Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ett batteri av motoriska test i en neonatal musmodell av cerebral pares

Published: November 3, 2016 doi: 10.3791/53569

Introduction

Utveckling av nya modeller av barn skada eller sjukdom med hjälp av gnagare är ofta svårt på grund av den fantastiska förmågan hos både råttor och möss att snabbt återhämta sig från neurologiska skador. Därför, för att validera en ny pediatrisk sjukdomsmodell, grundligt undersöka de cellulära och molekylära förändringar måste gå hand i hand med beteende utfall. På många sätt kan funktionell beteende återhämtning vara viktigare än underliggande cellförändringar i form av terapeutisk eller translationell relevans. Som forskare lära sig mer om skada i den vuxna och nyfödda, är det klart att deras svar är mycket olika och kan inte extrapoleras mellan de två. Exempelvis neonatala möss uppvisar olika nivåer av nervtillväxtfaktor, hjärnhärledd neurotrofisk faktor, neurotrofin-3 och glia-cellinje-härledd neurotrofisk faktor efter ryggmärgsskada 1,2. Dessutom nyfödda har betydande blod-hjärnbarriären läckage efter stroke 3, demonstrate kortikala neuron ombildning efter perifer nervskada 4, och har en fördröjd eller saktade astroglios efter ryggmärgsskada och hypoxi-ischemi 5,6. Därför är det viktigt att translationell pediatrisk forskning använda utvecklings motsvarande modeller och att dessa modeller utvärderas för både cellulära / molekylära förändringar och åldersanpassad beteendetester.

Cerebral pares (CP) är en motor sjukdom som drabbar 3: 1000 levande födda per år (NIH). Barn med CP uppvisar en rad symptom och komorbida förhållanden, beroende på sjukdomens svårighetsgrad. Svårighet med rörelse och samordning är de vanligaste tecknen, tillsammans med förseningar i gående motorutvecklingsmässiga milstolpar. Andra tecken är onormal muskeltonus (antingen ökas eller minskas), minskade finmotorik, gångsvårigheter, överdriven dreglande och svälj och tal förseningar (NIH). Den underliggande orsaken till CP tros varaen brist på syre och / eller blodflödet till hjärnan under pre- eller förlossningen, eller upp till ett år efter förlossningen. Dessutom är inflammation nu tros vara en viktig del i utvecklingen av CP.

Majoriteten av CP fall är förknippade med vita substansen skada runt kamrarna, så kallade periventrikulär leukomalaci (PVL). Detta neurologiska kännetecken antyder att den initiala förolämpning som leder till CP sker under perioden av hjärnans utveckling när oligodendrocyter är mest utsatta för förolämpning. Den period av snabb oligodendrocyt tillväxt i en människa, även den period då oligodendrocyter är mest känsliga för skador, är mellan 24-32 veckors graviditet. I gnagare, är den motsvarande period efter förlossningen dagar 2 - 7 7, och är när CP induceras i denna modell.

Neonatal musmodell av CP som användes för att utföra de tester som beskrivs här kombinerar hypoxi och ischemi med inflammation för att skapa en injury att bättre efterliknar neurodegeneration ses i mänsklig CP. Denna modell tar upp några av de stora brister som konstaterats i andra djurmodeller av CP, som saknar tydliga motoriken som liknar CP patienter människa, liksom distinkt vita substansen skada. Tidigare studier med en medarbetare med hjälp av samma modell har visat att tillsättningen av inflammation ökar vita substansen skada, därmed bättre efterlikna PVL hos barn med CP 8. Att bygga på tidigare data, presenterar detta papper en omfattande batteri av neonatala motortester för att utvärdera förändringar i motoriskt beteende som djuret åldrar.

Protocol

OBS: Alla djur operationer utfördes i enlighet med Temple University Ular avdelning och IACUC riktlinjer och rutiner. C57BL / 6 dammar och hingstar köptes från Charles River Laboratories och inhystes i avelsburar med en 12 timmar ljus / mörker-cykel (ljus på från 7:00 till 19:00) med fri tillgång till mat och vatten. Häckande par producerade kullstorlekar mellan 5 - 10 valpar.

1. Cerebral pares Induktions Surgery

  1. OBS: Cerebral pares inducerades med användning av postnatal dag (PND) 6 musungar, såsom tidigare beskrivits 8,9 (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
  2. Placera en valp i en glasskål på is med ett laboratorium torka att skydda valpens hud. Kontrollera om lämpligt bedövningsmedel plan till fots nypa och brist på rörelse. Flytta valpen till en vadderad kylpåse för operation.
  3. Sterilisera huden valpen användning av 70% etanol. När det är torrt, använd en # 11 steril kirurgisk blade och gör en 1 cm snitt i nacken.
  4. Med hjälp av ett stereoskopiskt operationsmikroskop, isolera den högra gemensamma halspulsådern med en liten krok och bränna med hjälp av en bärbar handhållen cauterizer. bekräftar visuellt att artären är tilltäppt. Sham kirurgi inkluderar visualisering och isolering av den gemensamma halspulsådern utan kauterisation.
  5. Justera huden och nära med hjälp av sutur lim (n-butyl-cyanoakrylat).
  6. Placera valpen på en 34 ° C värmedyna i 30 minuter för att övervaka spontan andning och normal rörelse.
  7. Återgå valpen (s) till dammen under 30 minuter.
  8. Placera valparna på en värmedyna eller annan uppvärmningsanordning inställd på 34 ° C inuti en hypoxi kammare inställd på 6% syre under 35 min. Syre ersätts av kväve. Noga övervaka kammarsyrenivån och temperaturen konsekventa skaderesultat.
  9. Ta valparna från hypoxi kammaren och återföra dem till värmedyna.
  10. Intraperitonealt injicera lipopolysackarid utspädd i steril saltlösning vid 1 mikrogram / kg och tillbaka valpen till dammen. Simulerade injektioner är injektioner av endast saltlösning.

2. Neonatal motoriska test

OBS! På PND 8, 48 h efter CP-induktion, är musungar testas för neurobehavioral utveckling. Valpar testas inom fyra timmar blocket före lunchtid för att eliminera tid på dygnet skillnader i beteende. Valpar tas bort från dammen för mer än 15 minuter åt gången för att förhindra en snabb förlust av kroppsvärmen och hunger / separationsproblem. Dessutom är pups får vila i mellan proven så att maximala insatser kommer att framkallas på varje test. Grunden för neonatala motoriska test är anpassad med hjälp av Fox batteri av tester 10,11 och Wahlsten s anpassning av Fox tester 12, liksom Treat-NMD och andra beteende publikationer (som noterats i texten för varje test). Fox batteri av tester är lämpliga för PND 2 - 21. Fox tester, smeteny närvarande här inkluderar: rätande reflex, gripa reflex negativa geotaxis (kallas vertikal skärmtest i Fox batteri) och fyra lem greppstyrka (modifierad från Fox och Wahlsten skärm klättring tester). Här är förflyttningar, front-lem styrka, och bakdelen styrka även testat att skilja reflexiv motorik mellan bluff och CP mus valpar. För att eliminera förbättringar på testning på grund av lärande, har tester begränsade till maximalt 3 studier där anges. Alla andra tester hade bara ett försök per djur.

  1. Förflyttningar (Figur 1) (anpassad från en råtta protokoll 13):
    OBS: Genomsökning är ett beteende som utvecklats tidigt i musen pup mellan PND 0-5, vid vilken punkt möss börjar att övergå till promenader, från 5 - 10 dagar gamla 14. På PND 8 tar förflyttningar prov fördelen med denna övergångs tidsförloppet. Förflyttningar kan dock görs hela livstid en mus och kan bestämmas i alla åldrar.Eftersom det inte finns någon risk för att lära, kan förflyttningar provningen upprepas så många gånger som behövs genom loppet av experimentet.
    1. Placera möss i en klar inhägnad där möss syns från toppen samt i sidan. Använd varsam stimulans genom att trycka på valpen svans att motivera valpen att gå.
    2. Betyg förflyttningar under 3 min med hjälp av följande skala: 0 = ingen rörelse, 1 = genomsökning med asymmetrisk lem rörelse, 2 = långsam krypande men symmetrisk lem rörelse, och 3 = snabbt krypa / gå.
      OBS: Här är symmetrisk lem rörelse som beskrivs där baktassar möter frontpaws under varje steg och varje steg smidigt övergångar till nästa steg. En mus som visar asymmetrisk lem rörelse har oregelbunden tass placering och övergångar från ett steg till nästa är ojämna.

Figur 1
Figur 1. Övergången frånKrypa till Walking kan urskiljas genom att observera baktassen, samt huvud och svans. (A) Under krypa, hela ryggen tassen, från tårna till hälen, vidrör marken när ambulerande, som betecknas med (*). En vuxen gångmönster ses när endast tårna och främre delen av baktassen vidrör marken (hälen höjs, deonoted av [**]). (B) Huvudet och svansen på en krypande mus är låg på marken. Huvudet börjar stiga under övergången från krypa till promenader. Övergången är klar när både huvud och svans är förhöjda och endast den främre delen av baktassen vidrör marken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Bakbenet fotvinkeln (Figur 2)
    OBS: Det finns en uppenbar utvecklings förändring i bakbenet hållning som den mouse mognar från att genomsöka till promenader, där bakbenen är placerade under kroppen när man går och vinkeln mellan bakbenen är mindre än den vinkel sett i genomsökning. Även om bakdelen fotvinkeln förändras över tiden, kan musen valpar i samma ålder med olika skador eller sjukdomar jämföras. I likhet med förflyttningar prov (3,1), det finns ingen potential för lärande. Således kan bakdelen fotvinkeln testet upprepas så många gånger som behövs genom loppet av experimentet.
    1. Antingen i en tydlig öppet fält låda eller ett avgränsat område, montera en videokamera från under eller över, respektive, för att spela in valpen när den rör sig runt fältet. Använd varsam stimulans genom att trycka på valpen svans att motivera valpen att gå. Rekord för två minuter.
    2. Med användning av de videoinspelningar, mäta fotvinkeln av valparna genom att dra en linje från slutet av hälen / shin till spetsen på den längsta (mitten) tå. Bara ta mätningen när valpen utför en fullständig stegi en rak linje och båda fötterna är platt på marken. Ta inte mätningar när valpen är stillastående eller när valpen vänder.
    3. Mät tre till fem uppsättningar av mul vinklar och beräkna den genomsnittliga vinkel för varje testad valp.

figur 2
Figur 2. bakdelen fotvinkeln kan användas för att bestämma gångrubbningar. Fotvinkeln kan mätas genom att dra en linje från mitten av hälen i mitten (längsta) siffra. Skadade djur har en större fotvinkeln jämfört med normal (se Representativa resultat, fotvinkeln). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Yta Uppriktningsprov (Figur 3):
    OBS! Rätande reflex är motorn möjligheten för en mus valp att kunna vända på sina fötter från ryggläge. Medelåldern för den rätande reflex att visas i gnagare är PND 5 med ett intervall från PND 1 -. 10 15 Eftersom detta test är en reflex, finns det ingen inlärnings komponent och det kan upprepas hela försöksperioden.
    1. Placera valpar på ryggen på en bomullslakan eller bänk pad och håll på plats i 5 sekunder.
    2. Släpp valparna och registrera den tid det tar för pup att återgå till framstupa läge, såväl som riktningen av upprätningsreflex (vänster eller höger). Totalt en min ges för varje försök, om det behövs.
    3. Upprepa för totalt tre försök.

Figur 3
Figur 3. Surface Uppriktningsprov. Detta test kräver bålkontroll och kan testa postural obalans. Humana CP patienter kan ha underskott i sin kärna.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Negativ geotaxis (Figur 4)
    OBS: Den genomsnittliga åldern för negativ geotaxis reflex att visas i gnagare är PND 7 med ett intervall från PND 3-15 15 negativa geotaxis testet bedömer motorik hos unga möss.. Möss placerade nedåt en sluttning och på grund av vestibulära ledtrådar av gravitation, valpar vända sig mot uppför sluttningen. Svaret på stimuli, eller taxibilar, är en medfödd beteende.
    1. Placera valpen med huvudet pekar nedåt på en 45 o lutning och håll den i 5 sekunder.
    2. Släpp valp och registrera tid och riktning valpen vänder sig mot uppåt. Total testtid är 2 min.
    3. Upprepa för totalt tre försök. Möss som faller ner lutning eller misslyckas med att vända kan vara antingen återtestas, elimineras, eller med tanke på noll poäng.
      OBS: Detta beslut är left till examinator, som ibland valpar kommer att rulla nedför lutning på grund av trötthet snarare än svaghet. När beslut fattas om hur man ska göra mål valpar som faller ner lutning, bör det noteras i de metoder och bör vara konsekvent genom testning av alla ämnen.

figur 4
Figur 4. Negativ geotaxis. Motor och vestibulära ingång krävs för musen för att erkänna dess orientering på en sluttning och vända. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Front lem Suspension (Figur 5) 16; anpassad från 17 18:
    OBS: Front lem fjädring testar forelimb styrka valpar, inklusive arm och tass styrka. Thans test rekommenderas inte för valpar yngre än PND 10 15. Valparna får gripa en tråd tvärs över en stabil objekt och hänga på tråden med båda framtassarna. Testningen området är över en vadderad släppzon. Testet kan upptäcka höger / vänster styrkeskillnader. Lärande och avsaknad av negativ förstärkning kan leda till ökad icke-deltagande. Möss faller omedelbart när den släpps eller underlåtenhet att förstå när de placeras på tråden indikerar icke-deltagande.
    1. Håll valparna stadigt i kroppen och göra det möjligt för dem att förstå tråden med båda framtassarna.
    2. Släpp valp. Med hjälp av en timer eller stoppur, registrera den totala tiden för att falla, liksom tass svaghet.
      OBS: Paw svaghet bestäms om en valp gående ligger från viran med en tass före den andra i stället för att släppa från viran med båda tassarna på samma gång.
    3. Upprepa testet för totalt tre gånger.


Figur 5. Front Limb Suspension. Denna suspension provet medför spänningar i frambenen tills muskeltrötthet. Med denna metod, utgångs styrka i frambenen är etablerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Bakbens Suspension (figur 6):
    OBS: Denna suspension test bestämmer bakdelen styrka. Det är ett test som utformats speciellt för nyfödda och användes ursprungligen på djur mellan PND 2-12 19,20, men kan anpassas för möss upp till PND 14. Detta test kan upptäcka höger / vänster bakben styrkeskillnader samt neuromuskulär funktion. En standard 50 ml konisk används, vadderad med laboratorie våtservetter. I likhet med den främre extremiteten suspensionsprov, kan detta test läras, särskilt syndce det inte finns någon negativ konsekvens av fallande. Således ökade icke-deltagande som ses av möss som faller så snart som släpps eller underlåtenhet att stanna när de placeras på kanten av röret, kan noteras.
    1. Med hjälp av en 50 ml konisk, plats valp försiktigt nedåt i röret med bakbenen hängde över kanten.
    2. Släpp valp. Observera bakdelen hållning.
    3. Betyg hållning i enlighet med följande kriterier.
      OBS: Betyg 4 indikerar normal bakdelen separation med svansen höjas; poäng 3 betyder svaghet är uppenbar och bakben är närmare varandra, men de sällan kontakt med varandra; poäng av 2 indikerar bakben är nära varandra och ofta gripande; poäng 1 visar en svaghet är uppenbar och bakbenen är nästan alltid i en knäppta läge med svansen höjas; 0 poäng indikerar konstant spännan av bakbenen med svansen sänks eller underlåtenhet att hålla fast röret i någon tid.
    4. Count drar om nödvändigt. En drag är qualified när valpen försöker lyfta sin kropp med hjälp av sina bakben medan upphängd på den sida av det koniska röret.
    5. Med hjälp av en timer eller stoppur, spela latensen att falla.
    6. Upprepa hela testet i triplikat.

figur 6
Figur 6. bakdelen Suspension. (A). Denna suspensionsprov orsakar spänningar i bakbenen tills muskeltrötthet. Baslinje styrka och hållning i bakbenen är etablerade. (B). Scoring. Observera Siffrorna ovanför representativa möss visar den möjliga hållning poäng. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Greppstyrka (Figur 7):
    OBS: Detta test kommer att undersöka tassen strength av alla fyra tassar på samma gång. En 16 x 18 glasfiber skärm tråd används. Medelåldern för en gnagare att kunna greppa en horisontell skärm är PND 8 med ett intervall från PND 5-15 15 Fox använde fyra lem horisontella skärmtest från PND 2 -.. 21 10 Detta test är modifierad från det vågräta standard skärm test; här skärmen roteras långsamt från ett horisontellt till vertikalt läge, för att utmana gripa alla fyra benen 21; anpassad från Corti S 16. Om musen håller på att maskskärmen när inverterad till 180 °, registrera latens att falla. Observera också kroppsvikten. En hängande impuls kan beräknas som [vikt (g) x latens att falla (sek)] vilket återspeglar den kraft som behövs för att motstå gravitationen.
    1. Med hjälp av en bit av ståltrådsnät, placera valp på skärmen. Låt valpen att anpassa sig till denna miljö under ca 5 sekunder.
    2. Invertera skärmen långsamt till 180 grader. Anteckna ungefärlig ANGLe på skärmen när valpen faller.
    3. Upprepa för totalt tre försök och genomsnitt försöken.

figur 7
Figur 7. greppstyrka. Möss krävs för att upprätthålla muskelspänningar i alla fyra benen som gravitationskraften ökar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Grasping Reflex (Figur 8)
    OBS! Greppa reflex uppträder vanligen hos gnagare vid PND 7 med ett intervall från PND 3-15 15 Varje tass prövas individuellt, alltså testet kan avslöja front- eller bakdelen frågor, liksom ensidighet frågor.. Eftersom det är en reflex, kan detta test upprepas tills reflexen visas. Det är inte benägna att lära. Som ett viktigt förbehåll, detta test skiljer inte gripstyrka, endast förmåga och måste testas före 15 dagars ålder när unga möss börjar förstå på grund av rädsla svar.
    1. Håll musen i nackskinnet av dess hals, på samma sätt som en mus pup bärs av dammen. Detta grepp gör att valpen att bli instinktivt orörlig och avslappnad, vilket möjliggör enkel testning.
    2. Stroke varje tass av pup med den trubbiga, rundade sidan av ett rakblad.
    3. Testa varje tass individuellt och registrera närvaron eller frånvaron av greppa och poäng 1 poäng per tass med vilken mus griper.
      OBS: scoring för höger tass preferens är 100% för höger tass preferens, - - -100% för vänster tass preferens, 50% för båda tassar gripa, och 0% för inga tassar greppa. Ekvationen för att bestämma dessa siffror är [(höger tass - vänster tass) / (höger tass + vänster tass + båda tassar)] x 100%.

/53569/53569fig8.jpg "/>
Figur 8. Grasping Reflex. Eftersom neonatala möss inte har en stark rädsla svar, detta test bestämmer strikt plantar / palmar reflex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Cliff aversion (figur 9):
    OBS: Cliff motvilja test labyrint reflexer, samt styrka och koordination och kan användas för att testa valpar från PND 1-14 22. En pre-doftande box (en ruta där minst 5 möss har fått fritt ströva) med en platt förhöjd avsats används och valpen placeras med siffrorna endast deras framtassarna och deras nos placerad över kanten. Scoring utförs genom att räkna den totala tiden det tar valpen att vända sig bort från klippan och flytta sina tassar och nos bort från kanten. Om inget svar ses efter 30 sekunder, är testet avslutas.Om valpen faller utanför kanten, kan utföras en enda ytterligare prövning.
    1. Med hjälp av en vy från sidan, placera valp på kanten av pre-doftande rutan och se till att framtassarna, siffror och nos är de enda delar över kanten.
    2. Släpp valp och starta timern.
    3. När både nos och tassar har tagits bort från kanten, stoppa timern och rekordtid.
    4. Upprepa testet för sammanlagt 3 försök. Om valpen inte rör sig bort från klippa inom 30 sekunder, ingen poäng ges.
      OBS: Bestämningen om valpen är en icke-Deltagare kontra nedsatt lämnas upp till bedömning av examinator. Höjden på klippan kan justeras för ålder valp att säkerställa valpen säkerhet. En lägre höjd kan användas med en svart "golv" för att efterlikna en större höjd.

figur 9
Figure 9. Cliff Aversionen. Vestibulära obalanser mäts med klippan motvilja testet. Här är valpens ögon fortfarande stängd så rädsla är inte den drivande faktorn att vända sig bort från klippkanten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Statistisk signifikans

  1. Med hjälp av en statistisk programvara analysera resultaten. Uttrycka data som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). Tester är parametrisk och därmed undersöka data med hjälp av t-test analyser.
    OBS: Försök inte utformade för att testa för könsskillnader. Skillnader anses vara statistiskt signifikant när p <0,05.

Representative Results

Möss testades från P7 (24 h efter kirurgi) till P13 (1 vecka efter operation), med användning av olika möss för varje tidpunkt, så att lära sig ett testning paradigm var inte en confounding variabel. P8 valdes som representativa resultat, som möss visade de största underskotten vid denna tidpunkt.

Övergång från Crawling till Walking fördröjs i CP neonatala möss

Humana patienter i kronisk fas har gångrubbningar, som sträcker sig från tå-gångavstånd till en scissored gång. Eftersom denna CP modell visar gångstil underskott som liknar människor, var förflyttningar bedömas. Möss bedömdes på gångsymmetrin och lem-tass rörelse under en rak promenad. Vid 48 timmar efter kirurgi (PND 8), CP möss hade mindre symmetrisk lem rörelse och en "krypande" gång jämfört med deras sken motsvarigheter (genomsnittlig förflyttningar poäng: CP 1,083 ±0,6337, n = 12 vs sham 1,639 ± 0,4859, n = 9; p <0,05, figur 10). Med en vecka, har både CP och bluff möss över till promenader (data visas ej).

Figur 10
Figur 10. CP Mus Pups inte ambulate samt Shams. Sham möss (svart fält) har en medelpoäng av 1,639 ± 0,4859 (n = 9), vilket innebär att deras ambulatorisk utveckling faller mellan asymmetrisk lemmen rörlighet och långsam genomsökning. CP möss (grå stapel) får ett genomsnitt på 1,083 ± 0,6337 (n = 12), vilket innebär att deras förflyttningar är mindre utvecklad och tenderar att ha asymmetrisk lem rörelse. Data uttrycks som medelvärde ± SEM; * Är p <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Hej ndlimb fotvinkeln ökas i CP

Förutom förflyttningar, var bakdelen fot vinkel bedömas. Åtta dagar gamla bluff mus valpar promenad med sina baktassar framåt, jämfört med HIL möss, som har utspärrade baktassar när man går i en rak linje (figur 2, genomsnittlig vinkel: CP 77,48 ± 9,848, n = 9, vs bluff 54,54 ± 8,043, n = 11; p <0,0001, figur 11). Denna ökade vinkel korrelerar med gång instabilitet i att valparna behöver öka vinkeln på sina baktassarna för att stabilisera sin gång och hjälpa till med balans och koordination.

Figur 11
Figur 11. CP Mouse Pups splay deras baktassar när man går. CP möss (svarta staplar) har en genomsnittlig vinkel mellan deras bakben av 77,48 ± 8,043 (n = 11), medan sken möss (grå b ars) har en genomsnittlig vinkel av 54,54 ± 9,848 (n = 9). Data uttrycks som medelvärde ± SEM; **** Är p <0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

CP Möss inte uppvisa underskott när Surface Uppriktningsprov

Ytan rätande testet ingick som en del CP patienter har nedsatt bålkontroll (Heyrman et al., 2013). Dessutom är det vestibulära systemet som krävs för att identifiera behovet rätande och det finns vestibulära underskott i vissa patienter i kronisk fas 23. CP-möss visar inte betydande underskott när rätande jämfört med skenkontroller (data ej visade).

CP Möss utföra samma som Sham negativa geotaxis Testing

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Negativa geotaxis används för att testa motorik hos unga valpar Möss utmanas genom att vara plats i nedförsbacke på en sluttande yta Delay eller underlåtenhet att orientera uppför skulle kunna tyda underskott.. i koordination, balans, eller vestibulära ingång. CP möss visar inga underskott när de utsattes för negativa geotaxis jämfört med sken möss (data visas ej). Dessutom, CP möss visade inte en preferens för att vända mot en sida mot en annan när omorientera .

Front-Limb Suspension Test är lämplig för möss äldre än 10 dagar

CP patienter har minskat muskeltonus och underskott i finmotorik, såsom greppa. För att testa svaghet i denna musmodell, använde vi en front-lem suspensionsprov. Dessutom använder denna modell ensidig ischemisk skada och dubbelsidig-ness kan bestämmas med hjälp av denna suspensionsprov. detta testär bättre för möss äldre än 10 dagar 15. Vid 8 dagar gamla, två dagar efter skada, fanns det inga signifikanta skillnader mellan CP och sham-möss (data ej visade).

Bakdelen styrka minskar i CP Möss

Humana patienter i kronisk fas ofta behöver hängslen eller hjälpmedel walking enheter på grund av brist av motorstyrning och styrka. För att kunna jämföra gnagare CP modell för människor, var bakdelen styrka bedömas med hjälp av bakbenen suspensionsprov. När upphängd från sidan av ett koniskt rör, CP möss visade svaghet i bakbenen, vilket framgår av en minskning i hängande score (bakben hängande poäng: CP 3,468 ± 0,5561, n = 13, vs sham 3,891 ± 0,1329, n = 13; p < 0,05, Figur 12). Ingen skillnad observerades i bakdelen fjädring tid (data ej visade). Således liknar CP patienter mänskliga, CP möss visar hindlIMB (ben) svaghet.

Figur 12
Figur 12. Sham möss är något, men betydligt starkare i sina bakben än CP möss. Vid en genomsnittlig hängande poäng 3,891 ± 0,1329 (n = 13), bluff möss (svart fält) visar mer bakdelen separation, och därmed en starkare bakbenen hållning, när hängande på kanten av ett rör än CP möss (grå bar) med en genomsnittlig hängande poäng 3,468 ± 0,5561 (n = 13). Data uttrycks som medelvärde ± SEM; * Är p <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Greppstyrka är minskat till följd av CP skada

Gripa med alla fyra tassar är viktigt för en gnagare igäller klättring och kör över ojämna ytor. Grip kräver betydande ihållande styrka, snarare än skicklighet eller linjär kraft, framför allt i de siffror och tassar 24. Möss som krävs för att hålla sin kroppsvikt på ett inverterat trådnät. CP möss kunde inte behålla sitt grepp och dessa möss föll betydligt lägre vinklar (fyra lem genomsnittliga vinkel: CP 75,627 ± 24,48, n = 11, vs bluff 96,57 ± 10.836, n = 9; p <0,05, figur 13). Dessa data visar att det finns ett betydande underskott i greppstyrka i CP möss.

Figur 13
Figur 13. CP Möss har Svagare Grip än Shams. Sham möss (svart fält) kan greppa en genomsnittlig inverterad vinkel av 96,57 ± 10,836 (n = 9). CP möss (grå stapel) kan bara nå en inverterad vinkel av 75,627 ± 24,48 (n = 11). Data uttrycks som medelvärde ± SEM; * Är p0; 0.05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Grasping Reflex Underskotten är tydligt i CP Möss

Tillsammans med grovmotoriska värden, finmotorik rörelser också nedsatt hos patienter i kronisk fas 25,26. Grip reflex hos människa är närvarande vid födseln och försvinner cirka 5-6 månader. Förändringar i gripreflexen, såsom överdriven hastighet eller styrka grip, underlåtenhet att förstå, eller återfödelse av gripreflexen efter 6 månaders ålder, alla indikera skador på nervsystemet. Att jämföra greppa i CP-modellen, var reflexiva grip underskott bestäms.

Vid 48 timmar efter skada, CP möss visar en minskning av gripreflexen (genomsnittliga tassar gripasvid 48 h: CP 2,429 ± 0,9376, n = 14, vs sham 3,214 ± 0,8018, n = 14; p <0,05, Figur 14A). Det fanns en liten, men inte signifikant ökning av höger tass preferens i framtassarna (data ej visade). Det fanns en signifikant höger tass preferens i de baktassar (CP 75,0 ± 42,74, n = 14, vs sham 17,86 ± 54,09, n = 14; p <0,005, Figur 14B). En vecka efter skada, CP möss visar grip underskott (genomsnittliga tassar greppas vid en vecka: CP 2,75 ± 1,035, n = 8, vs sham 3,80 ± 0,6325, n = 10; p <0,05, figur 14C), utan någon noterbar tass preferens .

Figur 14
Figur 14. CP Möss har greppa underskott i baktassar, kontra till skadade hjärnan regionen. (A) 48 h efter skada (PND 8), CP-möss (grå stapel) greppa en pinne med, i genomsnitt, färre tassar än sham animals (svart fält). (B) CP möss (grå stapel) visar en preferens för att gripa med rätt baktassen (kontralateralt till skada) i motsats till att använda den vänstra baktassen (ipsilateralt skada). Sham möss (svart fält) visar inte denna rätt tass önskemål. Höger tass preferens beräknas som ([höger tass - vänster tass] / [höger tass + vänster tass + båda tassarna] * 100) (C) En vecka efter skada, CP möss (grå stapel) visar fortfarande gripa underskott jämfört med. Shams (svart stapel). Data uttrycks som medelvärde ± SEM; * Är p <0,05, ** p <0,005. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

CP Möss vända sig bort från kanten Under Cliff Motvilja

Klippan motvilja Testet bygger på den inneboende rädsla för mössen att vända AWAy från en brant klippa och huvudet mot säkerhet. Även om vissa patienter i kronisk fas har vestibulära svårigheter, samt nedsatt motorstyrning, gjorde CP mössen inte visar några brister på detta test.

Discussion

Använda djurmodeller för att studera mänskliga sjukdomar är endast relevant om det finns en överlappning mellan den cellulära och molekylära svaret mellan människa och gnagare och att de beteendetester utförda har direkt relevans för mänskliga symptom. En av de stora frågorna med studier pediatrisk sjukdom är att många forskare använder vuxna gnagare för att skapa modellen, liksom vuxna gnagare beteende utvärdering, utan att beakta de utvecklings skillnader som kan vara viktiga för sjukdomsförloppet. På grund av dessa frågor, är det viktigt att forskning om pediatrisk användning sjukdomen inte bara rätt justerade utvecklings tidpunkter (t.ex. human CNS utveckling på 28 - 32 veckor motsvarar en postnatal dag 2-7 dag gnagare) 7, men också beteendetester som kommer att undersöka lämpliga motor, sensorisk eller reflexiva utvecklings beteenden. Således, eftersom varje ny neonatal sjukdomsmodell utvecklas, måste den noggrant testade för att säkerställa att den celluläraoch beteendemässiga reaktioner kommer att ge de mest lämpliga översättnings data mellan gnagare och människa.

Cerebral pares är en motorisk störning, som kvarstår i vuxen ålder. Ett problem med många av de cerebral pares modeller finns idag är bristen på repeterbara, standardiserade motortester som kan korrelera med underskott ses hos barn. I denna nya modell, som kombinerar hypoxi, ischemi och inflammation i en neonatal mus, var motoriskt beteende utvärderades med användning av ett batteri av tester som är specifika för neonatala möss. För att minska subjektivitet och öka den kvantitativa rapporteringen, har flera tester har modifierats för att inkludera mycket specifik, men lätt att utvärdera åtgärder som kan standardiseras. Dessutom kan fram- och bakbenen utvärderingar utföras separat, och vänster / höger skillnader kan bestämmas. Detta batteri av tester är specifik för neonatala möss upp till två veckors ålder.

Denna CP modell demonstrerargångsvårigheter (förflyttningar, bakdelen fotvinkeln), samt lem specifika svaghet (fyra lem fjädring, bakdelen fjädring), och brister i utvecklings reflexer (greppa reflex). Även i denna studie endast en tidpunkt undersöktes, kan dessa underskott spåras över tid.

Det finns andra batterier av tester som kan användas på nyfödda, såsom Fox batteri av tester eller Heyser bedömning av utvecklingsmässiga milstolpar 15. Men dessa tester jämför det nyfödda barnet till den vuxna, vars svar kan inte vara samma eftersom det nyfödda barnet utvecklas fortfarande. Fox batteri och Heyser s Assement tester förlitar sig på observations subjektivt information med dikotoma (ja eller nej) bedömning snarare än objektiva fakta (vinkel, hållning bygger på styrka, etc). På grund av den subjectiveness av dessa tester, har många forskare anpassat, lagts till eller avlägsnats kriterier, vilket gör deras resultat inte kan jämföras med andra och gränsening nyttan av data i form av upprättande av en baslinje underskott för en viss sjukdom eller störning. Genom att etablera en uppsättning standardiserade motortester som är kvalitativ och särskilt utformade för att testa nyfödda, kan resultaten från enskilda forskargrupper exakt och tillförlitligt redovisas och jämföras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Charles River Laboratories STRAIN CODE: 027  C57BL/6NCrl is the exact strain we use
Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish Corning Life Sciences Glass  3140125 Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399).
Covered lead ring Fisher Scientific S90139C Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish.
Scalpel Blade #11 World Precision Instrucments, Inc. 500240
Small Vessel Cauterizer Fine Science Tools 18000-00
Micro Hook Fine Science Tools 10064-14
Vetbond Suture Glue 3M 1469SB n-butyl cyanoacrylate adhesive
Lipopolysaccharide Sigma Life Science L4391 Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated
12 x 12 inch opaque box Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics C4022 Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H;  http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html
Camera/camcorder JVC GC-PX100BUS Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder.
Covidien Tendersorb™ Underpads Kendall Healthcare Products Co 7174
WypAll L40 Kimberly-Clark Professional 5600 Any surface with moderate grip will do
Surface at 45 degree incline We use a cardboard box.
Thin wire from a pipe cleaner Creatology M10314420 Any pipe cleaner from any craft store will work.
50mL conical tube Falcon 352070
Fiberglass Screen Wire New York Wire  www.lowes.com 14436 Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16
Razor blade Fisherbrand 12-640 A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work.
OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway PLASKOLITE INC 1AG2196A Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning.
Protractor Westscott ACM14371

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
  2. Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
  3. Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
  4. Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
  5. Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
  6. Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
  7. Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
  8. Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
  9. Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
  10. Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
  11. Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
  12. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
  13. Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
  14. Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
  15. Heyser, C. J. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. Q., et al. Chapter 8, (2004).
  16. Corti, S. Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ (2014).
  17. Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
  18. Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
  19. El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
  20. El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ 29-43 (2008).
  21. Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
  22. Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , Humana Press. New Jersey. (2008).
  23. Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Combined Sections Meeting of American Physical Therapy Association, Anaheim, CA, USA, , (2016).
  24. Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf (2011).
  25. Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
  26. Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).

Tags

Medicin Beteende neonatal mus motoriken cerebral pares hypoxi ischemi inflammation neonatala motoriska test
Ett batteri av motoriska test i en neonatal musmodell av cerebral pares
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feather-Schussler, D. N., Ferguson,More

Feather-Schussler, D. N., Ferguson, T. S. A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy. J. Vis. Exp. (117), e53569, doi:10.3791/53569 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter