Introduction
본 연구의 주요 초점은 유전자 코드 형광 단백질을 이용하여 시험관 내에서 막 전위 변화 결상을 입증하는 것이다. 막 전위의 이미지 변화는 신경 회로의 활동을 연구의 흥미로운 가능성을 제공합니다. 형광 강도의 변화에 따라서 막 전위 변화는 카메라의 각 화소는 비 침입 신경 활성의 측정을 가능하게되면 서로 게이트 전극. 40 년의 경우, 유기 전압에 민감한 염료는 1-4 잠재적 인 멤브레인의 변화를 관찰하는 데 유용되고있다. 그러나, 이들 염료는 세포 특이성이 부족하다. 또한, 일부 세포 유형은 염색하기 어렵다. 유전자 인코딩 된 전압 지표 (GEVIs)는 세포가 구체적으로 연구 형광 전압에 민감한 프로브를 표현하는 데 이러한 한계를 극복.
GEVIs의 세 가지 클래스가 있습니다. GEVI의 첫 번째 클래스는 VO를 사용단일 형광 단백질 (FP) 5-9이나 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍 10-12 중 하나와 전압 센싱 포스파타제 도메인에서 전 압을 감지. 센서의 두 번째 클래스는 형광 표시 직접적으로 13-15로 또는 전기 FRET (16, 17)를 통해 미생물 로돕신을 사용합니다. 세 번째 클래스는 두 개의 구성 요소, 막 고정 된 FP 및 막 결합 담금질 염료 18 ~ 20 인 두 번째 구성 요소 인 유전 적 구성 요소를 사용합니다. 두 번째와 세 번째 클래스가 시험 관내 및 슬라이스 실험 (19, 20)에 대한 유용하지만, 센서의 첫 번째 클래스는 현재 생체 내 6를 분석하는 데 유용합니다.
이 보고서에서 우리는 시험 관내에서 GEVIs의 첫 번째 클래스 (그림 1)를 사용하여 막 전위의 영상을 보여줄 것입니다. 전압 센서의 첫 번째 클래스는 생체 내 이미징로 전환 할 수있는 가장 쉬운 방법입니다. GEVIs U 이후약 센서 로돕신 클래스보다 밝게 50 배 FP 융합 전압 감지 영역이다 tilizing 그들이 아크 램프 조명을 이용하기보다는 매우 강력한 레이저를 필요로 묘화 될 수있다. 휘도 불균형의 또 다른 결과 GEVIs의 일류 쉽게 뇌의 자동 형광을 초과 할 수 있다는 것이다. 로돕신 기반 프로브는 할 수 없습니다. 센서의 세 번째 클래스는 첫 번째 클래스만큼 밝은하지만 생체 내에서 관리하기 어려운 화학 소광의 추가가 필요합니다.
그러므로 우리는 하나의 FP (Bongwoori) 8 FRET 쌍으로 구성된 프로브 (나비 2) (12)와 프로브의 인수를 시연 할 예정이다. 나비 2.242과 나비 2.244라는 이름의 녹색 형광 기증자, 클로버로 구성된 11, 빨간 형광 수용체, mRuby2 - VSFP-CR (클로버 - mRuby2 전압에 민감한 형광 단백질)의 나비 버전은 FRET이 보고서에 구축되어 
그림 1.이 보고서 (A)에 군데 유전자 인코딩 된 전압 표시 (GEVIs) 횡단 막 전압 감지 도메인과 형광 단백질을 갖는 GEVI 기반의 모노 FP의 두 가지 유형. (B) 횡단 막 전압 감지 도메인, FRET 공여체와 수용체로 구성 FRET 기반 GEVI. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
윤리 문 : 동물 실험 프로토콜은 KIST 동물 프로토콜 2014-001에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
1. 장비 설치
- 영상 설정
- 진동 절연 테이블에 거꾸로 형광 현미경을 놓습니다. 대물 렌즈와 전압 이미징에 사용하기에 적합한 형광 단백질 다이크로 익 미러와 필터를 구비 한 필터 큐브 (1.35 개구 수 60X 오일 침지 렌즈)를 사용하여 고배율.
주 :이 설치 높은 NA와 사용 목적을 위해 거꾸로 현미경을 사용하지만, 수직 현미경을 사용할 수도있다. 높은 개구 수 (NA)의 대물 렌즈는 낮은 NA함으로써 잡음비 (SNR에 신호를 향상으로보다 많은 빛을 수집 때문에 실제로 도립 현미경은 단지 프로브 개발이다 나눈 피크 광 신호로서 설명 될 수있다 기준의 표준 편차기록 형광). 비 개발자를 위해, 우리는 조각이나 생체 내 녹음에서 응용 프로그램의 직립 현미경을 추천 할 것입니다. - 광원을 준비 예., 크세논 아크 램프, 효율적인 표면 형광 넓은 필드 이미징 기계 셔터를 구비. 마운트 광 가이드를 통해 현미경으로 빛을 직접. 광 여기 필터를 통과하며 필터 큐브 제 다이크로 익 미러에 의해 반사된다. 보기 (21)의 필드 위에 극대화 빛의 강도와 균일하게 시료를 조명 빛을 맞 춥니 다.
참고 : 전통적으로, 75 와트 아크 램프는 밝은 조명 필드를 더 높은 와트 전구가 큰 만들 수 있기 때문에 사용되지만되지 않았습니다. 레이저가 이용 될 수 있지만, 하나의 파장에 한정된다. LED가 밝게되고 실제로 선택의 광원 여러 파장을 제공하고 기계적 셔터를 필요로하지 않는 수있다. - fluoresc에 두 개의 CCD 카메라를 탑재도 2D에 도시 된 바와 같이 런스 현미경.
주 : 제 CCD 카메라는 높은 공간 해상도를 가지고 시험 할 세포막에 GEVI 발현 세포의 식별을 위해 사용된다. 막 전위의 이미지 변경, 제 2 CCD 카메라는 높은 프레임 레이트 초 (FPS) 당 등 1,000 프레임이 있는지 확인합니다. 두 CCD 카메라 사이 촬상 경로를 전환하는 듀얼 포트 카메라 어댑터 (도 2D-(3))를 사용한다. 이렇게 설정 demagnifier 번째 CCD 카메라의 CCD 칩 상에 대물 렌즈의 이미지에 맞게 사용된다. - FRET 기반 GEVI의 이미지에 대한 첫 번째 (느림) 및 제 (빠른) CCD 카메라와 영상 분배기를 설치합니다. 필터 큐브 이색 미러 (560 ㎚)와 두 발광을 갖는 필터를 삽입 (520 ㎚ / 645 내지 40 / 75), 화상 분할한다. 이보기의 두 개의 필드, 수용체 형광을 나타내는 기증자 형광 다른 하나가 발생합니다. 이 S 제거econd 필터 큐브는 하나의 FP와 GEVI 이미징 때.
참고 :이 방법으로 시험 한 FP 기반 GEVI는 FP, 슈퍼 황도 pHluorin A227D (SE A227D)를 사용 Bongwoori입니다. 여기 필터 (/ 30 472 ㎚), 발광 측 필터 (497 ㎚ / 롱 패스)와 다이크로 익 미러 (495 나노 미터)을 그 여기 및 발광 스펙트럼을도 5에 기초하여 선택 하였다. 일반적으로 여기 및 방사 필터 이색 거울 블록 임의 여기 광이 방출 필터를 투과하면서 선명한 화상을 취득하는 형광 물질의 각 스펙트럼 최대 오버랩을 가져야한다. FRET 쌍 (11)을 기반 GEVI 기록 용 필터, 다이크로 익 미러의 선택은 도너와 수용체의 동시 형광 관찰 화상 스플리터 큐브 2 필터를 필요로하는 것을 제외하고 동일한 원리를 따른다. 현미경 필터 박스에 배치 된 제 1 필터 큐브 클로버 여기 필터 (475 ㎚ / 23)를 가질 필요가있다. 그런 다음, f를 방출두 FPS에서 luorescence는 제 이색 미러 (495 ㎚)를 통해 제 2 필터 큐브에 송신한다. 제 2 필터 큐브는 다이크로 익 미러 (560 ㎚) 각 FP 따라서 두 개의 서로 다른 FPS에서 형광을 분리하는 두 개의 방출 필터 (클로버 520 나노 미터 / 40 mRuby2에 대한 645 nm의 / 75)가 있습니다.
- 진동 절연 테이블에 거꾸로 형광 현미경을 놓습니다. 대물 렌즈와 전압 이미징에 사용하기에 적합한 형광 단백질 다이크로 익 미러와 필터를 구비 한 필터 큐브 (1.35 개구 수 60X 오일 침지 렌즈)를 사용하여 고배율.
| 단일 FP 기반 GEVI (Bongwoori) | 쌍 기반 GEVI을 FRET (나비 2.42 및 나비 2.44) | ||
| 현미경에 넣고 1 필터 큐브 | 여기 필터 | 472 나노 미터 / 30 | 475 나노 미터 / 23 |
| 다이크로 익 미러 | 495 nm의 | 495 nm의 | |
| 방출 필터 | 497 nm의 / 장거리 패스로 | - | |
| 빔 스플리터에 넣고 2 필터 큐브 | 다이크로 익 미러 | - | |
| 배기 필터 (1) | - | 520 나노 미터 / 40 | |
| 배기 필터 (2) | - | 645 나노 미터 / 75 |
단일 FP 기반 GEVI과 FRET 기반 GEVI 녹음에 사용되는 표 1. 두 개의 다른 필터 세트
- 진동 절연
- 진동 절연 테이블에 구성 요소를 움직이는 모든 장비를 설치하지 마십시오. 비 절연 장비에 연결된 케이블이 샘플의 진동을 피하기 위해 느슨한 지 확인합니다.
- 패치 클램프 챔버
- 대물 렌즈의 작동 거리가 상대적으로 작기 때문에 얇은 # 0 커버 유리 패치 클램프 챔버의 바닥을 밀봉. 이 거꾸로 현미경 설치의 단점이다.
주 : 높은 NA 대물 렌즈를 구비 한 트레이드 오프가 작동 거리가 감소함에. specim을 배치하기 위해매우 짧은 작동 거리 내에 EN은, 커버 글라스와 커버 슬립 (공정 2)는 가능한 한 얇게 할 필요가있다.
- 대물 렌즈의 작동 거리가 상대적으로 작기 때문에 얇은 # 0 커버 유리 패치 클램프 챔버의 바닥을 밀봉. 이 거꾸로 현미경 설치의 단점이다.
- 온도 제어
- 욕 용액을 33 O C 실험 내내 주위 패치 세포를 유지하는 온도 조절기를 통과하는지 확인.
- 장비 연결
- 패치 클램프 증폭기 및 고속 CCD 카메라 총검 닐 - Concelman (BNC) 명령 상자 광원의 기계적 셔터를 연결한다. 이것은 증폭기, 카메라, 동시에 상기 광원을 제어하는 촬상 소프트웨어를 활성화 할 것이다.
주 : 전기 촬상 부품 전기적 활성도 동시에 전기 광학 기록을 제공하기 위해 동기화 될 필요가있다.
- 패치 클램프 증폭기 및 고속 CCD 카메라 총검 닐 - Concelman (BNC) 명령 상자 광원의 기계적 셔터를 연결한다. 이것은 증폭기, 카메라, 동시에 상기 광원을 제어하는 촬상 소프트웨어를 활성화 할 것이다.
그림 2. 착용그것은에 도달하기 전에 GEVIs와 전압 이미징 광 경로를 따라 흐름 (A) 75 와트 제논 아크 램프, (B) 아크 램프로부터 여기 광에 대한, 표준 설치 제 다이크로 익 미러에 의해 상기 여기 필터로 여과 한 후 반사 시료 스테이지 오른쪽 상단에 삽입 된 저속 CCD 카메라 셀 패치 클램프 모두 선택을 돕기 위해 사용되는 전체 셀 구성, (C), (D) 영상 획득 부를 나타낸다 (1) 고속 CCD 카메라 (2) FP GEVIs 페어링 모노 FRET 모두 화상 스플리터 (3) demagnifier가 고속 CCD 카메라의 CCD 칩 상에 이미지를 맞추기 위해 (4) 이중 포트 카메라 어댑터 패치 셀의 식별, (E 및 F)의 단일 FP 기반 GEVI (E)와 이미지 획득 및 FRET 기반 GEVI 높은 공간 해상도로 촬상 경로 (5) 저속 CCD 카메라 전환(F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
GEVIs 2. 식
- 인간 배아 신장 293 세포에서
- 배양 인간 배아 신장 293 (HEK 293) CO 2 인큐베이터 (5 % CO 2)에서 37 ℃로 10 % 소 태아 혈청으로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)와 함께 세포. 100mm 직경 20mm 높이 조직 배양 접시를 사용합니다. 2 × 10 (3) 문화를 시작 - / cm 2 6 × 10 3 세포가 이후의 형질 전환을위한 80~90%의 포화 상태에 도달 할 때까지 품어.
- 트랜 스펙 션 당일, 세포 배지를 부드럽게 흡인 둘 베코 인산염 완충 식염수에 한번 세척 하였다. 1 ~ 2 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 용액으로 HEK 293 세포를 분산 솔루션을 대기음 부드럽게 C를 분리 접시의 측면을 누릅니다ELL 학생. 신선한 DMEM (10 % FBS)을 추가하고 피펫 팅에 의해 응집되어 세포를 떼어 놓다. 혈구를 사용하여 세포 농도를 결정한다.
- 0.08 플레이스 - 0.13 mm 두께 10mm 직경 프리 코팅 24- 웰 조직 배양 접시에 폴리 -L- 라이신으로 커버 슬립. 1 × 105 세포 / ㎠의 셀 밀도로 된 커버에 HEK 293 세포 종자.
주 : HEK 293 세포가 서로 간극 접합을 형성 할 수 있기 때문에, 시드 수가 분리 된 세포를 생성 할 필요가있다. - 일시적 제조자의 지시에 따라 리포 펙션 시약을 사용하여 GEVI를 코딩하는 유전자를 적절한 구조물로 세포를 형질 감염.
참고 : 백본 벡터로이 단계를 활용 한 pcDNA3.1 (Bongwoori) 및 pUB2.1 (나비 2.242)에 사용되는 유전자 구조를. DNA의 사용 양은 각 커버 슬립에 대한 ng를 100이었다 그러나, 형질 전환 조건은 각 GEVI 테스트 할 대해 경험적으로 결정될 필요가있다.
- 해리 마우스 엉덩이에pocampal 차 뉴런
- 배아 일 17 C57BL6 / N 쥐에서 해마를 해부 이전 22, 23 설명 된대로 다음 해마 신경 세포를 떼어 놓다.
- 접시 폴리 D 라이신 코팅 0.08-0.13 mm 상 해리 뉴런 두께 / ㎖의 세포 밀도를 1 × 105 세포에서 10 mm 직경 커버 슬립. CO 2 배양기를 37 ℃로 세포를 품어 (5 % CO 2).
- 앞서 설명한 바와 같이 24 인산 칼슘 형질 감염 시약을 이용하여 GEVI을 코딩하는 유전자 구성체 관내 (DIV)에 6~7일에 일시적 해리 뉴런 형질.
참고 : 백본 벡터로이 단계를 활용 한 pcDNA3.1 (Bongwoori) 및 pUB2.1 (나비 2.244)에 사용되는 유전자 구조를. 사용되는 DNA의 양은 각각 1 μg의 커버 슬립 하였다. 또, 형질 전환 조건은 각 시험 GEVI에 대한 경험적으로 결정해야합니다.
- 심상을 전압 이전에 발현 수준을 확인카
- CO 2 배양기에서 조직 배양 접시를 타고 표면 형광 현미경으로 형질 감염된 세포에서 형광을 관찰합니다.
- 막에서 형광을 확인한 후, 섹션 3에서 전압 이미징 패치 챔버에 커버 슬립을 전송합니다.
주 : 전압 영상 16 실시 - 24 시간 후 형질 전환합니다. 다른 형광 단백질은 다른 성숙 시간이 그러나, 일부 GEVIs 포스트 형질 전환에 더 많은 시간이 필요합니다. 예를 들어,이 프로토콜에 mRuby2를 포함하는 FRET 쌍 mRuby2의 성숙은 클로버 (11)보다 훨씬 더 오래 걸립니다 때문에 표현하는 데 시간이 더 걸릴 수 있습니다. 공여자와 수용자 모두의 형광 확인해야합니다.
3. 전압 이미징 프로토콜
- 좋은 멤브레인 식으로 건강한 셀을 선택
- 현미경을 사용하여, 즉 강한 보여줍니다 건강한 세포 (그림 4B)을 찾아내부 형광에 비해 막 지역화 형광. 둥근 세포를 패치하지보십시오. 원형 세포 중 하나를 분할 또는 사망 및 패치하기 어려운된다. 다음 패치 클램프 실험을 돕기 위해 시간에 진폭과 5.0 밀리 초에서 5.0 MV의 테스트 펄스를 적용합니다.
- 전압 이미징을위한 셀을 준비
- 패치 셀을 선택한 후 셀 위의 패치 클램프 피펫을 배치합니다. 이 부드럽게 세포막에 닿을 때까지 피펫을 가져옵니다. 패치 클램프 소프트웨어 (25)에 막 저항 2 MΩ 상승 -이 단계에서, 1 MΩ을 관찰합니다.
참고 : 때때로, 좋은 기가 옴 시일이 세포막을 터치하는 것만으로 발생할 수 있습니다. 한 기가 옴 밀봉 안정, 그것은 확인을해야합니다. - 부드럽게 피펫을 통해 부정적인 압력을 적용하여 기가 옴 밀봉을 설정합니다. 원하는 들고 전위 피펫 잠재력을 설정합니다.
- 기가 옴 인감, 이미지 번째를 유지하면서전자 고속 CCD 카메라로 셀 막 면적에 초점을 맞춘다.
- 입으로 흡입 펄스를인가함으로써 세포막을 파열되거나 전체 셀 구성 (26)을 부드럽게 야구.
- 이미지 패치는 영상 소프트웨어를 사용하여 실험 설계에있어서 전체 셀 클램프 구성에서 셀을 채워
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 'CCD의 ACQUIRE'페이지를 열려면 [SciMeasure 카메라] 메뉴 - [ACQUIRE]를 클릭합니다.
- 이미지를 저장하기 위해 새로운 데이터 파일을 만듭니다.
- 다음 [아날로그 출력]을 클릭하고 이미지를 수행하는 펄스 프로토콜 파일을 열려면 [ASCII 읽기]. 데이터가 평균해야하는 경우 '내부 반복 대한 평균값'을 클릭합니다. 그런 다음 '아날로그 출력'페이지를 닫습니다.
주 :이 펄스 프로토콜 설계 및이 단계에 앞서 각각의 실험 목적에 따라 '이 .txt'파일로 저장 될 필요가있다. - 설정 특정 acquis'CCD의 ACQUIRE'페이지에서 ition 매개 변수를 설정합니다. 입력 '획득을위한 프레임 수'와 '시련의 수'에 대한 특정 값.
참고 : 프레임 번호가 수집 속도 펄스 프로토콜의 타이밍에 의해 결정된다. 예를 들어, 영상은 1 kHz에서, 1000 프레임 촬영 시간의 1 초에 해당합니다. - 녹음을 시작 버튼 [(광학 + BNC) 데이터를 TAKE]를 클릭합니다. 전압 이미징이 진행되는 동안, 전체 셀에 걸쳐 안정적인 구성을 위해 패치 클램프 소프트웨어의 오실로스코프 창의 시계.
참고 GEVI의 응답 전압 범위를 테스트하기 ΔF / F 값 또는 생리 전압 범위에서 시간 해상도에서의 신호 크기를 MV -170 mV 이상 130에 이르는 펄스 프로토콜 단차 갖는 전압 펄스로 전체 셀 전압 클램프 실험을 수행. 활동 전위를 해결 GEVI의 성능을 확인하기 위해 배양 프리마에서 유발공예 뉴런, 이미지 전체 셀 전류 클램프 구성에서 셀.
- 패치 셀을 선택한 후 셀 위의 패치 클램프 피펫을 배치합니다. 이 부드럽게 세포막에 닿을 때까지 피펫을 가져옵니다. 패치 클램프 소프트웨어 (25)에 막 저항 2 MΩ 상승 -이 단계에서, 1 MΩ을 관찰합니다.
4. 데이터 수집
- ΔF / F의 계산
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 클릭 [파일] - 데이터 파일을 열어 [읽기 데이터 파일]을 분석한다. 우측 휴지 광량 (RLI)의 셀 이미지를 관찰
주 : 소프트웨어 평균을 제 5 프레임을 기록 RLI를 결정한다. - 화면에 측정 된 전류 및 전압 값을 가지고 '쇼 BNC 컨넥터'를 클릭합니다.
- 응답 광 신호와 픽셀을 식별하기 위해 프레임 빼기 기능을 활용하는 '프레임 빼기'에 'RLI 프레임'에서 페이지 모드를 변경합니다. 모든 픽셀은 형광의 잠재적 변화를 관찰 할 수 있기 때문에이 영상의 진정한 힘이다.
- 감산 두 시점 (F 0 F 1)을 선택합니다. 인 셀 식별하는 영역응답 신호를 보여주는 것은 잠재적 인 변화를 막을 수 있습니다.
주 : 프레임 감산 이미지 SNR은 신호를 시간적으로 평균을 각 시점을 위해 다수의 프레임을 선택함으로써 개선 될 수있다. 이 소프트웨어는 선택된 프레임에서 가져온 평균 광 강도를 빼고 F (1) -F 0 값 (ΔF)를 계산한다. 일반적으로 하나의 자극 기간 동안 촬영 유지 전위와 다른 시간 지점에서 취득한 시점을 선택한다. - 드래그 나 컴퓨터 마우스와 각 화소를 클릭하여 분석 될 필요가 화소를 지정한다. 소프트웨어 윈도우의 좌측에 선택된 픽셀의 평균 형광 강도의 그래픽 표현을 관찰한다.도 4b 및도 5b는 상기 프레임 차분 해석 대표 화상을 도시한다.
- RLI (F 0)에 의해 감산 픽셀을 나눈다. ΔF / F 값을 얻기 위해 [R1은 나누기]를 클릭합니다
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 클릭 [파일] - 데이터 파일을 열어 [읽기 데이터 파일]을 분석한다. 우측 휴지 광량 (RLI)의 셀 이미지를 관찰
- 데이터 내보내기
- '쇼 BNC 컨넥터'메뉴를 unclicking에 의해 전류 및 전압 그래프를 제거합니다. 로 이동 [OUTPUT] - 표준 그래프 소프트웨어에 의해 커브 피팅 분석을위한 ASCII 파일 형식으로 형광 추적을 내보낼 [표시 (ASCII)로 추적 저장].
5. 데이터 분석
- GEVI의 전압 감지 특성
- 데이터 분석 프로그램에서 전압 대 ΔF / F 값을 플롯에 의해 전압 그래프 (FV) 대 형광 변화를 그립니다. 클릭에 의해 광 신호의 전압 범위를 결정 볼츠만 기능 (표 2)에 커브를 피팅 [분석] - [피팅] - [S 자형 착용감] - [열기 대화는, 다음 볼츠만 함수를 선택한다.
참고 : 함수에 피팅이 possibl한다E는 다른 전압의 프로브 전압 감지 특성을 특성화하거나 상이한 세포에서 그들의 성능을 비교하기 위해. 이 프로브로부터 FV 곡선 S 자형 패턴을 표시하기 때문에 볼츠만 함수는이 논문에서 테스트 프로브를 사용할 수있다. - 초기 및 최종 값 함수에 의해 계산 된 (A (1)과 2)를 사용하여 각 ΔF / F 값을 정규화.
주 : 볼츠만 방정식에 최소 1이고 최대 값은 2이다. 정규화 제로로서 1 일 등이 정의하여 ΔF / F 값을 조정하기 위해 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어를 사용한다. 정규화 된 ΔF / F 값을 평균 및 통계 분석을위한 표준 오차를 계산한다. - 정규화 된 ΔF Replot / 전압 대 F 값은 이전에) 섹션 5.1.1에 설명.
- 데이터 분석 프로그램에서 전압 대 ΔF / F 값을 플롯에 의해 전압 그래프 (FV) 대 형광 변화를 그립니다. 클릭에 의해 광 신호의 전압 범위를 결정 볼츠만 기능 (표 2)에 커브를 피팅 [분석] - [피팅] - [S 자형 착용감] - [열기 대화는, 다음 볼츠만 함수를 선택한다.
- 광 응답 속도
- 데이터 분석 단계 4.2.2에서 얻은 ASCII 파일)을 엽니 다프로그램과 시간에 대한 ΔF / F 추적을 플롯.
- 데이터 분석 소프트웨어의 데이터 선택 '을 클릭 단차 전압 펄스의 시작 및 광 신호가 정상 상태에 도달 한 제 2 시간 포인트에 대응 한 시점을 선택한다. 클릭하여 단일 및 이중 지수 감쇠 기능을 모두이 범위에 맞는 [분석] - [피팅] - [지수 피팅] - [열기 대화 상자], 및 지수 감쇠 기능을 선택합니다. 더 나은 착용감을보고합니다.
주 : 단일 또는 이중 지수 감쇠 함수에 끼워 맞춤으로써, τ로 나타내는 정량의 시간 상수를 얻을 수있다. 이 도움이 될 것입니다 실험자는 다른 전압 지표 함께 할 그들의 측정의 반응 속도를 비교합니다. 형광 추적은 이중 지수 감쇠 기능을 설명 할 수 있습니다 빠르고 느린 구성 요소를 표시 할 수 있습니다. 이 경우, 계산은 상이한 진폭 두 시정 될 것이다. - 일을 계산전자 가중 τ 상수는 하나의 구성 요소와 프로브 두 시간 구성 요소를 나타내는 프로브의 반응 속도를 비교한다.
주 : 수학 식에 의해 정의 된 바와 같은 가중 된 타우는, 상대적인 진폭 승산 상대적인 진폭 승산 τ (1)의 합계 1 플러스 τ 2, 2로 계산된다;
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Representative Results
일시적으로 형질 감염된 세포는 크게 형광 강도의 변화 및 세포막 발현의 정도를 나타낼 수있다. 심지어 같은 coverslip에 일부 세포는 내부 형광의 다양한 수준을 제공합니다. 이는 세포에 의해 흡수 형질 제의 양 가장 쉽다. 때때로 너무 많이 발현이 세포 사멸 (27)의 결과로 펼쳐진 단백질 응답을 체험 할 수있는 세포 발생 (밝은, 높은 내부 형광, 세포를 반올림). 실험 따라서 내부 식 잡음비 (SNR)에 신호를 저하 무응답 형광을 생성 이후 가능한 한 적은 내부 형광 밝은 세포 희미 세포 모두를 테스트 할주의한다.
또 다른 고려 사항은 그림 3. 발색단의 성숙 속도 인 수용체 chromoph의 형광에서 차이를 보여줍니다공여 발색단 (클로버)보다 긴 숙성 시간이 광석 (mRuby2).
HEK 293 세포의 그림 3. 공 촛점 이미지는 일시적으로 FRET 기반 GEVI, 형질 Nabi2.242. (A) (B)의 잠재적 인 결과를 보여주는 공 촛점 이미지를 FRET 기증자 및 수용체에서 막 지역화 된 형광을 나타내는 HEK 세포의 공 촛점 이미지 mRuby2의 느린 성숙. 두 전시 mRuby2 형광이. 동안 모든 4 개의 셀은 클로버 형광을 나타내는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이미지는 공 초점 현미경에 의해 인수되었다. FRET 도너를 들면, 클로버, 488 nm의 레이저 여기에 사용 된 상기 발광은 CAPT시켰다ured와 50분의 525 nm의 대역 통과 필터. FRET 수용체, mRuby2가, 561 nm의 여기 레이저 및 50분의 595 nm의 대역 통과 필터를 조명 하였다 배출을 위해 사용되었다. 공 촛점 이미징을위한 샘플은 pH를 7.4로 조정 인산염 완충 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 / 자당 용액으로 고정하고 방지 페이드 시약 장착되었다.
형질 전환 조건이 최적화되면, 변이 다음 소스 분석하는 관심 영역을 결정하는 단계에서 온다. 높은 형광 변화의 셀 영역을 식별하기 위해 프레임을 사용하는 것은 감산 종종 ΔF / F 값을 최대화하기 위해 사용된다. 다른 셀로부터의 광을 수신하는 모든 화소를 선택한다. 이것은 잡음의 감소를 초래 화소 수를 증가 시키지만, 무응답 내부 형광이 포함되기 때문에, 신호의 크기를 감소시킨다. 두 방법 모두 한 실험자의 일관성 유지되는 정상입니다.
단일 FP 기반 GEVI 그림 4. 전압 이미징 표현HEK 293 세포 및 주요 해마 뉴런. 고속 CCD 카메라와 1 kHz에서 기록 단차 전압 펄스에 대한 응답을 도시 한 FP 기반 GEVI, Bongwoori의 (A) ΔF / F 트레이스한다. (B), 고속의 CCD 카메라로 촬상 HEK 293 세포; Bongwoori 및 형광 변화를 관찰 하였다 화소를 나타낸다 (오른쪽)의 프레임 차분 화상을 표현하는 세포 (왼쪽) 휴식 광량 (RLI). (C) Bongwoori를 발현하는 마우스 해마 차 신경 세포에서 유도 된 활동 전위의 광 기록. 활동 전위는 전체 셀 전류 클램프 모드에서 유발 하였다. ΔF / F 추적이 소마 상관 관계 픽셀에서 선정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대표 FLUO도너 및 억 셉터의 발색단 rescence 판독은도 5a에 도시되어있다. 비율 적 분석을 가능 도너 및 억 셉터는 상관 잡음 소스, 예를 들면., 이동을 감소시키기 위해 형광 변화의 극성은 반대이다. 예를 들어, 이동 상관 잡음 모두 공여체 및 형광 수용체에 대해 동일한 방향으로 형광의 변화를 나타낼 것이다. FRET 프로브를 비율 적 기반 이미징 할 동안 만 밝은 발색단을 분석하는 것이 좋다. 디머 발색단 실질적 기록 노이즈를 증가시킬 수 있기 때문이다.도 5b는이 효과를 보여준다. 광 신호는 셀이고 밝은 클로버로부터도 5b에서 프레임 감산 분명히 보여준다. 반대로 mRuby2 형광 프레임 감산 셀에 걸쳐 높은 정도의 잡음을 나타낸다. 따라서 클로버의 도너 신호는 인터넷에서 해마의 신경 세포에 도시gure의 5C.
GEVI 기반의 FRET 그림 5. 전압 영상은 HEK 293 세포와 해마 차 신경 세포로 표현. (A) 고속의 CCD 카메라와 1 kHz에서 기록 단차 전압 펄스에 대한 2 개의 파장에서의 응답을 도시 FRET 기반 GEVI, Nabi2.242의 ΔF / F 추적. (B) 최고; 기증자 (클로버 - RLI, 클로버 프레임 공제)와 수용체 (mRuby2 - RLI, mRuby2 프레임 공제) 각 FP, 아래 두 개의 서로 다른 임계 값으로 처리 된 이미지; 같은 임계 값은 mRuby2의 상대 어스레을 설명하기 위해 두 기증자 (클로버 - RLI, 클로버 프레임 공제)와 수용체 (mRuby2 - RLI, mRuby2 프레임 공제) 이미지를 사용 하였다. 모든 이미지는 Nabi2.242을 표현 같은 HEK 293 세포에서 촬영되었다. (C) 520 nm의 파장 TRNabi2.244 센서를 발현하는 마우스 해마 차 신경 세포에서 유도 된 활동 전위의 에이스. ΔF / F 추적이 소마 상관 관계 픽셀에서 선정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ΔF 및 ΔF / F 값에 대한 변하는 빛의 레벨 그림 6. 결과입니다. (A) 단일 FP 기반 GEVI, Bongwoori을 표현 HEK 293 세포의 이미지, 휴식 빛의 강도에 표시 (RLI), (B) 형광 추적 도시 커널은 평균 밝은 내부 형광을 가진 지역 : 잘 지역화 된 형광 신호, 지역 2 막 지역 : ΔF 세 가지 영역, 영역 1의 값 (F는 -F 0 X)D 영역 (3) :. 광 신호로부터 먼 지역, (C)는 커널을 보여주는 형광 흔적 (B)에서 같은 지역의 ΔF / F 값 평균 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 개념 | 식 | 말 |
| 분수 형광 변화 (ΔF / F) |  | 시점에서 측정 F (1) = 빛의 강도는, F 0 = 빛의 강도는 유지 전위 측정 |
| 볼츠만 기능 |  | Y = ΔF / F (MV)에서의 V는 = 막 전위 V 2 반 최대 ΔF / F, MV에서의 막 전위는 |
| 두 지수 감쇠 기능 | Y = y를 0 + 1 전자 - (t - t 0) / τ 1 + 2 전자 - (t - t 0) / τ 2 | τ 1, τ = 2 시상수, 1, 2 = 진폭, t, t = 0 개의 시점은, Y = 0 오프셋 |
표 2. 방정식
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Discussion
신경 조직은 여러 가지 방법으로 전압이 약간 억제 과분극가 시냅스 입력이 비교적 큰 전압 변화에 약간의 탈분극 및 활동 전위 결과 발생 원인 이용한다. GEVIs하여 막 전위의 변화를 측정 할 수 동시에 신경 회로의 여러 구성 요소를 분석 유망한 잠재력을 제공한다. 이 보고서에서 우리는 GEVIs를 사용하여 막 전위의 이미지 변화를위한 기본적인 방법을 보여줍니다.
전압 이미징 변경 주요 키 세포막에서 GEVI의 효율적인 표현이다. 세포 내 발현은 프로브의 SNR을 감소시키는 비 형광 반응을 생성한다. 형질 전환 조건의 최적화는 크게 광 측정의 일관성을 개선한다. 소설 GEVI을 테스트 할 때 실제로, 광학 활성의 차이는 북동에 전적으로 기인 있는지 확인하는 것도 알려진 프로브를 테스트하는 것이 좋습니다w 프로브 셀없는 상태.
도 6은 전압 촬상의 감도를 감소 내부 형광의 효과를 나타낸다, ΔF / F 값.도 6b는 ΔF는 단일 FP 기반 GEVI, Bongwoori 표현 HEK 세포 값이다. 추적이 상대적으로 밝은 내부 형광도 6A에서 볼 수 영역 (2) (청색)에서 비롯됩니다. 이 추적 인해 ΔF / F를 감소 밝은 내부 형광에 2 방울 크게도 6b의 흔적이 ΔF / F 값에 대한 RLI 값으로 나누어 그림 6C, 추적에서, 그러나 추적 1과 ΔF 값과 비슷한 수준이 값. 형광 추적 (3)는 매우 작은 ΔF이뿐만 아니라 아주 작은 RLI 값 (F)가 있습니다. 그 결과, 기록 노이즈에 상당한 증가가있는 잘못된 ΔF / F 신호이다. 또한이 예제는 ΔF을 보여주기 위해 포함되었다중대한. F로 시작하는 것이 매우 낮은 경우 ΔF / F에서 큰 변화는 도움이되지 않습니다.
영상 분할의 사용은 하나의 CCD 카메라로 2 개의 파장의 측정을 수반 할 수있다. 이것은 크게 프로브 개발 FRET 종속 형광 변화의 측정을 지원하고, 설치 비용을 감소시킨다. 그러나, 색수차 때문에,이 두 이미지는 아포 크로매틱 목적에 대한 필요성을 필요로 약간 초점이 될 것입니다. 그래서 가장 높은 개구와 목표를 선택하는 더 많은 빛 더 나은 SNR은 또한 형광 이미징을 향상시킨다. 또한, 하나는 발광 다이오드 (LED) 또는 SNR을 증가시키는 레이저로 강한 광원을 사용할 수있다. LED는 기계적 셔터를 필요로하지 않습니다.
이 보고서에서 우리는 하나의 FP GEVI과 FRET 기반 GEVI에서 광 신호를 보여줍니다. FRET 기반 GEVI의 가장 큰 장점은 비율 적 영상은 상관 잡음 D의 감소를 수 있다는 것입니다생체 내 호흡과 혈액 흐름에 UE. 형광 신호의 반대 극성 막 전위의 진정한 변화를 확인한다. 두 발색단의 형광 강도가 종종 상당히 다를 때문에, SNR은 달라질 수 있습니다. 이 비율 계량 분석을 교란하고 그 유용성 (28)을 제한한다. 또한 FRET 독립적 인 신호 (29)가있을 수 있습니다. 따라서 때로는 더 나은 막 전위의 변화를 분석하기 위해 FRET를 사용하는 경우에만 밝은 형광 발색단을 사용하는 것입니다.
전압 이미징 때문에 속도 및 칼슘 플럭스를 측정 칼슘 이미징에 비해 막 전위의 변화 변이 칼슘 이미징보다 더 도전이다. 뉴런 막을 칼슘 이온 플럭스에 비해 매우 빠른 시간 척도에서의 전위 변화, 및 서브 임계 이벤트 칼슘 이미징 30으로 측정 될 수 없다. 또한, 전압 프로브는 세포막에 있어야막 전위에서 광학적 리포트 변경 가능한 프로브의 양을 감소시키는 효과가있다. 따라서, 실제로는 CCD 칩에 도달 할 광자의 수는 상대적으로 소수이다. 이것은 높은 양자 효율 및 막 전위의 변화에 따라 높은 SNR을 이끌어 프로브 고속 낮은 판독 노이즈 카메라의 필요성을 요구한다. 시험 관내에서 세포를 묘화함으로써, 연구자들은 더 생체 측정에서 전에 GEVIs의 전위 장단점을 이해할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
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