Introduction
המוקד העיקרי של מאמר זה היא להדגים את דימות אופטי של השינויים הפוטנציאלים קרום במבחנה באמצעות חלבוני ניאון מקודדים גנטית. שינויי הדמיה בפוטנציאל הממברנה מציעים את האפשרות המרגשת של לימוד הפעילות של מעגלים עצביים. כאשר שינויי תוצאת פוטנציאל הממברנה לשינוי עוצם קרינה, כל פיקסל של המצלמה הופך אלקטרודה פונדקאית המאפשרים מדידות מפריעה של פעילות עצבית. במשך למעלה מארבעים שנה, צבעי מתח רגישים אורגניים היו מועילים להתבוננות שינויי קרום 1-4 פוטנציאלי. עם זאת, צבעים אלה חסרים סגוליים הסלולר. בנוסף, סוגי תאים מסוימים שקשה להכתים. גנטית אינדיקטורים מתח מקודד (GEVIs) להתגבר על המגבלות האלה ע"י התאים להיחקר במיוחד להביע את החללית מתח רגיש ניאון.
ישנם שלושה סוגים של GEVIs. המחזור הראשון של GEVI משתמש voltage חישת מחשבים מתוך phosphatase חישת המתח גם עם חלבון פלואורסצנטי יחיד (FP) 5-9 או תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) זוג 10-12. השיעור השני של חיישנים משתמש rhodopsin מיקרוביאלי כאינדיקטור ניאון ישירות 13-15 או באמצעות electrochromic סריג 16,17. המחזור השלישי מנצל שני מרכיבים, המרכיב הגנטי להיות FP מעוגן קרום ומרכיב השני להיות צבע מרווה קרום הנכנס 18-20. בעוד המעמדות השניות והשלישיות שימושיות בניסויים במבחנה פרוס 19,20, רק המחזור הראשון של החיישנים שימושיים כיום עבור in vivo מנתח 6.
בדו"ח זה נדגים את ההדמיה של פוטנציאל הממברנה באמצעות המחלקה הראשונה של GEVIs (איור 1) במבחנה. מחלקה ראשונה זו של חיישנים מתח היא הקלה ביותר לעבור הדמיה in vivo. מאז GEVIs utilizing תחום חישה מתח התמזגו FP הם על פי 50 בהיר יותר מאשר בכיתה rhodopsin של חיישנים, הם יכולים להיות צילמו באמצעות תאורה מנורת קשת ולא לדרוש לייזר בעלת עוצמה אדירה. תוצאה נוספת של הפער הבהיר היא כי המחזור הראשון של GEVIs יכול לחרוג פלואורסצנציה האוטומטית של מוח בקלות. הבדיקות מבוססות rhodopsin לא יכולות. המחזור השלישי של חיישן הוא פשוט בהיר כמו המחלקה ראשונה אבל דורש תוספת של מרווה כימי אשר קשה לנהל in vivo.
אנו, אם כן, להדגים את רכישת בדיקה עם סינגל FP (Bongwoori) 8 ו בדיקה המורכבת זוג סריג (נבי 2) 12. לדאוג בונה בדוח זה הם גרסאות פרפר של VSFP-CR (חלבוני ניאון רגיש מתח - תלתן-mRuby2) 11 המורכב תורם פלואורסצנטי ירוק, תלתן, וכן acceptor ניאון אדום, mRuby2, בשם נבי 2.242 ונבי 2.244 
איור 1. שני סוגים של אינדיקטורים מתח מקודדים גנטיים (GEVIs) צלמו הדוח (א) FP מונה מבוסס GEVI שיש תחום חישת מתח קרום טרנס חלבון פלואורסצנטי. (ב) GEVI סריג מבוסס מורכב תחום טרנס-קרום חישת מתח, תורם סריג acceptor. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרה אתיקה: פרוטוקול הניסוי בבעלי חיים אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש ב פרוטוקול חיה KIST 2014-001.
1. הגדרת ציוד
- התקנת הדמיה
- מניח מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך על שולחן בידוד רעידות. השתמש (עדשת טבילת שמן 60X עם 1.35 צמצם מספרי) גדלה גבוהה עדשה אובייקטיבית קוביית מסנן מצויד במראה dichroic ומסננים מתאים חלבוני הניאון משמשים הדמית המתח.
הערה: ההגדרה זו משתמשת מיקרוסקופ הפוך על מנת להעסיק מטרות עם גבוה NA, אבל מיקרוסקופים זקופים גם יכולים לשמש. אכן, מיקרוסקופ ההפוכה היא רק לפיתוח חללי מאז צמצם מספרי גבוה (NA) עדשה אובייקטיבית אוספת יותר אור מזו עם נמוך NA ובכך לשפר את היחס האות לרעש (SNR; ניתן לתאר את האות אופטי השיא חולק סטיית התקן של קו הבסיסקרינה) של הקלטה. עבור מפתחים-עישון, היינו ממליצים מיקרוסקופ זקוף עבור יישומים כגון פרוסה או בהקלטות vivo. - הכן מקור אור, למשל., מנורת קשת קסנון, מצויד תריס מכני הדמיה הרחבה בתחום epifluorescence היעיל. לכוון את האור אל מיקרוסקופ באמצעות ספר אור הר. האור יעבור דרך מסנן העירור משתקף במראה dichroic הראשון בקובייה המסננת. יישר את האור להאיר את הדגימה שווה עם עוצמת אור מוגדל על שדה הראייה 21.
הערה: בהתאם למסורת, מנורת קשת 75 ואט שמשה מאז נורות חלשות יותר ליצור גדולות אבל לא שדות תאורה בהירים. לייזר יכול לשמש אך מוגבלים באורך גל יחיד. נוריות הופך בהירות אכן עשוי להיות מקור האור של בחירה המציע אורכי גל מרובים ולא המחייב תריס מכאני. - הר שתי מצלמות CCD אל fluorescמיקרוסקופ ence כפי שמוצג באיור 2 ד.
הערה: מצלמת CCD הראשון יש רזולוציה מרחבית גבוהה והוא משמש לזיהוי של תא המבטא את GEVI בקרום פלזמה להיבדק. לשינויים הדמיה בפוטנציאל הממברנה, להבטיח כי מצלמת CCD השני יש שיעור גבוה מסגרת כגון 1,000 מסגרת לכל שניות (fps). השתמש במתאם מצלמת יציאה כפולה (איור 2D- (3)) לעבור את מסלול ההדמיה בין שתי מצלמות CCD. ב ההתקנה זה, demagnifier משמש להתאמת התמונה מן העדשה אובייקטיבי על שבב CCD במצלמה CCD השני. - התקן במפצל תמונה בין הראשונים (להאט) ומצלמות CCD שניות (מהירות) עבור הדמיה של GEVI מבוסס סריג. הכנס קובייה מסננת שיש הראה dichroic (560 ננומטר) ושני מסנני פליטה (520 ננומטר / 40 & 645 ננומטר / 75) ב במפצל התמונה. זה יגרום בשני תחומי הנוף, אחד עבור קרינת התורם האחר המייצג את קרינת acceptor. סר זו sקוביית econd מסנן כאשר הדמיה GEVI עם סינגל FP.
הערה: GEVI FP יחיד המבוסס נבדק בשיטה זו הוא Bongwoori אשר משתמשת FP, סופר המילקה pHluorin A227D (A227D SE). מסנן העירור (472 ננומטר / 30), מסנן הפליטה (497 ננומטר / ארוך לעבור) ואת המראה dichroic (495 ננומטר) נבחרו על בסיס ספקטרום העירור והפליטה שלה 5. באופן כללי, מסנן העירור והפליטה צריך חפיפה הגדולה עם כל ספקטרום של fluorophore לרכוש תמונה בהירה ואילו תיבות מראה dichroic כל אור עירור מועבר דרך מסנן הפליטה. הבחירה של מסננים והראה dichroic עבור הקלטת GEVI המבוססת סריג זוג 11 כדלקמן אותו העיקרון חוץ מזה זה מחייב קוביית מסנן שנייה מפצל תמונה לצורך השגחה זמני של קרינה התורמת acceptor. קוביית המסנן הראשונה להציב בתיבת סינון מיקרוסקופ צריכה להיות מסנן עירור (475 ננומטר / 23) עבור תלתן. ואז נפלט fluorescence משני FPS ישודר לקוביית המסנן השנייה דרך המראה dichroic הראשון (495 ננומטר). קוביית המסנן השנייה יש מראה dichroic (560 ננומטר) ושני מסנני פליטה (520 ננומטר / 40 עבור תלתן 645 ננומטר / 75 עבור mRuby2) עבור כל FP ובכך להפריד את הקרינה משני FPS שונה.
- מניח מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך על שולחן בידוד רעידות. השתמש (עדשת טבילת שמן 60X עם 1.35 צמצם מספרי) גדלה גבוהה עדשה אובייקטיבית קוביית מסנן מצויד במראה dichroic ומסננים מתאים חלבוני הניאון משמשים הדמית המתח.
| GEVI היחיד FP מבוסס (Bongwoori) | סריג GEVI זוג מבוסס (נבי 2.42 & נבי 2.44) | ||
| קוביית מסנן הראשונה להציב המיקרוסקופ | מסנן עירור | 472 ננומטר / 30 | 475 ננומטר / 23 |
| מראה dichroic | 495 ננומטר | 495 ננומטר | |
| מסנן פליטה | 497 ננומטר / מסירה ארוכה | - | |
| קוביית מסנן שנייה להציב ספליטר קורה | מראה dichroic | - | |
| פליטה לסנן 1 | - | 520 ננומטר / 40 | |
| פליטה לסנן 2 | - | 645 ננומטר / 75 |
טבלת 1. שני סטים מסננים שונים המשמשים עבור GEVI בהתבסס FP יחיד הקלטות GEVI מבוססות סריג
- בידוד רעידות
- אל תרכיב כל ציוד עם נע רכיבים על שולחן בידוד רעידות. ודא כי הכבלים מחוברים לציוד שאינו מבודד רופפים כדי למנוע רעידות של המדגם.
- תא מהדק תיקון
- חותם את החלק התחתון של חדר תיקון המהדק עם כוס כיסוי דקה # 0 מאז מרחק העבודה של המטרה היא קטנה יחסית. זהו חיסרון של ההתקנה מיקרוסקופ הפוכה.
הערה: כתוצאת איזון שיש עדשה אובייקטיבית גבוהה NA, מרחק העבודה פוחת. על מנת למקם את SPECIMen בתוך מרחק עבודה קצר מאוד, הזכוכית המכסה ואת coverslip (שלב 2) צריך להיות דק ככל האפשר.
- חותם את החלק התחתון של חדר תיקון המהדק עם כוס כיסוי דקה # 0 מאז מרחק העבודה של המטרה היא קטנה יחסית. זהו חיסרון של ההתקנה מיקרוסקופ הפוכה.
- בקרת טמפרטורה
- ודא כי פתרון האמבטיה זורם דרך בקר טמפרטורה כדי לשמור על תאי טלאים סביב 33 מעלות צלסיוס לאורך הניסוי.
- חיבורי ציוד
- חבר את מגבר צמד תיקון ואת התריס המכאני של מקור אור אל תיבת פקודת הכידון ניל-Concelman (BNC) של מצלמת CCD מהירות הגבוהה. פעולה זו תפעיל את תוכנת הדמיה לשלוט המגבר, מצלמה, ואת מקור האור בו זמנית.
הערה: רכיבים חשמליים והדמיה צורך לסנכרן כדי לספק להקלטות חשמליות ואופטיות סימולטני של פעילות חשמלית.
- חבר את מגבר צמד תיקון ואת התריס המכאני של מקור אור אל תיבת פקודת הכידון ניל-Concelman (BNC) של מצלמת CCD מהירות הגבוהה. פעולה זו תפעיל את תוכנת הדמיה לשלוט המגבר, מצלמה, ואת מקור האור בו זמנית.
איור 2. ציידהגדרת ment הדמית מתח עם GEVIs זרימת העבודה בעקבות נתיב האור, (א) מנורת קשת 75W קסנון, (ב) אור עירור ממנורת הקשת מסוננת לפי מסנן העירור ואז שמשתקפת במראה dichroic הראשון לפני שהוא מגיע אל בשלב הדגימה, הבלעה בפינה ימנית העליונה מציגה את התצורה התא כולו, (C) מצלמת CCD המהירות איטית משמשת לתועלת שתי אפשרויות מלחציים תא תיקון, (ד) בחלק רכישת התמונה; (1) מצלמת CCD מהירות גבוהה, (2) במפצל תמונה עבור שני סריג לזווג מונו FP GEVIs, (3) demagnifier כדי להתאים את התמונה על גבי שבב CCD במצלמה CCD מהירות גבוהה, (4) יציאה כפולה מתאם המצלמה כדי להעביר את מסלול הדמיה (5) מצלמת CCD מהירות איטית עם רזולוציה מרחבית גבוהה לזיהוי של התא כדי תיקון, (E & F) רכישת התמונה עם GEVI (E) מבוסס חד FP וכן GEVI סריג מבוססי(F). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ביטוי 2. GEVIs
- בכליה עובריים אנושיים 293 תאים
- עובריים אנושיים תרביות מכליות 293 (HEK 293) תאים עם המדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר על 37 מעלות צלסיוס ב CO 2 באינקובטור (5% CO 2). השתמשו בצלחת בתרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ ו -20 מ"מ גובה. הפעל את התרבות עם 2 x 10 3 - 6 x 10 תאים 3/2 ס"מ לדגור עד שהם מגיעים 80-90% confluency עבור transfection הבאים.
- ביום transfection, לשאוב התקשורת התא בעדינות ולשטוף פעם עם בופר פוספט של Dulbecco. לפזר את התאים HEK 293 עם 0.25% פתרון טריפסין-EDTA במשך 1-2 דקות, לשאוב את הפתרון לטפוח בעדינות את הצד של המנה כדי לנתק את גאמות. הוסף DMEM טריים (10% FBS) ו לנתק את התאים בכבדות על ידי pipetting. קבע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer.
- מניחים 0.08 - 0.13 מ עבה, 10 מ"מ קוטר coverslips מראש מצופה-פולי- L- ליזין בצלחת תרבות 24 גם רקמות. זרעים התאים HEK 293 על coverslips ב 1 x 10 5 תאים / 2 ס"מ צפיפות התאים.
הערה: מאחר ותאי HEK 293 מסוגלים להרכיב צומת פער אחד עם השני, מספר הזרעים צריך להניב תאים מבודדים. - זמני transfect תאים עם מבנה גן מתאים קידוד GEVI באמצעות ריאגנט lipofection בעקבות ההוראה של יצרן.
הערה: בונה גן המשמש pcDNA3.1 מנוצל שלב זה (Bongwoori) ו pUB2.1 (נבי 2.242) כמו וקטורים עמוד השדרה. כמות ה- DNA המשמש היה 100 ng עבור כל coverslip; עם זאת, התנאים transfection צריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל GEVI להיבדק.
- בשנת ירך עכבר ניתקהpocampal הנוירונים העיקריים
- לנתח hippocampi מהיום עוברי 17 C57BL6 / N עכברים ולאחר מכן לנתק את נוירונים בהיפוקמפוס כפי שתואר לעיל 22,23.
- פלייט הנוירונים ניתק על פולי- D- ליזין מצופה עבה 0.08-0.13 מ"מ, 10 מ"מ coverslips בקוטר של 1 x 10 5 תאים / מ"ל צפיפות התאים. דגירה התאים ב C 37 o ב- CO 2 באינקובטור (CO 5% 2).
- Transfect הנוירונים ניתק זמני ב 6 - 7 ימים במבחנה (DIV) עם מבנה הגן קידוד GEVI באמצעות מגיב transfection סידן פוספט כפי שתואר לעיל 24.
הערה: בונה גן המשמש pcDNA3.1 מנוצל שלב זה (Bongwoori) ו pUB2.1 (נבי 2.244) כמו וקטורים עמוד השדרה. כמות ה- DNA המשמש היה 1 מיקרוגרם לכל coverslip. שוב, התנאים transfection צריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל GEVI נבדק.
- בדקו את רמת הביטוי לפני מתח IMAגינג
- קחו את הצלחת בתרבית רקמה מן CO 2 באינקובטור ולבחון את הקרינה מן התאים transfected תחת מיקרוסקופ epifluorescence.
- לאחר אישור הקרינה מן הקרום, להעביר את coverslip לתא התיקון עבור הדמית המתח בסעיף 3.
הערה: הדמית המתח מתנהלת 16 - 24 שעות transfection פוסט. עם זאת, כמו חלבונים ניאון שונים יש פעמים בשלות שונות, GEVIs כמה צריך יותר זמן transfection פוסט. למשל, זוגות הסריג המכילים mRuby2 בפרוטוקול זה עלולים לקחת זמן רב יותר כדי להביע מאז ההבשלה של mRuby2 לוקחת באופן משמעותי יותר מאשר תלתן 11. הקרינה של תורם והן acceptor צריכה להיבדק.
3. פרוטוקול הדמיה מתח
- בחר תא בריא עם ביטוי קרום טוב
- באמצעות מיקרוסקופ, למצוא תא בריא (איור 4B) שמראה חזקקרינה מקומית קרום לעומת הקרינה פנימית. נסו לא לתקן תאים מעוגלים. תאים עגולים או מתחלקים או למות וקשה לתקן. החל דופק בדיקה של 5.0 mV ב msec משרעת 5.0 משך לסייע ניסויי מהדק תיקון הבאים.
- הכן את התא הדמיה מתח
- לאחר בחירת תא התיקון, למקם את פיפטה מהדק תיקון מעל תא. תביאו פיפטה למטה עד שהוא נוגע בעדינות קרום התא. בשלב זה, יש למלא אחר 1 MΩ - 2 עליית MΩ בהתנגדות הממברנה על תוכנת צמד תיקון 25.
הערה: לפעמים, חותם גיגה אוהם טובה יכולה להתקיים רק על ידי נגיעה קרום התא. כל עוד חותם גיגה אוהם יציב, זה צריך להיות בסדר. - להקים חותם גיגה אוהם ידי הפעלת לחץ שלילי בעדינות דרך פיפטה. הגדר את פוטנציאל פיפטה פוטנציאל החזקת רצוי.
- תוך שמירה על חותם גיגה אוהם, תמונת התא דואר עם מצלמת CCD מהירות גבוהה ולהתמקד אותו לאזור הממברנה.
- לקרוע את קרום התא על ידי החלת פולסים של יניקה דרך הפה או מזרק בעדינות כדי לבצע תצורת התא כולו 26.
- תמונת התיקון הדקה תא תחת תצורת מהדק תא כולו על פי תכנון הניסוי באמצעות תוכנת הדמיה
- הפעל את תוכנת ההדמיה. לחץ [לרכוש] - [SciMeasure מצלמה] תפריט כדי לפתוח את הדף 'CCD לרכוש'.
- יצירת קובץ נתונים חדשה לשמור את התמונות.
- לחץ [פלט אנלוגי] ולאחר מכן [ראה סקירת ASCII] כדי לפתוח את קובץ פרוטוקול הדופק לנהל את ההדמיה. הקש על 'ממוצע החזרות הפנימיות "אם נתונים צריך להיות בממוצע. ואז לסגור את הדף 'ANALOGUE OUTPUT ".
הערה: פרוטוקול הדופק זה צריך להיות מעוצב נשמר כקובץ '.txt "לפי המטרה של כל ניסוי לפני שלב זה. - גדר acquis הספציפיפרמטרים ition מהעמוד בו 'לרכוש CCD'. קלט את הערכים הספציפיים של 'מספר מסגרות הרכישה' ו 'מספר הניסויים'.
הערה: מספר המסגרות נקבעת לפי המהירות של הרכישה לבין העיתוי של פרוטוקול הדופק. לדוגמה, אם הדמיה kHz 1, 1,000 מסגרות שווה 1 שניות של זמן ההקלטה. - לחץ [לקחת נתונים (אופטיקה + BNC)] כפתור כדי להתחיל את ההקלטה. בעוד הדמית המתח מתקיימת, וצופים בחלון אוסצילוסקופ מתוכנת מהדק התיקון כדי להבטיח תצורה תא כולו יציבה לאורך כל ההקלטה.
הערה: כדי לבדוק את טווח מתחי התגובה של GEVI, גודל אות בשווי ΔF / F או החלטה זמנית בכל טווח המתח הפיזיולוגי, לערוך ניסוי מהדק מתח תא כולו עם פרוטוקול דופק כאילו נכנס פולסי מתח החל -170 mV ל -130 mV. כדי לקבוע את הביצועים של GEVI בפתרון פוטנציאל פעולה עורר מן פרימה תרבותינוירונים ר"י, תמונת התא תחת תצורת מהדק הנוכחית כולו תא.
- לאחר בחירת תא התיקון, למקם את פיפטה מהדק תיקון מעל תא. תביאו פיפטה למטה עד שהוא נוגע בעדינות קרום התא. בשלב זה, יש למלא אחר 1 MΩ - 2 עליית MΩ בהתנגדות הממברנה על תוכנת צמד תיקון 25.
4. קליטת נתונים
- חישוב ΔF / F
- הפעל את תוכנת ההדמיה. לחץ [FILE] - [קובץ קריאת נתונים] לפתוח קובץ נתונים להיות מנותח. שים את תמונת תא Intensity Resting האור שלה (RLI) בצד ימין
הערה: ממוצע התוכנה 5 המסגרות הראשונות לקבוע RLI של הקלטה. - לחץ על 'הצג BNCs' להביא את ערכי המתח והזרם נמדד למסך.
- שנו את מצב עמוד מתוך 'frame RLI' ל 'חיסור Frame' כדי להשתמש בפונקציה חיסור מסגרת לזהות פיקסלים עם אותות אופטיים תגובה. זהו כוחה האמיתי של הדמיה מאז כל פיקסל יכול להיבחן על שינויים אפשריים קרינה.
- בחר בשתי נקודות זמן (F 0 ו- F 1) עבור חיסור. לזהות באיזה אזור של התא הואמראה אותות מגיבים קרום שינוי פוטנציאל.
הערה: SNR עבור תמונות חיסור מסגרת ניתן לשפר על ידי בחירת מסגרות מרובות עבור כל נקודת זמן כדי זמנית את הממוצע של האות. התוכנה מחסירה את עוצמת האור הממוצעת ממסגרות שנבחרו ומחשבה את ערכי F 1 -f 0 (ΔF). בדרך כלל אחד בוחר בנקודת זמן רכשה בנקודת הפוטנציאל ופעם אחר החזיק שצולמה במהלך תקופת הגירוי. - לייעד את הפיקסלים שצריכים להיות מנותח על ידי גרירה או לחיצה כל פיקסל עם עכבר המחשב. הקפד על הייצוג הגרפי של עוצמת הקרינה הממוצעת מן פיקסלים שנבחרו בצד השמאלי של חלון התוכנה. דמויות 4B & 5B להציג תמונות נציג מניתוח חיסור מסגרת.
- מחלקים את פיקסלים מופחתים על ידי RLI (F 0). לחץ [Divide by RLIs] לרכוש ערכים ΔF / F
- הפעל את תוכנת ההדמיה. לחץ [FILE] - [קובץ קריאת נתונים] לפתוח קובץ נתונים להיות מנותח. שים את תמונת תא Intensity Resting האור שלה (RLI) בצד ימין
- נתוני יצוא
- סור גרפי מתח וזרם על ידי לבטל את לחיצת התפריט 'BNCs צג'. עבור אל [OUTPUT] - [שמור עקבות כמובאות (ASCII)] לייצא את עקבות קרינה בפורמט קובץ ASCII לניתוח עקום הולם על ידי תוכנת גרפים סטנדרטית.
ניתוח 5. נתונים
- רכוש מתח חישה של GEVI
- צייר את השינוי הקרינה לעומת גרף מתח (ע"ע) על ידי התוויית ערכי ΔF / F לעומת מתח בתוכנית ניתוח נתונים. התאם את העקומה לפונקצית בולצמן (טבלה 2) כדי לקבוע את טווח המתח של האות האופטי על ידי לחיצה על [ניתוח] - [התאמה] - [לנכון sigmoidal] - [הדו-שיח פתיחה], ולאחר מכן לבחור פונקציה בולצמן.
הערה: התאמה לפונקציה עושה את זה possiblדואר כדי לאפיין את תכונות חישת מתח של בדיקות מתח שונות או להשוות ההופעות שלהם בתאים שונים. הפונקציה בולצמן יכולה לשמש עבור הבדיקות נבדקות במאמר זה משום עקומות FV מחיישנים אלה מראות תבנית sigmoidal. - נרמל כל ערך ΔF / F באמצעות הערכים התחלתי וסופי (א 1 ו- A 2) מחושב על ידי הפונקציה.
הערה: משוואת בולצמן, המינימום הוא 1 ואת המרבי הוא א 2. לנורמליזציה, להשתמש בתוכנת יישום גיליון אלקטרוני להתאים את ערכי ΔF / F על ידי הגדרת 1 כאפס ו- A 2 כאחד. ממוצע הערכים ΔF / F מנורמל ולחשב סטיית התקן לניתוח סטטיסטי. - Replot ΔF המנורמל / ערכי F לעומת מתח כפי שתואר לעיל בסעיף 5.1.1).
- צייר את השינוי הקרינה לעומת גרף מתח (ע"ע) על ידי התוויית ערכי ΔF / F לעומת מתח בתוכנית ניתוח נתונים. התאם את העקומה לפונקצית בולצמן (טבלה 2) כדי לקבוע את טווח המתח של האות האופטי על ידי לחיצה על [ניתוח] - [התאמה] - [לנכון sigmoidal] - [הדו-שיח פתיחה], ולאחר מכן לבחור פונקציה בולצמן.
- מהירות התגובה אופטי
- פתח את הקובץ ASCII רכש משלב 4.2.2) עם ניתוח נתוניםתכנית עלילת עקבות ΔF / F לעומת הזמן.
- הקש על 'בורר נתונים' של תוכנת ניתוח נתונים ובחר נקודה זמן אחת המתאימה לתחילת דופק מתח צעד ונקודה בפעם שנייה כאשר האות האופטי הגיע יציב. שמתאימים טווח זה הוא פונקצית דעיכה מעריכית יחידה וכפולה ידי לחיצה על [ניתוח] - [התאמה] - [לנכון מעריכים] - [הדו-שיח פתיחה], ולבחור פונקצית דעיכה מעריכית. דווח על התאמה טובה יותר.
הערה: על ידי התאמה לפונקציות הדעיכה מעריכית היחידות או הכפולות, קבוע הזמן לכמת מיוצגת על ידי τ ניתן לרכוש. הנסיינים יעזרו זה להשוות את קינטיקה של המדידות שלהם נעשו עם אינדיקטורים מתח שונה. עקב הקרינה עלול להראות רכיבים מהירים ואיטיים שיכול להיות מתואר עם פונקצית דעיכה מעריכית כפולה. במקרה זה, חישוב יגרום שני קבועים זמן עם אמפליטודות שונות. - חישוב הדואר משוקלל τ קבוע להשוות את קינטיקה של בדיקות מפגין שני מרכיבים זמניים בדיקות עם מרכיב יחיד.
הערה: טאו המשוקלל מחושב כסכום של τ 1 מוכפל משרעת יחסית, A 1, בתוספת τ 2 מוכפל משרעת יחסית, A 2, כפי שהוגדר על ידי הנוסחה הבאה;
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זמני תאים transfected יכול להפגין וריאציה משמעותית בעוצמת הקרינה ואת מידת הביטוי קרום הפלזמה. אפילו באותו coverslip כמה תאים יהיו רמות שונות של הקרינה הפנימית. זהו ככל הנראה בשל כמות של סוכן transfection נספג על ידי התא. לפעמים, יותר מדי ביטוי גורם לתא לחוות את תגובת חלבון פרש וכתוצאה מכך אפופטוזיס 27 (בהיר, מעוגל תאים, עם קרינה פנימית גבוהה). הנסיין לכן הזהיר לבחון הן תאים בהירים תאים עמומים עם קרינה פנימית כמה שפחות מאז הביטוי הפנימי יוצר קרינה הלא-היענות כי מורידה את יחס האות לרעש (SNR).
שיקול נוסף הוא שיעור ההבשלה של chromophores. איור 3 מראה פער של הקרינה של chromoph acceptorבצר (mRuby2) אשר יש זמן בשל ארוך יותר כרומופור התורם (תלתן).
איור 3. תמונות Confocal של HEK 293 תאים transiently transfected עם GEVI סריג מבוסס, Nabi2.242. (א) תמונות Confocal של תאים HEK מראה קרום הקרינה מקומי מן סריג התורם acceptor, (ב) תמונות Confocal מראה תוצאה הפוטנציאל של התבגרות איטית של mRuby2. כל ארבעת התאים להפגין קרינת תלתן ואילו רק שתי תערוכה קרינת mRuby2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
התמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופ confocal. עבור תורם הסריג, תלתן, 488 ננומטר ליזר שמשו עירור והפליטה הייתה סרןured עם 525/50 ננומטר bandpass מסנן. את המקבל סריג, mRuby2, הואר 561 ננומטר לייזר עירור 595/50 ננומטר bandpass מסנן שימש פליטה. דגימות הדמית confocal תוקנו עם paraformaldehyde 4% / פתרון סוכרוז בופר פוספט המותאם 7.4 pH ולאחר מכן רכובות עם מגיב אנטי לדעוך.
ברגע שהתנאים transfection ממוטבים, במקור הבא של וריאציה מגיע מלקבוע את האזור של עניין להיות מנותח. באמצעות חיסור מסגרת לזהות אזורים של התא עם השינוי הקרינה הגבוהה ביותר משמש לעתים קרובות כדי למקסם את הערך ΔF / F. חלופה אחת היא לבחור את כל הפיקסלים קבלת האור מן התא. זה מגדיל את מספר הפיקסלים וכתוצאה מכך הפחתת הרעש, אבל מקטין את גודל האות מאז כלולה הקרינה פנימית ללא תגובה. שני השיטות הן בסדר כל עוד הנסיין נשאר קבוע.
הדמית מתח איור 4. עם GEVI המבוסס FP אחד שהתבטאב HEK 293 תאים בהיפוקמפוס ראשי נוירונים. (א) ΔF / F שמץ של יחיד FP מבוסס GEVI, Bongwoori, מראה תגובות פולסי מתח צעד רשם kHz 1 עם מצלמת CCD מהירות גבוהה. (ב) תא HEK 293 צלם עם מצלמת CCD מהירות הגבוהה; (משמאל) עוצמת Resting אור (RLI) של תא להביע Bongwoori & (מימין) את תמונת חיסור המסגרת המציין את הפיקסלים שבו שינוי הקרינה נצפה. (C) הקלטה אופטית של פוטנציאל פעולה הנגרמת מן הנוירונים העיקריים בהיפוקמפוס עכבר להביע Bongwoori. פוטנציאלי הפעולה היו עוררים תחת מצב מהדק הנוכחי תא כולו. עקב ΔF / F נבחר מן פיקסלים מתואמים סומה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Fluo נציגההודעה rescence של chromophores התורם acceptor מוצג באיור 5A. הקוטביות של שינוי הקרינה היא ההפך עבור התורם acceptor המאפשר ניתוח ratiometric להפחית מקורות רעש בקורלציה, למשל., תנועה. לדוגמא, רעש בקורלציה תנועה יפגין שינוי הקרינה באותו כיוון הן הקרינה התורמת acceptor. בעוד החללית המבוססת הסריג מסוגלת הדמית ratiometric, הוא לעתים קרובות יותר רק כדי לנתח את כרומופור הבהיר. הסיבה לכך היא כרומופור דימר יכול להגדיל את הרעש באופן משמעותי של ההקלטה. איור 5 מציג את האפקט הזה. חיסור מסגרת איור 5 ב מן התלתן הבהיר ניתן לראות בבירור היכן האות האופטי הוא בתא. לעומת זאת, חיסור מסגרת של הקרינה mRuby2 תערוכות לתארים גבוהים של רעש ברחבי התא. לכן, רק את האות התורם של תלתן מוצג נוירון בהיפוקמפוס Fi5C איור.
הדמיה מתח איור 5. עם סריג מבוסס GEVI הביע בתא HEK 293 ו הנוירונים העיקריים בהיפוקמפוס. (א) ΔF / F שמץ של GEVI מבוסס סריג, Nabi2.242, מראה תגובות בשני אורכי גל כדי פולסי מתח צעד רשם kHz 1 עם מצלמת CCD מהירות גבוהה. (ב) למעלה; התורם (תלתן-RLI, חיסור תלתן-מסגרת) ו acceptor (mRuby2-RLI, חיסור mRuby2 מסגרת) עיבוד תמונות עם שני ספים שונים עבור כל FP, תחתית; סף באותו שימש הן התורם (תלתן-RLI, חיסור תלתן-מסגרת) ו acceptor (mRuby2-RLI, חיסור mRuby2 מסגרת) תמונות כדי להמחיש את האפלוליות היחסית של mRuby2. כל התמונות צולמו מהתא אותו HEK 293 להביע Nabi2.242. (ג) TR גל 520 ננומטראס של פוטנציאל פעולה הנגרמת מן נוירון עיקרי בהיפוקמפוס עכבר להביע חיישן Nabi2.244. עקב ΔF / F נבחר מן פיקסלים מתואמים סומה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ההשלכות איור 6. של רמות משתנות אור עבור ΔF ו ΔF / F ערכים. (א) תמונה של תא HEK 293 להביע יחיד FP מבוסס GEVI, Bongwoori, הראו בעוצמת האור מנוחה (RLI), (ב) את עקבות הקרינה הקרנל מראה בממוצע ΔF (F x -f 0) ערכים משלושה אזורים שונים, באזור 1: באזור קרום עם אותות קרינה מקומיים טוב, באזור 2: אזור עם קרינה פנימית בוהק,אזור ד 3: באזור מרוחק מן האות האופטי, (ג) את עקבות הקרינה מראה הקרנל בממוצע הערכים ΔF / F מאותה אזורים (ב '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מושגים | משוואות | הֶעָרָה |
| שינוי הקרינה בשברי (ΔF / F) |  | F 1 = עוצמת האור נמדד בנקודת זמן, F 0 = עוצמת האור הנמדדים פוטנציאל החזקת |
| פונקציה בולצמן |  | y = ΔF / F, V = פוטנציאל הממברנה ב mV, V 1/2 הוא פוטנציאל הממברנה ב mV בחצי מקסימלי ΔF / F, A |
| פונקצית ריקבון זוגית מעריכים | y = y 0 + A 1 e - (t - t 0) / τ 1 + A 2 e - (t - t 0) / τ 2 | τ 1, τ 2 קבועי הזמן =, A 1, A 2 = אמפליטודות, t, t 0 = בשתי נקודות זמן, y 0 = לקזז |
טבלה 2. משוואות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת העצבים משתמשת מתח במספר הדרכים שונים, עיכוב גורם hyperpolarization קל, קלט סינפטי גורם שלילת קוטביות קלה וכן תוצאות פוטנציאל פעולה לשינוי מתח גדול יחסית. היכולת למדוד שינויים בפוטנציאל הממברנה על ידי GEVIs מציעה את הפוטנציאל המבטיח של ניתוח מספר מרכיבים של מעגלים עצביים בו זמנית. בדו"ח זה אנו מדגימים שיטת יסוד לשינויי הדמיה בפוטנציאל הממברנה באמצעות GEVIs.
מפתח מרכזי לשינויי הדמית מתח הוא הביטוי היעיל של GEVI בקרום הפלזמה. ביטוי תאיים יוצר קרינה הלא-היענות כי מפחיתה את יחס האות לרעש של חללית. אופטימיזציה של התנאים transfection בהרבה משפר את העקביות של מדידות אופטיות. ואכן, כאשר בודקים GEVI רומן רצוי גם לבדוק בדיקה ידועה על מנת להבטיח כי הבדלים בפעילות אופטית נובעים אך ורק אל neחללית w ולא התנאים של התאים.
איור 6 מראה את ההשפעה של קרינה פנימית בהפחתת רגישות הדמית המתח, ערך ΔF / F. איור 6 מציג ΔF מעריך תא HEK להביע את הסינגל-FP המבוסס GEVI, Bongwoori. Trace 2 מגיע מאזור 2 (צבע כחול) שבו יחסית קרינה פנימית בהירה נתפסת באיור 6A. יש עקבות זה רמה דומה של ערך ΔF כמו עקבות 1. עם זאת, באיור 6C שבו העקבות באיור 6B חולקו על ידי ערכי RLI לערכי ΔF / F, עקבות 2 טיפות משמעותיות בשל הקרינה הפנימית הבהירה אשר מקטין ΔF / F ערכים. יש קרינה זכר 3 ΔF קטן מאוד אבל גם בעל ערך RLI קטן מאוד (F). התוצאה היא אות מטעה ΔF / F כי יש עלייה ניכרת את הרעש של ההקלטה. דוגמה זו נכללה כדי להדגים את ΔF הוא גםחָשׁוּב. שינוי גדול ΔF / F הוא לא מועיל אם F הוא נמוך מאוד מלכתחילה.
השימוש במפצל התמונה מאפשרת מדידה בו זמנית של שני אורכי גל על מצלמת CCD יחיד. זה מאוד עוזר מדידת שינויי פלורסנט תלויים סריג לפיתוח בדיקה ומפחית את עלות ההתקנה. עם זאת, בשל אברציה כרומטית, שתי תמונות תהיינה קצת מחוץ לפוקוס דבר המחייב את הצורך אובייקטיבי apochromatic. האור יותר כן ייטב SNR, כך בוחר מטרות עם הצמצם המספרי הגבוה ביותר גם משפר דימות פלואורסצנטי. בנוסף, אפשר להשתמש במקורות אור חזק כגון דיודות פולטות אור (LED) או לייזר להגדיל SNR. נוריות אינן דורשות תריס מכאני.
בדוח זה אנו מציגים את האותות האופטיים מתוך GEVI FP יחיד GEVI מבוסס סריג. היתרון העיקרי של GEVI סריג מבוסס הוא הדמית ratiometric מאפשרת הקטנת ד הרעש בקורלציהue כדי הנשימה וזרימת הדם בגוף החי. הקוטביות ההפוכה של אותות הניאון מאשרת שינוי אמיתי פוטנציאל הממברנה. עם זאת, מאז את עוצמות קרינה של שני chromophores לעתים קרובות להשתנות באופן משמעותי, ה- SNR ישתנה גם. זה יוצר בלבול בין ניתוח ratiometric ומגביל השימושיות שלה 28. יש גם יכול להיות איתות סריג עצמאי 29. לכן לפעמים עדיף להשתמש כרומופור הניאון הבהיר רק בעת שימוש סריג לנתח שינויים בפוטנציאל הממברנה.
הדמית מתח היא אתגר גדול יותר מאשר סידן הדמיה בשל מהירות ההשתנות של השינויים בפוטנציאל הממברנה לעומת הדמית סידן אשר מודדת את שטף סידן. השינויים פוטנציאל הממברנה ב סולמות זמן מהר מאוד לעומת שטף יון סידן, והאירועים התת בנוירונים לא ניתן למדוד עם הדמית סידן 30. יתר על כן, חללית המתח חייבת להיות קרום הפלזמהאשר יהיה אפקטיבי מפחית את כמות בדיקה זמינה לשינויים בדו"ח אופטיים בפוטנציאל הממברנה. כתוצאה מכך, מספר הפוטונים שיכול באמת מגיעים שבב CCD הוא מעטים יחסית. זה מחייב את הצורך במהירות גבוהה מצלמה לקריאת רעש נמוכה עם יעילות קוונטית גבוהה בדיקה כי מעורר SNR גבוהה על שינויים בפוטנציאל הממברנה. על ידי הדמיה תאים במבחנה, החוקרים יהיה להבין טוב יותר את היתרונות הפוטנציאליים ואת החסרונות של GEVIs לפני שתנסה במדידות vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
- Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
- Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
- Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
- St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
- Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
- Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
- Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
- Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
- Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
- Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
- Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
- Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
- Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
- Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
- Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
- Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
- Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).
