Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Визуализации мембранного потенциала с двумя типами генетически кодируемых флуоресцентных датчиков напряжения

Published: February 4, 2016 doi: 10.3791/53566
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2,3, 2, 1,4, 2
1Department of Transdisciplinary Studies, Graduate School of Convergence Science and Technology, Seoul National University, 2Center for Functional Connectomics, Korea Institute of Science and Technology, 3College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, 4Advanced Institutes of Convergence Technology

Introduction

Основное внимание в этой статье является демонстрация оптических изображений изменений в мембранных потенциалов в пробирке с использованием генетически закодированные флуоресцентные белки. Изменения визуализации мембранного потенциала предлагает захватывающие возможности изучения деятельности нейронов схем. При внесении изменений в мембранного потенциала приводит к изменению интенсивности флуоресценции, каждый пиксель камеры становится суррогатной электрод позволяет ненавязчивая измерения активности нейронов. На протяжении более сорока лет, органические красители напряжения чувствительных были полезны для наблюдения изменений мембранного потенциала 1-4. Тем не менее, эти красители не хватает клеточную специфичность. Кроме того, некоторые типы клеток трудно окрасить. Генетически кодируемые индикатор напряжения (GeViS) преодолеть эти ограничения, имея клетки должны быть изучены конкретно выразить флуоресцентный напряжения чувствительных зонд.

Есть три класса GeViS. Первый класс Gevi использует ВОltage зондирования домен из напряжения зондирования фосфатазы либо одной флуоресцентного белка (FP) 5-9 или передача энергия резонанса Ферстер (лад) пары 10-12. Второй класс датчиков использует микробного родопсина в качестве флуоресцентного индикатора непосредственно 13-15 или через электрохромное FRET 16,17. Третий класс использует два компонента, генетический компонент является мембрана закреплена ФП и второй компонент, будучи связанный с мембраной закалки краситель 18-20. В то время как второй и третий классы полезны для в пробирке и нарезать экспериментов 19,20, только первый класс датчиков в настоящее время полезно в естественных условиях анализов 6.

В этом докладе мы продемонстрируем визуализацию мембранного потенциала с использованием первого класса GeViS (рис 1) в пробирке. Это первый класс датчиков напряжения является самым простым для перехода в режим визуализации в естественных условиях. Так GeViS уtilizing домен напряжения зондирования, слитый с FP являются около 50 раз ярче, чем класс родопсина датчиков, они могут быть отображены с помощью дуговой лампы подсветки, не требуя чрезвычайно мощный лазер. Другим следствием неравенства в яркости, что первый класс GeViS может легко превысить автофлуоресценции мозга. Родопсина основе зонды не могут. Третий класс датчика так же ярко, как в первый класс, но требует добавления химических гасителем который трудно вводить в естественных условиях.

Мы, следовательно, демонстрируют приобретение зонда с одним FP (Bongwoori) 8 и зонда, состоящей из пары FRET (Nabi 2) 12. FRET строит в настоящем докладе, бабочки версии ВМРП-CR (напряжение чувствительных флуоресцентных белков - клевер-mRuby2) 11, состоящей из зеленого флуоресцентного донора, клевер, и красного флуоресцентного акцептора, mRuby2, названный Наби 2,242 и 2,244 Наби

Рисунок 1
Рисунок 1. Два типа генетически кодируемых указателей напряжения (GeViS) отображается в этом отчете (а) моно FP основе Gevi имеющий трансмембранный напряжения зондирования домен и флуоресцентный белок. (B) на основе Gevi FRET состоит из транс-мембранного напряжения зондирования домена, донора и акцептора FRET. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике: Протокол эксперимента животное было одобрено Институциональные уходу и использованию животных комитета по протоколу животного KIST 2014-001.

1. Подготовка оборудования

  1. настройка изображений
    1. Поместите перевернутую флуоресцентного микроскопа на столе виброизоляции. Используйте большом увеличении (60X иммерсионным объективом с числовой апертурой 1,35) объектива и фильтра куба снабженную дихроичным зеркалом и фильтров, подходящей для флуоресцентных белков, используемых для визуализации напряжения.
      Примечание: Эта установка использует инвертированного микроскопа с тем чтобы использовать цели с более высокой NA, но прямые микроскопы могут быть также использованы. Действительно, инвертированный микроскоп только для развития зонда, поскольку выше числовая апертура (NA) линзы объектива собирает больше света, чем тот, с низким NA, тем самым улучшая отношение сигнала к шуму (SNR; может быть описана как пик оптического сигнала, деленной на стандартное отклонение базовой линиифлуоресценции) из записи. Для не-разработчиков, мы рекомендуем прямой микроскоп для таких приложений, как ломтик или в естественных записей.
    2. Подготовьте источник света, например., Дуговая ксеноновая лампа, оснащена механическим затвором для эффективной эпифлуоресцентной изображений широкого поля. Направьте свет микроскопа с помощью световода крепление. Свет будет проходить через фильтр возбуждения и находит свое отражение в первом дихроичного зеркала в фильтре куба. Совместите свет равномерно освещает образец с максимальным интенсивности света над полем зрения 21.
      Примечание: Традиционно, 75 Вт дуговая лампа была использована так как более высокие мощность лампочки создают больше, но не более яркие поля освещения. Лазеры могут быть использованы, но ограничены одной длине волны. Светодиоды становятся ярче и действительно может быть источником света выбора предлагая различных длин волн и не требующего механический затвор.
    3. Смонтировать две ПЗС-камеры к fluorescENCE микроскоп, как показано на рисунке 2D.
      Примечание: Первая камера CCD имеет высокое пространственное разрешение и используется для идентификации клетки, экспрессирующей Gevi в плазматической мембране, подлежащего испытанию. Для изменения изображений мембранного потенциала, убедитесь, что второй ПЗС-камера имеет высокую частоту кадров, таких как 1000 кадров в секунду (FPS). Используйте двойную адаптер порт камеры (рис 2D- (3)), чтобы переключить путь формирования изображения между двумя ПЗС-камер. В данной настройке demagnifier используется, чтобы поместить изображение от объектива на ПЗС-матрицы во втором ПЗС-камеры.
    4. Установите разветвитель изображения между первым (медленно) и второго (быстрых) ПЗС-камер для работы с изображениями на основе FRET Gevi. Вставьте фильтр куб, имеющий дихроичное зеркало (560 нм) и двух фильтров выбросов (520 нм / 40 & 645 нм / 75) в разветвитель изображений. Это приведет к двум полей зрения, по одному для флуоресценции донора и другой, представляющей акцепторный флуоресценцию. Удалить этот Second светофильтров при визуализации с Gevi с одним FP.
      Примечание: Сингл FP основе Gevi проходят в этом методе Bongwoori который использует FP, супер эклиптики pHluorin A227D (SE A227D). Были выбраны фильтр возбуждения (472 нм / 30), фильтр твердых (497 нм / длинный пас) и дихроичное зеркало (495 нм) на основании его спектры возбуждения и излучения 5. Как правило, возбуждения и излучения фильтры должны иметь наибольшее перекрываются друг с спектра флуорофора приобрести яркое изображение в то время как дихроичное зеркало блокирует любой свет возбуждения передается через фильтр эмиссии. Выбор фильтров и дихроичных зеркал для записи Gevi основе FRET пары 11 по тому же принципу, за исключением того, что требует второй фильтр куб в сплиттер изображения для одновременного наблюдения донора и акцептора флуоресценции. Первый фильтр куб помещают в коробку микроскоп фильтра должен иметь фильтр возбуждения (475 нм / 23) для Clover. Затем испускаемый еluorescence от обоих FPs будет передан второй фильтровальной куба через первый дихроичным зеркалом (495 нм). Второй фильтр куб имеет дихроичное зеркало (560 нм) и двух фильтров выбросов (520 нм / 40 для клевера и 645 нм / 75 для mRuby2) для при этом каждый FP отделения флуоресценции от двух разных кадров в секунду.
Одно Gevi основе FP
(Bongwoori) 		FRET основанную Gevi пара
(Nabi 2,42 & Nabi 2.44)
Первый фильтр куб помещают в микроскоп фильтр возбуждения 472 нм / 30 475 нм / 23
дихроичное зеркало 495 нм 495 нм
эмиссионный фильтр 497 нм / длинный пас -
Во-вторых светофильтров помещают в светоделителе дихроичное зеркало -
выбросов фильтр 1 - 520 нм / 40
эмиссионный фильтр 2 - 645 нм / 75

Таблица 1. Два разных наборов фильтров используется для одного FP основе Gevi и лобзиком Based Gevi Recordings

  1. виброизоляция
    1. Не монтировать любое оборудование с движущимися компонентами на стол виброизоляции. Убедитесь, что кабели, подключенные к неизолированным оборудования свободны, чтобы избежать вибрации образца.
  2. Зажим камера патч
    1. Уплотнение дна патч зажим камеры с тонким # 0 покровным стеклом, так как рабочее расстояние объектива относительно невелико. Это является недостатком перевернутой установки микроскопа.
      Примечание: Как компромисс иметь высокую NA объектива, рабочее расстояние уменьшается. Для того, чтобы поместить specimан течение очень короткого рабочего расстояния, покровное стекло и покровное (этап 2) должны быть как можно тоньше.
  3. Контроль температуры
    1. Убедитесь, что раствор ванны течет через регулятор температуры для поддержания исправленного-клетки около 33 ° С в течение всего эксперимента.
  4. соединения, оборудование
    1. Подключите усилитель патч зажим и механический затвор источника света к командной коробке Штык Neill-Concelman (BNC) камеры высокоскоростной CCD. Это позволит обработки изображений, чтобы управлять усилителем, камеру и источник света одновременно.
      Примечание: Электрические и визуализации компоненты должны быть синхронизированы с тем чтобы обеспечить для одновременных электрических и оптических записей электрической активности.

фигура 2
Рисунок 2. Если на персонажения настройки для работы с изображениями напряжения с GeViS рабочего процесса следующие пути света, (А) 75W ксеноновой дуговой лампы, (B) возбуждающего света от дуговой лампы фильтруется фильтром возбуждения, а затем отражается первым дихроичным зеркалом, прежде чем он достигает предметном столике, вставка в правом верхнем углу показывает конфигурацию целой клетки, (C) медленная скорость CCD камера используется, чтобы помочь как выбор зажимом клеток и патч, (г) часть захвата изображений; (1) высокая скорость CCD камера, (2) изображение разветвитель для обоих FRET сопряжение и моно FP GeViS, (3) demagnifier чтобы соответствовать изображение на ПЗС-матрицы в камере высокоскоростной CCD, (4) двухпортовый адаптер камеры для переключения пути изображений и (5) медленное камеру скорость CCD с высоким пространственным разрешением для идентификации ячейки к патч, (E & F) приобретение изображения с основанным одного FP Gevi (E) и FRET основе Gevi(F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

2. Выражение GeViS

  1. В клетках эмбриональной почки человека 293
    1. Культура эмбриональной почки человека 293 (НЕК 293) клетки с модифицированным Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С в СО 2 инкубаторе (5% CO 2). Используйте ткани культуры блюдо с диаметром 100 мм и высотой 20 мм. Начало культуры с 2 х 10 3 - 6 х 10 3 клеток / см 2 и инкубировать пока они не достигнут 80-90% слияния для последующего трансфекции.
    2. В день трансфекции, аспирацию клеточную среду и осторожно мыть один раз фосфатным буферным раствором Дульбекко. Дисперсные клетки НЕК 293 с 0,25% -ным раствором трипсина-ЭДТА в течение 1-2 мин, аспирации решение и осторожно постучите блюдо отсоединить грлоктей. Добавить свежий DMEM (10% FBS) и диссоциации слипаются клетки с помощью пипетки. Определить концентрацию клеток с помощью гемоцитометра.
    3. Поместите 0.08 - толщиной 0,13 мм, диаметр 10 мм покровные предварительно покрывают поли-L-лизина в культуральной пластины тканевой 24-луночного. Семенной клетки НЕК 293 на покровных в 1 х 10 5 клеток / см 2 плотность клеток.
      Примечание: Так как клетки НЕК 293, способны образовывать щелевые контакты друг с другом, количество семян должно давать изолированных клеток.
    4. Транзиторно трансфекции клеток с соответствующим генной конструкции, кодирующей Gevi с помощью реагента Липофекция следующие инструкции производителя.
      Примечание: генные конструкции, используемые для этого шага, используемой пкДНК3.1 (Bongwoori) и pUB2.1 (Nabi 2,242) в качестве магистральных векторов. Количество используется ДНК 100 нг для каждого покровного; Однако условия трансфекции должны быть определены эмпирически для каждого Gevi быть проверены.
  2. В диссоциированного бедра мышиpocampal первичные нейроны
    1. Рассеките гиппокампе из эмбриональных день 17 C57BL6 / N мышей, а затем отделить нейронов гиппокампа, как описано ранее 22,23.
    2. Тарелка диссоциированные нейроны на поли-D-лизин покрытием 0.08-0.13 мм толщиной, 10 мм диаметр покровные на 1 × 10 5 клеток / мл клеточной плотности. Инкубируйте клетки при 37 ° С в СО 2 инкубаторе (5% CO 2).
    3. Трансфекции диссоциированных нейронов транзиторно в 6 - 7 дней в пробирке (DIV) с генной конструкции, кодирующей Gevi с помощью реагента для трансфекции с фосфатом кальция, как описано ранее 24.
      Примечание: генные конструкции, используемые для этого шага, используемой пкДНК3.1 (Bongwoori) и pUB2.1 (Nabi 2,244) в качестве магистральных векторов. Количество ДНК использовали 1 мкг каждого покровное. Опять же, условия трансфекции должны быть определены эмпирически для каждого Gevi тестируемого.
  3. Проверьте уровень экспрессии до напряжением ИмаGing
    1. Возьмите планшет для тканевых культур от СО 2 инкубатора и наблюдать флуоресценцию от трансфицированных клеток под микроскопом эпифлуоресцентной.
    2. После подтверждения флуоресценцию от мембраны, передавать покровное к камере латание для визуализации напряжения в разделе 3.
      Примечание: изображения напряжения проводится 16 - 24 часов после трансфекции. Однако, как различные флуоресцентные белки имеют разные времена созревания, некоторые GeViS нужно больше времени в пост трансфекции. Например, пары FRET, содержащие mRuby2 в этом протоколе может занять больше времени, чтобы выразить так как созревание mRuby2 занимает значительно больше времени, чем Кловер 11. Флуоресценции как донора и акцептора должны быть проверены.

3. визуализации протокол Напряжение

  1. Выберите здоровую клетку с хорошим выражением мембраны
    1. Используя микроскопию, найти здоровую клетку (рис 4В), что показывает сильноеМембрана локализованы флуоресценции по сравнению с внутренней флуоресценции. Старайтесь не латать закругленные клетки. Круглые клетки либо деления или умирают, и их трудно исправить. Нанесите тестовый импульс 5,0 мВ по амплитуде и 5,0 мс по длительности, чтобы помочь последующих экспериментов локальной фиксации.
  2. Подготовьте камеру для визуализации напряжения
    1. После выбора ячейки для патч, поместите патч зажим пипетки над ячейкой. Доведите пипетки вниз, пока он слегка коснулась клеточную мембрану. На этом этапе необходимо соблюдать 1 МОм - 2 МОм рост сопротивления мембраны на зажиме исправление программного обеспечения 25.
      Примечание: Иногда, хороший гига-ом печать может произойти, просто прикасаясь к клеточную мембрану. Пока Giga-ом уплотнение является стабильной, она должна быть в порядке.
    2. Создание гига-ом печать, осторожно применяя отрицательное давление через пипетку. Набор потенциал пипетки на желаемом держащей потенциала.
    3. Сохраняя печать гига-ом, изображение ее клеток с помощью камеры высокой скорости CCD и сосредоточить его на площадь мембраны.
    4. Разрыв клеточной мембраны, применяя импульсы всасывания через рот или шприц осторожно, чтобы сделать всю конфигурацию 26 клеток.
    5. Изображение патч зажаты ячейку под всей конфигурации зажима клеток в соответствии с опытно-конструкторских с помощью обработки изображений
      1. Начало обработки изображений. Нажмите [приобретать] - меню [SciMeasure камеры], чтобы открыть страницу "CCD ACQUIRE '.
      2. Создать новый файл данных для сохранения изображений.
      3. Нажмите [Аналоговый выход], а затем [Читайте ASCII], чтобы открыть файл протокола импульса провести томографию. Нажмите на "средний внутренние повторений", если необходимо усреднить данные. Затем закройте страницу "Аналоговый выход".
        Примечание: Этот протокол импульса должна быть разработана и сохранена в виде файла '.txt' в соответствии с целью каждого эксперимента до этого шага.
      4. Набор конкретных AcquisПараметры ition со страницы 'CCD ACQUIRE. Входной конкретные значения для 'число кадров для приобретения »и« число испытаний ".
        Примечание: число кадров определяется скоростью сбора и сроках протокола подачи импульсов. Например, если изображения на частоте 1 кГц, 1000 кадров равна 1 сек времени записи.
      5. Нажмите [брать данные (оптика + BNC)], чтобы начать запись. В то время как изображения напряжение проходит, смотреть в окно осциллографа с помощью программного обеспечения патч зажим, чтобы обеспечить устойчивую конфигурацию Цельноклеточные всей записи.
        Примечание: Чтобы проверить реагировать диапазоном напряжения Gevi, размера сигнала в; F / значение F или временным разрешением на протяжении всего физиологического диапазона напряжения, провести целый напряжение ячейки зажим эксперимент с протоколом импульса ступив импульсов напряжения в диапазоне от -170 мВ до 130 мВ. Чтобы определить производительность Gevi в разрешении потенциалы действия вызвали из культивируемых примаRy нейроны, изображения клетка под конфигурации целой клетки токовых клещей.

4. Сбор данных

  1. Расчет; F / F
    1. Начало обработки изображений. Нажмите [FILE] - [Чтение данных файла], чтобы открыть файл данных для анализа. Заметим изображение клеток в его Отдых Интенсивность света (РЛИ) на правой стороне
      Примечание: Программное обеспечение усредняет первые 5 кадров, чтобы определить RLI записи.
    2. Нажмите на ссылку "показать BNC-« довести значений тока и напряжения, измеренные на экране.
    3. Изменение режима страницы из 'RLI раме' до 'Рамка вычитания ", чтобы использовать функцию рамки вычитания для идентификации пикселей с высокой скоростью отклика оптических сигналов. Это и есть истинная сила визуализации, так как каждый пиксель может быть проверены на предмет возможных изменений в флуоресценции.
    4. Выберите два временных точек (F 0 и F 1) для вычитания. Определить, в каком районе клеткипоказывая сигналы, реагирующие на мембранный потенциал изменения.
      Примечание: SNR для кадров вычитания изображений может быть улучшено путем выбора нескольких фреймов для каждой точки времени, чтобы временно усреднения сигнала. Программное обеспечение вычитает среднее интенсивность света, взятую из выбранных кадров и вычисляет значения F 1 -F 0 (; F). Обычно один выбирает часовой точку, приобретенного в ходе холдинг потенциалом и другой момент времени, принятым в период стимуляции.
    5. Назначить пиксели, которые должны быть проанализированы с помощью перетаскивания или нажав каждый пиксель с компьютерной мышью. Обратите внимание на графическое представление средней интенсивности флуоресценции из выбранных пикселей на левой стороне окна программного обеспечения. Рисунки 4B & 5B показывают репрезентативные изображения из анализа кадра вычитания.
    6. Разделите вычитается пикселей по RLI (F 0). Нажмите [Разделить по RLI,] приобретать значения; F / F
  2. Экспорт данных Рассчитать значения; F / F для каждого шага напряжения дальнейшего анализа напряжения свойства Gevi в зондирования. Используйте эти значения для рисования графиков, такие как; F / F по сравнению с напряжением на последующих данных анализов.
  3. Удалить тока и напряжения графики по unclicking меню "Показать BNC-». Перейти к [ВЫХОД] - [Сохранить трасс, как показано (ASCII)], чтобы экспортировать флуоресценции след в формате файла ASCII для подбора кривой анализа стандартным программным обеспечением графиков.

Анализ 5. Данные

  1. Напряжение зондирования собственностью Gevi
    1. Draw изменение флуоресценции от напряжения графике (FV), откладывая значения; F / F от напряжения в программе анализа данных. Кривую по функции Больцмана (таблица 2), чтобы определить диапазон напряжений оптического сигнала, нажав [Анализ] - [Место] - [сигмоидального нужным] - [Открыть диалоговое], а затем выберите функцию Больцмана.
      Примечание: Установка для функции делает его possiblе охарактеризовать свойства зондирования напряжения различных зондов напряжения или сравнить свои выступления в различных клетках. Функция Больцмана может быть использован для зондов, испытанных в данной работе, поскольку кривые FV из этих зондов показывают сигмоидального шаблон.
    2. Нормализация каждое значение; F / F, используя начальные и конечные значения (А 1 и А 2) вычисляется с помощью функции.
      Примечание: В уравнении Больцмана, минимальная составляет A 1 и максимум в 2. Для нормализации, используйте редакторы электронных таблиц программного обеспечения для настройки значений; F / F, определив 1 в качестве нуля и А 2 в качестве одного. Средние значения нормированы; F / F и рассчитать стандартную ошибку для статистического анализа.
    3. Replot нормированной; F / F значения в сравнении с напряжением, как описано ранее в разделе 5.1.1).
  2. Скорость оптического отклика
    1. Откройте файл ASCII приобретенные с шага 4.2.2) с анализом данныхПрограмма и построить след; F / F в зависимости от времени.
    2. Нажмите на кнопку 'селектор данных "в программном обеспечении анализа данных и выберите один момент времени, соответствующий началу ступенчатой ​​импульса напряжения и второй момент времени, когда оптический сигнал достиг устойчивого состояния. Установить этот диапазон как к одинарной и двойной экспоненциальной функцией затухания, нажав [Анализ] - [Место] - [Экспоненциальный нужным] - [Открыть диалоговое], и выбрать экспоненциальную функцию затухания. Сообщить лучшую подгонку.
      Примечание: По прилегающие к одинарные или двойные функции экспоненциального затухания, количественные постоянные времени, представленные т могут быть приобретены. Это поможет экспериментаторы сравнить кинетику их замеров с различными показателями напряжения. Флуоресценции след может показать быстрые и медленные компоненты, которые могут быть описаны с двойной функцией экспоненциального распада. В этом случае расчет приведет двух временных констант с различными амплитудами.
    3. Рассчитать тысе константы взвешенное Тпозволяют сравнить кинетику зондов, проявляющих два временных компонентов к зондов с одной компонентой.
      Примечание: Взвешенный тау рассчитывается как сумма т 1, умноженной на относительную амплитуду А 1, плюс т 2, умноженной на относительную амплитуду, A 2, как определено по следующей формуле; Уравнение 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Транзиторно трансфицированные клетки могут проявлять существенное изменение в интенсивности флуоресценции и степень экспрессии плазматической мембраны. Даже на той же покровным некоторые клетки будут иметь различные уровни внутреннего флуоресценции. Это наиболее вероятно из-за количества агентом трансфекции поглощенной клеткой. Иногда слишком много выражение заставляет клетку испытать развернутую реакцию белка, что приводит к апоптозу 27 (яркий, округлые клетки, с высоким внутренним флуоресценции). Экспериментатор поэтому предупреждение протестировать обе яркие клетки и тусклые клетки с минимальным внутренним флуоресценции, как это возможно, так как внутренним выражением создает не отвечающих флуоресценцию, что снижает отношение сигнал-шум (SNR).

Другим аспектом является скорость созревания хромофора. Рис.3 неравенства в флуоресценции акцептора chromophруда (mRuby2), который имеет более длительное время созревания, чем доноров хромофора (Clover).

Рисунок 3
Рисунок 3. конфокальных изображений клеток НЕК 293 временно трансфицировали с Based Gevi FRET, Nabi2.242. (А) конфокальных изображений с НЕК клетки, показывающие мембранный локализованную флуоресценцию от FRET донора и акцептора, (Б) конфокальной изображений, показывающих потенциальную следствие медленно созревание mRuby2. Все четыре клетки обладают Clover флуоресценцию пока только два выставляется mRuby2 флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии. Для донора FRET, клевер, 488 нм лазер используется для возбуждения и эмиссии была капитанряться с 525/50 нм полосовой фильтр. FRET акцептором, mRuby2, была освещена с 561 нм лазер для возбуждения и 595/50 нм полосового фильтра был использован для излучения. Образцы для конфокальной микроскопии фиксировали 4% -ным раствором параформальдегида / сахарозы в фосфатном буферном солевом растворе регулируют при рН 7,4 и затем монтируется с реагентом анти-выцветанию.

После того, как условия трансфекции оптимизированы, следующая источник изменений исходит от определения области, представляющей интерес для анализа. Использование кадров вычитание, чтобы определить регионы ячейки с наибольшим изменением флуоресценции часто используется для максимизации стоимости; F / F. В качестве альтернативы можно выбрать все пиксели, получающих свет из клетки. Это увеличивает число пикселей, приводящих к снижению шума, но уменьшает размер сигнала, поскольку не отвечающих внутренний флуоресценции входит. Оба метода отлично покуда экспериментатор остается последовательной.

4А показывает изменение флуоресценции в НЕК клеткой, экспрессирующей основанный одним FP Gevi, Bongwoori. Это типичный изменение флуоресценции в ответ на ступенчатых импульсов напряжения. Исходя из этих данных можно построить чувствительность напряжения на Gevi и определить включения и выключения Т констант при различных напряжениях на прилегающие к одинарной или двойной экспоненциальной функцией затухания. 16 испытаний, как правило, в среднем при визуализации HEK клеток для улучшения SNR маленьких шагов напряжения и обнаруживать любые потенциальные отбеливание во время записи. Эти зонды, которые дают надежную сигнал 100 мВ может быть проверена в диссоциированных нейронов гиппокампа (рис 4в). Флуоресценции след от гиппокампа нейрона представляет собой единый испытание.

Рисунок 4
Рисунок 4. визуализации Напряжение с помощью одного FP Based Gevi Выраженныйв клетках НЕК 293 и гиппокампа первичной нейронов. (A); F / F следа одной основе FP Gevi, Bongwoori, показывая ответов на ступенчатых импульсов напряжения, записанных на частоте 1 кГц с камерой высокоскоростного CCD. (Б) НЕК 293 клеток, полученную с камеры высокой скорости CCD; (Слева) Resting Интенсивность света (РЛИ) из клеток, экспрессирующих Bongwoori & (справа) вычитание изображение кадра, указывающий пиксели, где наблюдалась изменение флуоресценции. (C) Оптическая запись вызванных потенциалов действия от мыши гиппокампа первичных нейронов, выражающих Bongwoori. Потенциалы действия были вызвала в режиме токовых клещей вся клеток. ; F / F след был выбран из пикселей, согласованными с сомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Представитель флуоценция считывание донора и акцептора хромофоров показано на рисунке 5А. Полярность изменения флуоресценции находится напротив для донора и акцептора позволяет логометрические анализ, чтобы уменьшить коррелированные источники шума, например., Движение. Например, движение коррелирует шум будет демонстрировать изменения флуоресценции в том же направлении, как для донора и акцептора флуоресценции. Будучи основан зонд FRET способен логометрической визуализации, часто лучше, чтобы анализировать только светлую хромофор. Это потому, что диммер хромофор может существенно увеличить шум записи. 5В показана этот эффект. Вычитание кадров на фиг.5В от светлого Clover ясно показывает, где оптический сигнал в клетке. В противоположность этому, кадр вычитание mRuby2 флуоресценции показывает более высокую степень шума по всей клетке. Таким образом, только донор сигнал Clover показано в гиппокампе нейронов в Интернетфигура 5С.

Рисунок 5
Рисунок томография 5. Напряжение с FRET основе Gevi выражается в НЕК 293 клеток и гиппокампа первичных нейронов. (А) ; F / F след FRET основе Gevi, Nabi2.242, показывая ответов на двух длинах волн в ступенчатых импульсов напряжения, записанных на частоте 1 кГц с камерой высокоскоростного CCD. (B) Верхняя часть; донор (клевер-РЛИ, клевер-кадр вычитание) и акцептора (mRuby2-РЛИ, mRuby2-кадр вычитание) изображения, обработанные с двух разных порогов для каждого FP, снизу; тот же порог был использован как для донора (клевер-RLI, клевер-кадр вычитание) и акцептора (mRuby2-RLI, mRuby2-кадр вычитания) изображений для иллюстрации относительного густая mRuby2. Все изображения были взяты из той же НЕК 293 клеток, экспрессирующих Nabi2.242. (C) 520 нм Длина волны TRтуз индуцированных потенциалов действия от мыши гиппокампа первичного нейрона, выражающих датчик Nabi2.244. ; F / F след был выбран из пикселей, согласованными с сомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Рисунок 6
Рисунок 6. Последствия той или иной свет уровням для; F и; F / F ценностей. (А) образ НЕК 293 клеток, экспрессирующих одного основанную FP Gevi, Bongwoori, показано в состоянии покоя интенсивность света (РЛИ), (B) флуоресценции следы в среднем, показывающие ядра ; F (F х -F 0) значения из трех различных регионах, регион 1: мембранный регионе с хорошо локализованной сигнала флуоресценции, область 2: область с ярким внутренним флуоресценции, А.Н.д область 3: регион отдален от оптического сигнала, (C) флуоресценции следы, показывающие ядро усредненные значения; F / F от тех же регионах в (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

понятия уравнения замечание
Дробное изменение флуоресценции (; F / F) Уравнение 2 F 1 = интенсивность света измеряется в момент времени, F 0 = интенсивность света измеряется в холдинг потенциал
функция Больцмана Уравнение 3 у =; F / F, V = мембранный потенциал в мВ, В 1/2 мембранный потенциал в мВ в половине максимальной; F / F, A А 2 = максимальное значение, дх = наклон
Двойная функция экспоненциального распада у = у 0 + A 1 электронный - (т - т 0) / τ 1 + A 2 е - (т - т 0) / τ 2 Т 1, τ 2 = постоянные времени, A 1, A 2 = амплитуды, т, т 0 = два временных точек, Y 0 = смещение

Таблица 2. Уравнения

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нервная система использует напряжение несколькими различными способами, ингибирование вызывает небольшое гиперполяризации, синаптической вход вызывает небольшое деполяризацию и действие потенциальных результатов в относительно большом изменении напряжения. Возможность измерения изменения мембранного потенциала от GeViS предлагает многообещающий потенциал анализа нескольких компонентов нейронных цепей одновременно. В этом докладе мы демонстрируем основным методом изменения изображений в мембранного потенциала с использованием GeViS.

Основным ключом к изменениям визуализации напряжения является эффективное выражение Gevi в плазматической мембране. Внутриклеточной экспрессии создает не отвечающих флуоресценцию, что уменьшает ОСШ зонда. Оптимизация условий трансфекции значительно улучшает консистенцию оптических измерений. Действительно, при тестировании нового Gevi целесообразно также проверить известную зонд для того, чтобы различия в оптической активности являются полностью обусловлено пеж зонд, а не условия клеток.

На рисунке 6 показан эффект внутренней флуоресценции в уменьшении чувствительности визуализации напряжения,; F / F значение. Фиг.6В показывает; F значения в HEK клетки, экспрессирующие основанную одного FP к Gevi, Bongwoori. Трассировка 2 происходит от области 2 (синий цвет), где относительно яркой внутренней флуоресценции видно на фиг.6А. Этот след имеет аналогичный уровень стоимости; F как след 1. Тем не менее, в фиг.6С, где следы на фиг.6В были разделены по значениям RLI для значений; F / F, след 2 капли значительно из-за яркого внутреннего флуоресценции что снижает; F / F значения. Флуоресценции след 3 имеет очень малую; F, но также имеет очень малую величину RLI (F). Результатом является заблуждение; F / F сигнал, который имеет существенное увеличение шума записи. Этот пример был включен, чтобы продемонстрировать; F такжеважный. Большая изменение; F / F не полезно, если F является очень низким, чтобы начать с.

Использование разветвителя изображении позволяет сопутствующей измерение двух длин волн на одном ПЗС-камеры. Это в значительной степени способствует измерение FRET зависимых флуоресцентных изменений для развития зонда и снижает стоимость установки. Однако из-за хроматической аберрации, эти два изображения будут немного не в фокусе, требующего необходимость в апохроматические цели. Чем больше света, тем лучше SNR, так что выбор целей с наибольшей числовой апертурой также улучшает флуоресценции. Кроме того, можно использовать более сильные источники света, такие как светоизлучающие диоды (СИД) или лазера для увеличения SNR. Светодиоды не требуют механический затвор.

В этом докладе мы показываем оптические сигналы от одного FP Gevi и FRET основе Gevi. Основным преимуществом FRET основе Gevi что ратиометрический томография позволяет снизить коррелированного шума Dвследствии дыхания и кровотока в естественных условиях. Противоположной полярности флуоресцентных сигналов подтверждает реальное изменение мембранного потенциала. Тем не менее, поскольку интенсивности флуоресценции двух хромофоров могут значительно отличаться друг ОСШ также будет меняться. Это путает логометрические анализ и ограничивает его полезность 28. Там также может быть FRET-независимый сигнал 29. Поэтому иногда лучше использовать только ярче флуоресцентного хромофора при использовании FRET для анализа изменений в мембранного потенциала.

томография Напряжение является более сложным, чем визуализации кальция из-за скорости и изменчивости изменений мембранного потенциала по сравнению с изображениями кальция, который измеряет поток кальция. Мембранные возможные изменения в очень быстрых временных шкал по сравнению с ионным потоком кальция и подпороговые события в нейронах не может быть измерена с изображениями кальция 30. Кроме того, зонд напряжение должно быть в плазматической мембранечтобы быть эффективным, который уменьшает количество зонда, доступной оптически изменений отчета в мембранного потенциала. Следовательно, число фотонов, которые могут фактически приходим к ПЗС-матрицы является относительно небольшим. Это требует необходимость высокой скорости и низкой камеры чтения шума с высоким квантовым выходом и зонда, которое вызывает высокую SNR После внесения соответствующих изменений мембранного потенциала. По визуализации клеток в пробирке, исследователи будут лучше понимать потенциальные преимущества и недостатки GeViS перед попыткой в измерениях естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted Microscope Olympus IX71
60X objective lens (numerical aperture = 1.35) Olympus UPLSAPO 60XO
Excitation filter Semrock  FF02-472/30 For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Semrock FF01-497/LP
75W Xenon arc lamp CAIRN OptoSource Illuminator LEDs and lasers are also effective light sources
Slow speed CCD camera Hitachi KP-D20BU
Dual port camera adaptor Olympus U-DPCAD
High speed CCD camera RedShirtImaging, LLC NeuroCCD-SM
Image splitter CAIRN Optosplit 2
Excitation filter Semrock FF01-475/23-25 For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2)
Dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36
Emission filter Chroma ET520/40
Dichroic mirror Semrock FF560-FDi01-25X36
Emission filter Chroma ET645/75
Vibration isolation system Kinetic systems 250BM-IC, 5702E-3036-31
Patching chamber Warner instruments RC-26G, 64-0235
#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) Electron Microscopy Sciences 72198-20
Temperature controller Warner instruments TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip Ted Pella 260366
Lipofection agent Life Technologies 11668-027
Calcium phosphate reagent Clontech - Takara 631312
Patch clamp amplifier HEKA EPC 10 USB amplifier
Multi-channel data acquisition software HEKA Patchmaster
Image acquisition and analysis software RedShirtImaging Neuroplex
Spreadsheet application software Microsoft Microsoft Excel 2010
Data analysis software OriginLab OriginPro 8.6.0
Demagnifier Qioptiq LINOS Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp
Confocal microscope Nikon Nikon A1R confocal microscope
Anti-fade reagent Life Technologies P36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
  2. Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).
  3. Tasaki, I., Warashina, A. Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation. Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).
  4. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).
  5. Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75, 779-785 (2012).
  6. Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154, 904-913 (2013).
  7. St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).
  8. Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential. J Neurosci. 35, 372-385 (2015).
  9. Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors. Neurophoton. 2, 021012 (2015).
  10. Dimitrov, D., et al. Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor. PLoS One. 2, e440 (2007).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).
  12. Sung, U., et al. Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions. PLoS One. 10, e0141585 (2015).
  13. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Methods. 9, 90-95 (2012).
  14. Flytzanis, N. C., et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nat Commun. 5, 4894 (2014).
  15. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nat Methods. 11, 825-833 (2014).
  16. Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors. Nat Commun. 5, 3674 (2014).
  17. Zou, P., et al. Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET. Nat Commun. 5, 4625 (2014).
  18. Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons. Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).
  19. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).
  20. Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices. J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).
  21. Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. Methods in Cell Biology Volume 81. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).
  22. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  23. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  24. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).
  25. Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).
  26. Osorio, N., Delmas, P. Patch clamp recording from enteric neurons in situ. Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).
  27. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).
  28. Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing. Biophys J. 104, 51-62 (2013).
  29. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3, e2514 (2008).
  30. Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. Imaging voltage in neurons. Neuron. 69, 9-21 (2011).

Tags

Neuroscience выпуск 108 генетически закодированы индикатор напряжения визуализация напряжения лада изображение разветвитель флуоресцентный белок
Визуализации мембранного потенциала с двумя типами генетически кодируемых флуоресцентных датчиков напряжения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad,… More

Lee, S., Piao, H. H., Sepheri-Rad, M., Jung, A., Sung, U., Song, Y. K., Baker, B. J. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J. Vis. Exp. (108), e53566, doi:10.3791/53566 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter