Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53568
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

ERRATUM NOTICE

Abstract

Искусство получения рекомбинантных белков со сложными пост-трансляционных модификаций представляет собой серьезную проблему для исследований структуры и функции. Быстрое создание и высокое извлечение из временно трансфецированных клеточных линий млекопитающих обращается этот барьер и является эффективным средством выражения белки, которые, естественно, направлен через ER и Гольджи-опосредованной секреторной пути. Вот один протокол для экспрессии белка с использованием человеческого и HEK293F HEK293S клеточные линии, трансфицированные экспрессирующий вектор млекопитающего, предназначенный для высоких урожаев белка. Применимость этой системы продемонстрировали с помощью трех представительных гликопротеинов, которые выразили при урожайности между 95-120 мг очищенного белка восстановленного на литр культуры. Эти белки являются человеческий FcγRIIIa и крыс α2-6 сиалилтрансферазу, ST6GalI, как выражается с N-концевой GFP слияния, а также немодифицированного человеческого иммуноглобулина G1 Fc. Это надежные системы ИМПlizes бессывороточной среды, что является гибкой для выражения изотопно обогащенных белков и углеводов для структурных исследований с использованием масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Кроме того, в состав N-гликанов может быть настроена путем добавления небольшого молекулу, чтобы предотвратить определенные модификации гликанов таким образом, чтобы не уменьшить выход.

Introduction

Производство высокие урожаи соответствующим сложенными и посттрансляционно модифицированных белков человека для детального анализа структуры и функции остается серьезной проблемой. Большое количество систем экспрессии доступны, которые производят рекомбинантные белки с нативной как функции и поведение. Бактериальные системы экспрессии, преимущественно кишечной палочки штамма, представляют собой наиболее доступных и широко используемых инструментов в научно-исследовательской сфере, в связи с простотой этих систем экспрессии, хотя дрожжи, растения, насекомых и млекопитающих систем также описаны 1-4. Тем не менее, большинство из этих систем не способны соответствующим посттрансляционной модификации белков-мишеней. Фундаментальный интерес лабораториях Барб и Moremen производит эукариотических белков с соответствующей гликозилирования. Многие белки человека требуют соответствующего гликозилирования для правильного функционирования (см 5).

Эукариотическийгликозилирования техника обширна и способны сделать широкий спектр модификаций, в том числе как аспарагин (N) - и серина / треонина (О) -связанной сложные гликаны 6. Считается, что> 50% человеческих белков N-гликозилированные 7. Гликаны являются важными компонентами многих белков, включая терапевтические моноклональные антитела, эритропоэтин, и факторов свертывания крови, как фактор IX, чтобы назвать несколько. Хотя несколько методов существуют, чтобы подготовить соответствующим образом N-гликозилирования белков и варьируются от чисто синтетических 8-10, чтобы chemoenzymatic 11-14 или восстановление из инженерных рекомбинантных системах 15-20, не удивительно, что системы человека выражение до сих пор доказано, что самый надежный методы для генерации человеческих белков.

Многие терапевтические человека гликопротеины производятся в рекомбинантных системах, использующих клетки млекопитающих. Системы следует отметить яичника китайского хомячка (СНО), мышиной миеломы (ns0), хомячка Kidneу (ВНК), человеческого эмбриона почек (НЕК-293) и сетчатки клеточных линий человека, которые используются в адгезии или суспензионной культуры для производства белка 4,21,22. Тем не менее, системы экспрессии белка млекопитающего требовали генерацию стабильных клеточных линий, дорогих питательной среды и подложки помощь процедур трансфекции 23.

Млекопитающих трансфекции клеток достигается с помощью многочисленных агентов, включая фосфатов кальция 24,25, катионных полимеров (DEAE-декстран, полибрен, полилизин, polyethylimine (PEI)) или положительно заряженных катионные липосомы 26-29. PEI является поликатионное, загружают, линейный или разветвленный полимер (25 кДа), который формирует 26 стабильный комплекс с ДНК и эндоцитоз. При подкислении эндосомы, PEI, как полагают, набухают, что приводит к разрыву эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму 26,30.

До недавнего времени, временная трансфекция в suspensiна культуру проводилась по предварительной ДНК / PEI комплексообразования с последующим добавлением к культуре клеток 29. Тем не менее, Würm и соавторы сообщили весьма эффективный протокол, оптимизированный для рекомбинантного белка в клетках НЕК293, которые сформировали комплекс ДНК / PEI в месте 31,32. Это препарат, избежать стерилизации комплекса, и буфера обмена в культуральной среде. Дальнейшая оптимизация путем включения экспрессии плазмиды, повышающих привели к значительным увеличением доходности 33. В этом метод, который основывается на этих авансов и широко применим. Условия экспрессии также могут быть изменены, чтобы повлиять на состав N-гликанов.

Клеточная линия HEK293S, с делеции гена, что останавливает N-гликана обработки на промежуточном этапе, приводит к экспрессии белков с единых N-гликанов, состоящих из 2 N-ацетилглюкозамина остатков плюс пять остатков маннозы (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Эти клеткине хватает N-ацетилглюкозаминил трансферазы I (GntI) ген, который требуется для последующего N-гликанов обработки 36,37. Применение ингибиторов гликозилтрансферазы включая kifunensine, аналогов сиаловой кислоты и фукозы аналоговых и 2-дезокси-2-фтор-фукозы имеет подобные эффекты и ограничения N-гликанов обработки 38-41.

Протокол сообщалось здесь, использует вектор pGEn2, как показано на рисунке 1 42,43, PEI трансфекции помощь переходные в клетки линий (HEK293F или HEK293S клеток), а также восстановление с высоким выходом соответственно гликозилированный белок. Эта система является надежной и может использоваться для различных факторов, включая изотопной метки и гликановой техники для производства больших титров рекомбинантных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол является достаточным для выражения с использованием либо HEK293F или HEK293S клетки.

1. Создание сотовый

  1. Культура Прививка
    Примечание: Все процедуры манипулирования культуры должно осуществляться в BSL-2 объекта, и каждый пункт принес в кабинет биобезопасности должны быть стерилизованы путем распыления с 70% этанола в водном растворе.
    1. Используйте инкубатор шейкер при 135 оборотах в минуту, 80% влажности и при 8,0% CO 2 и 37 ° С. Включите "на" УФ лампы шкафа биобезопасности, по меньшей мере 1 ч до начала работы. Prewarm запечатанные среды А и B средний бутылки в водяной бане при 37 ° С в течение 1 часа.
    2. Стерилизация 125 мл колб Эрленмейера роста с вентилируемой крышкой, пипеток, дозаторов, и предварительно нагретой бутылки медиа опрыскиванием 70% -ным этанолом в водном растворе. Поместите эти элементы в шкафу биобезопасности. Примечание: Стерилизовать только внешний пластик покрытия 125 мл Эрленмейера культуральной колбы, а затем удалить, только когда яс внутри шкафа биобезопасности.
    3. Для культуры 30 мл, 26 мл вывести среды А и 3 мл среды В (10% от окончательной культуры) и передачи в Эрленмейера культуры колбу 125 мл и осторожно перемешать путем встряхивания (далее называется как свежей культуральной среды).
    4. Передача один флакон клеток, содержащих клетки, HEK293F замораживали при -80 ° С, на лед и перейти к комнатной культуре. Примечание: HEK293F клетки работают при плотности 1 х 10 7 клеток / мл.
    5. Теплый флакон осторожно водяной бане при 37 ° С для частичного оттаивать клетки (это занимает около одной мин и клетки не должны быть полностью размораживают). Стерилизовать снаружи флакона с 70% этанола в водном растворе и переместить его в шкафу биобезопасности.
    6. Используя 1 мл пипетки, вывести клеточной суспензии (приблизительно 0,7 мл) и передать в 125 мл колбу Эрленмейера, содержащую 29 мл свежей культуральной средой. Закройте крышку культуры колбу и переместить его в инкубированной шейкере.
    7. Обслуживание датчика: Проверьте сотовый плотность, жизнеспособности и клеточной Проходы
      1. Проверка плотности клеток после 24 ч оттаивания культуры, следуя протокол ниже. Примечание: Клетки выращивали в течение 24 часов после размораживания, чтобы обеспечить рост клеток эфирные и жизнеспособность> 80%.
      2. Стерилизовать культуры колбу с 70% этанола в водном растворе и переместить его в шкафу биобезопасности.
      3. С помощью пипетки 1 мл пипетки и медленно снять 100 мкл суспензии культуры и передачи в стерильный 0,5 мл трубки Эппендорф. Закрыть и передачи культуральной колбы обратно в шейкере, как можно скорее.
      4. Смешайте 7,5 мкл трипанового синий раствор с 7,5 мкл клеток. Смешайте энергично 7,5 мкл клеточной / Трипановый синий смеси и перенести его на счетной слайда.
      5. Включите автоматический счетчик клеток и поместите подсчета слайд в загрузочную камеру. Авто читатель активируется и клетки подсчитывали автоматически в единицахчисла клеток на мл и процентов жизнеспособности
      6. Определить объем культуры доноров, необходимого для перевода в свежей культуральной средой при плотности клеток 0,3 × 10 6 живых клеток / мл.
        Примечание: См пример расчета в дополнительных материалах.
      7. Повторите шаги 1.1.2 и 1.1.3 протокола "1.1 Культура Прививка" выше, для получения материалы, необходимые для свежей культуральной среды.
      8. Теплоноситель A (23 мл) и питательную среду В. (3 мл) в 125 мл свежего культуральной колбы. Удалить фондовые бутылки среде А и среднего B от биобезопасности кабинета.
        Примечание: Запасы СМИ бутылок не должны храниться в шкафу биобезопасности в то же время, как клетки НЕК 293F. Это ограничивает возможность загрязнения фондовый среднего бутылки.
      9. Удалить культуру клеток НЕК293 из инкубатора и распылить с 70% -ным этанолом в водном растворе. Используя новую пипетку, вывести аликвоту клеток (4 мл, этот объем был определен в соответствии тО шагом 1.2.6) из культуры и передать его в колбу, содержащую свежую питательную среду.
      10. Перевести обе культур из шкафа биобезопасности в инкубатор шейкере в соответствии с 1.1.1. Рост клеток к приближенному плотности 2-3 × 10 6 живых клеток / мл.
        Примечание: Примерное время удвоения клеток 32 ч. Это займет 3-4 дней, чтобы достичь этого плотность. Инкубируйте клетки в течение 3-4 пассажей иметь стабильный характер роста клеток до первой трансфекции.

    2. Подготовка материалов для трансфекции

    1. Подготовка клеток НЕК293 (день 1)
      1. Субкультуры клетки до плотности 1 х 10 6 клеток / мл в свежей среде B 24 ч до трансфекции в соответствии с шагом 1.2.
        Примечание: объем трансфекции культуры будет зависеть от числа клеток. Объемах, трансфекции (> 20 мл) потребуется больший объем культуры на данном этапе.
    2. Подготовка Stocks Материалов
      1. Подготовка исходного раствора линейного полиэтиленимина (PEI) в концентрации 1 мг / мл в буфере, содержащем 25 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) и 150 мМ NaCl (рН 7,5). Растворите PEI полностью; это может занять 30-60 мин при комнатной температуре. Стерилизовать через 0,22 мкм шприцевой фильтр и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного использования.
      2. Подготовьте стерильную ДНК плазмиды (в соответствии с шагами 2.2.2.1-2.2.2.4). Порядок плазмиды конструкция описана в другом месте 42. Краткий порядок подготовки ДНК объясняется здесь:
        1. Выращивают культуру химически компетентных клеток кишечной палочки, трансформированных вектором pGEn2 в 1 л LB среды (Tryptone- 10 г / л, дрожжевой выводами для 5 г / л и хлоридно-натриевой 10 г / л) с добавлением 100 мкг / мл ампициллина. Е. палочка выращивают при 37 ° С в увлажненной без встряхивания, инкубатор.
        2. Очищают pGEn2 вектор, кодирующий целевой ДНК плазмиды в соответствии с МануДНК очистки протокол изготовителе в.
        3. Для обеспечения полной стерильности плазмидной ДНК, выполните окончательные изопропанол осадков и ресуспендирование шаги процедуры экстракции ДНК внутри шкафа биобезопасности.
        4. Добавить объем изопропанола (указанный в наборе плазмидной ДНК), чтобы элюированной ДНК и центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин. Стерилизовать снаружи контейнера ДНК с 70% этанола в водном растворе и передать его в шкафу биобезопасности. Откажитесь изопропанольного супернатант с помощью пипетки и воздушно-сухой осадок ДНК. После высыхания, ресуспендируют осадок в буфере стерильной 10 мМ Трис, рН 8,0.
      3. Подготовка исходного раствора 220 мМ вальпроевой (VPA) кислоты в воде и стерилизуют путем прохождения через стерильный фильтр 0,22 мкм. Хранить раствор при -20 ° С до дальнейшего использования.

    3. Установление временной трансфекции

    1. Трансфекция (день 0)
      1. Проверьте плотность клеток, выполнив действия 1.2.2 через 1.2.5 »1.2. Обслуживание датчика" выше. Определить количество клеток для трансфекции (2,5-3,0 × 10 6 живых клеток / мл с жизнеспособностью> 95%). См пример расчета в дополнительных материалах.
      2. Передача объем суспензии культивируемых клеток, рассчитанных на предыдущем шаге (здесь 67 мл) до 250 мл центрифужную пробирку с использованием стерильного серологические пипетки. Собирают клетки центрифугированием в течение 5 мин при 100 х г в.
      3. В то же время, подготовить свежий трансфекции культуральную среду следующим шагом 1.1.3 в соответствии с "1.1. Культура Прививка" выше. См дополнительных материалов для расчета образца. Кроме того, передача 5 мл свежей культуральной среды в стерильную пробирку 15 мл и отложите в сторону.
      4. Передача пробирки, содержащие осажденные клетки в корпус биологической безопасности после стерилизации снаружи трубок с 70% -ным этанолом в водном растворе и использовать стерильной пипетки переливать гое супернатант, состоящий из отработанного культуральной среде.
      5. Энергично ресуспендирования клеток путем осаждают пипетированием вверх и вниз с помощью 10 мл свежей культуральной средой и передачи в колбу со свежей культуральной среде трансфекции (полученного на стадии 3.1.3 выше). Винт колпачка на вентилируемый клеточной культуральной колбы и колбу переместить в инкубатор (как указано в 1.1.1) в течение 15 мин-1 час при встряхивании.
      6. В течение этого времени, разбавить плазмидной ДНК и PEI запасов с использованием свежую культуральную среду (используя объем 5 мл выведены из шага 3.1.3 выше) до конечной концентрации 0,5 мкг / мкл. См образец расчеты в дополнительные материалы, чтобы определить количество ДНК и PEI. Передача культуральной колбы с рассредоточенными клеток в шкафу биобезопасности.
      7. Добавить плазмидной ДНК (300 мкл 0,5 мкг / мкл) к культуре с использованием микро-пипетки и перемешать, осторожно вручную встряхивании. Добавить PEI (900 мкл 0,5 мкг / мкл) к культуре, перемешать осторожно встряхивая. Добавить 3,8 мл свежей кульры среднего, с шага 3.1.3, выше и передачи колбу в инкубатор шейкере в течение 24 часов.
      8. Очистите биозащитой в соответствии со стадией 1.1.
    2. Разведение (День 1) (Для объема трансфекции 50 мл)
      1. Инкубируйте культуру, трансфицированных в течение 24 часов.
      2. Вывод 1 мл предварительно нагретой 220 мМ Вальпроевая кислота (VPA; подготовлен в соответствии с шагом 2.2.3.) С использованием стерильных 1 мл серологические пипетки и перенести его на стерильную пробирку на 50 мл.
      3. Вывод 5,0 мл предварительно нагретого среднего B и 44 мл предварительно нагретого среде А и добавить к раствору VPA с использованием стерильного серологические пипетки, с получением 50 мл свежей культуральной среды с конечной концентрацией 4,4 мМ VPA.
      4. Перемещение трансфи- культуру в биозащитой после стерилизации внешний вид колбу с 70% -ным этанолом в водном растворе, добавить подготовленную среда разведения и передачи колбу обратно в инкубируют шейкере.
    3. Экспрессия и урожая (Дни 2-6)
      1. Инкубируйте клетки в течение дополнительных 4-5 дней (всего 5-6 дней, так как трансфекции).
      2. Вывод аликвоты культуральной среды следующий шаг 1.2.2. в 1.2.5. описано в "1.2. Обслуживание датчика", выше, с использованием стерильного 1 мл серологические пипетки, следить за жизнеспособность клеток и сохранить аликвоты для анализа экспрессии белка в каждый день по SDS-PAGE (см раздел 5, ниже).
      3. Урожай клетки после 5-6 дней центрифугированием клетки плюс среда при 1000 г в течение 5 мин. Кроме того, урожай супернатант, если жизнеспособность клеток падает ниже 50% (см шаги 1.2.2-1.2.5).
      4. Слейте надосадочную, который будет содержать секретируемый белок. Добавьте 5 мл 10% отбеливателя в НЕК клеточного осадка и отбросить как Biohazard.

    4. Белки очистки

    1. Подготовка колонки 5 мл протеин-А-сефарозе. Равновесие колонки 5 объемами колонки буфера А (20 мМ 3- (N-морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS), рН 7,4, 100 мМ NACл).
    2. Центрифуга собранных супернатанта с экспрессированного белка на высокой скорости (14000 г в течение 10 мин) для удаления остатков клеточного дебриса. Сбор декантацией в чистую пробирку. Откажитесь от гранул как Biohazard.
    3. Сбор 10 мкл аликвоту супернатанта и дополнительно собрать небольшой образец на каждой стадии очистки белка анализа образца в ДСН-ПААГ (описано в разделе 5). Загрузите осветленный супернатант и собрать поток через.
    4. Промыть колонку с объемами 3-колонки буфера А и элюируют протеин с объемами 5-столбцов 100 мМ глицина, рН 3,0. Собирают элюат в пробирки, содержащие одну половину объема 1 М Трис-буфере, рН 8,0 быстро нейтрализовать рН.
    5. Промыть колонку с 10 объемами колонки буфера А и магазин для будущего использования.
    6. Буфер обмена элюированный белок с по меньшей мере 10-кратным избытком буфера А с использованием 10 кДа молекулярной массой среза фильтров центробежные. Примечание: Не сосредоточиться элюированную образец дляочень малый объем (<2 мл) в элюированной буфера. Используйте центробежные фильтры для обмена буфер буфером А.
    7. Магазин не очищенного белка при 4 ° С до следующего использования.
      Примечание: белок, экспрессируемый в надосадочной жидкости, могут быть очищены аффинной столбцов, выбранных на основании свойств белка или использования аффинных меток. Для типичного процедуры очистки, белок А колонки могут быть использованы для IgG Fc или его фрагментов или столбце никеля может быть использован для белков, экспрессируемых с поли-гистидина тега. Здесь приведено описание стадий очистки для IgG1-Fc с использованием колонку с белком А.

    5. Анализ белка в ДСН-ПААГ

    1. Развести Аликвоты (7,5 мкл) каждого образца с равным объемом 2х буфера для загрузки (0,125 М Трис, рН 8,0, 4% SDS, 10% бета-меркаптоэтанол, 20% глицерин, и 0,01% голубой бромфениловый).
    2. Варить смесь при 90 ° С в течение 5 мин, используя нагревательный блок или водяной бане. Центрифуга образцов при 10000 г FOR 1 мин. Загрузка подготовленную гель с 5 мкл маркера белка и 14 мкл образцов для анализа с использованием 20 мкл пипетки с одноразовый наконечник.
    3. Запустите один гель при 25 мА в течение 60 мин. После электрофореза шаг является полным, передавать гель в контейнер с 1 л воды и микроволновой печи в течение 5 мин.
    4. Пятно гель с красящим раствором (40% этанола, 10% -ной уксусной кислоты и 0,1% кумасси бриллиантовым синим) в течение 2 ч и destain в воде.

    6. Гликаны Анализ масс-спектрометрии

    1. Анализ гликаны, как описано выше 44. Вкратце, 75 мкг IgG1-Fc был трипсином, а затем обрабатывают помощью PNGазы F для выхода гликанах 45. Дата выхода гликаны перметилированный и проанализированы с помощью матрицы-активированная лазерная десорбция ионизации-время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOFMS).

    7. Корректировка протокол для специальных сценариев

    1. Мечения белков с 15 N-меченых аминокислот (для объема трансфекции 50 мл)
      1. Разлить 5 мг каждой аминокислоты в одном стерильном стеклянный флакон. Ресуспендируют с 4 мл воды автоклавного (обратите внимание, Тир не полностью растворить, в отличие от Lys и Phe). Стерилизацию автоклавированием раствора путем при 121 ° С в течение 15 мин. Дайте раствору остыть примерно до 50-60 ° С.
      2. Для объема трансфекции 50 мл, выполните шаг 3.1.3 в соответствии с "3.1 Создание временной трансфекции". Смотрите раздел Дополнительные материалы для примера с соответствующими объемами.
      3. Для трансфекции, следуют этапы "3. Установление временной трансфекции" с помощью свежую культуральную среду, замещенную меченых аминокислотных остатков, полученного выше.
      4. Через 24 часа трансфекции в день разбавления культуры, вывести 5,0 мл предварительно нагретого среднего B 40 мл предварительно нагретой среде А и свежей автоклавного 4 мл аликвоты смеси аминокислот (полученного, как на стадии 7.1.1. Выше) и добавить 1мл предварительно нагретого исходного раствора раствор VPA с получением 50 мл свежей культуральной среды растворения с конечной концентрацией 4,4 мМ VPA. Добавить эту среду трансфекции культуры, используя стерильную пипетку серологический.
      5. Передача трансфи- культуру в биозащитой после стерилизации внешний вид колбу с 70% -ным этанолом в водном растворе, добавить подготовленную среда разведения и передачи колбу обратно в инкубируют шейкере.
        Примечание: Средние А представляет собой химического состава, не содержащей сыворотки среде. Таким образом, можно приготовить другой состав. Связаться с поставщиком для получения пользовательского подготовку СРЕДНЕЙ, что не хватает некоторых аминокислот. Можно иметь все аминокислоты опущены, однако, мы предпочитаем использовать носитель, который не хватает только несколько избранных остатки, потому что полная отсева средней потребует регулировки осмолярности после добавки. Мы выбрали отсева среду Lys-Tyr-Phe, которые могут быть дополнены и не требуют регулировки осмолярности. Марихуанаrthermore, среда Поставщик не свободно обмениваться концентрации компонентов среды; мы использовали 100 мг / л каждый для Lys, Tyr и Phe с успехом. Объемы трансфекции и экспрессии среды должны быть скорректированы с учетом добавленных аминокислот. Вот корректировки выше протокола для изотопной метки
    2. Дополнение трансфекции с низкомолекулярных
      1. Подготовьте 100 мМ исходного раствора 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы с использованием автоклавного воды и стерилизовать этот раствор с использованием фильтра 0,22 мкм.
      2. Для культуры 50 мл, добавляют 125 мкл (при 250 мкм) фукозы аналогового решения трансфекции и разбавления сред. Примечание: Мы пренебречь выполнить любую дополнительную регулировку громкости, потому что добавление заместитель в этой концентрации составляет лишь 0,25% от общего объема культура .Это можно изменить выражение, используя низкомолекулярные ингибиторы гликановой обработки. Здесь мы опишем условия для включения 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы, ингибитор гликановой фукозилирования. Мы обнаружили,> снижение фукозилирования 90% путем добавления фукозы аналог при концентрации 250 мкМ в трансфекции и разбавления сред.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспрессия белка высокого уровня и чистоты

Эта оптимизированная система экспрессии генерируется высокий выход гликозилированного белков. Типичный образец показан в выражении IgG1-Fc (рисунок 1). В этом случае день 0 в день трансфекции с последующей День 1 (разбавление) и последующие дни культуры до 5 день экспрессии белка анализируют с помощью экспрессии растворимого фракцию в сырой среде. Очень небольшое количество экспрессии белка наблюдали в 1-й день, как культура аликвоту отбирали 3 ч после разбавления культуры. Это легче визуализировать с GFP-меченных белков, которые отображают четкую зеленый цвет в культуральной среде. Такое увеличение не наблюдалось в выражении GFP-FcγRIIIa и GFP-ST6GalI от День 2 Дня 5. Отсутствует значительное увеличение экспрессии наблюдается между 4-й день и День 5. На 5-й день, клетки <50%жизнеспособным и, следовательно, культуру собирали, чтобы ограничить протеолиз. Сродство очистка с использованием колонку с белком А для Fc IgG1, или столбца никеля для GFP-FcγRIIIa привело белков с высокой степенью чистоты (> 99%; рисунок 2), выход (таблица 1) и полное гликозилирование (данные не показаны).

15 Н или 13 С изотопной метки белков и гликанах

Эта система эффективно выразил изотопно-обогащенного Fc IgG1, по описанной протокола. Хотя небольшое снижение доходности белка наблюдалось (25-50%), хорошо диспергированные сигналы были замечены в 2d ЯМР спектра, которая коррелирует резонансную частоту 1 Н-атомов и непосредственно связан амида 15 N атомов (Рисунок 3). Этот уровень экспрессии позволяет эффективное производство белка в масштабах, необходимых для структурных исследований на основе (как правило, 2-20мг белка) и иллюстрирует успешное включение меченых изотопов в белок. Высокая степень сходства между этим спектром и опубликованных спектров показывают высокую степень мечения белков произошло с минимальным карабкаться из 15 N 43 этикеток.

Производство белки с различными N-гликанов

Различные гликоформы были произведены с клетками HEK293F и HEK293S. Матрица-лазерной десорбцией ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS), анализ ферментативно выпущенных N-гликанов показал ожидаемые гликоформ (рисунок 4). Белки, выраженные с HEK293S клеток, обитающих N-гликаны, которые были в парня 5 GlcNAc 2 формы и не содержит фукозу (рисунок 4). Гликаны из HEK293F выраженной материала были сложными типа, biantennary формы с основной фукозой и в основном имеющие терминалN-ацетилглюкозамина (GlcNAc) или небольшая доля моно- или ди-galactosylated (GAL) формах. Хотя это не знаю, что родные N-гликаны ST6GalI и FcγRIIIa, тем гликана профиль для IgG1 Fc очень похож на IgG1 Fc, очищенного из сыворотки крови человека 46. Основные различия включают в себя степень модификации; Fc IgG1, из сыворотки крови человека показывает более высокую степень, чем наблюдаемое галактозилирования для выражения HEK293F. Добавление 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы, ингибитора гликановой фукозилирования, к выражению проводили с использованием клеточной линии HEK293F показали резкое снижение> фукозы включения 90% (рисунок 4).

Рисунок 1
Рисунок 1: Высокие выходы рекомбинантных белков восстанавливаются путем экспрессии из вектора pGEn2. (А - В) Два выражения vectors, используемые в данном исследовании были получены из плазмиды pIBI30, который содержит усилитель R кассету и E. палочка начала репликации. Уровень (С) Экспрессия секретируемого белка Fc IgG1, после транзиторной трансфекции клеток HEK293F. Анализ SDS-PAGE показывает накопление белков, выраженных от 0 до Дня День 5 и указывается стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Восстановление экспрессированного белка из культуральной среды. (А) IgG1-Fc, (Б) GFP-FcγRIIIa. "Средний" относится к культуральной среде после центрифугирования; FT = течь через дробь из колонки очистки. Образцы SDS-странице пр epared в невосстанавливающих условиях без -меркаптоэтанол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Аминокислота селективный маркировки IgG1 Fc 1 Н- 15 N гетероядерной одного квантовая когерентность спектр [15 N-Tyr; 15 Н-Lys] меченные Fc IgG1, выражается с помощью HEK293F клеток в обычай среда А с добавлением (15 Н ) помечены л-Tyr и L-Lys. Crosspeaks были назначены на основе предыдущих докладах 43,47. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

_upload / 53568 / 53568fig4.jpg "/>
Рисунок 4:. Экспрессия белка в присутствии низкомолекулярных модуляторов гликановой композиции N-гликанов профили Fc IgG1, выраженное в НЕК293 использованием различных условий культивирования. Верхняя спектр был получен с использованием гликаны, выделенные из Fc IgG1, выражается в HEK293S клеток. Центр спектр показывает Гликоформы Fc IgG1, из материала, выраженного в HEK293F клеток и нижней спектра готовят аналогично ожидать клетки выращивали в присутствии ингибитора ВВП-фукозы биосинтеза, 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы. N-гликаны представлены как мультфильма диаграмм следующих конвенции CFG 5: N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), синий квадратов; Манноза (Человек), зеленые круги; Fucose (ОФП) красные треугольники; Галактоза (Гал), желтые круги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

<TBODY>
Белок Выход (мг / л)
Fc IgG1, 120
GFP-FcgRIIIa 100
GFP-ST6GalI 95

Таблица 1: Выход для различных белков, выраженных в HEK293F клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол иллюстрирует экспрессию белка с помощью переходного трансфекции HEK293F или S клеток. Оптимальные условия трансфекции, установленные в лабораториях Барб и Moremen использовать критическую комбинацию плотности клеток и реагентов концентрации для достижения высокой эффективности трансфекции. Критические соображения при реализации этого протокола включают в себя: поддержание стабильной культуры до трансфекции (с последовательным культура удвоения раз); трансфекции клеток активно растущих (достигается путем разбавления клеток до 1 × 10 6 клеток / мл 24 ч до трансфекции клетки) с жизнеспособностью выше 95%; плотность клеток в трансфекции должна быть между 2,5-3,0 × 10 6 живых клеток / мл с жизнеспособность> 95% (плотность трансфекции) в культуре, содержащей 90% Средние A и 10% B Средняя, и, добавив ДНК до PEI того в 3 мкг / мл и 9 мкг / мл, соответственно 31; через 24 часа после трансфекции культуры разбавляют 1: 1 в средней Контаоцен- ками 4,4 мм вальпроевой кислоты, приведет к концентрации 2,2 мм valprioc кислоты в разбавленном культуры; фаза рост производства затем продолжается в увлажненной вибрирующей колбе при 37 ° С и 8% CO 2 в течение дополнительных 4-5 дней. Вектор, описанный здесь оптимизирован и важной особенностью системы экспрессии растворимого белка 32,42.

Если целевой белок не выражает, в дополнение к перечисленных выше факторов, несколько других переменных может способствовать низкими выходами. Обеспечить кодирующей белок ДНК-последовательность содержит кодоны, оптимизированные для клеток человека. Это может быть оценена с несколькими интернет-ресурсов. Стерильность в течение всей процедуры имеет первостепенное значение. Активно растет и чистая культура HEK293F клеток должны появляться несколько зернистыми невооруженным глазом, и среда должна быть в основном ясно (особенно при плотностях клеток <1,0 × 10 6 клеток / мл).

Культуры, загрязненные бактериями или грибком должныбыть немедленно удалены, чтобы предотвратить распространение. Это важно для поддержания здорового исходной культуры. Это достигается путем инокуляции этих культур в клетках плотностью 0,3 × 10 6 клеток / мл. Нижние плотности прививки может замедлить темпы роста, ограничивая подачу различных факторов роста, необходимых для роста и деления клеток 48. Как культур были пассировать в течение более, чем 25 или 30 раз, наблюдалось снижение экспрессии. По этой причине, культуры пересевали более чем в 30 раз, отбрасываются.

Возможно белок деградирует в экспрессионной среды, или выражение сроки слишком длинный, что приводит к деградации белка. По этим причинам это рекомендуется для контроля жизнеспособности культуры и экспрессию белка в каждый день, чтобы определить оптимальный экспрессии сроки. Важно очистки белков как можно быстрее после сбора среды. Для некоторых белков, это полезно включать ингибиторы протеазы Дуриночистка г. В общей сложности, эти корректировки улучшили восстановление белков в Барб и Moremen лабораториях 42,43.

Переходный трансфекции клеток НЕК293 показал большую полезность для производства растворимых белков и домены, которые, естественно, ориентированные на секреторный путь. Вполне вероятно, что производство цитоплазматических или интегральными мембранными белками потребует дальнейшей оптимизации. Основное преимущество этой системы в том, что носители подложки и оборудование для производства белка присутствуют и доступны в клетках НЕК293 49. Это в значительной степени объясняет его преимущества перед другими методами производства рекомбинантного белка, таких как бактерии или нет с ограниченными пост-трансляционных модификаций, или дрожжей и бакуловирусных систем с правильно сложить, но разные N-гликоформы включены 1,50,51.

Кроме того, протокол, описанный здесь, показывает дополнительную возможность включить низкую молекулярную массу комфунтов, такие как меченых аминокислот, меченой глюкозы или малых молекул, предназначенных дл модификации состава N-гликанов. Клетки НЕК293 также оказаться опыт по экспрессии белков не млекопитающих, в том числе растительных ферментов, а также поддерживает взаимодействие экспрессию нескольких полипептидов для восстановления белковых комплексов (данные не показаны).

Структурная и функциональная характеристика гликопротеинов часто мешает производственных образец проблем. Система экспрессии белка описаны здесь преодолевает этот недостаток путем выполнения пост-трансляционные модификации, используя естественное дополнение сложных внутриклеточных ферментов гликановых обработки 6. Этот надежный и простой протокол доказано для временной трансфекции подвески клеток человека HEK293. Этот метод продемонстрировал значительный выход гликопротеин (> 95 мг / л) с тремя N-гликозилированных белков и может вместить добавки, такие как меченых аминокислотных остатков или маленькая молекула химического Inhibitor 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы. Выраженные гликопротеины могут быть дополнительно реконструированы пост-очистки для получения широкого спектра определенных гликоформ 52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке грантами K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) и P01GM107012 (KWM) из Национального института здоровья, и средств от Роя Дж Carver Департамента биохимии, биофизики и молекулярной биологии в Университете штата Айова , Содержание данной работы является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet  NuAire, Inc. CellGard ES NU-S475-400 Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation shaker INFORS HT Multitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium  Life Technologies 12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium  SIGMA 14571C 
125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431143
250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap Corning Incorporated/Life Sciences 431144
FreeStyle HEK 293F Cells Life Technologies R790-07
1 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10B
10 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10J
25 ml Disposable serological pipette Fisher Scietific 13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP) Drummond Scientific 161263
Trypan Blue Solution  Thermo Scientific  SV30084.01
Counting slides  Bio-Rad 145-0011
TC20 Automated Cell Counter  Bio-Rad  145-0102
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc. 23966 Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 μM syringe filter and store at -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) EMD Chemicals Inc. 7365-45-9
25 mm Syringe Filter, 0.22 μM Fisher Scietific 09-719A
Trisaminomethane (Tris base) Fisher Scietific BP152-1
XL1-Blue Stratagene 222249
Trypton Fisher Scietific BP1421-2
Yeast extract Fluka Analytical  92144
Sodium chloride BDH chemicals BDH8014
Plasmid Purification Kit QIAGEN 12145
Valproic (VPA) SIGMA P4543 Prepare stock solution of 220 mM  in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 °C
Centrifuge Thermo Scientific  EW-17707-65
Protein A-Sepharose column SIGMA P9424
Ni-NTA superflow QIAGEN 30430
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Fisher Scietific BP308-500
Glycine Fisher Scietific BP381-500
10 kDa molecular weight cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters  Millipore UFC901096
Sodium dodecyl sulfate ALDRICH L3771
Beta-mercaptoethanol ALDRICH M6250
Glycerol SIGMA G5516
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad 161-0373
Acetic Acid, Glacial  Fisher Scietific 64-19-7
coomassie brilliant blue  Bio-Rad  161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  Applied Biosystems
15N labeled L-Tyrosine ALDRICH 332151
15N labeled L-Lysine ALDRICH 592900
Unlabeled L-Phenylalanine SIGMA-ALDRICH P2126
13C6-Glucose ALDRICH 389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose  SANTA CRUZ Biotechnology sc-283123

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226 (2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13 (2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96 (2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Tags

Клеточная биология выпуск 106 гликопротеин иммуноглобулин G Fc-рецептор рекомбинантные белки человек HEK293F и HEK293S клетки

Erratum

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 09/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subedi, G. P., Johnson, R. W.,… More

Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. W. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J. Vis. Exp. (106), e53568, doi:10.3791/53568 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter