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Neuroscience

इमेजिंग झिल्ली फ्लोरोसेंट वोल्टेज सेंसर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग के दो प्रकार के साथ संभावित

Published: February 4, 2016 doi: 10.3791/53566
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2,3, 2, 1,4, 2
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

Introduction

इस पत्र के प्रमुख ध्यान केंद्रित आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर इन विट्रो में झिल्ली क्षमता में परिवर्तन के ऑप्टिकल इमेजिंग का प्रदर्शन है। झिल्ली क्षमता में परिवर्तन इमेजिंग neuronal सर्किट की गतिविधि का अध्ययन करने के रोमांचक संभावना प्रदान करता है। एक प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन में झिल्ली क्षमता परिणाम में परिवर्तन, कैमरे के प्रत्येक पिक्सेल एक किराए की इलेक्ट्रोड neuronal गतिविधि के nonintrusive माप सक्षम हो जाता है। चालीस से अधिक वर्षों के लिए, कार्बनिक वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों झिल्ली क्षमता 1-4 में परिवर्तन के अवलोकन के लिए उपयोगी हो गया है। हालांकि, इन रंगों सेलुलर विशिष्टता की कमी है। इसके अलावा, कुछ प्रकार की कोशिकाओं के दाग के लिए मुश्किल हैं। आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज संकेतक (GEVIs) कोशिकाओं विशेष रूप से अध्ययन किया जा फ्लोरोसेंट वोल्टेज के प्रति संवेदनशील जांच अभिव्यक्त होने से इन सीमाओं को पार।

वहाँ GEVIs के तीन वर्गों रहे हैं। GEVI के प्रथम श्रेणी VO का उपयोग करता हैया तो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) 5-9 या एक Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) की जोड़ी को 10-12 के साथ ltage संवेदन वोल्टेज संवेदन फॉस्फेट से डोमेन। सेंसर के द्वितीय श्रेणी के एक फ्लोरोसेंट सूचक सीधे 13-15 के रूप में या electrochromic झल्लाहट 16,17 के माध्यम से माइक्रोबियल rhodopsin उपयोग करता है। तृतीय श्रेणी के दो घटकों, आनुवंशिक घटक एक झिल्ली लंगर एफपी और एक दूसरे घटक एक झिल्ली बाध्य शमन डाई 18-20 जा रहा जा रहा है इस्तेमाल करता है। दूसरी और तीसरी कक्षाओं विट्रो और टुकड़ा प्रयोगों में 19,20 के लिए उपयोगी होते हैं, केवल सेंसर के प्रथम श्रेणी वर्तमान में विवो 6 विश्लेषण के लिए उपयोगी होते हैं।

इस रिपोर्ट में हम इन विट्रो में (चित्रा 1) GEVIs के प्रथम श्रेणी का उपयोग कर झिल्ली क्षमता की इमेजिंग प्रदर्शन करेंगे। वोल्टेज सेंसर की यह प्रथम श्रेणी के लिए सबसे आसान vivo इमेजिंग के लिए संक्रमण है। GEVIs यू के बाद सेएक वोल्टेज संवेदन डोमेन एक एफपी के लिए जुड़े हुए हैं के बारे में tilizing सेंसर की rhodopsin वर्ग की तुलना में उज्जवल 50 गुना, वे बजाय चाप दीपक रोशनी का उपयोग कर एक अत्यंत शक्तिशाली लेजर की आवश्यकता होती है imaged किया जा सकता है। चमक में असमानता का एक और परिणाम है कि GEVIs के प्रथम श्रेणी आसानी से मस्तिष्क की ऑटो प्रतिदीप्ति अधिक हो सकती है। rhodopsin आधारित जांच नहीं कर सकते। सेंसर के तृतीय श्रेणी के बस के रूप में प्रथम श्रेणी के रूप में उज्ज्वल है, लेकिन एक रासायनिक पीने की वस्तु है जो विवो में प्रशासन के लिए मुश्किल है के अलावा आवश्यकता है।

हम होगा, इसलिए, एक एकल एफपी (Bongwoori) 8 और एक झल्लाहट जोड़ी से मिलकर एक जांच (नबी 2) 12 के साथ एक जांच के अधिग्रहण प्रदर्शित करता है। 11 एक हरी फ्लोरोसेंट दाता, तिपतिया घास से मिलकर, और एक लाल फ्लोरोसेंट स्वीकर्ता, mRuby2, नबी २.२४२ और नबी २.२४४ नाम - झल्लाहट इस रिपोर्ट में constructs VSFP-सीआर (तिपतिया घास-mRuby2 वोल्टेज के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन) की तितली संस्करण हैं

आकृति 1
चित्रा 1. वोल्टेज संकेतक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग (GEVIs) यह रिपोर्ट (ए) में imaged एक मोनो आधारित GEVI एक पार झिल्ली वोल्टेज संवेदन डोमेन और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन होने एफपी की दो प्रकार। (बी) के एक झल्लाहट आधारित एक पार झिल्ली वोल्टेज संवेदन डोमेन, एक झल्लाहट दाता और स्वीकर्ता के शामिल GEVI। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

आचार कथन: पशु प्रयोग प्रोटोकॉल केआईएसटी पशु प्रोटोकॉल 2014-001 में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. उपकरण सेटअप

  1. इमेजिंग सेटअप
    1. एक कंपन अलगाव की मेज पर एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी रखें। उद्देश्य लेंस और एक फिल्टर एक dichroic दर्पण और फिल्टर फ्लोरोसेंट वोल्टेज इमेजिंग के लिए इस्तेमाल प्रोटीन के लिए उपयुक्त के साथ सुसज्जित घन (1.35 संख्यात्मक एपर्चर के साथ 60X तेल विसर्जन लेंस) एक उच्च वृद्धि का प्रयोग करें।
      नोट: इस सेटअप आदेश में उच्च एनए के साथ उद्देश्यों को रोजगार के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है, लेकिन ईमानदार माइक्रोस्कोप भी इस्तेमाल किया जा सकता है। दरअसल, उलटा माइक्रोस्कोप के बाद से उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य लेंस एक कम NA जिससे शोर अनुपात (SNR करने के लिए संकेत सुधार लाने के साथ एक से अधिक प्रकाश एकत्र केवल जांच के विकास के लिए है, से विभाजित पीक ऑप्टिकल संकेत के रूप में वर्णित किया जा सकता आधारभूत का मानक विचलनरिकॉर्डिंग के प्रतिदीप्ति)। गैर डेवलपर्स के लिए, हम इस तरह के टुकड़ा के रूप में या विवो रिकॉर्डिंग में अनुप्रयोगों के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप की सिफारिश करेंगे।
    2. एक प्रकाश स्रोत, जैसे तैयार करें।, क्सीनन चाप दीपक, कुशल epifluorescence व्यापक क्षेत्र इमेजिंग के लिए एक यांत्रिक शटर के साथ सुसज्जित है। माइक्रोस्कोप के लिए प्रत्यक्ष प्रकाश एक प्रकाश गाइड के माध्यम से माउंट। प्रकाश उत्तेजना फिल्टर के माध्यम से समाप्त हो जाएगी और फिल्टर क्यूब में पहली dichroic दर्पण से परिलक्षित होता है। प्रकाश संरेखित दृश्य 21 के क्षेत्र से अधिक अधिकतम प्रकाश तीव्रता के साथ समान रूप से नमूना रोशन करने के लिए।
      नोट: परंपरागत रूप से, एक 75 वाट चाप दीपक उज्जवल रोशनी क्षेत्रों इस्तेमाल किया गया था के बाद से उच्च वाट क्षमता प्रकाश बल्ब बड़ा बनाते हैं, लेकिन नहीं। लेजर का इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन एक एकल तरंगदैर्ध्य के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं। एल ई डी उज्जवल होते जा रहे हैं और वास्तव में पसंद के प्रकाश स्रोत के कई तरंग दैर्ध्य की पेशकश की और एक यांत्रिक शटर की आवश्यकता नहीं हो सकता।
    3. fluoresc के लिए दो सीसीडी कैमरों माउंटखिलाडि़यों खुर्दबीन के रूप में चित्रा 2 डी में दिखाया गया है।
      नोट: पहली सीसीडी कैमरा उच्च स्थानिक संकल्प किया है और एक सेल प्लाज्मा झिल्ली में GEVI व्यक्त की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है परीक्षण किया जाना है। झिल्ली क्षमता में इमेजिंग परिवर्तन के लिए, यह सुनिश्चित दूसरी सीसीडी कैमरा एक उच्च फ्रेम दर प्रति सेकंड (एफपीएस) के रूप में इस तरह के 1,000 फ्रेम है। दो सीसीडी कैमरों के बीच स्विच करने के लिए एक मार्ग इमेजिंग दोहरी बंदरगाह कैमरा अनुकूलक (चित्रा 2D- (3)) का प्रयोग करें। इस सेटअप में, एक दूसरे demagnifier सीसीडी कैमरे में सीसीडी चिप पर उद्देश्य लेंस से छवि को फिट करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    4. झल्लाहट आधारित GEVI की इमेजिंग के लिए पहले (धीमा) और दूसरा (उपवास) सीसीडी कैमरों के बीच एक छवि अलगानेवाला स्थापित करें। एक फिल्टर घन एक dichroic दर्पण (560 एनएम) और दो उत्सर्जन फिल्टर होने डालें (520 एनएम / 40 और 645 एनएम / 75) छवि अलगानेवाला में। यह दाता प्रतिदीप्ति और अन्य स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक दृश्य के दो क्षेत्रों में परिणाम होगा। इस हटाये sएक भी एफपी के साथ एक GEVI जब इमेजिंग econd फिल्टर घन।
      नोट: एकल एफपी आधारित इस पद्धति में परीक्षण GEVI Bongwoori जो एफपी, सुपर क्रांतिवृत्त pHluorin A227D (एसई A227D) का उपयोग करता है। उत्तेजना फिल्टर (472 एनएम / 30), उत्सर्जन फिल्टर (497 एनएम / लंबे समय से गुजारें) और dichroic दर्पण (495 एनएम) अपनी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 5 पर आधारित चयन किया गया था। आम तौर पर, उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर जबकि dichroic दर्पण ब्लॉक या किसी भी उत्तेजना प्रकाश उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से प्रेषित एक उज्ज्वल छवि प्राप्त करने की fluorophore प्रत्येक स्पेक्ट्रम के साथ सबसे बड़ा ओवरलैप होनी चाहिए। झल्लाहट जोड़ी 11 के आधार GEVI रिकॉर्डिंग के लिए फिल्टर और dichroic दर्पण के चयन को छोड़कर यह दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति की समवर्ती अवलोकन के लिए छवि अलगानेवाला में एक दूसरा फिल्टर घन आवश्यक है कि एक ही सिद्धांत को मानता है। पहले फिल्टर क्यूब माइक्रोस्कोप फिल्टर बॉक्स में रखा गया तिपतिया घास के लिए एक उत्तेजना फिल्टर (475 एनएम / 23) की जरूरत है। तो एफ उत्सर्जितदोनों एफपीएस से luorescence पहले dichroic दर्पण (495 एनएम) के माध्यम से दूसरे फिल्टर क्यूब को प्रेषित किया जाएगा। दूसरा फिल्टर घन एक dichroic दर्पण (560 एनएम) और प्रत्येक एफपी इस प्रकार दो अलग एफपीएस से प्रतिदीप्ति अलग करने के लिए दो उत्सर्जन फिल्टर (तिपतिया घास के लिए 520 एनएम / 40 और 645 एनएम / 75 mRuby2 के लिए) है।
एकल एफपी आधारित GEVI
(Bongwoori) 		झल्लाहट जोड़ी आधारित GEVI
(नबी 2.42 और नबी 2.44)
पहली फिल्टर घन माइक्रोस्कोप में रखा उत्तेजना फिल्टर 472 एनएम / 30 475 एनएम / 23
dichroic दर्पण 495 एनएम 495 एनएम
उत्सर्जन फिल्टर 497 एनएम / लंबे समय से गुजारें -
दूसरा फिल्टर घन बीम फाड़नेवाला में रखा dichroic दर्पण -
उत्सर्जन फिल्टर 1 - 520 एनएम / 40
उत्सर्जन फिल्टर 2 - 645 एनएम / 75

तालिका 1. दो अलग अलग फिल्टर सेट एक एकल आधार पर GEVI एफपी और एक झल्लाहट आधारित GEVI रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल

  1. कंपन अलगाव
    1. कंपन अलगाव की मेज पर चलती घटकों के साथ किसी भी उपकरण माउंट नहीं है। सुनिश्चित करें कि केबल है कि गैर पृथक उपकरण से जुड़े होते हैं नमूना के कंपन से बचने के लिए ढीली कर रहे हैं।
  2. पैच दबाना चैम्बर
    1. एक पतली # 0 कवर गिलास के साथ पैच दबाना कक्ष के नीचे सील के बाद से उद्देश्य के काम दूरी अपेक्षाकृत छोटा है। यह उलटा माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए एक नुकसान है।
      ध्यान दें: एक उच्च एनए उद्देश्य लेंस होने के एक tradeoff, काम दूरी कम हो जाती है। आदेश specim करने के लिए जगह मेंen बहुत ही कम काम दूरी के भीतर, कांच कवर और coverslip (चरण 2) के रूप में संभव के रूप में पतली होने की जरूरत है।
  3. तापमान नियंत्रण
    1. सुनिश्चित करें कि स्नान समाधान एक तापमान नियंत्रक के माध्यम से बहती 33 ओ सी प्रयोग के दौरान चारों ओर से समझौता-कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए।
  4. उपकरण कनेक्शन
    1. पैच दबाना एम्पलीफायर और उच्च गति सीसीडी कैमरे के संगीन Neill-Concelman (bnc) आदेश बॉक्स करने के लिए प्रकाश स्रोत के यांत्रिक शटर कनेक्ट करें। इस इमेजिंग सॉफ्टवेयर एम्पलीफायर, कैमरा, और एक साथ प्रकाश स्रोत को नियंत्रित करने के लिए सक्षम हो जाएगा।
      नोट: बिजली और इमेजिंग घटकों के क्रम में बिजली की गतिविधि के एक साथ बिजली और ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए प्रदान करने के लिए सिंक्रनाइज़ किया जा करने की जरूरत है।

चित्र 2
चित्रा 2. लैसइमेजिंग GEVIs के साथ वोल्टेज प्रकाश मार्ग का अनुसरण कार्यप्रवाह, (ए) 75W क्सीनन चाप दीपक, (बी) के आर्क दीपक से उत्तेजना प्रकाश के लिए जाहिर सेटअप उत्तेजना फिल्टर द्वारा फ़िल्टर किया जाता है और फिर पहले dichroic दर्पण से परिलक्षित से पहले यह तक पहुंच गई नमूना चरण में, ऊपरी दाएँ कोने में एक क्षेपक पूरे सेल विन्यास, (सी) धीमी गति सीसीडी कैमरा एक सेल और पैच दबाना के दोनों पसंद सहायता करने के लिए प्रयोग किया जाता है, (डी) छवि अधिग्रहण हिस्सा पता चलता है; (1) उच्च गति सीसीडी कैमरा, (2) दोनों के लिए छवि अलगानेवाला झल्लाहट जोड़ी और मोनो एफपी GEVIs, (3) छवि सीसीडी चिप पर उच्च गति सीसीडी कैमरे में फिट करने के लिए demagnifier, (4) दोहरी बंदरगाह कैमरा एडाप्टर पैच करने के लिए सेल की पहचान, (ई एंड एफ) एक एकल एफपी आधारित GEVI (ई) के साथ छवि के अधिग्रहण और एक झल्लाहट आधारित GEVI के लिए इमेजिंग मार्ग और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ (5) धीमी गति सीसीडी कैमरा स्विच करने के लिए(एफ)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. GEVIs की अभिव्यक्ति

  1. मानव भ्रूण गुर्दे 293 कोशिकाओं में
    1. संस्कृति मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK 293) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) सीओ 2 इनक्यूबेटर (5% सीओ 2) में 37 ओ सी में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक के साथ कोशिकाओं। 100 मिमी व्यास और 20 मिमी ऊंचाई के साथ एक टिशू कल्चर पकवान का प्रयोग करें। 2 एक्स 10 3 के साथ संस्कृति शुरू - 6 एक्स 10 3 कोशिकाओं / 2 सेमी और सेते हैं जब तक वे बाद में अभिकर्मक के लिए 80-90% confluency तक पहुँचने।
    2. अभिकर्मक के दिन, सेल मीडिया aspirate और धीरे Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा के साथ एक बार धो लें। 1-2 मिनट के लिए 0.25% trypsin EDTA समाधान के साथ HEK 293 कोशिकाओं को फैलाने समाधान निकालना और धीरे ग अलग करने के लिए पकवान की ओर नलएल। ताजा DMEM (10% FBS) जोड़ें और pipetting द्वारा clumped कोशिकाओं को अलग कर देना। एक hemocytometer का उपयोग करके सेल एकाग्रता का निर्धारण।
    3. जगह 0.08-0.13 मिमी मोटी, 10 मिमी व्यास पूर्व में लिपटे एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में पाली एल लाइसिन साथ coverslips। 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी सेल घनत्व में coverslips पर HEK 293 कोशिकाओं बीज।
      नोट: चूंकि HEK 293 कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ अंतराल जंक्शनों बनाने में सक्षम हैं, बीज नंबर अलग कक्षों उपज की जरूरत है।
    4. क्षणिक एक उपयुक्त जीन का निर्माण निर्माता के निर्देश के बाद एक lipofection अभिकर्मक का उपयोग करके एक GEVI एन्कोडिंग के साथ कोशिकाओं transfect।
      नोट: इस कदम जीन उपयोग किया pcDNA3.1 (Bongwoori) और pUB2.1 (नबी २.२४२) रीढ़ वैक्टर के रूप में के लिए इस्तेमाल किया निर्माणों। के डीएनए इस्तेमाल राशि 100 प्रत्येक coverslip के लिए एनजी था; हालांकि, अभिकर्मक शर्तों अनुभव से निर्धारित होने के लिए प्रत्येक GEVI परीक्षण किया जा करने की जरूरत है।
  2. अलग माउस कूल्हे मेंpocampal प्राथमिक न्यूरॉन्स
    1. भ्रूण दिन 17 C57BL6 / एन चूहों से hippocampi काटना और फिर hippocampal न्यूरॉन्स को अलग कर देना, जैसा कि पहले 22,23 वर्णित है।
    2. प्लेट पाली डी lysine लेपित .08-.13 मिमी पर अलग न्यूरॉन्स मोटी, 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल सेल घनत्व में 10 मिमी व्यास coverslips। कंपनी में 37 ओ सी में कोशिकाओं को सेते 2 इनक्यूबेटर (5% सीओ 2)।
    3. एक जीन का निर्माण के रूप में पहले 24 में वर्णित एक कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके एक GEVI एन्कोडिंग के साथ इन विट्रो (DIV) में 7 दिन - 6 पर क्षणिक अलग न्यूरॉन्स transfect।
      नोट: इस कदम जीन उपयोग किया pcDNA3.1 (Bongwoori) और pUB2.1 (नबी २.२४४) रीढ़ वैक्टर के रूप में के लिए इस्तेमाल किया निर्माणों। इस्तेमाल किया डीएनए की मात्रा 1 प्रत्येक coverslip के लिए माइक्रोग्राम था। फिर, अभिकर्मक शर्तों अनुभव से प्रत्येक GEVI परीक्षण के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता।
  3. अभिव्यक्ति के स्तर आईएमए वोल्टेज से पहले की जाँच करेंGing
    1. सीओ 2 इनक्यूबेटर से टिशू कल्चर प्लेट ले लो और एक epifluorescence खुर्दबीन के नीचे ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति निरीक्षण करते हैं।
    2. झिल्ली से प्रतिदीप्ति की पुष्टि के बाद, धारा 3 में वोल्टेज इमेजिंग के लिए पट्टी चैम्बर के लिए coverslip हस्तांतरण।
      नोट: वोल्टेज इमेजिंग आयोजित किया जाता है 16-24 घंटा के बाद अभिकर्मक। हालांकि, के रूप में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन विभिन्न परिपक्वता समय है, कुछ GEVIs बाद अभिकर्मक में और अधिक समय की जरूरत है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में mRuby2 युक्त झल्लाहट जोड़े व्यक्त करने के लिए mRuby2 की परिपक्वता काफी लंबे समय तक क्लोवर 11 से अधिक लेता है के बाद से लंबे समय तक लग सकता है। दोनों दाता और स्वीकर्ता के प्रतिदीप्ति जाँच की जानी चाहिए।

3. वोल्टेज इमेजिंग प्रोटोकॉल

  1. अच्छा झिल्ली अभिव्यक्ति के साथ एक स्वस्थ सेल का चयन
    1. माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, एक स्वस्थ कोशिका (चित्रा 4 बी) पाते हैं कि मजबूत चलताझिल्ली स्थानीय प्रतिदीप्ति आंतरिक प्रतिदीप्ति की तुलना में। गोल कोशिकाओं पैच करने के लिए नहीं की कोशिश करें। परिपत्र कोशिकाओं या तो विभाजित या मर रहा है और पैच करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं। अवधि में आयाम और 5.0 मिसे में 5.0 एम वी की परीक्षा पल्स लागू बाद पैच दबाना प्रयोगों सहायता करने के लिए।
  2. वोल्टेज इमेजिंग के लिए सेल तैयार
    1. पैच के लिए एक सेल चुनने के बाद, सेल ऊपर पैच दबाना पिपेट जगह है। पिपेट नीचे लाने के लिए जब तक यह धीरे कोशिका झिल्ली को छू लेती है। पैच दबाना सॉफ्टवेयर 25 पर झिल्ली के विरोध में 2 MΩ वृद्धि - इस चरण में, 1 MΩ निरीक्षण करते हैं।
      नोट: कभी कभी, एक अच्छा मुहर giga ओम कोशिका झिल्ली को छू द्वारा बस हो सकता है। जब तक giga ओम मुहर स्थिर है, यह ठीक किया जाना चाहिए।
    2. धीरे पिपेट के माध्यम से नकारात्मक दबाव लागू करने के द्वारा एक giga ओम मुहर स्थापित करना। एक वांछित होल्डिंग क्षमता पर पिपेट संभावित सेट करें।
    3. जबकि giga ओम मुहर, छवि को बनाए रखने वेंउच्च गति सीसीडी कैमरा के साथ ई सेल और झिल्ली क्षेत्र के लिए यह ध्यान केंद्रित।
    4. मुंह से सक्शन की दालों को लागू करने से कोशिका झिल्ली टूटना या धीरे सिरिंज एक पूरे सेल विन्यास 26 बनाने के लिए।
    5. छवि पैच एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार एक पूरे सेल दबाना विन्यास के तहत सेल clamped
      1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करो। 'सीसीडी अधिग्रहण' पृष्ठ को खोलने के लिए [SciMeasure कैमरा] मेनू - [अधिग्रहण] पर क्लिक करें।
      2. छवियों को बचाने के लिए एक नया डेटा फ़ाइल बनाएँ।
      3. [अनुरूप उत्पादन] पर क्लिक करें और फिर एक पल्स प्रोटोकॉल फ़ाइल को खोलने के लिए इमेजिंग का संचालन करने के लिए [एक ASCII पढ़ें]। 'आंतरिक repetitions औसत' पर क्लिक करें डेटा औसतन किया जा करने की जरूरत है। फिर 'अनुरूप उत्पादन' पेज को बंद करें।
        नोट: यह नाड़ी प्रोटोकॉल बनाया गया है और इस कदम से पहले एक प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार एक '.txt' फ़ाइल के रूप में सहेजा जाना चाहिए।
      4. विशिष्ट अक्विस सेट'सीसीडी अधिग्रहण' पेज से ition मापदंडों। इनपुट 'के अधिग्रहण के लिए तख्ते की संख्या' और 'परीक्षणों की संख्या' के लिए विशिष्ट मूल्यों।
        नोट: फ्रेम की संख्या अधिग्रहण की गति और नाड़ी प्रोटोकॉल के समय से निर्धारित होता है। उदाहरण के लिए, इमेजिंग 1 kHz पर, 1000 फ्रेम रिकॉर्डिंग समय के 1 सेकंड के बराबर होती है, तो।
      5. [ले डेटा (प्रकाशिकी + bnc)] बटन रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए क्लिक करें। जबकि वोल्टेज इमेजिंग जगह ले जा रहा है, रिकॉर्डिंग के दौरान स्थिर पूरे सेल विन्यास सुनिश्चित करने के लिए पैच दबाना सॉफ्टवेयर से आस्टसीलस्कप खिड़की देखते हैं।
        नोट: GEVI के उत्तरदायी वोल्टेज रेंज का परीक्षण करने के लिए, ΔF / एफ मूल्य या शारीरिक वोल्टेज रेंज भर में अस्थायी समाधान में संकेत आकार, एक पल्स प्रोटोकॉल कदम रखा होने वोल्टेज एम वी एम वी -170 से 130 से लेकर दालों के साथ एक पूरे सेल वोल्टेज दबाना प्रयोग आचरण। कार्रवाई क्षमता को हल करने में GEVI के प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए सुसंस्कृत प्राइमा से पैदा कीRY न्यूरॉन्स, छवि एक पूरे सेल वर्तमान दबाना विन्यास के तहत सेल।

4. डाटा अधिग्रहण

  1. ΔF / एफ की गणना
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करो। क्लिक करें [फ़ाइल] - [पढ़ें डेटा फ़ाइल] एक डेटा फ़ाइल को खोलने के लिए विश्लेषण किया जा सके। सही पक्ष पर आराम कर अपनी हल्की तीव्रता (RLI) में सेल छवि का निरीक्षण
      नोट: सॉफ्टवेयर का औसत पहले 5 फ्रेम रिकॉर्डिंग के RLI निर्धारित करने के लिए।
    2. पर 'BNCs दिखाएँ' पर क्लिक करें स्क्रीन करने के लिए मापा वर्तमान और वोल्टेज मूल्यों लाने के लिए।
    3. फ्रेम घटाव समारोह का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी ऑप्टिकल संकेतों के साथ पिक्सल की पहचान करने के लिए 'फ़्रेम घटाव' करने के लिए 'RLI फ्रेम' से पेज मोड बदलें। इस इमेजिंग की असली शक्ति है के बाद से हर पिक्सेल प्रतिदीप्ति में संभावित परिवर्तनों के लिए जांच की जा सकती है।
    4. घटाव के लिए दो समय अंक (एफ 0 और एफ 1) का चयन करें। पहचानें सेल का जो क्षेत्र हैउत्तरदायी संकेतों दिखा संभावित परिवर्तन झिल्ली को।
      नोट: फ्रेम घटाव छवियों के लिए SNR अस्थायी संकेत औसत करने के लिए हर समय बिंदु कई फ्रेम का चयन करके सुधार किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर औसत प्रकाश की तीव्रता चयनित फ्रेम से लिया घटा देती है और एफ 1 एफ 0 मूल्यों (ΔF) खरीदते हैं। आम तौर पर एक एक समय बिंदु उत्तेजना की अवधि के दौरान लिया होल्डिंग क्षमता और एक अन्य समय बिंदु पर हासिल कर लिया चुनता है।
    5. पिक्सल खींचकर या कंप्यूटर माउस के साथ प्रत्येक पिक्सेल क्लिक करके विश्लेषण करने की आवश्यकता है कि निर्दिष्ट। सॉफ्टवेयर विंडो के बाईं ओर पर चयनित पिक्सल से औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की चित्रमय प्रतिनिधित्व का निरीक्षण करें। आंकड़े 4 बी और 5 ब फ्रेम घटाव विश्लेषण से प्रतिनिधि छवियों को दिखाने के।
    6. RLI (एफ 0) घटाया पिक्सल फूट डालो। ΔF / एफ मूल्यों को प्राप्त करने के लिए [RLIs द्वारा फूट डालो] क्लिक करें
  2. निर्यात डेटा प्रत्येक वोल्टेज कदम आगे GEVI वोल्टेज संवेदन गुणों का विश्लेषण करने के लिए ΔF / एफ मूल्यों की गणना। ऐसे ΔF / एफ के रूप में रेखांकन आकर्षित करने के लिए की तुलना में बाद में डेटा के लिए वोल्टेज का विश्लेषण करती है इन मूल्यों का प्रयोग करें।
  3. 'BNCs शो' मेनू क्लिक न करके वर्तमान और वोल्टेज रेखांकन निकालें। करने के लिए जाओ [उत्पादन] - [निशान प्रदर्शित (ASCII) के रूप में सहेजें] मानक रेखांकन सॉफ्टवेयर द्वारा वक्र ढाले विश्लेषण के लिए एक ASCII फ़ाइल स्वरूप में प्रतिदीप्ति का पता लगाने के निर्यात करने के लिए।

5. डेटा विश्लेषण

  1. GEVI का वोल्टेज संवेदन संपत्ति
    1. एक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम में वोल्टेज बनाम ΔF / एफ मूल्यों साजिश रचने के द्वारा बनाम वोल्टेज ग्राफ (FV) प्रतिदीप्ति परिवर्तन ड्रा। एक बोल्ट्जमान समारोह (तालिका 2) करने के लिए वक्र फिट क्लिक करके ऑप्टिकल संकेत का वोल्टेज सीमा निर्धारित करने के लिए [विश्लेषण] - [फिटिंग] - [sigmoidal फिट] - [खोलें संवाद], और फिर बोल्ट्जमान समारोह चुनें।
      नोट: एक समारोह के लिए फिटिंग बनाता है यह संभवई अलग वोल्टेज जांच की वोल्टेज संवेदन गुण को चिह्नित करने या विभिन्न कक्षों में उनके प्रदर्शन की तुलना करें। बोल्ट्जमान समारोह जांच इस पत्र में परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि इन जांच से FV घटता sigmoidal पैटर्न दिखा।
    2. प्रारंभिक और अंतिम मूल्यों (ए -1 और ए 2) समारोह द्वारा गणना का उपयोग करके प्रत्येक ΔF / एफ मूल्य मानक के अनुसार।
      नोट: बोल्ट्जमान समीकरण में, कम से कम एक 1 है और अधिकतम एक 2 है। सामान्य बनाने के लिए, एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर का उपयोग शून्य के रूप में एक 1 और एक के रूप में एक 2 परिभाषित द्वारा ΔF / एफ मूल्यों को समायोजित करने के लिए। सामान्यीकृत ΔF / एफ मूल्यों औसत और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए मानक त्रुटि की गणना।
    3. सामान्यीकृत ΔF replot / एफ मूल्यों वोल्टेज बनाम के रूप में पहले खंड 5.1.1 में वर्णित)।
  2. ऑप्टिकल प्रतिक्रिया की गति
    1. एक डेटा विश्लेषण के साथ ASCII कदम 4.2.2 से अर्जित फ़ाइल) खोलेंकार्यक्रम और समय बनाम ΔF / एफ ट्रेस साजिश है।
    2. पर डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में 'डाटा चयनकर्ता' पर क्लिक करें और एक समय बिंदु का चयन एक कदम वोल्टेज नाड़ी की शुरुआत और एक दूसरी बार बात है जब ऑप्टिकल संकेत स्थिर राज्य तक पहुँच गया है के लिए इसी। क्लिक करके दोनों एक सिंगल और डबल घातीय क्षय समारोह के लिए इस श्रृंखला के लिए फिट [विश्लेषण] - [फिटिंग] - [घातीय फिट] - [खोलें संवाद], और एक घातीय क्षय समारोह चुनें। बेहतर फिट रिपोर्ट।
      नोट: एकल या डबल घातीय क्षय कार्यों के लिए फिटिंग करके, τ द्वारा प्रतिनिधित्व मात्रा निर्धारित समय स्थिरांक का अधिग्रहण किया जा सकता है। यह प्रयोगकर्ताओं में मदद मिलेगी अलग वोल्टेज संकेतक के साथ किया उनके माप के कैनेटीक्स की तुलना करें। प्रतिदीप्ति का पता लगाने के तेज और धीमी घटकों एक डबल घातीय क्षय समारोह के साथ वर्णित किया जा सकता है कि दिखा सकता है। इस मामले में, गणना के विभिन्न आयाम के साथ दो समय स्थिरांक में परिणाम होगा।
    3. गणना वेंई भारित τ स्थिरांक एक घटक के साथ जांच के लिए दो अस्थायी घटकों का प्रदर्शन जांच के कैनेटीक्स तुलना करने के लिए।
      नोट: के रूप में निम्नलिखित सूत्र द्वारा परिभाषित एक भारित ताऊ, τ 1 का योग रिश्तेदार आयाम से गुणा, एक 1, प्लस τ 2 रिश्तेदार आयाम से गुणा, ए 2 के रूप में गणना की जाती है; 1 समीकरण

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Representative Results

क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं प्रतिदीप्ति तीव्रता में महत्वपूर्ण परिवर्तन और प्लाज्मा झिल्ली अभिव्यक्ति की डिग्री प्रदर्शन कर सकते हैं। भले ही coverslip पर कुछ कोशिकाओं आंतरिक प्रतिदीप्ति के स्तर पर अलग होगा। यह सेल द्वारा अवशोषित अभिकर्मक एजेंट की मात्रा के कारण सबसे अधिक संभावना है। (उज्ज्वल, गोल कोशिकाओं, उच्च आंतरिक प्रतिदीप्ति) के साथ कभी कभी, बहुत ज्यादा अभिव्यक्ति सेल सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया apoptosis 27 में जिसके परिणामस्वरूप अनुभव करने के लिए कारण बनता है। इसलिए प्रयोगकर्ता के बाद से आंतरिक अभिव्यक्ति है कि शोर अनुपात (SNR) के लिए संकेत को कम करती है एक गैर जिम्मेदार प्रतिदीप्ति बनाता है जितना संभव हो कम आंतरिक प्रतिदीप्ति के साथ दोनों उज्ज्वल कोशिकाओं और मंद कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए आगाह किया है।

एक और विचार chromophores की परिपक्वता की दर है। चित्रा 3 स्वीकर्ता chromoph के प्रतिदीप्ति में असमानता से पता चलता हैअयस्क (mRuby2) जो दाता क्रोमोफोर (तिपतिया घास) की तुलना में लंबे समय तक परिपक्वता का समय दिया है।

चित्र तीन
चित्रा 3. HEK 293 कोशिकाओं के confocal छवियों क्षणिक एक झल्लाहट आधारित GEVI, साथ ट्रांसफ़ेक्ट Nabi2.242। (ए) एक HEK सेल के Confocal छवियों, झल्लाहट दाता और स्वीकर्ता से झिल्ली स्थानीय प्रतिदीप्ति दिखा (बी) के एक संभावित परिणाम दिखा Confocal छवियों mRuby2 की धीमी परिपक्वता। सभी चार कोशिकाओं तिपतिया घास प्रतिदीप्ति दिखा रहे हैं जबकि केवल दो प्रदर्शनी mRuby2 प्रतिदीप्ति। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

छवियों को एक confocal खुर्दबीन से हासिल किया गया। झल्लाहट दाता के लिए, तिपतिया घास, 488 एनएम लेजर उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया गया था और उत्सर्जन कैप्टन गया थाका आश्वासन दिया साथ 525/50 एनएम bandpass फिल्टर। झल्लाहट स्वीकर्ता, mRuby2, उत्तेजना के लिए 561 एनएम लेजर और 595/50 एनएम bandpass फिल्टर के साथ प्रकाशित की गई थी उत्सर्जन के लिए इस्तेमाल किया गया था। confocal इमेजिंग के लिए नमूने फॉस्फेट बफर खारा 7.4 पीएच पर समायोजित में 4% paraformaldehyde / sucrose के समाधान के साथ तय किया गया और उसके बाद एक विरोधी फीका अभिकर्मक के साथ मुहिम शुरू की।

एक बार जब अभिकर्मक शर्तों अनुकूलित कर रहे हैं, भिन्नता के अगले स्रोत ब्याज के क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए विश्लेषण किया जा से आता है। फ्रेम घटाव का उपयोग करते हुए उच्चतम प्रतिदीप्ति परिवर्तन के साथ सेल के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए अक्सर ΔF / एफ मूल्य को अधिकतम करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक वैकल्पिक सेल से प्रकाश प्राप्त पिक्सल के सभी का चयन करने के लिए है। इस शोर की कमी है, जिसके परिणामस्वरूप पिक्सेल की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन संकेत आकार कम हो जाती है के बाद से गैर जिम्मेदार आंतरिक प्रतिदीप्ति शामिल है। दोनों तरीकों के रूप में लंबे समय तक लगातार बनी हुई है प्रयोगकर्ता के रूप में ठीक हैं।

चित्रा -4 ए एक HEK सेल एक एकल एफपी आधारित GEVI, Bongwoori व्यक्त की प्रतिदीप्ति परिवर्तन को दर्शाता है। यह कदम रखा वोल्टेज दालों के जवाब में एक ठेठ प्रतिदीप्ति परिवर्तन है। इस डेटा से एक GEVI की वोल्टेज संवेदनशीलता साजिश और पर और एक या दो घातीय क्षय समारोह के लिए फिटिंग द्वारा विभिन्न वोल्टेज पर τ स्थिरांक बंद का निर्धारण कर सकते हैं। 16 परीक्षणों को आम तौर पर औसतन HEK कोशिकाओं इमेजिंग जब छोटे वोल्टेज कदम के SNR सुधार करने के लिए और रिकॉर्डिंग के दौरान किसी भी संभावित विरंजन पता लगाने के लिए कर रहे हैं। उन जांच जो 100 एम वी पर एक मजबूत संकेत दे अलग hippocampal न्यूरॉन्स (चित्रा 4C) में परीक्षण किया जा सकता है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन से प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए एक एकल परीक्षण है।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक एकल एफपी आधारित GEVI के साथ वोल्टेज इमेजिंग व्यक्तHEK 293 कोशिकाओं और hippocampal प्राथमिक न्यूरॉन्स। (ए) एक एकल एफपी आधारित GEVI, Bongwoori की ΔF / एफ का पता लगाने के लिए एक उच्च गति सीसीडी कैमरा के साथ 1 kHz पर दर्ज कदम रखा वोल्टेज दालों के लिए प्रतिक्रियाओं में दिखा। (ख) एक HEK 293 सेल उच्च गति सीसीडी कैमरा के साथ imaged; (बाएं) आराम हल्की तीव्रता एक सेल Bongwoori व (दाएं) फ्रेम घटाव छवि पिक्सल जहां प्रतिदीप्ति परिवर्तन मनाया गया का संकेत व्यक्त की (RLI)। (सी) माउस हिप्पोकैम्पस प्राथमिक Bongwoori व्यक्त न्यूरॉन्स से प्रेरित कार्रवाई की क्षमता के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग। कार्रवाई क्षमता पूरे सेल वर्तमान दबाना मोड के तहत पैदा हुए थे। ΔF / एफ ट्रेस पिक्सल सोमा के लिए सहसंबद्ध से चुना गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक प्रतिनिधि Fluoदाता और स्वीकर्ता chromophores की rescence readout चित्रा 5 ए में दिखाया गया है। प्रतिदीप्ति परिवर्तन के polarity दाता और स्वीकर्ता ratiometric विश्लेषण सक्षम करने के लिए सहसंबद्ध शोर स्रोतों, जैसे।, आंदोलन को कम करने के लिए विपरीत है। उदाहरण के लिए, आंदोलन सहसंबद्ध शोर दोनों दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति के लिए एक ही दिशा में प्रतिदीप्ति में एक परिवर्तन प्रदर्शन करेंगे। जबकि झल्लाहट आधारित जांच ratiometric इमेजिंग के लिए सक्षम है, यह केवल उज्जवल क्रोमोफोर विश्लेषण करने के लिए अक्सर बेहतर है। यह वह जगह है। क्योंकि मद्धम क्रोमोफोर काफी रिकॉर्डिंग के शोर में वृद्धि कर सकते चित्रा 5 ब इस प्रभाव को दर्शाता है। उज्जवल तिपतिया घास से चित्रा 5 ब में फ्रेम घटाव स्पष्ट रूप से पता चलता है जहां ऑप्टिकल संकेत सेल में है। इसके विपरीत, mRuby2 प्रतिदीप्ति के फ्रेम घटाव सेल भर शोर के उच्च डिग्री से पता चलता है। इसलिए, तिपतिया घास के ही दाता संकेत फाई में एक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन में दिखाया गया हैGure 5C।

चित्रा 5
चित्रा एक झल्लाहट आधारित GEVI साथ 5. वोल्टेज इमेजिंग HEK 293 सेल और हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स में व्यक्त किया। (ए) ΔF / एफ एक झल्लाहट आधारित GEVI, Nabi2.242, एक उच्च गति सीसीडी कैमरा के साथ 1 किलोहर्ट्ज़ पर दर्ज कदम रखा वोल्टेज दालों के लिए दो तरंग दैर्ध्य पर प्रतिक्रियाएं दिखाने का पता लगा। (बी) के शीर्ष; दाता (तिपतिया घास-RLI, तिपतिया घास-घटाव फ्रेम) और स्वीकर्ता (mRuby2-RLI, mRuby2 फ्रेम घटाव) प्रत्येक एफपी, नीचे के लिए दो अलग अलग थ्रेसहोल्ड के साथ संसाधित छवियों; एक ही सीमा दोनों दाता (तिपतिया घास-RLI, तिपतिया घास-घटाव फ्रेम) और स्वीकर्ता (mRuby2-RLI, mRuby2 फ्रेम घटाव) छवियों के लिए इस्तेमाल किया गया था mRuby2 के रिश्तेदार मंदता वर्णन करने के लिए। सभी छवियों को एक ही सेल HEK 293 Nabi2.242 व्यक्त करने से ले जाया गया। (सी) 520 एनएम तरंगदैर्ध्य टीआरNabi2.244 सेंसर व्यक्त एक माउस हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन से प्रेरित कार्रवाई क्षमता का इक्का। ΔF / एफ ट्रेस पिक्सल सोमा के लिए सहसंबद्ध से चुना गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 ΔF और ΔF / एफ मूल्यों के लिए अलग प्रकाश के स्तर के परिणाम। (ए) एक HEK 293 सेल एक भी एफपी आधारित GEVI, Bongwoori व्यक्त करने का एक छवि, आराम हल्की तीव्रता में दिखाया गया है (RLI), (बी) प्रतिदीप्ति निशान दिखा गिरी औसतन झिल्ली क्षेत्र में अच्छी तरह से स्थानीय प्रतिदीप्ति संकेत है, इस क्षेत्र के साथ 2: उज्ज्वल आंतरिक रोशनी के साथ एक क्षेत्र, एक ΔF तीन अलग-अलग क्षेत्रों, क्षेत्र 1 से (एफ एक्स एफ 0) मूल्योंडी 3 क्षेत्र: क्षेत्र ऑप्टिकल संकेत से दूर, (सी) प्रतिदीप्ति गिरी दिखा निशान (बी) में एक ही क्षेत्रों से ΔF / एफ मूल्यों औसत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अवधारणाओं समीकरण टिप्पणी
आंशिक परिवर्तन प्रतिदीप्ति (ΔF / एफ) 2 समीकरण एफ 1 = प्रकाश एक समय बिंदु पर मापा तीव्रता, एफ 0 = प्रकाश की तीव्रता होल्डिंग क्षमता पर मापा
बोल्ट्जमान समारोह 3 समीकरण y = ΔF / एफ, एम वी में वी = झिल्ली क्षमता, वी 1/2 आधा अधिक से अधिक ΔF / एफ, एक पर एम वी में झिल्ली क्षमता है 2 = अधिकतम मूल्य, dx = ढलान
डबल घातीय क्षय समारोह y = वाई 0 + 1 एक ई - (टी - टी 0) / τ 1 + A 2 ई - (टी - टी 0) / τ 2 τ 1, τ 2 = समय स्थिरांक, ए 1, ए 2 = आयाम, टी, टी 0 = दो समय अंक, वाई 0 = ऑफसेट

तालिका 2 समीकरण

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Discussion

तंत्रिका तंत्र कई अलग अलग तरीकों में वोल्टेज, अवरोध एक मामूली hyperpolarization, synaptic इनपुट एक अपेक्षाकृत बड़े वोल्टेज परिवर्तन में एक मामूली विध्रुवण और एक संभावित कार्रवाई के परिणाम का कारण बनता है का कारण बनता है का उपयोग करता है। GEVIs द्वारा झिल्ली क्षमता में परिवर्तन के उपाय करने की क्षमता एक साथ neuronal सर्किट के कई घटकों का विश्लेषण करने की अपार संभावना है। इस रिपोर्ट में हम झिल्ली क्षमता में परिवर्तन इमेजिंग GEVIs प्रयोग करने के लिए एक मौलिक विधि का प्रदर्शन।

वोल्टेज में इमेजिंग परिवर्तन के लिए एक प्रमुख कुंजी प्लाज्मा झिल्ली में GEVI के कुशल अभिव्यक्ति है। Intracellular अभिव्यक्ति है कि जांच के SNR कम कर देता है एक गैर जिम्मेदार प्रतिदीप्ति बनाता है। अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन बेहद ऑप्टिकल माप की स्थिरता में सुधार। दरअसल, जब एक उपन्यास GEVI परीक्षण कर यह सुनिश्चित करना है कि ऑप्टिकल गतिविधि में मतभेद के बारे में कुछ करने के लिए पूरी तरह से कारण होते हैं यह भी एक ज्ञात जांच का परीक्षण करने की सलाह दी जाती हैडब्ल्यू जांच और नहीं कोशिकाओं की शर्तों।

चित्रा 6 वोल्टेज इमेजिंग की संवेदनशीलता को कम करने में आंतरिक रोशनी के प्रभाव को दर्शाता है, ΔF / एफ मूल्य। चित्रा 6B ΔF एक HEK सेल एकल एफपी आधारित GEVI, Bongwoori व्यक्त मान दिखाता है। ट्रेस 2 क्षेत्र 2 (नीला रंग) जहां अपेक्षाकृत उज्ज्वल आंतरिक प्रतिदीप्ति चित्रा 6A में देखा जाता है से आता है। इस ट्रेस उज्ज्वल आंतरिक प्रतिदीप्ति जो ΔF / एफ कम हो जाती है के कारण 2 बूँदें काफी चित्रा 6C जहां चित्रा 6B में निशान ΔF / एफ मूल्यों के लिए RLI मूल्यों से विभाजित किया गया है, का पता लगाने में पता लगाने के रूप में 1. ΔF मूल्य के समान स्तर है हालांकि, मूल्यों। प्रतिदीप्ति का पता लगाने के एक बहुत छोटे से 3 ΔF है, लेकिन यह भी एक बहुत छोटे RLI मूल्य (एफ) है। परिणाम एक भ्रामक ΔF / एफ संकेत रिकॉर्डिंग के शोर में पर्याप्त वृद्धि की है कि है। यह उदाहरण ΔF प्रदर्शित करने के लिए शामिल किया गया था यह भी हैजरूरी। यदि एफ के साथ शुरू करने के लिए बहुत कम है ΔF / एफ में एक बड़े परिवर्तन मददगार नहीं है।

एक छवि फाड़नेवाला के उपयोग के लिए एक एकल सीसीडी कैमरे पर दो तरंग दैर्ध्य के सहवर्ती माप सक्षम बनाता है। यह बहुत जांच के विकास के लिए झल्लाहट निर्भर फ्लोरोसेंट परिवर्तन की माप सहायता करता है और सेटअप की लागत कम कर देता है। हालांकि, रंगीन विपथन के कारण, इन दो छवियों से थोड़ा ध्यान एक apochromatic उद्देश्य के लिए जरूरत की जरूरत महसूस से बाहर हो जाएगा। अधिक प्रकाश बेहतर SNR, ताकि उच्चतम संख्यात्मक एपर्चर के साथ उद्देश्यों को चुनने भी प्रतिदीप्ति इमेजिंग में सुधार। इसके अलावा, ऐसे ही एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) या SNR बढ़ाने के लिए लेजर के रूप में मजबूत प्रकाश स्रोतों का उपयोग कर सकते हैं। एल ई डी एक यांत्रिक शटर की आवश्यकता नहीं है।

इस रिपोर्ट में हम एक भी एफपी GEVI और एक झल्लाहट आधारित GEVI से ऑप्टिकल संकेतों दिखा। एक झल्लाहट आधारित GEVI का मुख्य लाभ यह है कि ratiometric इमेजिंग सहसंबद्ध शोर डी की कमी के लिए सक्षम बनाता हैश्वसन और इन विवो में रक्त के प्रवाह को UE। फ्लोरोसेंट संकेतों के विपरीत polarity झिल्ली क्षमता में एक वास्तविक परिवर्तन की पुष्टि करता है। हालांकि, बाद से दो chromophores की प्रतिदीप्ति तीव्रता अक्सर काफी भिन्नता है, SNR भी अलग अलग होंगे। इस ratiometric विश्लेषण घालमेल कर दिया है और इसकी उपयोगिता 28 को सीमित करता है। वहाँ भी एक झल्लाहट स्वतंत्र संकेत 29 हो सकती है। इसलिए यह कभी कभी जब झल्लाहट का उपयोग कर झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए केवल उज्जवल फ्लोरोसेंट क्रोमोफोर का उपयोग करने के लिए बेहतर है।

वोल्टेज इमेजिंग गति और कैल्शियम इमेजिंग जो कैल्शियम प्रवाह उपायों की तुलना में झिल्ली क्षमता में परिवर्तन की परिवर्तनशीलता के कारण कैल्शियम इमेजिंग से ज्यादा चुनौतीपूर्ण है। झिल्ली क्षमता न्यूरॉन्स में कैल्शियम आयन प्रवाह की तुलना में बहुत तेजी से समय के तराजू में परिवर्तन, और subthreshold घटनाओं कैल्शियम इमेजिंग 30 के साथ नहीं मापा जा सकता। इसके अलावा, वोल्टेज जांच प्लाज्मा झिल्ली में होना चाहिएप्रभावी जो झिल्ली क्षमता में ऑप्टिकली रिपोर्ट परिवर्तन करने के लिए उपलब्ध जांच की मात्रा कम हो। नतीजतन, फोटॉनों की संख्या है कि वास्तव में सीसीडी चिप पर पहुंच सकते हैं अपेक्षाकृत कुछ है। यह एक उच्च गति और उच्च क्षमता क्वांटम और एक जांच है कि झिल्ली क्षमता में परिवर्तन पर एक उच्च SNR elicits साथ कम पढ़ा-शोर कैमरा के लिए जरूरत की आवश्यकता है। इन विट्रो में कोशिकाओं इमेजिंग द्वारा, शोधकर्ताओं बेहतर विवो माप में प्रयास करने से पहले संभावित लाभ और GEVIs के नुकसान को समझ सकेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted Microscope Olympus IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35) Olympus UPLSAPO 60XO
Excitation filter Semrock  FF02-472/30 For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Semrock FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp CAIRN OptoSource Illuminator LEDs and lasers are also effective light sources
Slow speed CCD camera Hitachi KP-D20BU
Dual port camera adaptor Olympus U-DPCAD
High speed CCD camera RedShirtImaging, LLC NeuroCCD-SM
Image splitter CAIRN Optosplit 2
Excitation filter Semrock FF01-475/23-25 For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2)
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Chroma ET520/40
Dichroic mirror Semrock FF560-FDi01-25X36
Emission filter Chroma ET645/75
Vibration isolation system Kinetic systems 250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber Warner instruments RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) Electron Microscopy Sciences 72198-20
Temperature controller Warner instruments TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip Ted Pella 260366
Lipofection agent Life Technologies 11668-027
Calcium phosphate reagent Clontech - Takara 631312
Patch clamp amplifier HEKA EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software HEKA Patchmaster
Image acquisition and analysis software RedShirtImaging Neuroplex
Spreadsheet application software Microsoft Microsoft Excel 2010
Data analysis software OriginLab OriginPro 8.6.0
Demagnifier Qioptiq LINOS Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp
Confocal microscope Nikon Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent Life Technologies P36930

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 108 आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज सूचक वोल्टेज इमेजिंग झल्लाहट छवि अलगानेवाला फ्लोरोसेंट प्रोटीन
इमेजिंग झिल्ली फ्लोरोसेंट वोल्टेज सेंसर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग के दो प्रकार के साथ संभावित
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Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad, M., Jung, A., Sung, U., Song, Y. K., Baker, B. J. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J. Vis. Exp. (108), e53566, doi:10.3791/53566 (2016).

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