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Biology

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

A arte da produção de proteínas recombinantes com modificações pós-tradução complexas representa um grande desafio para estudos da estrutura e função. O estabelecimento rápido e elevada recuperação de linhas celulares de mamífero transf ectadas transitoriamente aborda esta barreira e é um meio eficaz para expressar as proteínas que são naturalmente canalizados através da via secretora do ER e Golgi-mediada. Aqui é um protocolo para a expressão da proteína usando a HEK293F humano e linhas de células HEK293S transfectadas com um vector de expressão de mamífero concebido para rendimentos elevados de proteína. A aplicabilidade desse sistema é demonstrada por meio de três glicoproteínas representativos que expressavam com rendimentos entre 95-120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultura. Estas proteínas são a FcγRIIIa humana e a sialiltransferase de rato α2-6, ST6GalI, ambos expressos com uma fusão com GFP N-terminal, bem como a imunoglobulina humana G1 Fc não modificada. Este robusto sistema utizará um meio isento de soro que é adaptável para a expressão de proteínas e hidratos de carbono para estudos estruturais, utilizando espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear isotopicamente enriquecidos. Além disso, a composição do N-glicano pode ser ajustado por adição de uma pequena molécula para evitar certas modificações de glicano de uma maneira que não reduz o rendimento.

Introduction

A produção de rendimentos elevados de proteínas humanas adequadamente dobrados e modificada pós-translacionalmente por análise detalhada da estrutura e função continua a ser um desafio significativo. Um grande número de sistemas de expressão disponíveis que produzem proteínas recombinantes com função e comportamento semelhante à nativa. Sistemas de expressão bacterianos, predominantemente estirpes de Escherichia coli, representam as ferramentas mais acessíveis e frequentemente utilizadas na área da pesquisa, devido à simplicidade destes sistemas de expressão, embora sistemas de mamíferos levedura, plantas, insectos e são também descritos 1-4. No entanto, a maioria destes sistemas são incapazes de modificação pós-tradução adequada das proteínas alvo. Um interesse fundamental dos laboratórios Barb e Moremen está produzindo proteínas eucarióticas com glicosilação apropriada. Muitas proteínas humanas exigem glicosilação adequada para o bom funcionamento (ver 5).

O eucarióticamaquinaria de glicosilação é extensa e capaz de fazer uma grande variedade de modificações, incluindo tanto a asparagina (N) - e serina / treonina (O) -linked glicanos complexos 6. Estima-se que> 50% das proteínas humanas são N-glicosilados 7. Glicanos são componentes essenciais de muitas proteínas incluindo anticorpos monoclonais terapêuticos, eritropoietina e fatores de coagulação do sangue, como factor IX, para citar alguns. Apesar de existirem vários métodos para preparar adequadamente proteínas N-glicosiladas e variam de puramente sintético 8-10, para 11-14 quimioenzimáticas ou recuperação de sistemas recombinantes engenharia 15-20, não surpreendentemente, sistemas de expressão humanos têm, até agora provou ser o mais robusto métodos para gerar proteínas humanas.

Muitos glicoproteínas terapêuticas humanos são produzidos em sistemas recombinantes que utilizam células de mamífero. Sistemas de nota são o de ovário de hamster chinês (CHO), mieloma de ratinho (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), rim embrionário humano (HEK-293) e linhas de células da retina humanas que são empregues na adesão ou suspensão de cultura para a produção de proteína 4,21,22. No entanto, os sistemas de expressão de proteína de mamífero têm exigido a geração de linhas celulares estáveis, meios de cultura caros e procedimentos de transfecção de substrato assistida 23.

Transfecção de células de mamífero é conseguido com o auxílio de numerosos agentes, incluindo fosfatos de cálcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) ou lipossomas catiónicos carregados positivamente 26-29. PEI é um policatiónico, carregada, linear ou ramificada de polímero (25 kDa) 26 que forma um complexo estável com o ADN e é sujeita a endocitose. Após acidificação do endossoma, PEI é pensado para inchar, levando à ruptura dos endossomas e libertação do ADN para o citoplasma 26,30.

Até recentemente, a transfecção transiente em suspensia cultura foi realizada por formação de complexos de ADN / PEI antes, seguido pela adição à cultura de células 29. No entanto, Würm e colaboradores relataram um protocolo optimizado altamente eficiente para a produção de proteína recombinante em células HEK293 que formaram um complexo de ADN / PEI in situ 31,32. Isto evitou a preparação, a esterilização do complexo, e a troca de tampão para um meio de cultura. Otimização, incluindo plasmídeos de aumento de expressão levaram a aumentos significativos de produtividade 33. Aqui é um método que se baseia esses avanços e é amplamente aplicável. Condições de expressão, também pode ser alterado para afectar a composição de N-glicanos.

A linha celular HEK293S, com uma deleção do gene que interrompe o processamento de N-glicano numa fase intermédia, leva-se à expressão de proteínas com uniformes N-glicanos que consistem de 2 resíduos de N-acetilglucosamina e mais cinco resíduos de manose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulasfalta a transferase de N-acetilglucosaminil I (GnTI) gene que é necessário para o processamento de N-glicanos a jusante 36,37. A utilização de inibidores de glicosiltransferase incluindo kifunensine, análogos de ácido siálico e fucose e o análogo de 2-desoxi-2-fluoro-fucose e possui efeitos de processamento de N-glicanos 38-41 limites semelhantes.

O protocolo aqui relatada utiliza o vector pGEn2 como mostrado na Figura 1 42,43, PEI assistida transfecção transiente em células de mamífero (linhas HEK293F HEK293S ou células), e a recuperação de rendimentos elevados de proteína apropriadamente glicosilada. Este sistema é robusto e pode acomodar vários factores, incluindo a marcação isotópica e engenharia de glicano para a produção de grandes títulos de proteínas recombinantes.

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Protocol

Este protocolo é suficiente para a expressão usando HEK293F ou células HEK293S.

1. Estabelecimento celular

  1. Cultura Inoculação
    Nota: Todos os procedimentos de manipulação de cultura deve ser realizada em uma facilidade BSL-2 e cada item trazido para o gabinete de biossegurança devem ser esterilizados por pulverização com um 70% de etanol em solução aquosa.
    1. Operar o agitador a 135 rpm incubadora, 80% de humidade e a 8,0% de CO2 e 37 ° C. "Ligar" a lâmpada UV da cabine de segurança biológica, pelo menos, 1 h antes do trabalho. Pré-aquecer as garrafas de meio A e Meio B selados colocado no banho de água a 37 ° C durante 1 h.
    2. Esterilizar frascos de 125 ml de crescimento Erlenmeyer com uma tampa ventilada, pipetas, pipetas e frascos de mídia pré-aquecido por pulverização com o etanol a 70% em solução de água. Coloque esses itens no gabinete de biossegurança. Nota: Esterilizar somente no plástico exterior cobrindo a garrafa de cultura de 125 ml Erlenmeyer, e em seguida, retire apenas quando is dentro da cabine de segurança biológica.
    3. Para uma cultura de 30 ml, retirar 26 ml de meio A e 3 ml de Meio B (10% da cultura final) e transferir para o frasco de cultura de Erlenmeyer de 125 ml e misturar suavemente por agitação (daqui em diante denominado como meio de cultura fresco).
    4. Transferência de um frasco de células contendo células HEK293F, congeladas a -80 ° C, em gelo e mover-se para a sala de cultura. Nota: as células HEK293F são fornecidos a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml.
    5. Aquecer suavemente o frasco em banho-maria a 37 ° C para descongelar as células parcialmente (isto leva aproximadamente um minuto e células não deve ser completamente descongelado). Esteriliza-se o exterior de um frasco com o etanol a 70% em solução de água e movê-lo para a cabine de segurança biológica.
    6. Usando uma pipeta de 1 ml, retirar a suspensão de células (aproximadamente 0,7 ml) e transferir para o balão de Erlenmeyer de 125 ml contendo 29 ml de meio de cultura fresco. Fechar a tampa do frasco de cultura e movê-lo para o agitador incubadas.
    7. Manutenção celular: Verifique densidade celular, viabilidade e Passages Celulares
      1. Verifique a densidade de células após 24 h de descongelação da cultura seguindo o protocolo abaixo. Nota: As células são cultivadas durante 24 horas após a descongelação para garantir células essenciais de crescimento e viabilidade> 80%.
      2. Esteriliza-se o frasco de cultura com o etanol a 70% em solução de água e movê-lo para a cabine de segurança biológica.
      3. Usando uma pipeta de 1 ml e pipeta, retirar lentamente 100 ul de suspensão de cultura e transferência para um filtro estéril de 0,5 mL Eppendorf tubo. Fechar e transferir o frasco de cultura de volta para o agitador o mais rapidamente possível.
      4. Misture 7,5 ul de uma solução de azul de tripano, com 7,5 ul de células. Misture vigorosamente com 7,5 ul da célula / Trypan mistura azul e transferi-lo para o slide contagem.
      5. Ligue o contador de células automático e contagem coloque a lâmina para dentro da câmara de carregamento. O leitor automático é activado e células são contados automaticamente nas unidadesdo número de células por ml e viabilidade por cento
      6. Determinar o volume da cultura requerido para o dador de transferência para um meio de cultura fresco a uma densidade de células de 0,3 x 10 6 células / ml vivo.
        Nota: Veja um exemplo de cálculo em Materiais adicionais.
      7. Repita os passos 1.1.2 e 1.1.3 do protocolo "1,1 Cultura Inoculação" acima para preparar os materiais necessários para o meio de cultura fresco.
      8. Transferir Meio A (23 ml) e Meio B (3 ml) a um balão de 125 ml de cultura fresco. Retirar as garrafas de ações de médio A e B Médio do gabinete de biossegurança.
        Nota: Os stocks de garrafas de material não deve ser mantida no armário de segurança biológica, ao mesmo tempo que as células HEK 293F. Isto limita a possibilidade de contaminação das garrafas médias estoque.
      9. Remover a cultura de células HEK293 da incubadora e pulverizar com o etanol a 70% em solução de água. Usando uma pipeta nova, retirar a alíquota de células (4 ml, este volume foi determinado de acordo com tO passo 1.2.6) a partir da cultura e transferi-lo para o balão que continha meio de cultura fresco.
      10. Transferir as duas culturas a partir do gabinete de biossegurança para o shaker incubadora definido de acordo com 1.1.1. Crescer as células até uma densidade de aproximadamente 2-3 x 10 6 células / ml vivo.
        Nota: O tempo de duplicação das células é de aproximadamente 32 h. Vai demorar 3-4 dias para chegar a esta densidade. Incubam-se as células durante 3-4 passagens para ter o padrão de crescimento de células estável antes da primeira transfecção.

    2. Prepare Materiais para Transfection

    1. Preparando células HEK293 (Dia 1)
      1. Subcultura de células a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em meio fresco B 24 h antes da transfecção de acordo com o Passo 1.2.
        Nota: O volume da cultura de transfecção será dependente do número de células. Maiores volumes de transfecção (> 20 ml) vai exigir um maior volume de cultura nesta fase.
    2. Preparando Stocks de Materiais
      1. Preparar a solução de estoque de polietilenimina linear (PEI) a uma concentração de 1 mg / ml num tampão contendo 25 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES) e NaCl 150 mM (pH 7,5). Dissolver completamente PEI; isto pode demorar 30-60 min à temperatura ambiente. Esterilizar através de filtro de seringa de 0,22? M e armazenamento a -20 ° C para uso a longo prazo.
      2. Preparar DNA de plasmídeo estéril (de acordo com os passos 2.2.2.1-2.2.2.4). O processo de construção do plasmídeo está descrita em outro lugar 42. Uma breve procedimento para a preparação de DNA é explicado aqui:
        1. Crescer uma cultura de células de Escherichia coli quimicamente competentes-transformadas com o vector pGEn2 em 1 L de meio LB (Tryptone- 10 g / L, levedura Extrato de 5 g / L e chloride- de sódio a 10 g / l) suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. E. coli é cultivada a 37 ° C em um não-humidificado, incubador com agitação.
        2. Purifica-se o ADN que codifica pGEn2 plasmídeo vector alvo de acordo com a manuprotocolo de purificação de DNA cante.
        3. Para garantir a esterilidade completa do DNA plasmídeo, execute as isopropanol precipitação e ressuspensão etapas finais dos procedimentos de extração de DNA dentro da cabine de segurança biológica.
        4. Adicionar o volume de isopropanol (especificado no kit de preparação de plasmídeo) para o DNA eluído e centrifugar a 10.000 x g durante 10 min. Esteriliza-se o exterior do recipiente de ADN com etanol a 70% em solução de água e transferi-lo no interior do armário de biosegurança. Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de isopropanol e ar-secar o sedimento de DNA. Depois de seco, ressuspender o sedimento em tampão Tris 10 mM estéril, pH 8,0.
      3. Preparar a solução de estoque de 220 mM de ácido valpróico (VPA) em água e esterilizar por passagem através de um filtro estéril de 0,22 um. Guardar a solução a -20 ° C até à sua utilização.

    3. Estabelecer uma transfecção transiente

    1. A transfecção (dia 0)
      1. Verifique a densidade de células seguindo os passos 1.2.2 através de 1.2.5 de "1.2. Manutenção celular" acima. Determinar a quantidade de células para a transfecção (2,5-3,0 x 10 6 células / ml em directo com a viabilidade> 95%). Veja um exemplo de cálculo em Materiais adicionais.
      2. Transferir o volume de células de cultura em suspensão calculados na etapa anterior (aqui 67 ml) para um tubo de centrífuga de 250 ml usando uma pipeta serológica estéril. Recolher as células por centrifugação durante 5 min a 100 x g.
      3. Enquanto isso, prepare-se um meio de cultura fresco transfecção seguinte passo 1.1.3 de acordo com "1.1. Inoculação Cultura" acima. Veja os Materiais suplementares para o cálculo da amostra. Além disso, a transferência de 5 ml de meio de cultura fresco para um tubo estéril de 15 ml e retiradas.
      4. Tubos de transferência contendo as células sedimentadas na cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior dos tubos com o etanol a 70% em água e solução de usar uma pipeta estéril para decantar the sobrenadante que consiste em meio de cultura gasto.
      5. Vigorosamente ressuspender as células sedimentadas por pipetagem para cima e para baixo usando 10 ml de meio de cultura fresco e transferir para o frasco com meio de cultura fresco a transfecção (preparado no passo 3.1.3, supra). Colocar a tampa na garrafa de cultura de células ventilado e mover o balão para a incubadora (como definido em 1.1.1) para 15 min-1 h com agitação.
      6. Durante este tempo, dilui-se o ADN plasmídico e os estoques de PEI, utilizando meio de cultura fresco (utilizando o volume de 5 ml a partir do passo 3.1.3 retirada acima) a uma concentração final de 0,5 ug / ul. Veja exemplos de cálculos em Materiais adicionais para determinar a quantidade de DNA e PEI. Transferir o frasco de cultura com as células dispersas na cabine de segurança biológica.
      7. Adicionar DNA de plasmídeo (300 ul de 0,5 mg / mL) para a cultura utilizando micro-pipeta e misturar por agitação manual suave. Adicionar PEI (900 ul de 0,5 mg / mL) para a cultura, misturar agitando suavemente. Adicionar 3,8 ml de cul frescomédio ture, a partir do passo 3.1.3, acima e frasco de transferência para o shaker incubadora durante 24 h.
      8. Limpe o gabinete de biossegurança de acordo com o Passo 1.1.
    2. Diluição (Dia 1) (Para um volume de 50 ml de transfecção)
      1. Incubar a cultura transfectadas durante 24 horas.
      2. Retirar 1 mL de ácido valpróico pré-aquecido de 220 mM (VPA; preparado de acordo com o passo 2.2.3.), Utilizando uma pipeta de 1 mL estéreis serológica e transferi-lo para um tubo estéril de 50 ml.
      3. Retirar 5,0 ml de Meio B pré-aquecido e pré-aquecida de 44 ml de meio A e este adicionar à solução VPA usando uma pipeta serológica estéril para preparar 50 ml de meio de cultura fresco com uma concentração final de 4,4 mM de VPA.
      4. Mover a cultura transfectado para a cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior da garrafa com um 70% de etanol em solução aquosa, adicionar o meio de diluição preparada e transferir do frasco de volta para o agitador incubadas.
    3. Expressão e colheita (Dias 2-6)
      1. Incube as celulas por mais 4-5 dias (5-6 dias no total desde a transfecção).
      2. Retirar alíquotas de meio de cultura seguintes passo 1.2.2. a 1.2.5. descrito em "1.2. Manutenção celular", acima, utilizando uma pipeta de 1 ml estéril sorológica, para monitorar a viabilidade de células e salvar alíquotas para analisar a expressão da proteína em cada dia por SDS-PAGE (veja Seção 5, abaixo).
      3. Células de 5-6 dias após a colheita por centrifugação do meio de células mais a 1000 g durante 5 min. Além disso, a colheita do sobrenadante se a viabilidade celular cai abaixo de 50% (ver passos 1.2.2-1.2.5).
      4. Decantar o sobrenadante que contém proteína segregada. Adicionam-se 5 ml de uma lixívia a 10% ao sedimento celular HEK e descartar como um perigo biológico.

    4. Purificação de Proteínas

    1. Prepara-se uma coluna com 5 ml de Proteína-A Sepharose. Equilibrar a coluna com 5 volumes de tampão A (20 mM de 3- (coluna N-morfolino) propanossulf único (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCeu).
    2. Centrifuga-se o sobrenadante recolhido com proteína expressa a alta velocidade (14.000 g durante 10 min) para remover todos os restos de células remanescente. Recolhe por decantação para um tubo fresco. Desprezar o pelete como um perigo biológico.
    3. Recolhe-se uma alíquota de 10 ul do sobrenadante e, adicionalmente, recolher uma pequena amostra em cada etapa de purificação da proteína para analisar a amostra por SDS-PAGE (descrito na Secção 5). Carregar o sobrenadante clarificado e recolher o fluxo através.
    4. Lava-se a coluna com volumes de tampão A 3-coluna e elui-se a proteína com volumes de 100 mM de glicina, pH 3,0, 5-coluna. Recolhe-se o eluato em tubos contendo metade do volume de tampão Tris 1 M, pH de 8,0 para neutralizar rapidamente o pH.
    5. Lava-se a coluna com 10 volumes de coluna de tampão A e armazenado para utilização futura.
    6. Tampão de trocar a proteína eluída com pelo menos um excesso de 10 vezes de tampão A por meio de 10 kDa de peso molecular filtros centrífugos de corte. Nota: Não se concentrar a amostra eluída aum volume muito baixo (<2 ml) no tampão eluiu. Use os filtros centrífugas para trocar o tampão com tampão A.
    7. Loja proteína purificada a 4 ° C até à próxima utilização.
      Nota: A proteína expressa no sobrenadante pode ser purificado por colunas de afinidade, seleccionados com base nas propriedades da proteína ou a utilização de marcas de afinidade. Por um procedimento de purificação típico, Proteína A coluna pode ser utilizada para IgG ou fragmentos Fc ou coluna de níquel pode ser utilizado para proteínas expressas com um marcador de poli-histidina. Aqui, é uma descrição dos passos de purificação para a IgG1-Fc utilizando uma coluna de proteína.

    5. Análise de proteína por SDS-PAGE

    1. Dilui-se alíquotas (7,5 ul) de cada amostra com um volume igual de 2X tampão de carga (Tris 0,125 M, pH 8,0, SDS a 4%, 10% β-mercaptoetanol, 20% de glicerol e 0,01% de azul de bromofenol).
    2. Ferve-se a mistura a 90 ° C durante 5 min, utilizando um bloco de aquecimento ou banho-maria. Centrifugar as amostras a 10.000 g foR 1 min. Carregar o gel preparado com 5 ul de proteína marcadora e 14 ul de amostras para análises utilizando uma pipeta de 20 mL com uma ponta descartável.
    3. Execute um gel a 25 miliamperes para 60 min. Uma vez que o passo de electroforese é completa, transferir o gel para um recipiente com 1 L de água e de microondas durante 5 min.
    4. Corar o gel com solução de coloração (etanol a 40%, ácido acético a 10% e 0,1% de azul brilhante de Coomassie) durante 2 horas e destain em água.

    6. Glicanos Análise por Espectrometria de Massa

    1. Analise glicanos, tal como descrito anteriormente 44. Resumidamente, 75 ug de IgG1-Fc foi tripsinizadas, em seguida, tratada por PNGaseF para a libertação de 45 glicanos. Glicanos libertados foram analisados ​​e permetilado usando ionização de dessorção laser espectrometria de massa assistida por matriz-tempo de voo (MALDI-TOFMS).

    7. Ajustes de protocolo para Cenários especiais

    1. Marcar proteínas com 15 N-Aminoácidos marcado (para um volume de 50 ml de transfecção)
      1. Dispensar 5 mg de cada um dos aminoácidos em um único frasco de vidro estéril. Ressuspender com 4 ml de água autoclavada (nota Tyr não completamente solubilizar, ao contrário de Lys e Phe). Esterilizar a solução em autoclave a 121 ° C durante 15 min. Deixar a solução arrefecer para cerca de 50-60 ° C.
      2. Para um volume de transfecção de 50 ml, siga o passo 3.1.3 de acordo com "3.1 O estabelecimento de uma transfecção transitória". Consulte a seção Materiais adicionais para um exemplo com volumes adequados.
      3. Para a transfecção, seguir os passos de "3. Estabelecimento de uma transfecção transiente" com meio de cultura fresco substituído com resíduos de aminoácidos marcados como preparado acima.
      4. Após 24 horas da transfecção, no dia da diluição da cultura, retirar 5,0 ml de Meio B pré-aquecida, pré-aquecida de 40 ml de Meio A esterilizado e um recém-4 mL alíquota da mistura de amino ácido (preparado como no passo 7.1.1. Supra) e adicionar 1pré-aquecido ml de solução de solução mãe de VPA para preparar 50 ml de meio de cultura fresco a diluição com uma concentração final de 4,4 mM de VPA. Adicionar este meio para a cultura de transfecção usando uma pipeta serológica estéril.
      5. Transferir a cultura transfectado para a cabine de segurança biológica depois de esterilizar o exterior da garrafa com um 70% de etanol em solução aquosa, adicionar o meio de diluição preparada e transferir o frasco de volta para o agitador incubadas.
        Nota: Meio A é, um meio isento de soro quimicamente definido. Assim, é possível preparar uma formulação diferente. Entre em contato com o fornecedor para obter um costume Médio Uma preparação que carece de certos aminoácidos. É possível ter todos os aminoácidos deixado de fora, no entanto, é preferível utilizar meio que carece apenas alguns resíduos de escolha porque um meio de abandono completa exigiria o ajustamento da osmolaridade após a suplementação. Nós escolhemos um meio de abandono Lys-Tyr-Phe que pode ser completada e não necessita de ajustamento da osmolaridade. Furthermore, o meio Um fornecedor não partilha livremente as concentrações dos componentes do meio; utilizou-se 100 mg / L de cada uma para Lys, Tyr e Phe com sucesso. Os volumes do meio de transfecção e expressão deve ser ajustado para ter em conta os aminoácidos adicionados. Aqui estão as adaptações do protocolo acima para a rotulagem isótopo
    2. Suplemento a transfecção com uma pequena molécula
      1. Preparar a solução de estoque de 100 mM de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose usando água autoclavada e esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 um.
      2. Para uma cultura de 50 ml, adicionar 125 ul (a 250 uM) da solução de fucose analógico para o meio de transfecção e de diluição. Nota: Foram negligenciada para efectuar qualquer ajuste adicional de volume porque a adição do substituinte, pelo que esta representa concentração de apenas 0,25% do total .É volume de cultura é possível modificar a expressão utilizando pequenas moléculas inibidoras de processamento de glicano. Aqui nós descrevemos as condições para a inclusão de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose, um inibidor da fucosilação glicano. Encontrámos> 90% de redução em fucosilação adicionando o análogo de fucose na concentração de 250 uM em meio de transfecção e a diluição.

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Representative Results

A expressão da proteína de alto nível e pureza

Este sistema de expressão optimizada gerado um elevado rendimento de proteínas glicosiladas. Um modelo típico é mostrado na expressão da IgG1-Fc (Figura 1). Neste caso, é o dia 0 o dia da transfecção seguido por Dia 1 (diluição) e dias de cultura subsequentes, até ao dia 5. A expressão da proteína é analisada utilizando a fracção de expressão solúvel no meio em bruto. Uma muito pequena quantidade de expressão de proteína foi observada no Dia 1 como o alíquota de cultura foi retirado 3 horas após a diluição da cultura. Isto é mais fácil de visualizar com proteínas GFP que exibem uma cor verde distinta no meio de cultura. Tal foi observado um aumento na expressão da GFP e GFP-FcγRIIIa-ST6GalI do dia 2 ao dia 5. Não houve aumento significativo na expressão foi observado entre o Dia 4 e Dia 5. No dia 5, as células foram <50%cultura viável e, portanto, foi colhido para limitar a proteólise. A purificação por afinidade utilizando uma coluna de proteína para a coluna de Fc de IgG1 ou de níquel para GFP-FcγRIIIa resultou em proteínas com elevada pureza (> 99%; Figura 2), um rendimento (Tabela 1) e a glicosilação completo (dados não mostrados).

15 N ou 13 C rotulagem Isotope entre proteínas e carboidratos

Este sistema eficientemente expressa isotopicamente enriquecido Fc de IgG1 de acordo com o protocolo descrito. Embora tenha sido observada uma pequena redução na produção de proteína (25-50%), os sinais bem dispersas foram observados num espectro de RMN 2D que correlaciona a frequência de ressonância de 1 átomos de H e a amida directamente ligado 15 átomos de N (Figura 3). Este nível de expressão permite a produção de proteínas eficiente à escala requerida para estudos de base da estrutura (tipicamente 2-20mg de proteína) e ilustra a incorporação bem sucedida dos isótopos marcados na proteína. O elevado grau de semelhança entre este espectro e o espectro de publicados indicam um elevado grau de marcação da proteína com um mínimo de codificação ocorreu a 15 N de etiquetas 43.

A produção de proteínas com diferentes N-glicanos

Diferentes glicoformas foram produzidos com as células e HEK293F HEK293S. Assistida por matriz com dessorção por laser espectrometria de massa de ionização (MALDI-MS), análises dos N-glicanos enzimaticamente libertados mostrou-as glicoformas esperados (Figura 4). As proteínas expressas a partir de células HEK293S N-glicanos que eram da Man ​​5 GlcNAc 2 forma e não continham nenhum fucose (Figura 4). Abrigavam Glicanos a partir de material HEK293F-expressos foram do tipo complexo, formas biantenais com núcleo fucose e tendo na maior parte do terminalN-acetilglucosamina (GlcNAc) ou pequena proporção de formas mono- ou di-galactosilado (GAL). Embora não se sabe quais são os N-glicanos de ST6GalI nativos e são FcγRIIIa, o perfil de glicano para a IgG1 Fc é altamente semelhante à Fc de IgG1 humana purificada a partir de soro de 46. As principais diferenças incluem o grau de modificação; Fc de IgG1 humana a partir do soro apresenta um maior grau de galactosilação do que a observada para a expressão HEK293F. A adição de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose, um inibidor da fucosilação glicano, para uma expressão conduzida utilizando a linha celular HEK293F mostraram uma dramática redução> 90% na incorporação de fucose (Figura 4).

figura 1
Figura 1: rendimentos elevados de proteínas recombinantes são recuperados por expressão a partir do vector pGEn2. (A - B) Dois expressão vectores utilizados neste estudo foram gerados a partir de um plasmídeo que contem pIBI30 uma cassete de Ampr e uma E. origem de replicação de E. coli. Nível (C) A expressão da proteína Fc de IgG1 segregada após a transfecção transitória de células HEK293F. Análise SDS-PAGE mostra a acumulação de proteínas expressas a partir do dia 0 ao dia 5 e é indicado pela seta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Recuperação de proteína expressa a partir do meio de cultura. (A) de IgG1-Fc, (B) GFP-FcγRIIIa. "Médio" refere-se ao meio de cultura depois de centrifugação; FT = fluxo através fração da coluna de purificação. Amostras de SDS-PAGE são pr epared em condições de não redução sem β-mercaptoetanol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Aminoácido rotulagem selectiva de IgG1 Fc 1 H- 15 N heteronuclear único espectro de coerência quântica [15 N-Tyr; 15 N-Lys] marcado com IgG1 Fc expresso utilizando células HEK293F no costume Medium A suplementada com (15 N ) marcado l-Tyr e L-Lis. Picos cruzados foram atribuídos com base em relatórios anteriores 43,47. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4:. A expressão de proteínas na presença de modulares da composição perfis de glicano N-glicano de Fc de IgG1 expresso em células HEK293 utilizando diferentes condições de cultura. O espectro de cima foi preparado utilizando glicanos isolados a partir de Fc de IgG1 expresso em células HEK293S. O espectro de centro revela as glicoformas de IgG1 Fc a partir de material expresso em células HEK293F e o espectro de fundo foi preparado de modo semelhante esperar as células foram cultivadas na presença de um inibidor da biossíntese de GDP-fucose, 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose. N-glicanos são apresentados como diagramas seguintes desenhos animados da convenção CFG 5: acetylglucosamine N- (GlcNAc), quadrados azuis; Manose (Man), círculos verdes; Fucose (FUC) triângulos vermelhos; Galactose (Gal), círculos amarelos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<tbody>
Proteína Rendimento (mg / L)
Fc de IgG1 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Quadro 1: Rendimento de diferentes proteínas expressas em células HEK293F.

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Discussion

Este protocolo ilustra a expressão de proteína através da transfecção transitória de células HEK293F ou S. As condições de transfecção ideais estabelecidos nos laboratórios Barb e Moremen empregam uma combinação crítica de concentrações densidade celular e reagentes para atingir alta eficiência de transfecção. Considerações críticas na aplicação da presente protocolo incluem: manutenção de uma cultura estável antes da transfecção (com a cultura consistente vezes duplicação); transfecção de células em crescimento activo (obtida por diluição de células para 1 x 10 6 células / ml 24 h antes da transfecção), com a viabilidade celular superior a 95%; densidade celular da transfecção deve ser entre 2,5-3,0 x 10 6 células / ml em directo com uma viabilidade> 95% (densidade) de transfecção numa cultura contendo 90% de meio A e 10% de Meio B; e, a adição de ADN antes da adição de PEI a 3 ug / mL e 9 mg / ml, respectivamente, 31; às 24 h pós-transfecção da cultura é diluída 1: 1 em forma Containing 4.4 mM de ácido valpróico para resultar numa concentração de 2,2 mM de ácido valprioc na cultura diluída; a fase de crescimento de produção continua, em seguida, em um frasco de agitação humidificada a 37 ° C e 8% de CO2 durante um período adicional de 4-5 dias. O vector aqui descrito está optimizado e uma característica importante do sistema de expressão de proteína solúvel 32,42.

Se uma proteína alvo não consegue expressar, para além dos factores listados acima, várias outras variáveis ​​podem contribuir para rendimentos baixos. Assegurar a sequência de DNA codificadora da proteína contém codões optimizados para as células humanas. Esta pode ser avaliada com vários recursos on-line. Esterilidade durante todo o procedimento é primordial. Um crescente e puro ativamente cultura de células HEK293F deve aparecer ligeiramente granuladas a olho nu, e o meio deve ser na maior parte clara (particularmente a densidades celulares <1,0 × 10 6 células / ml).

As culturas contaminadas com bactérias ou fungos devemser removido imediatamente para evitar a propagação. É importante manter um estoque cultura saudável. Isto é alcançado através da inoculação de culturas dessas células a uma densidade de 0,3 x 10 6 células / ml. Densidades mais baixas de inoculação pode retardar a taxa de crescimento, limitando o fornecimento de vários factores de crescimento necessários para o crescimento e divisão celular 48. Como as culturas foram subcultivadas mais de 25 ou 30 vezes, uma diminuição na expressão foi observado. Por esta razão, as culturas subcultivadas mais de 30 vezes são descartados.

É possível que a proteína está a ser degradado no meio de expressão, ou a expressão a longo prazo é também, levando à degradação de proteínas. Por estas razões, é recomendado para monitorar a viabilidade da cultura e expressão de proteína em cada dia, para determinar a expressão de um período de tempo óptimo. É importante para purificar proteínas tão rapidamente quanto possível após a colheita do meio. Para algumas proteínas, é útil incluir inibidores de protease durang purificação. No total, esses ajustes têm melhorado a recuperação de proteínas no Barb e Moremen laboratórios 42,43.

A transfecção transiente de células HEK293 demonstrou grande utilidade para a produção de proteínas solúveis e os domínios de proteínas que são naturalmente segmentados para a via secretora. É provável que a produção de proteínas de membrana integrais ou citoplasmáticos irá exigir uma maior optimização. Uma vantagem principal deste sistema é os substratos nativos e máquinas para a produção de proteína estão presentes e disponíveis nas células HEK293 49. Este é responsável em grande parte as suas vantagens em relação a outros métodos de produção de proteínas recombinantes tais como bactérias ou sem modificações pós-tradução limitadas, ou sistemas de levedura e baculovírus com enrolamento correcto mas diferentes glicoformas incorporada N-1,50,51.

Além disso, o protocolo aqui descrito mostra a capacidade adicional de baixo peso molecular incluem COMlibras tais como aminoácidos marcados, glucose marcada ou pequenas moléculas concebidas para modificar a composição de N-glicanos. As células HEK293 também provar perito na expressão de proteínas de não-mamíferos, incluindo enzimas de plantas, e suporta a co-expressão de vários polipéptidos para a recuperação de complexos de proteína (dados não apresentados).

A caracterização estrutural e funcional de glicoproteínas é muitas vezes dificultada por desafios de produção da amostra. O sistema de expressão de proteína aqui descrito supera esta desvantagem através da realização de modificações pós-translacionais usando o complemento natural de enzimas intracelulares sofisticadas de processamento de glicano 6. Este protocolo robusto e simples é comprovada para a transfecção transitória de células HEK293 humanos suspensão. Este método demonstrou um rendimento significativo glicoproteína (> 95 mg / L) com três proteínas N-glicosiladas e podem acomodar os suplementos, tais como resíduos de aminoácidos marcados ou os INH químicos de pequenas moléculasibitor 2-desoxi-2-fluoro-L-fucose. As glicoproteínas expressas pode ser reformado mais pós-purificação para preparar uma vasta gama de glicoformas definidas 52.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelas subvenções K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dos Institutos Nacionais de Saúde, e por fundos do Roy J. Carver Departamento de Bioquímica, Biofísica e Biologia Molecular da Universidade de Iowa . O conteúdo desta obra é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

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Cellular Biology 106 Edição glicoproteína imunoglobulina G Fe receptor as proteínas recombinantes humana e células HEK293F HEK293S

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão
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Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

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