنامج المشبك التصحيح لضمان استقرار تكوين خلية كاملة في جميع أنحاء تسجيل.
ملاحظة: لاختبار مدى الجهد استجابة لGEVI، وحجم إشارة في ΔF / قيمة F أو القرار الزماني في جميع أنحاء مجموعة الجهد الفسيولوجية، إجراء كلها خلية المشبك الجهد التجربة مع نبضات الجهد بروتوكول النبض بعد أن صعد تتراوح بين -170 بالسيارات إلى 130 فولت. لتحديد أداء GEVI في حل إمكانات العمل أثار من الوجاهة مثقفالخلايا العصبية راي، صورة الخلية تحت التكوين المشبك الحالي خلية كاملة.
- بعد اختيار الخلية إلى التصحيح، وضع ماصة التصحيح المشبك فوق الخلية. جلب ماصة أسفل حتى يلمس بلطف غشاء الخلية. في هذه الخطوة، ومراقبة 1 MΩ - 2 ارتفاع MΩ في مقاومة الغشاء على المشبك التصحيح برنامج 25.
4. الحصول على البيانات
- حساب ΔF / F
- بدء برامج التصوير. انقر على [FILE] - [قراءة البيانات أرشيف] لفتح ملف بيانات ليتم تحليلها. مراقبة صورة خلية في لكثافة يستريح الخفيفة (مؤشر القائمة الحمراء) على الجانب الأيمن
ملاحظة: المتوسطات البرمجيات الأطر 5 الأولى لتحديد مؤشر القائمة الحمراء للتسجيل. - انقر على "مشاهدة BNCs" لتحقيق القيم الحالية والجهد يقاس على الشاشة.
- تغيير وضع الصفحة من "إطار RLI 'إلى' الطرح الإطار" إلى الاستفادة من وظيفة إطار الطرح لتحديد بكسل مع الإشارات الضوئية استجابة. هذه هي القوة الحقيقية التصوير لأن كل بكسل يمكن فحص التغيرات المحتملة في مضان.
- حدد نقطتين الوقت (F 0 و F 1) لالطرح. تحديد أي منطقة من الخلية هوتظهر إشارات استجابة لغشاء تغيير محتمل.
ملاحظة: SNR للصور إطار الطرح يمكن تحسينها من خلال اختيار إطارات متعددة لكل نقطة زمنية في المتوسط زمنيا الإشارة. البرنامج يطرح متوسط شدة الضوء مأخوذة من الإطارات المحددة ويحسب F 1 -F 0 القيم (ΔF). عادة واحد يختار نقطة زمنية حصلت على عقد النقطة المحتملة ووقت آخر اتخذت خلال فترة التحفيز. - تعيين بكسل التي تحتاج إلى تحليل عن طريق سحب أو النقر فوق كل بكسل مع فأرة الكمبيوتر. مراقبة تمثيل رسومي من متوسط كثافة مضان من البيكسل المحددة على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج. أرقام 4B 5B وتظهر الصور التمثيلية من تحليل إطار الطرح.
- تقسيم بكسل تطرح من قبل RLI (F 0). انقر على [القسمة على مؤشرات مؤشر القائمة الحمراء] للحصول على القيم ΔF / F
- بدء برامج التصوير. انقر على [FILE] - [قراءة البيانات أرشيف] لفتح ملف بيانات ليتم تحليلها. مراقبة صورة خلية في لكثافة يستريح الخفيفة (مؤشر القائمة الحمراء) على الجانب الأيمن
- تصدير البيانات
- إزالة الرسوم البيانية التيار والجهد من قبل unclicking القائمة 'مشاهدة BNCs ". الذهاب إلى [الناتج] - [حفظ آثار وعرض (ASCII)] لتصدير التتبع مضان في تنسيق ملف ASCII لتحليل تركيب منحنى بواسطة برنامج الرسوم البيانية القياسية.
تحليل 5. البيانات
- الجهد الملكية الاستشعار من GEVI
- رسم التغيير مضان مقابل الرسم البياني الجهد (اناث) من خلال التآمر القيم ΔF / F مقابل الجهد في برنامج تحليل البيانات. تناسب منحنى إلى وظيفة بولتزمان (الجدول 2) لتحديد مدى الجهد للإشارة الضوئية عن طريق النقر [تحليل] - [تركيب] - [صالح السيني] - [الحوار فتح]، ثم اختر وظيفة بولتزمان.
ملاحظة: من المناسب أن وظيفة يجعل من الامكانه لتوصيف خصائص الاستشعار عن الجهد تحقيقات الجهد مختلفة أو لمقارنة أدائهم في خلايا مختلفة. وظيفة بولتزمان يمكن استخدامها لتحقيقات اختبارها في هذه الورقة لأن منحنيات اناث من هذه التحقيقات تبين نمط السيني. - تطبيع كل قيمة ΔF / F باستخدام القيم الأولية والنهائية (A 1 و A 2) وتحسب على أساس وظيفة.
ملاحظة: في معادلة بولتزمان، والحد الأدنى هو A 1 والحد الأقصى هو A 2. للتطبيع، واستخدام البرمجيات تطبيق جدول بيانات لضبط القيم ΔF / F من خلال تحديد A 1 صفر وA 2 واحد. متوسط في ΔF تطبيع / القيم F وحساب الخطأ المعياري للتحليل الإحصائي. - Replot وΔF تطبيع / القيم F مقابل الجهد كما هو موضح سابقا في القسم 5.1.1).
- رسم التغيير مضان مقابل الرسم البياني الجهد (اناث) من خلال التآمر القيم ΔF / F مقابل الجهد في برنامج تحليل البيانات. تناسب منحنى إلى وظيفة بولتزمان (الجدول 2) لتحديد مدى الجهد للإشارة الضوئية عن طريق النقر [تحليل] - [تركيب] - [صالح السيني] - [الحوار فتح]، ثم اختر وظيفة بولتزمان.
- سرعة الاستجابة البصرية
- فتح ملف ASCII المكتسبة من الخطوة 4.2.2) مع تحليل البياناتبرنامج ورسم التتبع ΔF / F مقابل الوقت.
- انقر على "محدد البيانات" في برنامج تحليل البيانات وتحديد نقطة زمنية واحدة المقابلة لبداية نبضة الجهد صعدت ونقطة زمنية ثانية عند الإشارة الضوئية قد وصل إلى حالة من الثبات. تناسب هذه المجموعة على حد سواء وظيفة تسوس الأسي مفردة ومزدوجة عن طريق النقر [تحليل] - [تركيب] - [صالح الأسي] - [الحوار فتح]، واختيار وظيفة تسوس الأسي. بلغ تناسب أفضل.
ملاحظة: من خلال تركيب لوظائف الاضمحلال الأسي واحدة أو مزدوجة، الثوابت الوقت كميا ممثلة τ يمكن الحصول عليها. وهذا سوف يساعد المجربون مقارنة حركية قياساتهم القيام به مع مؤشرات الجهد مختلفة. تتبع مضان قد تظهر مكونات السريعة والبطيئة التي يمكن وصفها مع ضعف وظيفة تسوس الأسي. في هذه الحالة، فإن حساب يؤدي في اثنين من الثوابت الوقت مع سعة مختلفة. - حساب الالبريد الثوابت τ المرجح للمقارنة بين حركية تحقيقات العارضة عنصرين الزمنية للتحقيقات مع مكون واحد.
ملاحظة: يتم احتساب تاو المرجح كمجموع τ 1 مضروبا في السعة النسبية، A 1، بالإضافة إلى τ 2 مضروبا في السعة النسبية، A 2، على النحو المحدد في الصيغة التالية:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عابر خلايا transfected يمكن أن يحمل تفاوت كبير في كثافة مضان ودرجة التعبير غشاء البلازما. حتى على نفس ساترة بعض الخلايا سيكون لها مستويات مختلفة من مضان الداخلي. وهذا هو الأرجح بسبب كمية العامل ترنسفكأيشن تمتصه الخلايا. في بعض الأحيان، والكثير من التعبير يتسبب الخلية لتجربة استجابة البروتين تكشفت مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج 27 (مشرق، تقريب الخلايا، مع مضان الداخلية عالية). ولذلك حذر المجرب لاختبار كل من خلايا مشرق والخلايا قاتمة مع مضان الداخلي أقل قدر ممكن منذ التعبير الداخلي يخلق مضان غير المراعية أن يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR).
وهناك اعتبار آخر هو معدل نضوج حاملات الشكل 3 يظهر التفاوت في مضان من chromoph متقبلخام (mRuby2) التي لديها وقت نضوج أطول من حامل اللون المانحة (البرسيم).
الشكل 3. الصور متحد البؤر كلوة 293 خلايا Transfected عابر مع القائم GEVI الحنق، Nabi2.242. (A) صور متحد البؤر من خلية كلوة تظهر غشاء مضان المترجمة من الحنق المانحة ومتقبل، (B) صور متحد البؤر تظهر النتائج المحتملة لل النضج البطيء لmRuby2. جميع الخلايا الأربعة يحمل البرسيم مضان في حين أن اثنين فقط معرض mRuby2 مضان. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم الحصول على الصور عن طريق المجهر متحد البؤر. للمتبرع الحنق، البرسيم، تم استخدام 488 نانومتر ليزر لالإثارة والكابتن انبعاثمحكم مع 525/50 نانومتر ممر الموجة مرشح. متقبل الحنق، mRuby2، كانت مضاءة مع 561 نانومتر ليزر لالإثارة و595/50 نانومتر ممر الموجة مرشح كان يستخدم لالانبعاثات. كانت ثابتة العينات للتصوير مبائر مع 4٪ لامتصاص العرق الحل / السكروز في الفوسفات مخزنة المالحة تعديل في درجة الحموضة 7.4 ثم شنت مع كاشف مكافحة تتلاشى.
مرة واحدة يتم تحسين ظروف ترنسفكأيشن، مصدر القادم من الاختلاف يأتي من تحديد المنطقة ذات الاهتمام ليتم تحليلها. باستخدام إطار الطرح لتحديد مناطق الخلية التي تحتوي على أعلى التغيير مضان غالبا ما تستخدم لتعظيم قيمة ΔF / F. والبديل هو اختيار كل من بكسل تلقي الضوء من الخلية. وهذا يزيد من عدد من بكسل مما أدى إلى الحد من الضوضاء، ولكن يقلل من حجم إشارة منذ يتم تضمين مضان الداخلي غير متجاوب. كلتا الطريقتين هي الغرامة ما دام المجرب ثابت.
الشكل 4. الجهد التصوير مع FP القائم GEVI واحد أعربت عنفي كلوة 293 الخلايا والحصين الابتدائية الخلايا العصبية. (A) ΔF / F أثر واحد FP أساس GEVI، Bongwoori، والتي تبين الردود على نبضات الجهد صعدت سجلت في 1 كيلو هرتز مع كاميرا CCD عالية السرعة. (ب) كلوة 293 خلية تصوير مع كاميرا CCD سرعة عالية؛ (يسار) يستريح ضوء الكثافة (مؤشر القائمة الحمراء) من خلية معربا عن Bongwoori و(يمين) في الطرح صورة إطار تشير إلى بكسل حيث لوحظ تغيير مضان. (ج) تسجيل البصري من إمكانات العمل الناجم من الماوس الخلايا العصبية الأولية الحصين معربا عن Bongwoori. وقد أثار إمكانات العمل في إطار خلية كاملة وضع المشبك الحالي. وقد تم اختيار التتبع ΔF / F من بكسل ربطها سوما. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وفلوو تمثيليويظهر قراءات rescence من الجهات المانحة ومتقبل حاملات في الشكل 5A. قطبية التغيير مضان هو الآخر للالمانحة ومتقبل تمكين تحليل ratiometric للحد من مصادر الضوضاء المترابطة، على سبيل المثال، حركة. على سبيل المثال، فإن حركة المترابطة الضوضاء يحمل تغييرا في مضان في نفس الاتجاه لكلا المانحة ومتقبل مضان. في حين أن التحقيق يستند الحنق قادر على التصوير ratiometric، غالبا ما يكون أفضل لتحليل فقط حامل اللون أكثر إشراقا. وذلك لأن حامل اللون باهتة يمكن أن تزيد بشكل كبير من الضوضاء من التسجيل. الشكل 5B يظهر هذا التأثير. الطرح الإطار في الشكل 5B من أكثر إشراقا البرسيم يظهر بوضوح حيث تكون الإشارة الضوئية هي في الخلية. في المقابل، فإن الطرح إطار mRuby2 مضان يظهر درجة عالية من الضوضاء في جميع أنحاء الخلية. لذلك، لا يظهر فقط إشارة من الجهات المانحة من البرسيم في الخلايا العصبية قرن آمون في فايجوري 5C.
الرقم 5. الجهد التصوير مع الحنق على أساس GEVI أعرب في كلوة 293 خلية والخلايا العصبية الأولية الحصين. (A) ΔF / F أثر لGEVI الحنق القائم، Nabi2.242، والتي تبين الردود على اثنين من الأطوال الموجية لنبضات الجهد صعدت سجلت في 1 كيلو هرتز مع كاميرا CCD عالية السرعة. (ب) الأعلى. الجهة المانحة (البرسيم-مؤشر القائمة الحمراء، البرسيم الإطار الطرح) ومتقبل (mRuby2-مؤشر القائمة الحمراء، mRuby2 الإطار الطرح) الصور المجهزة مع اثنين من عتبات مختلفة لكل FP، أسفل. تم استخدام نفس العتبة بالنسبة لكل من الجهات المانحة (البرسيم-مؤشر القائمة الحمراء، البرسيم الإطار الطرح) ومتقبل (mRuby2-مؤشر القائمة الحمراء، mRuby2 الإطار الطرح) وصور لتوضيح الخفوت النسبي للmRuby2. وقد تم نقل كل الصور من نفس كلوة 293 خلية معربا عن Nabi2.242. (ج) 520 نانومتر الطول الموجي آرالآس إمكانات العمل الناجم من ماوس الخلايا العصبية الأولية الحصين معربا عن استشعار Nabi2.244. وقد تم اختيار التتبع ΔF / F من بكسل ربطها سوما. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. النتائج المترتبة على مستويات متفاوتة الخفيفة لΔF وΔF / F القيم. (A) صورة من كلوة 293 خلية التعبير عن واحد FP أساس GEVI، Bongwoori، أظهرت في يستريح ضوء الكثافة (مؤشر القائمة الحمراء)، (ب) آثار مضان وبلغ متوسط تظهر النواة ΔF (F س -F 0) القيم من ثلاث مناطق مختلفة، والمنطقة 1: منطقة الغشاء مع إشارة مضان المحلية بشكل جيد، والمنطقة 2: منطقة مع مضان داخلي مشرق، وهيد المنطقة 3: منطقة بعيدة عن إشارة ضوئية، (ج) آثار مضان تظهر نواة متوسط القيم ΔF / F من نفس المناطق في (ب). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المفاهيم | معادلات | تعليق |
| التغيير مضان كسور (ΔF / F) |  | F 1 = قياس شدة الضوء في نقطة زمنية، F 0 = قياس شدة الضوء في إمكانية عقد |
| وظيفة بولتزمان |  | ذ = ΔF / F، V = غشاء المحتملة في بالسيارات، والخامس 1/2 هو غشاء المحتملة في بالسيارات في نصف القصوى ΔF / F، A |
| وظيفة مزدوجة تسوس الأسي | ذ = ذ 0 + A 1 ه - (ر - ر 0) / τ 1 + A 2 ه - (ر - ر 0) / τ 2 | τ 1، τ 2 = الثوابت الوقت، A 1، A 2 = سعة، ر، ر 0 = نقطتين الوقت، ص 0 = تعويض |
الجدول 2. المعادلات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يستخدم الجهاز العصبي الجهد في عدة طرق مختلفة، وتثبيط يسبب فرط طفيف، ومدخلات متشابك يؤدي إلى الاستقطاب طفيف والعمل النتائج المحتملة في تغيير الجهد الكبير نسبيا. القدرة على قياس التغيرات في غشاء المحتملة التي كتبها GEVIs توفر إمكانات واعدة من تحليل العديد من مكونات الدوائر العصبية في وقت واحد. في هذا التقرير ونحن لشرح طريقة أساسي لإجراء تغييرات التصوير في غشاء المحتملة باستخدام GEVIs.
مفتاح رئيسي للتغييرات التصوير في الجهد هو التعبير الفعال للGEVI في غشاء البلازما. التعبير داخل الخلايا يخلق مضان غير المراعية أن يقلل من SNR لجنة التحقيق. تحسين الظروف ترنسفكأيشن يحسن إلى حد كبير اتساق القياسات البصرية. في الواقع، عند اختبار GEVI رواية فإنه من المستحسن لاختبار أيضا التحقيق معروفة للتأكد من أن الاختلافات في النشاط البصري ومن المقرر بالكامل لشمال شرقالتحقيق ث وليس شروط الخلايا.
ويبين الشكل 6 تأثير مضان الداخلي في خفض حساسية التصوير الجهد، قيمة ΔF / F. ويبين الشكل 6B ΔF القيم خلية كلوة معربا عن GEVI واحد-FP القائم، Bongwoori. تتبع 2 يأتي من المنطقة 2 (اللون الأزرق) حيث ينظر مضان الداخلي مشرق نسبيا في الشكل 6A. هذا التتبع لديها مستوى مماثل من قيمة ΔF كما أثر 1. ومع ذلك، في الشكل 6C حيث تم تقسيم آثار في الشكل 6B من قيم مؤشر القائمة الحمراء للقيم ΔF / F، تتبع 2 قطرات بشكل كبير بسبب مضان الداخلي مشرق مما يقلل ΔF / F القيم. مضان التتبع 3 لديه ΔF صغير جدا ولكن أيضا لديه قيمة مؤشر القائمة الحمراء الصغيرة جدا (F). والنتيجة هي ΔF / مضلل F إشارة إلى أن لديه زيادة كبيرة في ضجيج تسجيل. أدرج هذا المثال للتدليل على ΔF أيضاأهمية. تغيير كبير في ΔF / F ليست مفيدة إذا F منخفضة جدا لتبدأ.
استخدام الخائن صورة يمكن قياس ما يصاحب ذلك من موجتين على كاميرا CCD واحدة. وهذا يساعد بشكل كبير على قياس الحنق التغييرات الفلورسنت تعتمد للتنمية التحقيق ويقلل من تكلفة الإعداد. ومع ذلك، بسبب انحراف لوني، وهذه الصورتين يكون قليلا من التركيز مما يستدعي ضرورة وجود هدف لامزيغة. لمزيد من الضوء على أفضل SNR، وذلك باختيار الأهداف وفقا لأعلى الفتحة العددية كما يحسن التصوير مضان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن استخدام مصادر الضوء القوية مثل الثنائيات الباعثة للضوء (LED) أو الليزر لزيادة SNR. المصابيح لا تحتاج إلى مفتاح ميكانيكي.
في هذا التقرير نقدم لك مجموعة من الإشارات الضوئية من FP GEVI واحد وGEVI القائم على الحنق. والميزة الرئيسية لGEVI القائم على الحنق هو أن التصوير ratiometric يمكن الحد من الضوضاء مترابطة درق إلى التنفس وتدفق الدم في الجسم الحي. التقاطب عكس الاشارات الفلورسنت يؤكد وجود تغيير حقيقي في غشاء المحتملة. ومع ذلك، منذ كثافات مضان من حاملات هما غالبا ما تتفاوت تفاوتا كبيرا، فإن SNR تختلف أيضا. هذا يفند تحليل ratiometric ويحد من فائدته 28. ويمكن أيضا أن يكون هناك المستقلة الحنق إشارة 29. ولذلك فمن الأفضل في بعض الأحيان لاستخدام فقط في حامل اللون أكثر إشراقا الفلورسنت عند استخدام الحنق لتحليل التغيرات في غشاء المحتملة.
التصوير الجهد أكثر صعوبة من التصوير الكالسيوم نظرا لسرعة وتنوع التغيرات في غشاء المحتملة مقارنة التصوير الكالسيوم الذي يقيس تدفق الكالسيوم. التغييرات غشاء المحتملة في جداول زمنية سريعة جدا بالمقارنة مع تدفق أيونات الكالسيوم، والأحداث دون العتبي في الخلايا العصبية لا يمكن قياسها مع التصوير الكالسيوم 30. وعلاوة على ذلك، يجب أن يكون التحقيق الجهد في الغشاء البلازميأن تكون فعالة مما يقلل من كمية من مسبار المتاحة للتغيرات تقرير بصريا في غشاء المحتملة. وبالتالي، فإن عدد الفوتونات التي يمكن أن تصل فعلا في رقاقة CCD هو قليل نسبيا. وهذا يتطلب الحاجة إلى السرعة العالية والمنخفضة كاميرا للقراءة الضوضاء مع كفاءة الكم عالية والتحقيق الذي يتسبب في ارتفاع SNR على تغيرات في غشاء المحتملة. عن طريق التصوير الخلايا في المختبر، والباحثين على فهم أفضل لفوائد ومخاطر محتملة من GEVIs قبل محاولة في قياسات الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
- Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
- Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
- Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
- St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
- Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
- Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
- Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
- Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
- Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
- Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
- Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
- Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
- Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
- Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
- Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
- Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
- Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).
