Introduction
Het hoofddoel van dit artikel is het optische beeldvorming van veranderingen in membraanpotentialen in vitro gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen demonstreren. Imaging veranderingen in membraanpotentiaal biedt de spannende mogelijkheid bestuderen van de activiteit van neuronale circuits. Wanneer veranderingen in membraanpotentiaal resulteren in een verandering fluorescentie-intensiteit, elke pixel van de camera wordt een surrogaat elektrode waarmee nonintrusive metingen van neuronale activiteit. Al meer dan veertig jaar, hebben organische voltage-gevoelige kleurstoffen die bruikbaar zijn voor het observeren van de veranderingen in de membraanpotentiaal 1-4 geweest. Echter, deze kleurstoffen gebrek cellulaire specificiteit. Bovendien zijn sommige celtypen moeilijk te bevlekken. Genetisch gecodeerde spanningsindicatoren (GEVIs) deze beperkingen te ondervangen doordat de cellen specifiek te bestuderen drukken de fluorescerende spanningsgevoelige probe.
Er zijn drie klassen van GEVIs. De eerste klasse van GEVI maakt gebruik van de voltage-sensing domein van de spanning sensing fosfatase met ofwel een enkel fluorescerend eiwit (FP) 5-9 of een Förster resonance energy transfer (FRET) paar 10-12. De tweede klasse van sensoren maakt gebruik van microbiële rhodopsine als een fluorescerende indicator rechtstreeks 13-15 of via elektrochrome FRET 16,17. De derde klasse gebruikt twee componenten, de genetische component een membraan verankerd FP en een tweede component een membraan gebonden kleurstof 18-20 quenching. Terwijl de tweede en derde klassen zijn bruikbaar voor in vitro experimenten en slice 19,20, alleen de eerste klasse van sensoren zijn bruikbaar voor in vivo analyses 6.
In dit verslag wij de beeldvorming van membraanpotentiaal tonen met de eerste klasse van GEVIs (figuur 1) in vitro. Dit eersteklas spanningssensoren is het makkelijkst om de overgang in vivo beeldvorming. Sinds GEVIs utilizing een spanningsgestuurde sensing domein gefuseerd aan een FP zijn ongeveer 50 maal helderder dan de rhodopsine klasse van sensoren, kunnen worden afgebeeld met behulp booglamp verlichting plaats van dat een zeer krachtige laser. Een ander gevolg van het verschil in helderheid dat de eerste klasse van GEVIs gemakkelijk de auto-fluorescentie van de hersenen kan overschrijden. De rhodopsine gebaseerde probes kan niet. De derde klasse van sensor even helder als de eerste klasse, maar vereist de toevoeging van een chemisch quencher die moeilijk toe te dienen in vivo.
Wij demonstreren daarom het verkrijgen van een probe met één FP (Bongwoori) 8 en een probe bestaande uit een FRET paar (Nabi 2) 12. De FRET construeert in dit rapport zijn vlinder versies van VSFP-CR (voltage-gevoelige fluorescerende eiwitten - Clover-mRuby2) 11, bestaande uit een groen fluorescerend donor, Clover, en een rode fluorescerende acceptor, mRuby2, genaamd Nabi 2,242 en 2,244 Nabi 
Figuur 1. Twee soorten genetisch gecodeerde Voltage Indicators (GEVIs) Bedrukte in dit rapport (A) Een mono FP gebaseerd GEVI met een trans-membraan-voltage sensing domein en een fluorescerend eiwit. (B) A FRET gebaseerd GEVI bestaat uit een trans-membraan-voltage sensing domein, een FRET donor en acceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Het experiment dier protocol werd bij KIST dier protocol 2014-001 goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. apparatuur Setup
- Imaging setup
- Plaats een omgekeerde fluorescentie microscoop op een trillingsisolatie tafel. Gebruik een hoge vergrotingsfactor (60X olie-immersie objectief met 1,35 numerieke lensopening) objectief en een filter kubus uitgerust met een dichroïsche spiegel en filters die geschikt zijn voor de fluorescente eiwitten die gebruikt worden voor de spanning beeldvorming.
Opmerking: Deze opstelling maakt gebruik van een omgekeerde microscoop om doelstellingen dienst met hogere NA, maar rechtop microscopen kunnen ook worden gebruikt. Inderdaad, de geïnverteerde microscoop is voor ontwikkeling probe daar een grotere numerieke apertuur (NA) objectieflens verzamelt meer licht dan die met een lage NA waardoor de signaal-ruisverhouding (SNR te verbeteren, kan worden omschreven als de piek optische signaal gedeeld door de standaardafwijking van de basislijnfluorescentie) van de opname. Voor niet-ontwikkelaars, zouden we een rechtopstaande microscoop voor toepassingen zoals stuk of in vivo opname aanbevolen. - Bereid een lichtbron, bijv., Xenon booglamp, uitgerust met een mechanische sluiter voor efficiënte epifluorescentie wide-field imaging. Richt het licht aan de microscoop via een lichtgeleider te monteren. Het licht zal door de excitatie- filter en wordt gereflecteerd door de eerste dichroïsche spiegel in het filter kubus. Lijn het licht om het monster gelijkmatig verlichten met maximale lichtintensiteit boven het gezichtsveld 21.
Let op: Traditioneel werd een 75 watt booglamp gebruikt sinds hoger wattage gloeilampen te maken groter, maar niet helderder verlichting velden. Lasers kunnen worden gebruikt, maar zijn beperkt tot een enkele golflengte. LED's worden steeds helderder en kan inderdaad de lichtbron van de keuze aanbieden van meerdere golflengtes en niet verplichten tot een mechanische sluiter zijn. - Monteer de twee CCD-camera's om de tllingen microscoop zoals in Figuur 2D.
Opmerking: De eerste CCD camera heeft een hoge ruimtelijke resolutie en wordt gebruikt voor de identificatie van een cel die de GEVI in het plasmamembraan te testen. Voor grafische veranderingen in de membraanpotentiaal, ervoor te zorgen dat de tweede CCD camera heeft een hoge framerate, zoals 1000 frames per seconde (fps). Gebruik een dual port camera adapter (figuur 2D (3)) naar de beeldvorming pad schakelen tussen de twee CCD-camera's. In deze opstelling wordt een demagnifier gebruikt om het beeld van het objectief past op de CCD chip in de tweede CCD camera. - Installeer een beeld splitser tussen de eerste (traag) en tweede (snel) CCD camera's voor beeldvorming van FRET gebaseerde GEVI. Plaats een filter kubus met een dichroïsche spiegel (560 nm) en twee emissie-filters (520 nm / 40 en 645 nm / 75) in de afbeelding splitter. Dit zal resulteren in twee velden gezien, één voor de donor fluorescentie en de andere die de acceptor fluorescentie. Verwijder deze second filter kubus wanneer het afbeelden van een GEVI met een enkele FP.
Opmerking: De single FP gebaseerd GEVI getest in deze methode is Bongwoori waarop de FP, super ecliptica pHluorin A227D (SE A227D) gebruikt. De excitatie filter (472 nm / 30), emissiefilter (497 nm / lange pass) en de dichroïsche spiegel (495 nm) werden geselecteerd op basis van de excitatie- en emissiespectra 5. In het algemeen moet de excitatie en emissie filters de grootste overlap bij elk spectrum van de fluorofoor om een helder beeld te verkrijgen terwijl de dichroïsche spiegel blokkeert excitatielicht via uitstralingsfilter verstrekte. De selectie van filters en dichroïsche spiegels voor het FRET paar 11 gebaseerd GEVI opname volgt hetzelfde principe, behalve dat het noodzakelijk een tweede filter kubus in het beeld splitter voor gelijktijdige waarneming van donor en acceptor fluorescentie. Het eerste filter kubus geplaatst in het vak microscoop filter aan een excitatie filter (475 nm / 23) voor klaver hebben. Dan is de uitgezonden fluorescence Beide KP wordt door de eerste dichroïsche spiegel (495 nm) naar de tweede filter kubus toegezonden. De tweede filter kubus heeft een dichroïsche spiegel (560 nm) en twee emissie-filters (520 nm / 40 voor Clover en 645 nm / 75 voor mRuby2) voor elk FP waardoor de fluorescentie van twee verschillende KP's scheiden.
- Plaats een omgekeerde fluorescentie microscoop op een trillingsisolatie tafel. Gebruik een hoge vergrotingsfactor (60X olie-immersie objectief met 1,35 numerieke lensopening) objectief en een filter kubus uitgerust met een dichroïsche spiegel en filters die geschikt zijn voor de fluorescente eiwitten die gebruikt worden voor de spanning beeldvorming.
| Single FP gebaseerde GEVI (Bongwoori) | FRET paar gebaseerd GEVI (Nabi 2,42 & Nabi 2,44) | ||
| Eerste filter kubus geplaatst in de microscoop | excitatie filter | 472 nm / 30 | 475 nm / 23 |
| dichroïsche spiegel | 495 nm | 495 nm | |
| emissie-filter | 497 nm / lange pass | - | |
| Tweede filter kubus geplaatst in de bundelsplitser | dichroïsche spiegel | - | |
| emissie-filter 1 | - | 520 nm / 40 | |
| emissie-filter 2 | - | 645 nm / 75 |
Tabel 1. Twee Verschillende Filter Sets gebruikt voor een enkele FP Gebaseerd GEVI en een FRET Based GEVI Recordings
- trillingsisolatie
- Niet bevestigen alle apparatuur met bewegende onderdelen op het trillingsisolatie tafel. Zorgen dat de kabels die zijn aangesloten op niet-geïsoleerde apparatuur los trillingen van het monster te voorkomen.
- Patch clamp kamer
- Dicht de bodem van de patch clamp kamer met een dunne # 0 dekglas omdat de werkafstand van het objektief relatief klein. Dit is een nadeel van de omgekeerde microscoop setup.
Opmerking: Als een afweging van de hoge NA objectieflens, de werkafstand afneemt. Om de specimens te plaatsenen binnen zeer korte werkafstand, het dekglaasje en het dekglaasje (stap 2) dient zo dun mogelijk te zijn.
- Dicht de bodem van de patch clamp kamer met een dunne # 0 dekglas omdat de werkafstand van het objektief relatief klein. Dit is een nadeel van de omgekeerde microscoop setup.
- Temperatuurregeling
- Zorg ervoor dat het bad oplossing stroomt door een temperatuurregelaar aan de patched-cellen rond te behouden 33 o C gedurende het experiment.
- apparatuuraansluitingen
- Sluit de patch clamp versterker en de mechanische sluiter van de lichtbron om de Bayonet Neill-Concelman (BNC) commando doos van de high speed CCD-camera. Dit zal de beeldvormende software in staat stellen de versterker camera en de lichtbron tegelijk bedienen.
Opmerking: De elektrische en imaging componenten moeten worden gesynchroniseerd om te zorgen voor gelijktijdige elektrische en optische opnames van elektrische activiteit.
- Sluit de patch clamp versterker en de mechanische sluiter van de lichtbron om de Bayonet Neill-Concelman (BNC) commando doos van de high speed CCD-camera. Dit zal de beeldvormende software in staat stellen de versterker camera en de lichtbron tegelijk bedienen.
Figuur 2. Equipment Setup voor Voltage Imaging met GEVIs De workflow volgt het lichtpad, (A) 75W Xenon booglamp, (B) de excitatie licht van de booglamp wordt gefilterd door de excitatie filter en vervolgens gereflecteerd door de eerste dichroïsche spiegel voordat het tot aan het monster podium, een inzet op de rechterbovenhoek toont de gehele cel configuratie (C) de lage snelheid CCD-camera wordt gebruikt om zowel de keuze van een cel en patch clamp hulp, (D) het beeld overname deel; (1) de hoge snelheid CCD camera, (2) het beeld splitter voor zowel FRET koppelen en mono FP GEVIs, (3) de demagnifier om het beeld te passen op de CCD chip in de high speed CCD-camera, (4) de dubbele poort camera-adapter aan de beeldvorming route en (5) de lage snelheid CCD camera met een hoge ruimtelijke resolutie te schakelen voor de identificatie van de cel patch, (E & F) het beeld acquisitie met een single-FP gebaseerde GEVI (E) en een op FRET gebaseerde GEVI(F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Expressie van GEVIs
- In menselijke embryonale nier 293-cellen
- Cultuur humane embryonale nier 293 (HEK 293) cellen met Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 ° C in een CO2-incubator (5% CO2). Gebruik een weefselkweekplaat van 100 mm diameter en 20 mm hoogte. Start de kweek met 2 x 3-6 oktober x 10 3 cellen / cm2 en geïncubeerd totdat zij 80-90% confluentie voor daaropvolgende transfectie bereikt.
- Op de dag van transfectie zuig het celmedium en voorzichtig was eenmaal met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing. Verspreiden de HEK 293-cellen met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 1-2 minuten, zuigen de oplossing en tik zachtjes tegen de schotel naar de c losells. Voeg verse DMEM (10% FBS) en distantiëren van de samengeklonterd cellen door pipetteren. Bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer.
- Place 0,08-0,13 mm dik, 10 mm dekglaasjes vooraf bekleed met poly-L-lysine in een 24-well weefselkweekplaat. Zaad de HEK 293 cellen op dekglaasjes in 1 x 10 5 cellen / cm 2 celdichtheid.
Opmerking: Aangezien HEK 293-cellen kan vormen gap junctions met elkaar zijn, het aantal zaden moet geïsoleerde cellen werd verkregen. - Tijdelijk transfecteren van de cellen met een geschikt genconstruct dat codeert voor een GEVI door een lipofectie reagens volgende instructies van de fabrikant.
Opmerking: De genconstructen gebruikt voor deze stap gebruikt pcDNA3.1 (Bongwoori) en pUB2.1 (Nabi 2,242) als backbone vectoren. De hoeveelheid gebruikte DNA was 100 ng per dekglaasje; moeten echter transfectie omstandigheden empirisch bepaald worden voor elke GEVI te testen.
- In gedissocieerde muis hippocampal primaire neuronen
- Ontleden hippocampus uit embryonale dag 17 C57BL6 / N muizen en vervolgens het dissociëren hippocampale neuronen zoals eerder beschreven 22,23.
- De plaat gedissocieerd neuronen op met poly-D-lysine beklede 0,08-0,13 mm dik, 10 mm dekglaasjes in 1 x 10 5 cellen / ml celdichtheid. Incubeer de cellen bij 37 o C CO 2 incubator (5% CO2).
- Het transfecteren gedissocieerd neuronen tijdelijk op 6-7 dagen in vitro (DIV) met een genconstruct dat codeert voor een GEVI door calciumfosfaat transfectie reagens zoals eerder beschreven 24.
Opmerking: De genconstructen voor deze stap gebruikt pcDNA3.1 (Bongwoori) en pUB2.1 (Nabi 2,244) als backbone vectoren. De hoeveelheid gebruikte DNA was 1 ug per dekglaasje. Ook hier moet transfectie omstandigheden empirisch bepaald voor elke geteste GEVI zijn.
- Controleer de expressie niveau van voor spanning imaGing
- Neem de weefselkweek plaat uit de CO 2 incubator en let op de fluorescentie van de getransfecteerde cellen onder een epifluorescentiemicroscoop.
- Na bevestiging van de fluorescentie van het membraan, de overdracht van de dekglaasje aan de patchen kamer voor de spanning beeldvorming in hoofdstuk 3.
Opmerking: De spanning beeldvorming wordt uitgevoerd 16-24 uur na transfectie. Echter, zoals verschillende fluorescerende eiwitten hebben verschillende rijpen tijden, wat GEVIs hebben meer tijd nodig in post transfectie. Zo kan de FRET paren die mRuby2 in dit protocol langer uit te drukken, omdat de rijping van mRuby2 significant langer duurt dan 11 klaver. De fluorescentie van donor en acceptor worden gecontroleerd.
3. Voltage Imaging Protocol
- Kies een gezonde cel met goede membraan expressie
- Microscopische, vindt een gezonde cel (figuur 4B) die sterk toontgelokaliseerde fluorescentie in vergelijking met interne fluorescentie. Probeer afgeronde cellen niet te patchen. Cirkelvormige cellen worden ofwel verdelen of stervende en zijn moeilijk te patchen. Breng een testpuls van 5,0 mV in amplitude en 5,0 msec in duur tot de volgende patch clamp experimenten te helpen.
- Bereid de cel spanning imaging
- Na het kiezen van een cel patch, plaatst u de patch clamp pipet boven de cel. Breng de pipet naar beneden totdat deze net tegen de celmembraan. Bij deze stap acht 1 MQ - 2 MQ toename membraanweerstand de patch clamp 25 software.
LET OP: soms kan een goede giga-ohm afdichting simpelweg gebeuren door het aanraken van het celmembraan. Zolang het giga-ohm afdichting stabiel is, moet het OK. - Opzetten van een giga-ohm afdichting door voorzichtig het toepassen van negatieve druk door de pipet. Stel de pipet potentiaal op een gewenste potentiaal te houden.
- Met behoud van de giga-ohm afdichting, afbeelding the cel met de high speed CCD-camera en de focus aan het membraanoppervlak.
- Scheuren het celmembraan door het toepassen van pulsen van zuiging via de mond of de spuit voorzichtig om een hele cel configuratie 26 te maken.
- Het imago van de patch geklemd cel onder een gehele cel clamp-configuratie op basis van de experimenteel ontwerp met behulp van een imaging software
- Start de imaging software. Klik [ACQUIRE] - menu [SciMeasure Camera] om het openstellen van de 'CCD ACQUIRE' pagina.
- Maak een nieuw gegevensbestand om de beelden op te slaan.
- Klik [analoge uitgang] en vervolgens [Lees een ASCII] het openen van een puls protocol bestand naar de beeldvorming te voeren. Klik op 'het gemiddelde van de interne herhalingen' als de gegevens moeten worden gemiddeld. Sluit vervolgens de 'Analoge uitgang' pagina.
Opmerking: Deze puls protocol moet worden ontworpen en opgeslagen als een ".txt" map volgens het doel van elke proef voorafgaand aan deze stap. - Stel specifieke acquisvulle parameters uit de 'CCD ACQUIRE' pagina. Voer de specifieke waarden voor 'Aantal frames voor overname' en 'Aantal trials'.
Opmerking: Het aantal frames wordt bepaald door de snelheid van de verwerving en de timing van de puls protocol. Als bijvoorbeeld beeldvorming bij 1 kHz, 1000 frames gelijk aan 1 seconde opnametijd. - Klik [NEMEN GEGEVENS (Optics + BNC)] knop om de opname te starten. Terwijl de spanning beeldvorming plaatsvindt, kijken naar de oscilloscoop venster van de patch clamp software om stabiele whole cell configuratie in de gehele opname.
Opmerking: Om de GEVI's responsieve spanningsbereik testen, signaal grootte in AF / F-waarde of temporele resolutie in de hele fysiologische spanningsbereik, voeren een volledige cel voltage clamp experiment met een puls protocol te hebben stapte spanningspulsen variërend van -170 mV tot 130 mV. Om de prestaties van de GEVI te bepalen bij het oplossen van actiepotentialen opgewekt uit gekweekte primary neuronen, imago van de cel onder een whole cell stroomtang configuratie.
- Na het kiezen van een cel patch, plaatst u de patch clamp pipet boven de cel. Breng de pipet naar beneden totdat deze net tegen de celmembraan. Bij deze stap acht 1 MQ - 2 MQ toename membraanweerstand de patch clamp 25 software.
4. Data Acquisition
- Berekening van de AF / F
- Start de imaging software. Klik op [FILE] - [Read Data File] om het openen van een bestand te analyseren. Let op de afbeelding cel in haar Resting Light Intensity (RLI) aan de rechterzijde
Opmerking: De software gemiddelde eerste 5 frames RLI bepalen van de opname. - Klik op 'Toon BNCs' om de stroom en spanning gemeten waarden naar het scherm te brengen.
- Wijzig de pagina-modus van 'RLI kader' naar 'Frame aftrekken' aan het frame aftrekken functie gebruiken om pixels met responsieve optische signalen te identificeren. Dit is de ware kracht van beeldvorming omdat elke pixel mogelijke veranderingen in fluorescentie kan worden onderzocht.
- Selecteer twee keer punten (F 0 en F 1) voor het aftrekken. Tot welk gebied van de celgeeft signalen reagerend op potentiaalverandering membraan.
Opmerking: De SNR voor het frame subtractiebeelden kan worden verbeterd door meerdere frames voor elk tijdstip temporeel gemiddelde van het signaal. De software trekt de gemiddelde lichtsterkte genomen van geselecteerde frames en berekent de F-1-F 0-waarden (AF). Meestal kiest men een tijdstip verworven bij de holding potentieel en een ander tijdstip genomen tijdens de stimulatie periode. - Duiden de pixels die moeten worden geanalyseerd door slepen of klikken elke pixel met de computermuis. Neem de grafische weergave van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de geselecteerde pixels aan de linkerzijde van het softwarevenster. Figuren 4B en 5B tonen representatieve beelden van het frame aftrekken analyse.
- Verdeel de afgetrokken pixels door de RLI (F 0). Klik [Divide door RLIs] om AF / F-waarden te verwerven
- Start de imaging software. Klik op [FILE] - [Read Data File] om het openen van een bestand te analyseren. Let op de afbeelding cel in haar Resting Light Intensity (RLI) aan de rechterzijde
- export data
- Verwijder stroom en spanning grafieken door los te klikken menu 'Toon BNCs'. Ga naar [OUTPUT] - [Save Traces Zoals getoond (ASCII)] om de fluorescentie spoor te exporteren in een ASCII-bestandsformaat voor curve fitting analyse door middel van standaard grafische software.
5. Data Analysis
- Spanning sensing eigendom van de GEVI
- Teken de fluorescentie verandering versus spanning grafiek (FV) door het uitzetten van de AF / F-waarden ten opzichte van de spanning in een data-analyse programma. Breng de curve naar een Boltzmann functie (tabel 2) aan het spanningsbereik van het optische signaal te bepalen door te klikken op [Analyse] - [Fitting] - [sigmoïdale fit] - [Open dialoogvenster] en kies vervolgens Boltzmann functie.
Opmerking: Montage om een functie maakt het mogelijk te bedienene de spanningsdetectie eigenschappen van verschillende spanning probes te karakteriseren of om hun prestaties te vergelijken in verschillende cellen. De functie Boltzmann kan worden gebruikt voor de testen in dit document sondes omdat de FV krommen van deze probes vertonen sigmoïdale patroon. - Normaliseren elk AF / F-waarde met behulp van de eerste en laatste waarden (A 1 en A 2), berekend door de functie.
Opmerking: In de Boltzmann vergelijking, het minimum is A 1 en het maximum is A 2. Voor normalisatie, gebruik maken van een spreadsheet-applicatie software om de AF / F waarden aan te passen door het definiëren van A 1 als nul en A 2 als één. Het gemiddelde van de genormaliseerde AF / F-waarden en bereken standaardafwijking voor statistische analyse. - Replot de genormaliseerde AF / F-waarden versus spanning zoals eerder beschreven in paragraaf 5.1.1).
- Teken de fluorescentie verandering versus spanning grafiek (FV) door het uitzetten van de AF / F-waarden ten opzichte van de spanning in een data-analyse programma. Breng de curve naar een Boltzmann functie (tabel 2) aan het spanningsbereik van het optische signaal te bepalen door te klikken op [Analyse] - [Fitting] - [sigmoïdale fit] - [Open dialoogvenster] en kies vervolgens Boltzmann functie.
- De snelheid van de optische respons
- Open het ASCII-bestand overgenomen van stap 4.2.2) met een data-analyseprogramma en plot van de AF / F spoor tegen de tijd.
- Op 'Data selector in de data-analyse software en selecteer een tijdstip corresponderend met het begin van een getrapte spanningspuls en een tweede tijdstip waarop het lichtsignaal de stationaire toestand bereikt. Breng dit bereik om zowel een enkele en dubbele exponentieel verval functie door te klikken op [Analyse] - [Fitting] - [exponentiële fit] - [Open dialoogvenster], en kies een exponentiële verval functie. Rapporteer de betere pasvorm.
Opmerking: Door het aanbrengen van de enkele of dubbele exponentieel verval functies, kan de gekwantificeerde tijdconstanten vertegenwoordigd door τ worden verworven. Dit zal helpen onderzoekers vergelijken de kinetiek van hun metingen gedaan met verschillende voltage indicatoren. De fluorescentie trace kan snelle en langzame componenten die kunnen worden beschreven met een dubbele exponentiële vervalfunctie tonen. In dit geval zal de berekening resulteren in twee tijdconstanten met verschillende amplitudes. - Bereken the gewogen τ constanten om de kinetiek van probes vertonen twee tijdelijke componenten om probes met een enkele component te vergelijken.
Opmerking: Een gewogen tau wordt berekend als de som van τ 1 vermenigvuldigd met de relatieve amplitude A 1, plus τ 2 vermenigvuldigd met de relatieve amplitude, A 2, zoals gedefinieerd door de volgende formule;
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transient getransfecteerde cellen kunnen aanzienlijke verschillen in fluorescentie-intensiteit en de mate van plasmamembraan expressie vertonen. Zelfs op dezelfde dekglaasje sommige cellen variërende niveaus van interne fluorescentie hebben. Dit komt waarschijnlijk door de hoeveelheid transfectie agens opgenomen door de cel. Af te veel expressie veroorzaakt de cel ongevouwen eiwit die resulteert in apoptose 27 ervaren (helder, ronde cellen met hoge inwendige fluorescentie). De experimentator daarom gewaarschuwd om zowel heldere cellen en dim cellen te testen met zo weinig mogelijk interne fluorescentie omdat met expressie creëert een niet-reagerend fluorescentie die de signaal-ruisverhouding (SNR) verlaagt.
Een andere overweging is de snelheid van rijping chromoforen. Figuur 3 toont verschil in fluorescentie van de acceptor chromopherts (mRuby2) die een langere rijping tijd dan de donor chromofoor (Klaver) heeft.
Figuur 3. Confocale afbeeldingen van HEK 293 cellen tijdelijk getransfecteerd met een FRET gebaseerde GEVI, Nabi2.242. (A) confocale beelden van een HEK cellen toont gelokaliseerde fluorescentie van FRET donor en acceptor, (B) confocale beelden die een mogelijk gevolg van langzame rijping van mRuby2. Alle vier cellen vertonen Clover fluorescentie terwijl slechts twee tentoonstelling mRuby2 fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De beelden werden verworven door een confocale microscoop. Voor de FRET donor, Clover, 488 nm laser werd gebruikt voor excitatie en de emissie werd CAPTgureerd met 525/50 nm banddoorlaatfilter. De FRET acceptor, mRuby2, werd verlicht met 561 nm laser voor excitatie en 595/50 nm banddoorlaatfilter werd gebruikt voor de emissie. De monsters voor confocale beeldvorming werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde / sucrose oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing op pH 7,4 en vervolgens gemonteerd met een anti-fade reagens.
Zodra de transfectie omstandigheden geoptimaliseerd, de volgende bron van variatie komt uit het bepalen van het gebied van belang te analyseren. Framestijlen gebruiken aftrekken tot de gebieden van de cel met de hoogste fluorescentie verandering identificeren wordt vaak gebruikt om de AF / F maximaliseren. Een alternatief is om alle pixels die licht ontvangen uit de cel te selecteren. Dit verhoogt het aantal pixels resulteert in de vermindering van ruis, maar vermindert de signaalgrootte aangezien niet-reagerende interne fluorescentie inbegrepen. Beide methoden zijn goed zolang de experimentator verenigbaar blijft.
Figuur 4. Voltage Imaging met een Single FP Based GEVI Uitgedruktin HEK 293 cellen en primaire hippocampale neuronen. (A) AF / F spoor van één FP gebaseerde GEVI, Bongwoori, geeft antwoorden op getrapte spanningspulsen geregistreerd op 1 kHz met een snelle CCD camera. (B) Een HEK 293 cel afgebeeld met de high speed CCD-camera; (Links) Resting Light Intensity (RLI) van een cel die (rechts) het frame aftrekken met vermelding van de pixels waar de fluorescentie verandering werd waargenomen Bongwoori &. (C) Optische opname van geïnduceerde actiepotentialen van de muis hippocampus primaire neuronen uitdrukken Bongwoori. De actiepotentialen werden opgeroepen in het kader van whole cell stroomtang modus. De AF / F trace werd geselecteerd uit de pixels gecorreleerd met de soma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een vertegenwoordiger fluocerend uitlezen van de donor en acceptor chromoforen wordt getoond in figuur 5A. De polariteit van de fluorescentieverandering is tegenover de donor en acceptor mogelijk ratiometrische analyse gecorreleerde geluidsbronnen, bv., Te ondervangen. Zo zal beweging gecorreleerde ruis een verandering in fluorescentie vertonen in dezelfde richting van de donor en acceptor fluorescentie. Terwijl de FRET gebaseerde probe kan ratiometrische beeldvorming, is het vaak beter alleen analyseren hoe helderder chromofoor. Dit komt omdat de dimmer chromofoor in hoofdzaak het geluid van de opname kunnen verhogen. Figuur 5B toont dit effect. Het frame aftrekken figuur 5B van de heldere klaver blijkt duidelijk waar het optische signaal in de cel. Daarentegen het kader aftrek van mRuby2 fluorescentie toont hogere mate van lawaai de hele cel. Daarom wordt alleen de donor signaal klaver getoond in hippocampale neuron in Figuur 5C.
Figuur 5. Voltage beeldvorming met een FRET gebaseerd GEVI uitgedrukt in HEK 293 cel en hippocampus primaire neuronen. (A) AF / F spoor van een op FRET gebaseerde GEVI, Nabi2.242, tonen de respons na twee golflengtes getrapte spanningspulsen geregistreerd op 1 kHz met een snelle CCD camera. (B) Top; de donor (Clover-RLI, Clover frame aftrekken) en acceptor (mRuby2-RLI, mRuby2 frame aftrekken) beelden bewerkt met twee verschillende drempels voor elk FP, Bottom; dezelfde drempel werd gebruikt voor zowel donor (Clover-RLI, Clover frame aftrekken) en acceptor (mRuby2-RLI, mRuby2 frame aftrekken) beelden naar de relatieve duisternis van mRuby2 te illustreren. Alle beelden werden genomen van dezelfde HEK 293 cel die Nabi2.242. (C) De 520 nm trace van geïnduceerde actiepotentialen van een muis hippocampus primaire neuron uitdrukken Nabi2.244 sensor. De AF / F trace werd geselecteerd uit de pixels gecorreleerd met de soma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Gevolgen van verschillende Lichtniveaus voor AF en de AF / F-waarden. (A) Een beeld van een HEK 293 cel die een enkele FP gebaseerd GEVI, Bongwoori, getoond in Resting Light Intensity (RLI), (B) de fluorescentie sporen tonen kernel gemiddeld AF (F x-F 0) waarden uit drie verschillende regio's, regio 1: membraan regio met goed gelokaliseerde fluorescentiesignaal, regio 2: een gebied met heldere interne fluorescentie, eend regio 3: gebied ver van optisch signaal, (C) de fluorescentie sporen tonen kernel gemiddelde AF / F-waarden uit dezelfde regio in (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Concepts | vergelijkingen | Opmerking |
| Fractional fluorescentie verandering (AF / F) |  | F 1 = lichtintensiteit gemeten op een tijdstip, F 0 = lichtintensiteit gemeten op holdingniveau potentieel |
| Boltzmann functie |  | y = AF / F, V = membraanpotentiaal in mV, V 02/01 is het membraan potentieel in mV bij half-maximale AF / F, A |
| Double exponentiële verval functie | y = y 0 + A 1 e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 | τ 1, 2 τ = tijdconstanten, A 1, A 2 = amplitudes, t, t = 0 twee tijdstippen, y 0 = offset |
Tabel 2. Vergelijkingen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het zenuwstelsel gebruikt spanning op verschillende manieren remming veroorzaakt een lichte hyperpolarisatie, synaptische ingang veroorzaakt een lichte depolarisatie en een actiepotentiaal leidt tot een relatief grote spanningsverandering. Het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal meten door GEVIs biedt het veelbelovend potentieel gelijktijdig analyseren van verschillende componenten van neuronale circuits. In dit rapport tonen we een fundamentele methode voor het afbeelden veranderingen in de membraanpotentiaal behulp GEVIs.
Een belangrijke sleutel voor beeldvorming veranderingen in de spanning efficiënte expressie van het GEVI in de plasmamembraan. Intracellulaire expressie creëert een niet-reagerend fluorescentie dat de SNR van de sonde beperkt. Het optimaliseren van de transfectie omstandigheden sterk verbetert de consistentie van de optische metingen. Inderdaad, het testen van een nieuw GEVI is het raadzaam om een bekende probe testen zodat verschillen in optische activiteit zijn geheel veroorzaakt door de new probe en aan de voorwaarden van de cellen.
Figuur 6 het effect van interne fluorescentie in het verminderen van de gevoeligheid van de spanning imaging toont, AF / F waarde. Figuur 6B toont een AF waarden HEK cel die de interne-FP gebaseerde GEVI, Bongwoori. Trace 2 komt uit de regio 2 (blauwe kleur), waar relatief lichte interne fluorescentie wordt gezien in figuur 6A. Dit spoor is vergelijkbaar niveau van AF waarde spoor 1. Echter, in figuur 6C, waar de sporen in figuur 6B werden verdeeld door RLI waarden van AF / F-waarden, het spoor 2 druppels aanzienlijk als gevolg van de felle interne fluorescentie die AF / F afneemt waarden. Fluorescentie spoor 3 heeft een zeer kleine AF, maar heeft ook een zeer kleine waarde RLI (F). Het resultaat is een misleidende AF / F signaal dat een aanzienlijke toename van het lawaai van de opname heeft. Dit voorbeeld is opgenomen om de AF tonen ookbelangrijk. Een grote verandering in de AF / F is niet handig als F is zeer laag om mee te beginnen.
Het gebruik van een beeld splitser maakt het gelijktijdig meten van twee golflengten op een CCD-camera. Dit ondersteunt sterk het meten van FRET veranderingen afhankelijke fluorescente probe voor ontwikkeling en vermindert de kosten van de installatie. Echter, als gevolg van chromatische aberratie, deze twee beelden enigszins onscherp noodzakelijk de noodzaak van een apochromatische doelstelling. Hoe meer licht, hoe beter SNR, dus het kiezen van de doelstellingen met de hoogste numerieke opening verbetert ook fluorescentiebeeldvorming. Bovendien kan een sterkere lichtbronnen zoals lichtuitzendende diodes (LED) of laser SNR vergroten. LEDs hebben geen mechanische sluiter vereist.
In dit verslag tonen we de optische signalen van één FP GEVI en een op FRET gebaseerde GEVI. Het belangrijkste voordeel van een op FRET gebaseerde GEVI dat ratiometrische imaging maakt de reductie van gecorreleerde ruis dUE ademhaling en bloedstroming in vivo. Tegenfase van de fluorescentiesignalen bevestigt een echte verandering in de membraanpotentiaal. Aangezien de fluorescentie-intensiteiten van de twee chromoforen vaak sterk verschillen, de SNR zal ook variëren. Dit verwart de ratiometrische analyse en het nut ervan 28 beperkt. Er kan ook een FRET-onafhankelijke signaal 29 zijn. Het is daarom soms beter om alleen de heldere fluorescerende chromofoor bij het gebruik FRET veranderingen in membraanpotentiaal te analyseren.
Voltage beeldvorming is moeilijker dan calcium beeldvorming door de snelheid en de variabiliteit van de veranderingen in membraanpotentiaal opzichte van calcium beeldvorming die de calciumflux meet. De membraanpotentiaal verandert zeer snel tijdschalen vergeleken met de flux van calciumionen en subthreshold evenementen in neuronen kan niet worden gemeten met calcium imaging 30. Bovendien moet de spanning sonde in het plasmamembraanwaarbij de effectieve hoeveelheid probe waarover verslag optisch veranderingen in de membraanpotentiaal beperkt te zijn. Bijgevolg is het aantal fotonen die daadwerkelijk op de CCD chip komen relatief weinig. Dit vereist de noodzaak van een hoge snelheid en een laag geluidsniveau read-camera met een hoog kwantumrendement en een probe die een hoge SNR van veranderingen in membraanpotentiaal opwekt. Door beeldvorming cellen in vitro, zullen de onderzoekers een beter inzicht in de potentiële voordelen en valkuilen van GEVIs voordat in vivo metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
- Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
- Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
- Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
- St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
- Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
- Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
- Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
- Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
- Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
- Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
- Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
- Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
- Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
- Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
- Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
- Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
- Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).
