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Biology

重组人蛋白与HEK293悬浮细胞的瞬时转染高产表达

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

产生重组蛋白的复杂的翻译后修饰的技术代表的结构和功能研究的主要挑战。迅速建立和高回收率从瞬时转染的哺乳动物细胞系解决了这一障碍并为表达该通过ER和高尔基体介导的分泌途径自然引导蛋白质的一种有效手段。这里是使用人类的HEK293F和转染的设计的高蛋白质产量的哺乳动物表达载体HEK293S细胞系表达一个协议。这个系统的适用性用与之间95-120毫克每升培养物中回收纯化的蛋白的产量表达三个具有代表性的糖蛋白是证明。这些蛋白质是人类和FcγRIIIa的大鼠α2-6唾液酸转移酶，ST6GalI，既表达具有N-末端GFP融合，以及未经修饰的人免疫​​球蛋白G1的Fc。这个强大的系统UTIlizes一个无血清培养基是能适应于同位素富集蛋白质和碳水化合物用于使用质谱和核磁共振谱结构研究的表达。此外，所述N-聚糖的组合物可以通过添加一个小分子，以防止某些聚糖修饰的方式，并没有降低产量来调节。

Introduction

制备适当折叠和翻译后修饰的人蛋白质的高产量的结构和功能的详细的分析仍然是一个显著挑战。可产生重组蛋白具有天然样的功能和行为的大量表达系统。细菌表达系统，主要是大肠杆菌菌株，代表了最方便和常用的工具，在研究领域，由于这些表达系统的简单性，尽管酵母，植物，昆虫和哺乳动物系统也描述1-4。然而，大多数这些系统是不能的靶蛋白的适当的翻译后修饰。锋芒毕露和Moremen实验室的根本利益，是生产真核蛋白与适当的糖基化。许多人类蛋白质需要适当的糖基化的功能是否正常（见图5）。

真核糖基化机制是广泛的，能够进行修改多种多样，包括天冬酰胺（N）的-和丝氨酸/苏氨酸（O） -连接的复合聚糖6。据估计，人蛋白质的> 50％是N-糖基化的7。聚糖是许多蛋白质​​包括治疗性单克隆抗体，促红细胞生成素，和凝血因子样因子IX的必要成分，仅举几例。虽然多种方法可用来制备适当N-糖基化蛋白和范围从纯合成8-10，以酶法11月14日或恢复从工程改造的重组系统15-20，这并不奇怪，人表达系统迄今被证明是最稳健的方法产生的人类蛋白质。

许多治疗人糖蛋白产生在使用哺乳动物细胞的重组系统。值得注意的系统是中国仓鼠卵巢（CHO），小鼠骨髓瘤（NS0），幼仓鼠KidneY（BHK），人胚肾（HEK-293），并且被用在粘附或悬浮培养生产蛋白质4,21,22人视网膜细胞系。然而，哺乳动物蛋白表达系统需要的稳定细胞株，昂贵的生长培养基和基质辅助转程序23的生成。

哺乳动物细胞的转染与众多试剂，包括磷酸钙24,25，阳离子聚合物（DEAE-葡聚糖，聚凝胺，聚赖氨酸，聚乙酰亚胺（PEI））或带正电荷的阳离子脂质体26-29的帮助来实现。 PEI是聚阳离子，充电，直链或支链的聚合物（25 kDa）的26，其形成稳定的络合物与DNA和被内吞。在核内体的酸化，PEI被认为是膨胀，导致内体和DNA的释放的破裂进入细胞质26,30。

直到最近，在suspensi瞬时转染上培养进行事先的DNA / PEI复合物的形成，随后加入到细胞培养物29。然而，亚龙和同事报道了生产重组蛋白的HEK293细胞在原位形成31,32的DNA / PEI复合物进行了优化的高效的协议。这避免了准备，复杂的灭菌，并进入培养基缓冲液交换。通过包括导致显著的产量增加33表达增强质粒进一步优化。这里是建立在这些进展和广泛适用的方法。表达的条件也可以被改变以影响N-聚糖组合物。

所述HEK293S细胞系，与基因缺失，其停止N-聚糖处理在中间级，导致与均匀N-聚糖的蛋白质组成的2 N-乙酰葡糖胺残基的加五甘露糖残基（曼5的GlcNAc 2）34中的表达， 35。这些细胞缺乏N-乙酰转移酶I（GntI），这是需要的下游N-聚糖处理36,37基因。使用糖基转移酶抑制剂，包括kifunensine，唾液酸类似物和岩藻糖类似物和2-脱氧-2-氟-岩藻糖也有类似的影响和限制N-聚糖处理38-41。

协议报这里使用pGEn2矢量如图1 42,43，PEI辅助瞬时转染到哺乳动物细胞系（HEK293F或HEK293S细胞），并适当地糖基化蛋白的高产率的恢复。这个系统是稳健，可容纳各种因素，包括同位素标记和聚糖工程用于生产重组蛋白的大效价。

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Protocol

该协议是充分利用两种HEK293F或HEK293S细胞中的表达。

1.细胞建立

  1. 培接种
    注：所有培养操作过程必须在BSL-2设施内进行和每个项目带入生物安全柜必须通过在水溶液中的70％的乙醇喷雾进行灭菌。
    1. 操作培养摇床中于135转，湿度80％，并在8.0％的CO 2和37℃。打开“的”生物安全柜中至少1小时前工作的紫外灯。 Prewarm密封培养基A和培养基B瓶在水浴在37℃进行1小时。
    2. 通过在水溶液中70％乙醇消毒喷洒125毫升锥形瓶中生长具有通风帽，移液器，移液器和预热媒体瓶。发生在生物安全柜这些项目。注意：消毒只有外塑料覆盖125毫升锥形烧瓶中培养，然后，只有当它我删除S中的生物安全柜中。
    3. 为30ml的培养，撤回和26 ml的培养基A 3毫升培养基B的（最终培养的10％）和转移到125毫升的锥形烧瓶中培养，并轻轻振荡混合（以下称为新鲜培养基）。
    4. 传递一个小瓶含有HEK293F细胞，冷冻在-80℃，在冰上，并移动到培养室的细胞。注意：HEK293F细胞以1×10 7个细胞/ ml的密度提供的。
    5. 轻轻暖小瓶在水 - 浴中于37℃，以部分解冻细胞（大约需要1分钟，细胞不应该被完全解冻）。消毒小瓶的外部与在水溶液中的70％的乙醇，并将其移动到生物安全柜。
    6. 使用1毫升吸管，撤回细胞悬浮液（约0.7毫升）并转移到含有29日毫升新鲜培养基125毫升锥形瓶中。关闭培养瓶的盖子，并将其移动到培养摇床。
    7. 电池保养：检查细胞密度，活力和细胞传代
      1. 按照下面的协议检查文化解冻24小时后的细胞密度。注意：将细胞解冻，以确保必要的细胞生长> 80％的存活率和后生长24小时。
      2. 消毒培养瓶中，在水溶液中的70％的乙醇，并把它移动到了生物安全柜。
      3. 使用1ml吸管和移液器，慢慢撤回100微升悬浮培养并转移到无菌的0.5毫升的Eppendorf管中。关闭并尽快培养瓶中转移放回摇床越好。
      4. 混合7.5微升台盼蓝溶液与7.5微升细胞。与7.5微升的细胞/台盼蓝的混合物剧烈混合，并将其转移到计数幻灯片。
      5. 打开自动细胞计数器，然后将计数滑入装载室。自动读取器被激活和细胞中的单元自动计数每毫升和百分比生存力的细胞数的
      6. 确定所需的转移到新鲜的培养基中以0.3×10 6个活细胞/ ml的细胞密度的供体培养物体积。
        注：查看示例计算补充资料。
      7. 重复步骤1.1.2和1.1.3以上的“1.1培接种”协议的准备所需的新鲜培养基材料。
      8. 转移培养基A（23毫升）和培养基B（3毫升）中，以一个新的125个毫升培养瓶中。从生物安全柜中取出瓶子股票中A和培养基B的。
        注意：介质瓶窗饰不应被保持在生物安全柜，同时作为HEK 293F细胞。这限制污染库存介质瓶的可能性。
      9. 从培养箱中取出HEK293细胞培养和喷洒在水溶液中的70％的乙醇。使用新的移液管，撤细胞的等分（4毫升，这个量是确定的，根据牛逼从培养Ò步骤1.2.6），并将其转移到含有新鲜培养基的烧瓶中。
      10. 从生物安全柜转让双方文化的培养摇床根据1.1.1设置。生长细胞2-3×10 6个活细胞/ ml的密度近似。
        注：细胞的近似倍增时间为32小时。这将需要3-4天达到这一密度。孵育细胞3-4代以具有先于所述第一转染细胞的稳定生长模式。

    2.准备材料转

    1. 准备HEK293细胞（第1天）
      1. 根据传代培养的细胞，以1×10 6个细胞/ ml，在新鲜培养基B 24 hr的密度在转染之前步骤1.2。
        注意：转染培养的体积将取决于细胞的数目。较大的转染体积（> 20毫升）将要求在此阶段有较大体积的培养。
    2. 准备圣材料ocks
      1. 在含有25mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和150毫摩尔NaCl（pH7.5）中的缓冲液制备的线性聚乙烯亚胺（PEI）原液以1mg / ml的浓度。完全溶解PEI;这可能需要30-60分钟，在室温。通过0.22微米注射器式滤器并储存消毒在-20℃下长期使用。
      2. （按步骤2.2.2.1-2.2.2.4）准备无菌质粒DNA。该质粒的构建过程，其他地区42描述。一个简短的程序进行DNA准备在此说明：
        1. 生长在1升LB培养基（Tryptone- 10克/升，酵母extract- 5克/升和钠氯化物10克/升），补充了100微克/的转化的pGEn2矢量化学感受态大肠杆菌细胞的培养ml氨苄青霉素。E.大肠杆菌生长在37℃下在非加湿，振荡培养箱。
        2. 根据马努净化pGEn2矢量编码对象质粒DNA厂家的DNA纯化的过程。
        3. 以确保质粒DNA完全无菌，执行最终异丙醇沉淀和再悬浮步骤的生物安全柜内将DNA提取程序。
        4. 异丙醇（在质粒制备试剂盒中指定）的体积添加到洗脱的DNA和离心机以10,000× 离心10分钟。消毒的DNA的容器，用70％的乙醇的外侧水溶液和生物安全柜内传送。丢弃用吸管和异丙醇上清液风干DNA沉淀。一旦干燥，重悬沉淀在无菌的10mM Tris缓冲液，pH 8.0。
      3. 制备的220毫米丙（VPA）酸储备溶液中的水，通过无菌0.22微米的过滤器通过通道消毒。存储所述溶液在-20℃直至进一步使用。

    （三）建立瞬时转染

    1. 转（第0天）
      1. 通过下面的步骤1.2.2通过“1.2。电池维护”上面的1.2.5检查细胞密度。确定用于转染（2.5-3.0×10 6个活细胞/ ml的存活率> 95％）细胞的量。查看示例计算补充资料。
      2. 转移到250毫升的离心管中的前一步骤（此处67毫升）计算悬浮培养细胞使用无菌血清吸管的体积。收集细胞离心5分钟，在100×g下。
      3. 在此期间，准备根据“1.1。培养接种”上方的新鲜染培养基以下步骤1.1.3。见补充材料的计算示例。此外，新鲜的培养基转移5 ml到无菌的15毫升管，备用。
      4. 含有沉淀的细胞到生物安全柜灭菌管的外面与70％乙醇在水中的溶液，并使用无菌移液管，以滗次后传输管Ë上清包括废培养基。
      5. 大力通过上下抽吸用10ml新鲜培养基，并转移到新鲜的转染培养基烧瓶悬浮沉淀的细胞（在上述步骤3.1.3制备）。拧上排出细胞培养烧瓶中的帽并与摇动烧瓶培养箱（如在1.1.1中设置）为15分钟-1小时。
      6. 在此期间，稀释质粒DNA，并使用新鲜的培养基（使用5 ml的体积来自上述步骤3.1.3撤销）为0.5微克/微升的最终浓度的PEI的股票。见补充材料样品计算，以确定DNA和PEI的量。转移与分散的细胞进入生物安全柜的培养瓶中。
      7. 加入质粒DNA（300微升0.5微克/微升）用微量移液器的文化和温和的人工摇动拌匀。加入PEI（900微升0.5微克/微升），以文化，轻轻晃动混​​匀。加入3.8毫升新鲜的小路TURE介质，从步骤3.1.3，上方和培养摇床24小时转移烧瓶中。
      8. 清洁按照步骤1.1生物安全柜。
    2. 稀释（1天）（适用于50毫升的转染量）
      1. 孵育转染的培养24小时。
      2. 撤回1 ml的预热220毫丙戊酸（VPA;根据步骤2.2.3制备。），使用无菌的1 ml的血清吸液管，并将其转移到无菌的50ml管中。
      3. 撤回5.0毫升预热培养基B和44毫升预热培养基A和用无菌血清吸管以制备50ml新鲜培养基与丙戊酸钠4.4 1mM的终浓度将其添加到VPA溶液。
      4. 移动转染培养到生物安全柜灭菌烧瓶的外观与在水溶液中的70％的乙醇后，添加所制备的稀释介质将烧瓶转移回温育摇床。
    3. 表达和收获（2-6天）
      1. 孵育细胞额外4-5天（5-6天以来的总转）。
      2. 撤回培养基的以下步骤1.2.2等分试样。到1.2.5。中所述“1.2。细胞维持，”上方用无菌1 ml的血清吸液管，以监测细胞生存力和保存等分试样来分析蛋白质表达在每天通过SDS-PAGE（见第5，下文）。
      3. 后5-6天通过离心细胞加介质在1000克5分钟收获细胞。此外，收获上清，如果细胞生存力低于50％（见步骤1.2.2-1.2.5）。
      4. 倒出将包含分泌蛋白质的上清液。加入5毫升10％的漂白剂的HEK细胞沉淀并丢弃作为生物危害。

    4.蛋白质纯化

    1. 制备柱用5ml蛋白A琼脂糖。平衡柱用缓冲液A（20mM的3-（5倍柱体积的N-吗啉代）丙磺酸（MOPS），pH值7.4，100mM的NAC升）。
    2. 离心收集的上清液以表达的蛋白质以高速（14,000个克，10分钟）以去除任何剩余的细胞碎片。通过滗入新的试管收集。弃沉淀为一个生物危害。
    3. 收集上清液的10微升等分试样并另外收集在每个蛋白质纯化步骤来分析样品通过SDS-PAGE的小样本（第5部分）。加载澄清的上清液，并收集通过的流动。
    4. 洗涤用缓冲液A的3-柱体积的柱，洗脱蛋白与100mM的甘氨酸，pH值3.0 5柱体积。收集在含有二分之一体积的1M TRIS缓冲液，pH值为8.0到迅速中和pH管中的洗出液。
    5. 用缓冲液A和存储的10个柱体积为将来使用洗柱。
    6. 缓冲交换洗脱的蛋白具有至少10倍过量的缓冲液A，用10 kDa的分子量截止离心过滤器。注意：不要集中洗脱样品一个非常低的体积（<2毫升）中的洗脱缓冲液中。使用离心过滤器以用缓冲液A交换缓冲
    7. 商店纯化的蛋白质在4°C，直到下次使用。
      注：蛋白质表达在上清液可通过蛋白的属性的基础上或在使用亲和标签的选定亲和柱进行纯化。对于一个典型的纯化方法，蛋白A柱可用于抗体或Fc片段或镍柱可以用于表达与聚组氨酸标签的蛋白质。这里，是的纯化步骤的IgG1-Fc的使用蛋白A柱的描述。

    蛋白通过SDS-PAGE 5.分析

    1. 稀释各样品的等分试样（7.5微升）与2×上样缓冲液（0.125摩尔Tris，pH8.0中，4％SDS，10％β巯基乙醇，20％甘油，和0.01％溴酚蓝）等体积。
    2. 在90℃下煮沸混合物用于使用热块或水浴5分钟。离心样品以10000g FO的R 1分钟。加载与5微升标记蛋白和14微升样品用于使用20微升吸管一次性尖端分析所制备的凝胶。
    3. 运行一个凝胶在25毫安60分钟。一旦电泳步骤完成后，将凝胶转移到容器用1L水和微波5分钟。
    4. 染色用染色溶液（40％乙醇，10％乙酸和0.1％考马斯亮蓝）2小时，脱色在水凝胶中。

    6.聚糖分析质谱

    1. 如前面所述44分析聚糖。简言之，75微克的IgG1-Fc的被胰蛋白酶处理，然后，处理通过PNGaseF为聚糖45的释放。释放聚糖全甲基化，并通过使用飞行时间的基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-TOFMS）分析。

    7.协议调整为特殊场景

    1. 标记蛋白15 N-标记的氨基酸（对于50毫升的转染体积）
      1. 分配5毫克每种氨基酸为单个的无菌玻璃小瓶中。悬浮用4ml蒸压水（注意酪氨酸不会完全溶解，不像Lys和Phe的生产）。消毒在121℃将溶液高压灭菌15分钟。允许溶液冷却至约50-60℃。
      2. 对于50毫升的转染量，按照“3.1建立瞬时转染”按照步骤3.1.3。见有适当数量的一个例子补充材料部分。
      3. 对于转染，按照步骤的“（3）建立一个瞬时转染的”使用取代有标记的氨基酸残基如上制备新鲜培养基。
      4. 转染后的24小时，在培养稀释的天，提取5.0毫升预热培养基B中加入40ml预热培养基A和新鲜蒸压4毫升一份的氨基酸混合物（其制备如步骤7.1.1。段）并添加1毫升预热的VPA的溶液原液，制备50ml新鲜稀释培养基与丙戊酸钠4.4 10mM的终浓度。添加使用无菌血清吸管上述培养基转染培养。
      5. 传送转染培养到生物安全柜灭菌烧瓶的外观与在水溶液中的70％的乙醇后，添加所制备的稀释介质将烧瓶转移回温育摇床。
        注意：培养基A是化学成分确定的，无血清的培养基。因此，有可能制备不同的制剂。联系供应商以获取自定义中的制剂，缺乏某些氨基酸。有可能有所有氨基酸冷落，但是，我们优选使用介质缺乏只有一些特定的残基，因为完全失落培养基将补充后需要调整渗透压。我们选择了可补充，并且不需要摩尔渗透压调整一个赖氨酸酪氨酸 - 苯丙氨酸漏失介质。福rthermore，中等提供者不自由分享培养基成分的浓度;我们用100毫克/升的每个为赖氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸与成功。转染和表达培养基的体积必须被调整以考虑所添加的氨基酸。下面是调整上述的协议同位素标记
    2. 补充转染与小分子
      1. 准备的使用高压灭菌水2-脱氧-2-氟-1-岩藻糖的100mM储备溶液，并用0.22微米过滤灭菌该溶液。
      2. 为50毫升的培养，添加125微升的岩藻糖类似物溶液的转染和稀释介质（250μM）。注意：我们忽略了执行任何进一步的音量调整，因为增加取代基在此浓度只占0.25％的总培养体积。它是可能的修改使用聚糖处理的小分子抑制剂的表达。这里，我们描述的条件，包括2-脱氧2-氟-1-岩藻糖，岩藻糖基聚糖的抑制剂。我们发现在岩藻糖基>减少90％的添加岩藻糖类似物在250μM，在转染和稀释介质的浓度。

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Representative Results

高水平表达和纯度

这种优化的表达系统产生的高收率糖基化蛋白。典型的图案显示在IgG1的-Fc的（图1）的表达。在这种情况下，第0天是转染一天随后1天（稀释）和随后的培养天至第5天的蛋白质表达使用在粗培养基中的可溶性表达馏分进行分析。观察到在第1天的一个非常小的量的蛋白质表达作为培养等分试样取出培养稀释后3小时。这种情况很容易可视化与显示一个不同的绿颜色在培养基中GFP标记的蛋白。观察到这种增加为在GFP-FcγRIIIa的和GFP-ST6GalI的表达从第2天至5天，在表达无显著增加4日和5天之间观察到在第5天，将细胞<50％可行的，因此收获培养物，以限制蛋白水解。 （> 99％; 图2）利用蛋白为IgG1的Fc或镍柱列的GFP-FcγRIIIa的导致具有高纯度的蛋白质的亲和纯化，产率（表1）和完整的糖基化（数据未显示）。

蛋白质和多糖的15 N或13 C同位素标记

该系统有效地表达，根据所描述的方案同位素富集的IgG1 Fc段。虽然观察到一个小的降低蛋白质产率（25-50％），良好分散的信号分别出现在一个二维NMR谱该相关1 H原子的共振频率和直接结合酰胺15 N原子（图3）。这种表达水平允许在需要的结构为基础的研究（通常2-20规模高效的蛋白质生产mg蛋白质）和示出了标记的同位素成蛋白质的成功掺入。这个频谱与出版谱之间的相似程度高表明蛋白标记的高度发生以最小的加扰的15 N标签43。

生产的蛋白质具有不同的N-聚糖

不同的糖型制作与HEK293F和HEK293S细胞。基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）的酶可释放的N-聚糖的分析显示预期的糖型（图4）。从HEK293S细胞窝藏N-聚糖那名的曼5的GlcNAc 2形式和不含有岩藻糖（图4）表达的蛋白。从HEK293F表达材料聚糖复合型，双天线形式的核心岩藻糖，大多具有末端N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）或单 - 或二 - 半乳糖（GAL）形式小的比例。虽然它不知道什么天然的N-聚糖ST6GalI和FcγRIIIa的是，该聚糖天寒IgG1 Fc段是高度相似的IgG1 Fc的人血清46纯化。主要不同包括改性程度; IgG1 Fc段从人血清中显示出更高程度的半乳糖基化比观察到的HEK293F表达。使用的HEK293F细胞系进行的加入2-脱氧-2-氟-1-岩藻糖，岩藻糖基聚糖的抑制剂，涉及一种表达表明在岩藻糖掺入急剧减少> 90％（图4）。

图1
图1： 重组蛋白的高产率通过从pGEn2矢量表达恢复。 （A - B）两种解释v在这项研究中使用ectors从一个pIBI30质粒包含一个放大 R盒和大肠杆菌产生的大肠杆菌复制起点。 HEK293F细胞的瞬时转染后（C）的表达分泌的IgG1 Fc蛋白的水平。 SDS-PAGE分析显示，表达的蛋白质的积累，从第0天至第5天，并用箭头指示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2：恢复 从培养基中表达的蛋白质。 （A）的IgG1-Fc的，（B）GFP-FcγRIIIa的。 “中”是指在离心后的培养液; FT =从纯化塔流经分数。的SDS-PAGE样品公关 epared在非还原条件下不β巯基乙醇。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3：IgG1 Fc段的氨基酸选择性标记 1 H 15 N异核单量子相干谱〔15 N-二酪氨酸; 15 N-二赖氨酸] -标记的定制培养基A补充有使用HEK293F细胞IgG1 Fc段表示（15 N ）标记的1-酪氨酸和L-赖氨酸。交叉峰基于以前的报告43,47被分配。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图 4：使用不同的培养条件在HEK293细胞中的聚糖组合物的小分子调节剂的存在下蛋白质表达 IgG1 Fc段的N-聚糖剖面表示。顶部频谱使用多糖分离IgG1 Fc段表达HEK293S细胞制备。中心光谱揭示了从材料中表达的HEK293F细胞和底部光谱的IgG1 Fc段糖型类似地制备期望的细胞生长为GDP-岩藻糖生物合成的抑制剂，2-脱氧-2-氟-1-岩藻糖的存在。 N-糖链主要包括以下的CFG约定5卡通图：N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc），蓝色方形;甘露糖（文），绿色的圆圈;岩藻糖（岩藻糖）红色三角形;半乳糖（GAL），黄色圆圈。 请点击此处查看该图的放大版本。

<TBODY>
蛋白 产率（毫克/升）
IgG1 Fc段 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

表1：收率 为表示在HEK293F细胞中不同的蛋白质。

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Discussion

这个协议说明通过HEK293F或S细胞的瞬时转染的蛋白表达。建立的倒钩和Moremen实验室的最佳转染条件采用细胞密度和试剂浓度的临界组合，以实现高效率的转染。实施这项协议时，关键的考虑因素包括：保持在转染前一个稳定的文化（具有一致的文化倍增时间）;活跃生长的细胞的转染细胞存活率大于95％（按稀释细胞至1×10 6个细胞/ ml 24小时在转染之前实现）;在转染细胞密度应在含90％培养基A和10％培养基B的培养与存 ​​活率> 95％（转染密度）之间2.5-3.0×10 6个活细胞/ ml;和之前的PEI添加来添加的DNA在3微克/毫升和9微克/毫升，分别31;在24小时后转染的培养物以1:1稀释在培养基CONTA进不去4.4毫丙戊酸导致2.2毫valprioc酸中稀释的培养浓度;然后生产相生长在潮湿的摇瓶中，在37℃和8％CO 2继续额外4-5天。此处描述的载体进行了优化，可溶性蛋白表达系统32,42的一个重要特点。

如果目标蛋白质不表达，除了上述因素中，多个其它变量可以有助于产量低。确保蛋白质编码的DNA序列含有密码子的人细胞进行了优化。这可与多个在线资源进行评估。整个手术过程中不育是至关重要的。一，积极成长和纯HEK293F细胞的培养应该会出现小幅颗粒感肉眼和媒体应该多为清晰的（特别是在细胞密度<1.0×10 6个细胞 /毫升）。

培养沾染细菌或真菌应立即删除，以防止扩散。它是重要的是保持一个健康的股市文化。这是通过在0.3×10 6个细胞/ ml的细胞密度接种这些培养实现。下接种密度可以通过限制所需的细胞生长和分裂48各种生长因子的供给减缓其生长速度。作为文化已传代超过25或30倍，在表达下降了观察。为此，文化传代30次以上将被丢弃。

这是可能的蛋白质被降解，在表达培养基，或表达时限过长，导致蛋白降解的。由于这些原因，是推荐监视培养物生存力和蛋白质表达在每天确定最佳表达的时间表。它收获介质后尽可能快地纯化蛋白质是重要的。对于某些蛋白质，是有帮助的包括蛋白酶抑制剂durin克净化。总的来说，这些调整，改善了倒钩和Moremen实验室42,43蛋白的回收。

HEK293细胞的瞬时转染表现出极大的实用的制造可溶性蛋白质和蛋白质结构域天然被靶向分泌途径。它很可能是生产胞质或膜蛋白，将需要进一步优化。这种系统的主要优点是天然底物和机械蛋白生产都存在并且可以在HEK293细胞49。这在很大程度上帐户到其优于其它重组蛋白质的生产方法，如细 ​​菌没有或有限的翻译后修饰，或酵母和杆状病毒系统与正确折叠的，但不同的N-糖型并入1,50,51。

此外，这里描述的方案示出了添加的能力包括低分子量的COM磅如标记的氨基酸，标记的葡萄糖或设计修改N-聚糖组合物的小分子。在HEK293细胞也证明擅长非哺乳动物蛋白质，包括植物酶的表达，并支持共表达多个多肽的蛋白复合物的回收的（数据未显示）。

糖蛋白的结构和功能特性通常是由样品生产挑战而受到阻碍。此处所描述的蛋白表达系统超越这个缺点通过完成使用的复杂的细胞内聚糖酶处理6天然补体的翻译后修饰。这个强大而简单的协议被证明对人体悬浮HEK293细胞的瞬时转染。这种方法表现出的糖蛋白显著收率（> 95毫克/升）有三个N-糖基化的蛋白质，可容纳补充剂，如标记的氨基酸残基或小分子化学INHibitor 2-脱氧-2-氟-1-岩藻糖。表达的糖蛋白，可以进一步改造后的净化准备了广泛定义的糖型52。

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Acknowledgments

这项工作是由财政拨款K22AI099165（AWB）的支持，P41GM103390（KWM）和P01GM107012（KWM）由美国国立卫生研究院，以及来自生物化学，生物物理学和分子生物学的罗伊J.卡佛系美国爱荷华州立大学基金。这项工作的内容​​完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

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Tags

细胞生物学，第106，糖蛋白，免疫球蛋白G，FC，受体，重组蛋白，人HEK293F和HEK293S细胞

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

重组人蛋白与HEK293悬浮细胞的瞬时转染高产表达
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Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

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