Introduction
Pediatrik yaralanma veya kemirgenler kullanarak hastalığın yeni modeller geliştirmek nedeniyle hızla nörolojik yaralanma kurtarmak için her iki sıçan ve farelerin şaşırtıcı yeteneği genellikle zordur. Bu nedenle, herhangi bir yeni pediatrik bir hastalık modeli, iyice davranışsal sonuçlar ile el-ele gitmek gerekir hücresel ve moleküler değişiklikleri inceleyen doğrulamak için. Birçok yönden, fonksiyonel davranış kurtarma terapötik ya da öteleme alaka açısından altta yatan hücresel değişiklikler daha önemli olabilir. Araştırmacılar yetişkin ve yenidoğan yaralanma hakkında daha fazla bilgi olarak, verdikleri yanıtlara çok farklı ve bu ikisi arasındaki çıkarım olamaz açıktır. Örneğin, yeni doğan farelerin, sinir büyüme faktörü, beyin türevli nörotrofik faktör, nörotrofin-3 ve spinal kord yaralanması 1,2 aşağıdaki glial hücre çizgisi türevli nörotrofik faktör, farklı düzeylerde gösterir. Ayrıca, yenidoğanlar inme 3, d sonra önemli kan-beyin bariyeri sızıntısıperiferik sinir yaralanması 4 sonrası kortikal nöron yeniden düzenlenmesini göstermenin ve spinal kord yaralanması ve hipoksi-iskemi 5,6 takiben geciktirilebilir veya yavaşlatılabilir astrogliasis var. Nedenle, öteleme pediatrik araştırma gelişimsel eşdeğer modelleri kullanmak olduğunu ve bu modellerin her ikisi de hücresel / moleküler değişiklikler ve yaşa uygun davranış testleri için değerlendirilir önemlidir.
1000 canlı doğumda yıllık (NIH): Serebral Palsi (SP) 3 etkileyen bir motor hastalığıdır. CP çocuklar hastalığın şiddetine bağlı olarak, semptomları ve ko-morbid koşullar aralığı sergiler. hareket ve koordinasyon güçlüğü ve motor gelişimi ulaşmada gecikmeler ile birlikte en sık görülen belirtileridir. Diğer belirtiler, anormal kas tonusu (artmış veya azalmış ya), ince motor becerileri, yürüme güçlüğü, aşırı drooling ve yutma ve konuşma gecikmeleri (NIH) azaltılmış bulunmaktadır. CP altında yatan neden olduğuna inanılmaktadırYa da bir yıllık doğum sonrası kadar öncesi ya da peripartum döneminde oksijen ve / veya beyne kan akışının olmaması. Buna ek olarak, iltihap artık SP gelişmesinde önemli bir bileşen olduğu düşünülmektedir.
CP vakaların çoğunluğu periventriküler lökomalaziyle (PVL) olarak bilinen ventriküllerin etrafında beyaz madde hasarı ile ilişkilidir. Bu nörolojik damgasını CP yol açan ilk hakaret oligodendrocytes hakaret en savunmasız beyin gelişimi süresince meydana geldiğini göstermektedir. 32 haftalık gebelik - oligodendrocytes yaralanmaya en yatkın olan bir insanda hızlı oligodendrosit büyüme dönemi, aynı zamanda dönem, 24 arasındadır. Kemirgen olarak eşdeğer süresi, doğum sonrası gün 2 - 7 7 ve CP bu modelde indüklenir zamandır.
Burada özetlenen testleri yapmak için kullanılan CP yenidoğan fare modeli Enj oluşturmak için inflamasyon ile hipoksi ve iskemi birleştirirDaha iyi taklit nörodejenerasyon insan CP görülen Ury. Bu model insan CP hastaları benzeyen farklı motor defisit yanı sıra farklı beyaz cevher hasarı eksikliği SP'nin diğer hayvan modellerinde gözlenen önemli eksiklikler, bazı giderir. Aynı modeli kullanarak bir ortak çalışan tarafından yapılan önceki çalışmalar inflamasyon eklenmesi böylece daha iyi CP 8 çocuklarda görülen PVL taklit, beyaz cevher hasarı arttırdığını göstermiştir. önceki verilere dayanarak, bu kağıt hayvan yaşlandıkça, motor davranış değişiklikleri değerlendirmek amacıyla yenidoğan motor testleri kapsamlı bir bataryayı sunuyor.
Protocol
NOT: Tüm hayvan ameliyatları Temple Üniversitesi ÜZER departmanı ve IACUC politikaları ve prosedürlerine uygun olarak yapıldı. C57BL / 6 baraj ve sires Charles River Laboratuvarları satın alındı ve (7:00 ışık - 19:00), 12 saat ışık / karanlık döngüsü ile üreme kafeslerde edildi yiyecek ve su ücretsiz erişim ile. 10 yavruların - Damızlık çiftleri 5 ila çöp boyutları üretti.
1. Serebral Palsi İndüksiyon Cerrahisi
- NOT: Daha önce 8,9 açıklandığı gibi Serebral palsi, doğum sonrası gün (PND) 6 fare yavrular kullanılarak oluşturuldu (http://www.jove.com/video/1951/mouse-models-of-periventricular-leukomalacia).
- Bir laboratuvar yavrunun cildi korumak için silme ile buz üzerinde bir cam kapta yavru yerleştirin. ayak tutam ve fiziksel hareket azlığı uygun anestezik düzlemde olup olmadığını kontrol edin. Ameliyat için yastıklı buz paketi yavru taşıyın.
- % 70 etanol kullanılarak yavru cilt sterilize edin. Ne zaman kuru, bir 11. steril cerrahi bla kullanınde ve boyun 1 cm kesi yapmak.
- stereoskopik bir operasyon mikroskobunun kullanılması sureti küçük kancalı Sağ ortak karotid arteri izole etmek ve taşınabilir el cauterizer kullanılarak dağlamak. Görme arter tıkalı olduğunu teyit etmektedir. Sham cerrahi koterizasyon olmadan görselleştirme ve karotis arter izolasyonunu içerir.
- cilt ve yakın kullanarak dikiş tutkal (n-butil siyanoakrilat) hizalayın.
- Spontan solunum ve normal hareket izlemek için 30 dakika süreyle 34 o C ısıtma yastığı yavru yerleştirin.
- 30 dakika boyunca baraj yavruyu (ler) döndürür.
- Bir ısıtma yastığı veya 35 dakika boyunca% 6 oksijen ayarlanmış bir hipoksi odasının içinde 34 o C'de belirlenen diğer ısınma cihazda yavrular yerleştirin. Oksijen, nitrojen ile değiştirilir. Yakından tutarlı yaralanma sonuçları için bölmesi oksijen seviyesini ve sıcaklığını izlemek.
- hipoksi odasından yavrular çıkarın ve ısıtma yastığı onları geri.
- Intraperitoneal lipopoly enjektesakarit 1 ug / kg steril serum fizyolojik içinde sulandırılmış ve baraj yavru dönün. Sham enjeksiyonlar sadece serum fizyolojik enjeksiyonları vardır.
2. Yenidoğan Motorlu Testleri
Not: PND 8 üzerinde, 48 saat CP indüksiyondan sonra, fare yavrular nörodavranışsal gelişimi için test edilmiştir. Yavrular davranış gün farklılıkları süresini ortadan kaldırmak için, öğleden önce 4 saat bloğu içinde test edilmiştir. Yavrular vücut ısısı ve açlık / ayırma konularında hızlı kaybını önlemek için bir defada en fazla 15 dakika süreyle baraj kaldırılır. Buna ek olarak, yavruların maksimal çabalar her testte ortaya çıkacaktır ki testler arasındaki dinlenme izin verilir. (Her test için metinde belirtildiği gibi) yenidoğan motor testleri temeli testlerinin 10,11 Fox'un pil ve Fox'un testlerinin 12 Wahlsten en adaptasyon yanı sıra tedavi-NMD ve diğer davranış yayınları kullanılarak adapte edilir. Fox'un testten 21. meyilli - testlerin Fox'un pil PND 2 için uyguny mevcut burada içerir: refleksini açgözlü, refleksi ve dört ekstremite kavrama kuvveti (dikey Fox pil ekran testi denir) negatif geotaxis (Fox ve Wahlsten ekran tırmanma testlerinden değiştirilmiş). Burada, ambulasyon, ön bacak gücü ve hindlimb gücü de sahte ve CP fare yavrular arasındaki refleksif motor davranışları ayırt etmek test edilir. nedeniyle öğrenme testi iyileştirmeler ortadan kaldırmak için, testler kaydetti 3 deneme ile sınırlıdır bulundu. Diğer tüm testler hayvan başına yalnızca bir deneme vardı.
- (Sıçan protokolü 13 uyarlanmıştır) ambulasyon (Şekil 1):
NOT: 14 yaşında 10 gün - - nokta fareler 5'ten, yürüyüş geçiş başlar hangi 5, Emekleme PND 0 ile fare yavru erken geliştirilmiş bir davranıştır. PND 8 at, ambulasyon testi bu geçiş zamanla yararlanır. Ambulasyon, ancak, bir fare ömrü boyunca atılır ve her yaşta belirlenebilir.öğrenme için bir potansiyel bulunmaktadır zamanda deney süresince gerektiği gibi, ambulasyon testi birçok kez tekrarlanabilir.- Fareler üst hem de yan görebilir açık bir muhafaza içinde yer fareler. yürümeye yavruyu motive etmek yavrunun kuyruğu dokunarak nazik prodding kullanın.
- 0 = hiçbir hareketin, asimetrik ekstremite hareketi ile tarama 1 = 2 = yavaş tarama ama simetrik ekstremite hareketi ve 3 = hızlı tarama / yürüyüş: Aşağıdaki ölçeği kullanarak 3 dakika yürümeyi puan.
NOT: pençelerin her adımda sırasında frontpaws buluştuğu Burada, simetrik ekstremite hareketi tarif edilir ve bir sonraki adıma sorunsuz her adımı geçişler. asimetrik ekstremite hareketini gösteren bir fare düzgün değil bir adım diğerine düzensiz pençe yerleştirme ve geçişler bulunmaktadır.
Gönderen Geçiş 1. ŞekilYürüyebilen zaman ile gösterilen şekilde Walking sürünerek arka pençe yanı sıra baş ve kuyruk gözlem ile ayırt edilebilir. (A) emekleme sırasında, tüm arka pençe, topuk ayak parmakları arasından, yere temas (*). Sadece ayak ve ön kısmı yere temas arka pençe zaman bir yetişkin yürüme paterni. (B) baş ve bir tarama fare kuyruğu (topuk [**] tarafından deonoted, yükselir) yere düşük olduğu görülmektedir. Baş yürüyüş sürünerek geçişi sırasında yükselmeye başlar. Baş ve kuyruk hem yükseltilir ve pençelerinin sadece ön yere dokunduğunda geçiş tamamlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Arka bacak Ayak Açısı (Şekil 2)
NOT: mous olarak hindlimb duruş belirgin bir gelişimsel bir değişiklik bulunmamaktadıre yürüme ve arka ayaklarında arasındaki açı emekleme görülen açıdan daha az olduğunda arka ayaklarında bünyesinde konumlandırılmış yürüyüş, sürünerek gelen olgunlaşır. arka bacak ayak açısı zamanla değişen olsa da, farklı bir yaralanma ya da hastalık ile aynı yaş Yavru fare karşılaştırılabilir. ambulasyon testi (3.1) benzer şekilde, öğrenme için hiçbir potansiyel var. Deney sırasında gerektiği gibi Böylece, arka pençe ayak açısı testi birçok kez tekrarlanabilir.- Ya net açık alan kutu veya kapalı bir alanda, bu alanın etrafında hareket ettikçe yavru kaydetmek için, aşağıda ya da yukarıda sırasıyla bir video kamera monte. yürümeye yavruyu motive etmek yavrunun kuyruğu dokunarak nazik prodding kullanın. İki dakika kaydedin.
- video kayıtlarını kullanarak, en uzun (orta) ayak ucuna kadar topuk / kaval kemiğinin ucundan bir çizgi çizerek yavruların ayak açısını ölçün. yavru tam bir adım yerine getirirken sadece ölçü almakve düz bir çizgide iki ayak yere düz. yavru dururken ölçüm yapmayın veya yavru dönerken.
- Ayak açıları üç ila beş set ölçmek ve test edilen her yavru için ortalama açısını hesaplamak.
Arka ayağın Ayak Açısı Yürüme Patolojilerin Belirlenmesinde Kullanılan edilebilir Şekil 2.. Ayak açısı orta (en uzun) rakam ortasından topuğundan bir çizgi çizerek ölçülebilir. (Ayak Açısı Temsilcisi Sonuçlar bakınız) normale göre yaralı hayvanların büyük bir ayak açısına sahiptir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Yüzey Altı düzeltilmesi (Şekil 3):
NOT: düzeltilmesi refleks motor yeteneği Bir fare yavrusu sırtüstü pozisyonda kendi ayakları üzerine çevirmek mümkün. Kemirgenlerde görünmesini düzeltilmesi refleksi için yaş ortalaması PND 1 aralığında ile PND 5'tir -. 10 15 Bu test, bir refleks olduğu gibi, hiçbir öğrenme bileşenidir ve deneme süresi boyunca tekrar edilebilir.- Bir pamuk yaprak ya da tezgah yastığı sırtlarında yavrular koyun ve 5 saniye pozisyonda tutun.
- yavrular bırakın ve yüzüstü pozisyona dönmek için yavru süresini yanı sıra düzeltilmesi yönünü (sol veya sağ) kaydedin. Gerekirse bir dakika toplam, her deneme için verilmiştir.
- Üç çalışmada toplam tekrarlayın.
Şekil 3. Yüzey Altı düzeltilmesi. Bu test gövde kontrolü gerektirir ve postural dengesizlikler için test edebilir. İnsan CP hastaları çekirdeklerinde açıkları olabilir.e.com/files/ftp_upload/53569/53569fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Negatif Geotaxis (Şekil 4)
NOT: negatif geotaxis refleksi için yaş ortalaması kemirgenlerde görünmesini PND 3 aralığında ile PND 7 - 15 15 negatif geotaxis testi genç farelerde motor koordinasyon değerlendirir.. Fareler yerçekimi vestibüler ipuçlarına, yavruların yamaç yukarı yüz çevirmek, bir yamaçtan aşağı bakacak ve yerleştirildiğinden. yanıtı uyaran, ya da taksiler, doğuştan gelen bir davranıştır.- Onun kafası 45 o eğimde aşağı bakacak şekilde yavru koyun ve 5 saniye boyunca tutun.
- yavru bırakın ve yavru yukarı yüz çevirir zaman ve yön kaydedin. Toplam test süresi 2 dk.
- Üç çalışmada toplam tekrarlayın. eğim aşağı düşebilir ya da açmak için başarısız Fare olabilir, ya yeniden test elenirse veya sıfır puan verilir olabilir.
NOT: Bu karar lsınav için eft olarak bazen yavrular nedeniyle uyku ziyade zayıflık eğim aşağı yuvarlanacak. Karar eğim aşağı düşer yavrular puanı nasıl yapılır sonra, yöntemleri dikkat edilmelidir ve tüm deneklerin test boyunca tutarlı olmalıdır.
Şekil 4. Negatif Geotaxis. Motor ve vestibüler giriş yamaçta yönünü tanımak ve etrafında çevirmek için fare için gereklidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Ön bacak Süspansiyon (Şekil 5) 16; 18, 17 uyarlanmıştır:
NOT: Ön bacak süspansiyon kolu ve pençe kuvveti de dahil olmak üzere yavruların, ön ayakları gücünü sınar. Tonun test PND 10 15 daha küçük yavruların için tavsiye edilmez. Pups istikrarlı bir nesne üzerinde sinirli bir tel kavramak ve her iki forepaws ile tel üzerine asmak için izin verilir. test alanı yastıklı bırakma bölgesi üzerindedir. Test sol / sağ taraf gücü farklılıkları tespit edebilir. Öğrenme ve negatif takviye yokluğu artmış dışı katılıma yol açabilir. serbest ya da tel üzerinde yerleştirildiğinde başarısızlık kavramak için zaman derhal düşen fareler olmayan katılım göstergesidir.- vücut tarafından sıkıca yavrular tutun ve her iki forepaws ile tel kavramak sağlayacak.
- yavru bırakın. Bir zamanlayıcı veya kronometre kullanarak, düşmeye toplam zaman kayıt yanı sıra pençe zayıflık.
NOT: Bir yavru sürekli yerine aynı anda her iki pençeleri ile telden bırakmadan başka önce bir pençe ile telden düşerse Paw zayıflık tespit edilir. - üç kez olmak üzere toplam testi tekrarlayın.
Şekil 5. Ön Ekstremite Süspansiyon. Bu süspansiyon test kas yorgunluğu kadar ön ayakları gerginliği neden olur. Bu yaklaşımla, ön ayakları bazal gücü kurulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Hindlimb Süspansiyon (Şekil 6):
NOT: Bu süspansiyon test hindlimb gücünü belirler. Bu yenidoğanlar için özel olarak tasarlanmış bir testtir ve başlangıçta PND 2 ila hayvanlar üzerinde kullanılan - 12 19,20, ama PND 14. sol / sağ arka bacak kuvveti farklılıkları yanı sıra kas fonksiyonunu algılayabilir Bu test kadar fareler için adapte edilebilir. Standart bir 50 ml konik laboratuar mendil ile doldurulur, kullanılır. Ön ekstremite süspansiyon testine benzer şekilde, bu test, özellikle günah öğrenilebilirce düşen hiçbir olumsuz sonucu yoktur. serbest veya başarısızlık tüp kenarına yerleştirildiğinde, olabileceğini belirtti kalmak en kısa sürede düşen fareler tarafından görüldüğü gibi Böylece, sigara katılımı artmıştır.- onun arka ayakları jant üzerinde asılı olan 50 ml'lik bir konik kullanarak, yer yavru hafifçe tüp içine yüz aşağı.
- yavru bırakın. hindlimb duruş gözlemleyin.
- Aşağıdaki kriterlere göre duruş puanı.
NOT: 4 Puan kaldırdı kuyruk normal hindlimb ayrımı gösterir; 3 puan zayıflığı açıktır ve arka ayaklarında birbirine yaklaştırır ama onlar nadiren birbirleriyle temas anlamına gelir; 2 puan arka ayaklarında birbirleriyle ve sık sık dokunarak yakın olduğunu gösterir; 1 puan, bir zayıflık açıktır ve arka ayaklarında yükseltilmiş kuyruklu bir sıktı konumda hemen hemen her zaman gösterir; 0 puan indirdi kuyruk veya herhangi bir süre için tüp tutunmaya yetmezliği olan arka ayaklarında sürekli clasping gösterir. - Gerekirse Kont çeker. Bir çekme qual olduğunukonik tüp tarafında asılı iken yavru kendi arka ayaklarında kullanarak bedenini kaldırmak için çalıştığında ified.
- Bir zamanlayıcı veya kronometre kullanarak, gecikme düşmeye kaydedin.
- üç nüsha olarak tüm testi tekrarlayın.
Şekil 6. Arka ayağın Süspansiyon. (A). Bu süspansiyon test kas yorgunluğu kadar arka ayaklarında gerginliği neden olur. Arka ayaklarında bazal gücü ve duruş (B). Puanlama. Kurulur. Mümkün duruş puanı gösteren temsili fareler üzerinde numaralarını not edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Kavrama Gücü (Şekil 7):
NOT: Bu test pençe s inceleyeceğizAynı zamanda Dört bacak trength. Bir 16 x 18 fiberglas elek teli kullanılır. 15 15 Fox PND 2 dört uzuv yatay ekran testi kullanılır - - bir kemirgen yatay ekran kavramak mümkün olabilmesi için yaş ortalaması PND 5 aralığında olan PND 8'dir.. 21 10 Bu test yatay standart modifiye edilir ekran testi; Burada ekran dört ekstremite 21 açgözlü meydan dikey konuma bir yatay, yavaş yavaş döndürülür; Corti S 16 uyarlanmıştır. 180 ° ters fare örgü ekran üzerine tutarsa, gecikme düşmeye kaydedin. Aynı zamanda, vücut ağırlığı not edin. Bir asılı dürtü olarak hesaplanabilir [düşmeye ağırlığı (g) x gecikme (sn)], yerçekimine direnmesi için gerekli kuvveti yansıtmaktadır.- tel örgü bir parça kullanarak, ekran üzerinde yavru yerleştirin. yavru yaklaşık 5 saniye boyunca bu ortama uyum için izin ver.
- 180 derece yavaş ekranı ters çevirin. Yaklaşık angl kaydedinEkranın e yavru kapalı düştüğünde.
- Üç çalışmada toplam tekrarlayın ve denemeler ortalama.
Şekil 7. Tutma Gücü. Fareler yerçekimi kuvveti arttıkça dört ekstremitede kas gerginliği sürdürmek için gereklidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Grasping Refleks (Şekil 8)
NOT: açgözlü refleks genellikle PND 3 aralığında olan PND 7'de kemirgenlerde görünür - 15 15 Her pençe nedenle test ön veya arka ayakların sorunları yanı sıra, yanlılık sorunları ortaya çıkarabilir, ayrı ayrı test edilir.. Bir refleks olarak refleks görünene kadar, bu test tekrarlanabilir. Bu öğrenme eğilimli değildir. önemli bir uyarı olarak, bu test açgözlü gücü, sadece yetenek ayrım yapmaz, ve çocuk fareler yanıtı korku nedeniyle kavramak başladığında yaşı 15 gün önce test edilmelidir.- Bir fare yavru baraj yapılır benzer şekilde kendi ensesinden tarafından fare tuşunu basılı tutun. Bu tutma yavru test kolaylığı sağlayan, içgüdüsel hareketsiz ve rahat hale gelmesine neden olur.
- İnme künt ile yavru her pençe, bir jilet tarafı yuvarlanır.
- tek tek her pençe test ve kavrama varlığını veya yokluğunu kaydetmek ve fare kavrıyor pençe başına 1 puan.
NOT: Sağ pençe tercihi için puanlama, sağ pençe tercihi için% 100 - - Sol pençe tercihi için -100%, her iki pençeleri için% 50 açgözlü ve açgözlü hiçbir pençeleri için% 0. x 100% - Bu numaralarını belirlemek için denklem [/ (sağ pençe + sol pençe + her iki pençeleri) (sol pençe sağ pençe)] 'dır.
/53569/53569fig8.jpg "/>
Yenidoğan fareler güçlü bir korku tepkisi yok çünkü Şekil 8. Grasping Refleks., Bu test kesinlikle plantar / palmar refleksini belirler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Cliff Kaçınma (Şekil 9):
NOT: Cliff kaçınma testleri refleksleri yanı sıra güç ve koordinasyon labirent ve PND 1-14 22 yavrular test etmek için kullanılır. Düz yükseltilmiş çıkıntıya sahip bir ön kokulu kutusu (serbestçe dolaşmak için 5 farelerin bir izin verilen minimum olmuş bir kutu) kullanılır ve yavru sadece forepaws ve kenar üzerinde konumlandırılmış kendi burnu basamak ile yerleştirilir. Puanlama uzak uçurumun çevirmek ve kenardan uzak pençeleri ve burun taşımak için yavru alır toplam süreyi sayarak gerçekleştirilir. cevap yok 30 saniye sonra görülür ise, test sona erdirilir.yavru kenarından düşerse, tek bir ek deneme yapılabilir.- Bir yandan görünümünü kullanarak, forepaws, rakam ve burun kenarına sadece parçalardır emin, önceden kokulu kutusunun kenarında yavru yerleştirin.
- yavru bırakın ve Sayacı başlatmak.
- burun ve pençeleri hem kenarından çıkarıldıktan sonra, zamanlayıcı ve kayıt zamanı durdurmak.
- 3 denemelerin toplam testi tekrarlayın. yavru 30 saniye içinde uzak uçurumun hareket etmiyorsa, skor yok verilir.
NOT: yavru muayene takdirine bırakılmıştır engelli karşı olmayan bir katılımcı olup olmadığını belirleme. uçurumun yüksekliği yavrunun güvenliğini sağlamak için yavru yaşı için ayarlanabilir. Daha küçük boy daha büyük bir yüksekliğe taklit siyah "zemin" ile kullanılabilir.
Figüre 9. Cliff Kaçınma. Vestibüler dengesizlikler uçurum kaçınma testi kullanılarak ölçülür. Burada, yavrunun gözleri hâlâ korku uzak Uçurumun kenarından açmak için itici faktör değil yani kapalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. İstatistiksel Anlamlılık
- İstatistiksel yazılımını kullanarak sonuçları analiz eder. ortalama (SEM) ortalama ± standart hata olarak verileri ifade eder. Testler parametrik ve böylece, t-testi analizleri kullanarak veri inceleyin.
NOT: Deneyler cinsiyet farklılıkları test etmek için tasarlanmamıştır. Farklılıklar zaman p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı olduğu düşünülmektedir.
Representative Results
Fareler her zaman noktası için farklı fareler kullanılarak P7 P13 (24 saat ameliyat sonrası) (ameliyat sonrası 1 hafta), test edilen bu yüzden test paradigması öğrenme karıştırıcı bir değişken değildi. fareler, bu zaman noktasında büyük açıklarını gösteriyordu P8, Örnek sonuç olarak seçilmiştir.
Yürüyüş için Crawling Geçiş CP Yenidoğan Farelerde Gecikmeli edilir
İnsan CP hastaları ayak yürüyen bir Kağıttan yürümenin kadar, yürüyüş anormallikleri var. Model görüntüler insana benzer açıklarını gait Bu CP olarak, ambulasyon değerlendirildi. Fareler düz bir yürüyüş sırasında yürüyüş simetri ve uzuv-pençe hareketi değerlendirildi. CP 1.083 ±: 48 saat aşağıdaki cerrahi (PND 8) at, CP fareler daha az simetrik ekstremite hareketi ve sahte muadillerine göre bir "tarama" yürüyüşü (ortalama ambulasyon skoruSham 1.639 ± 0,4859 vs 0,6337, n = 12, n = 9; p <0.05, Şekil 10). bir hafta, CP ve sahte fareler, hem (veriler gösterilmemiştir) yürüyen taşıdılar.
Şekil 10. CP Fare Pups Şems yanı sıra Ambulate yok. Sham fareler (siyah çubuk) 1,639 ± 0.4859 (n = 9), onların ayakta gelişimini anlamı asimetrik ekstremite hareketi ve yavaş tarama arasında düşer ortalama puanı var. CP fareler (gri çubuk) kendi ambulasyon anlamı daha az gelişmiş olduğunu, 1,083 ± 0.6337 (n = 12) ortalama puanı almak ve asimetrik ekstremite hareketini sahip olma eğilimindedir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir; * P <0.05 olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
hindlimb Ayak Açısı CP artan bir
ambulasyon ek olarak, arka pençe ayak açı tayin edilmiştir. CP 77,48 ± 9,848, n = 9, vs sahte 54.54 ±: ortalama açı; sekiz günlük bir sahte fare yavruları kendi pençelerin düz bir çizgi (Şekil 2 yürürken pençelerin yayvan olan HIL farelere kıyasla, ileriye dönük ile yürümek 8,043, n = 11, p <0.0001, Şekil 11). Yavrular kendi yürüyüşü ve denge ve koordinasyonu ile yardımcı olmak amacıyla kendi arka pençelerinin açısını artırmak gerekir ki bu artan açı, yürüyüş istikrarsızlık ile ilişkilidir.
Şekil 11. CP Fare Pups Splay onların pençelerin Walking. CP fareler (siyah çubuklar), 7748 ± 8,043 (n = 11) kendi arka ayaklarında arasında bir ortalama açısına sahip sahte fareler (gri b ise Ars) 54.54 ± 9.848 (ortalama açısına sahiptir, n = 9). Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir; **** P <0.0001 olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CP Fareler Açıkları göster olmadığında Yüzey Altı düzeltilmesi
Bazı CP hastaları gövde kontrolünü bozulmuş gibi yüzey düzeltilmesi testi (HEYRMAN ve ark., 2013) dahil edildi. Ayrıca, vestibüler sistem düzeltilmesi ihtiyacını tespit etmek için gerekli olan ve bazı CP hastalarında 23 vestibüler eksiklikler vardır. Sham kontrollere kıyasla düzeltilmesi Cp fareler önemli düzeyde açıkları gösterme (veriler gösterilmemiştir).
CP Fareler Negatif Geotaxis Testi Sham aynı gerçekleştirin
"Fo: keep-together.within-page =" t.. 1 "> Negatif geotaxis eğimli bir yüzeyde yokuş aşağı bakacak şekilde yer olmanın Fareler meydan genç yavrular motor koordinasyon test etmek için kullanılan açıklarını gösterebilir şark yokuş yukarı için Gecikme ya da başarısızlık olduğunu (veriler gösterilmemiştir) sahte farelere kıyasla olumsuz geotaxis ile meydan okuduğunda koordinasyon, denge, ya da vestibüler giriş. CP fareler hiçbir açıkları göstermektedir. Ayrıca, CP fareler yeniden yönlendirme karşı başka bir tarafa doğru çevirmek için bir tercih yoktu .Ön Ekstremite Süspansiyon Testi 10 gün daha eski Fareler için uygun olan
CP hastalar kavrama gibi ince motor becerileri, kas tonu ve açıklarını azalmıştır. Bu fare modelinde zayıflık test etmek için, biz bir ön ekstremite süspansiyon testi kullanılır. Bundan başka, bu model, tek taraflı iskemik hasar ve taraflı lık Bu süspansiyon testi kullanılarak belirlenebilir kullanır. bu test10 gün 15 yaşından büyük fareler için daha iyidir. 8 gün eski at, yaralanma sonrası iki gün, CP ve sahte fareler arasında anlamlı bir fark yoktu (veriler gösterilmemiştir).
Arka bacak Mukavemet CP Farelerde azalma olduğu
İnsan CP hastalar sıklıkla nedeniyle motor kontrol ve güç eksikliği ayraçlar veya yardımcı yürüme cihazları gerekir. insanlara kemirgen CP modelini karşılaştırmak amacıyla, arka bacak kuvveti hindlimb süspansiyon testi kullanılarak değerlendirildi. CP 3.468 ± 0,5561, n = 13, vs plasebo 3.891 ± 0,1329, n = 13, p <: konik bir tüp yan asılı zaman puan asılı bir azalma ile gösterildiği gibi, CP farenin arka bacak asılı mı (arka bacak güçsüzlüğü gösterdi 0.05, Şekil 12). Fark arka bacak süspansiyon zamanda gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, insan CP hastalara benzer, CP fareler hindl göstermekimb (bacak) zayıflığı.
Şekil 12. Sham Fare, sahte fareler (siyah çubuk) daha arka bacak ayırma ve bu nedenle güçlü bir hindlimb duruş göstermek 3.891 ± 0,1329 ortalama asılı puanı ise. Biraz ama (n = 13) CP Fare daha kendi arka ayaklarında yer önemli ölçüde güçlü olan 3,468 ± 0.5561 (n = 13) ortalama asılı puanı ile CP farelerde (gri çubuk) daha tüpün kenarında asılı zaman. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir; * P <0.05 olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kavrama Gücü Takip edilenler CP Yaralanma azalma olduğu
Dört bacak ile tutan bir kemirgen önemlidirtırmanma ve düz olmayan yüzeylerde üzerinde çalışan şartları. Grip, özellikle hanelere, daha doğrusu el becerisi veya doğrusal kuvvetinden daha önemli sürekli güç gerektirir ve 24 pençeler. Fareler ters tel süzgeç üzerinde vücut ağırlığı tutmak için gerekli oldu. CP fareler kendi kavrama korumak mümkün değildi ve bu fareler anlamlı derecede düşük açılarda düştü (dört uzuv ortalama açısı: CP 75,627 ± 24.48, n = 11, vs sahte 96,57 ± 10,836, n = 9, p <0.05, Şekil 13). Bu veriler CP farelerde kavrama kuvvetinde önemli bir açığı olduğunu göstermektedir.
Şekil 13. CP Fare Şems daha zayıf Kavrama var. 96,57 ± 10.836 ortalama ters açıya kavrayabilir Sham fareler (siyah çubuk) (n = 9). CP fareler (gri çubuk) Sadece 75,627 ± 24.48 (n = 11) bir ters açı ulaşabilir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir; * P0; 0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Grasping Refleks Açıkları CP Farelerde Görünür olan
Kaba motor açıkları ile birlikte, ince motor hareketleri de CP hastalarında 25,26 bozulmaktadır. İnsanlarda doyumsuz refleks doğuştan mevcuttur ve yaklaşık 5 kaybolur - 6 ay. Ancak, bu tür abartılı hız veya açgözlü gücü, kavramak yetmezliği veya yaş 6 ay sonra doyumsuz refleks reemergence olarak kavrayarak refleks değişiklikleri, tüm sinir sistemine zarar gösterir. CP modelinde açgözlü karşılaştırmak için, dönüşlü kavrama açıkları belirlendi.
yaralanma sonrası 48 saatte, CP fareler refleksini doyumsuz bir azalma göstermektedir (ortalama pençeleri kavradı48 saatte: CP 2.429 ± 0,9376, n = 14, vs 3,214 ± 0,8018 sahte, n = 14; p <0.05, Şekil 14A). forepaws sağ pençe tercihi hafif, ancak anlamlı değildir artış oldu (veriler gösterilmemiştir). Orada pençelerin önemli bir sağ pençe tercihi oldu (CP 75.0 ± 42.74, n = 14, sahte 17.86 ± 54,09 vs, n = 14; p <0.005, Şekil 14B). Hiçbir önemli pençe tercihi ile;: Bir hafta yaralanma sonrası, CP fareler kavrama açıkları (Şekil 14C, p <0.05 CP 2.75 ± 1.035, n = 8, sahte 3.80 ± 0,6325 vs, n = 10 ortalama pençeleri 1 hafta kavradı) göstermek .
Şekil 14. CP Fare Yaralı Beyin Bölgesi'ne taraftaki pençelerin içinde Grasping Açıkları, var. (A) 48 saat takip yaralanma (PND 8), CP fareler (gri çubuk) ortalama ile bir sopa kavramak, sahte anima daha az pençelerils (siyah çubuk). (B) CP fareler (gri çubuk) Sol arka pençe (yaralanma ipsilateral) ile karşıt olarak (yaralanma taraf) doğru arka pençe ile doyumsuz için bir tercih görüntüler. Sham fareler (siyah çubuk) bu doğru pençe tercihi göstermez. Sağ pençe tercihi olarak hesaplanır ([sağ pençe - pençe sol] / [sağ pençe + sol pençe + her iki pençeleri] * 100) (C) Bir hafta aşağıdaki yaralanma, CP fareler (gri çubuk) ile karşılaştırıldığında hala açıkları açgözlü gösteriyor. shams (siyah çubuk). Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir; * ** P <0.005, p <0.05 olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
CP Fareler Cliff Kaçınma sırasında uzak Edge çevirmek
uçurum kaçınma testi awa açmak için farelerin doğal korku dayanırgüvenliği konusundaki dik bir uçurumun ve baştan y. Bazı CP hastaları vestibüler zorluklar yanı sıra engelli motor kontrolü olmasına rağmen, CP fareler bu testin herhangi açıkları yoktu.
Discussion
İnsan ve kemirgen arasında gerçekleştirilen davranış testleri insan belirtiler doğrudan ilgisi olduğu hücresel ve moleküler yanıt arasındaki örtüşme varsa insan hastalıklarının incelemek için hayvan modelleri kullanarak sadece ilgili olduğunu. Pediatrik hastalık çalışmaları ile önemli konulardan biri birçok araştırmacı hastalık sürecinde önemli olabilir gelişimsel farklılıkları dikkate almadan, modeli, hem de yetişkin kemirgen davranış değerlendirme oluşturmak için yetişkin kemirgenler kullanmaktır. 7 (7 gün kemirgen - - 32 hafta bir doğum sonrası 2. günde eşdeğerdir 28. örneğin insan sinir sistemi geliştirme) bu konuların, çünkü pediatrik hastalık kullanımı ile ilgili araştırmalar sadece uygun ayarlanmış gelişim zaman noktaları önemlidir ama aynı zamanda davranış testleri uygun motor, duyusal veya dönüşlü gelişimsel davranışlarını inceleyeceğiz söyledi. Her yeni doğan hastalık modeli geliştirilmiştir Böylece, sıkı hücre sağlamak için test edilmelidirve davranışsal tepkiler kemirgen ve insan arasındaki en uygun çevrilebilir veri sağlayacaktır.
Serebral palsi yetişkinliğe kadar devam motor bozukluğudur. bugün mevcut serebral palsi modellerin çoğu ile bir problem pediatrik hastalarda görülen açıkları ile ilişkili olabilir tekrarlanabilir, standart motorlu test eksikliğidir. Bir yenidoğan fare hipoksi, iskemi ve inflamasyon birleştiren bu yeni modelde, motor davranışları yenidoğan fareler için özel testlerin bir pil kullanılarak değerlendirilmiştir. nicel raporlama öznelliği azaltmak ve artırmak amacıyla, çeşitli testler standardize edilebilir önlemleri değerlendirmek üzere çok özel, ama kolay içerecek şekilde modifiye edilmiştir. Buna ek olarak, ön ve arka ayakların değerlendirmeler ayrı ayrı yapılabilir ve sağ / sol farklılıklar tespit edilebilir. testler Bu pil iki haftalık kadar neonatal fare için özeldir.
Bu CP modeli gösterirgelişimsel reflekslerinde (ambulasyon, arka bacak ayak açısı) yürüme zorluğu, hem de bacak-spesifik zayıflık (dört uzuv süspansiyon, hindlimb süspansiyon) ve açıkları (refleksi açgözlü). Bu çalışmada sadece bir timepoint incelendiğinde olsa da, bu açıkları zamanla izlenebilir.
Bu tür testlerin Fox pil veya gelişim aşamalarından 15 Heyser en Değerlendirilmesi olarak yenidoğan kullanılabilir testlerin, diğer pil vardır. Ancak, bu testler olan yanıtları yenidoğan hala gelişmekte olduğu için aynı olmayabilir yetişkin, için yenidoğan karşılaştırın. Fox'un batarya ve Heyser en şerefiyeler testleri yerine (gücüne dayalı açı, duruş, vb) objektif verilere göre, dichotomous (evet veya hayır) değerlendirilmesi ile gözlemsel subjektif bilgilere dayanmaktadır. Çünkü bu testlerin öznellik arasında birçok bilim adamı bu nedenle başkalarına ve limit eşsiz sonuçlarını yapma kriterleri, adapte eklenebilir veya kaldırdıkBelirli bir hastalık ya da bozukluk için bir temel açık oluşturulması açısından veri yararlılığını ing. nitel ve özellikle yenidoğanlar test etmek için tasarlanmış standart motor testleri bir dizi kurarak, bireysel araştırma grupları sonuçları doğru ve güvenilir rapor ve mukayese edilebilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | STRAIN CODE: 027 | C57BL/6NCrl is the exact strain we use |
| Anesthesia Dish, PYREX™ Crystallizing Dish | Corning Life Sciences Glass | 3140125 | Capacity: 25.03 oz. (740ml); Dia. x H: 4.92 x 2.55 in. (125 x 65mm). However, any small round glass container will work. A 2 cup capacity pyrex food storage bowl with flat bottom will also work and is much cheaper (Pyrex model number: 6017399). |
| Covered lead ring | Fisher Scientific | S90139C | Lead ring for stablizing flasks in a water bath. It is used inside the anesthesia dish. |
| Scalpel Blade #11 | World Precision Instrucments, Inc. | 500240 | |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Micro Hook | Fine Science Tools | 10064-14 | |
| Vetbond Suture Glue | 3M | 1469SB | n-butyl cyanoacrylate adhesive |
| Lipopolysaccharide | Sigma Life Science | L4391 | Lipopolysaccaride from E.coli 0111:B4, gamma irradiated |
| 12 x 12 inch opaque box | Acrylic Display Manufacturing: A division of Piasa Plastics | C4022 | Colored Acrylic 5-Sided Cube, 3/16" Colored Acrylic, 12"W x 12"D x 12"H; http://www.acrylicdisplaymfg.com/html/cubes_19.html |
| Camera/camcorder | JVC | GC-PX100BUS | Any camcorder that works well in low light and can be imported and edited. We use the JVC GC-PX100 Full HD Everio Camcorder. |
| Covidien Tendersorb™ Underpads | Kendall Healthcare Products Co | 7174 | |
| WypAll L40 | Kimberly-Clark Professional | 5600 | Any surface with moderate grip will do |
| Surface at 45 degree incline | We use a cardboard box. | ||
| Thin wire from a pipe cleaner | Creatology | M10314420 | Any pipe cleaner from any craft store will work. |
| 50mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| Fiberglass Screen Wire | New York Wire www.lowes.com | 14436 | Any supplier can be used as long as their screen is 16 x 16 or 18 x 16 |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | A wooden stick applicator or wooden part of a cotton-tipped swab will also work. |
| OPTIX 24-in x 4-ft x 0.22-in Clear Acrylic Sheet to make Clear Acrylic Walkway | PLASKOLITE INC | 1AG2196A | Clear acrylic (1/8" thick) with sides and a top to limit exploration. We bought a sheet of acrylic from a local hardware store and had them cut it to size. (2) 2" x 2"; (3) 2" x 18"; (1) 2" x 15.5"; (1) 2" x 3". Using clear tape, tape all sides together, with the 15.5" piece on top. Tape the 3" piece to the end of the 15.5" piece to create a flap/entryway for the mice. Alternatively, part or all of the walkway can be glued together, and only taping on the top pieces. This design will allow for the walkway to be opened for easy cleaning. |
| Protractor | Westscott | ACM14371 |
References
- Nakamura, M., Bregman, B. S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury. Exp Neurol. 169 (2), 407-415 (2001).
- Widenfalk, J., Lundströmer, K., Jubran, M., Brene, S., Olson, L. Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid. J Neurosci. 21 (10), 3457-3475 (2001).
- Fernández-Lòpez, D., Faustino, J., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Cusick, C. G. Extensive cortical reorganization following sciatic nerve injury in adult rats versus restricted reorganization after neonatal injury: implications for spatial and temporal limits on somatosensory plasticity. Prog Brain Res. 108, 379-390 (1996).
- Barrett, C. P., Donati, E. J., Guth, L. Differences between adult and neonatal rats in their astroglial response to spinal injury. Exp Neurol. 84 (2), 374-385 (1984).
- Villapol, S., Gelot, A., Renolleau, S., Charriaut-Marlangue, C. Astrocyte Responses after Neonatal Ischemia: The Yin and the Yang. Neuroscientist. 14 (4), 339-344 (2008).
- Craig, A., Ling Luo, N., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Exp Neurol. 181 (2), 231-240 (2003).
- Shen, Y., Liu, X. B., Pleasure, D. E., Deng, W. Axon-glia synapses are highly vulnerable to white matter injury in the developing brain. J Neurosci Res. 90 (1), 105-121 (2012).
- Shen, Y., Plane, J. M., Deng, W. Mouse models of periventricular leukomalacia. J Vis Exp. (39), (2010).
- Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
- Tremml, P., Lipp, H. P., Müller, U., Ricceri, L., Wolfer, D. P. Neurobehavioral development, adult openfield exploration and swimming navigation learning in mice with a modified beta-amyloid precursor protein gene. Behav Brain Res. 95 (1), 65-76 (1998).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72 (2), 251-264 (1974).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Del Bigio, Long-term motor deficit following periventricular hemorrhage in neonatal rats: A potential model for human cerebral palsy. J Cerebr Blood F Met. , (2005).
- Williams, E., Scott, J. P. The Development of Social Behavior Patterns in the Mouse, in Relation to Natural Periods. Behaviour. 6 (1), 35-65 (1954).
- Heyser, C. J. Assessment of developmental milestones in rodents. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. Q., et al. Chapter 8, (2004).
- Corti, S. Grip strength TREAT-NMD: Experimental protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ (2014).
- Corti, S., Nizzardo, M., et al. Neural stem cell transplantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 118 (10), 3316-3330 (2008).
- Grondard, C., Biondi, O., et al. Regular exercise prolongs survival in a type 2 spinal muscular atrophy model mouse. J Neurosci. 25 (33), 7615-7622 (2005).
- El-Khodor, B. F. Behavioral Phenotyping for Neonates. Experimental Protocols for SMA animal models. , (2011).
- El-Khodor, B. F., Edgar, N., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212 (1), http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sma-sops/ 29-43 (2008).
- Venerosi, A., Ricceri, L., Scattoni, M. L., Calamandrei, G. Prenatal chlorpyrifos exposure alters motor behavior and ultrasonic vocalization in CD-1 mouse pups. Environ Health. 8 (12), (2009).
- Hill, J. M., Lim, M. A., Stone, M. M. Developmental milestones in the newborn mouse. Neuromethods 39: Neuropeptide Techniques. , Humana Press. New Jersey. (2008).
- Visual dependence influences postural responses to continuous visual perturbation in adults with spastic cerebral palsy. Yu, Y., Keshner, A. E., Tucker, C. A., Thompson, E. D., Lauer, R. T. Combined Sections Meeting of American Physical Therapy Association, Anaheim, CA, USA, , (2016).
- Carlson, G. The use of four limb hanging tests to monitor muscle strength and condition over time. Experimental Protocols for SMA animal models. , http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1.005.pdf (2011).
- Gordon, A. M., Duff, S. V. Relation between clinical measures and fine manipulative control in children with hemiplegic cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 41 (9), 586-591 (1999).
- Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int J Pediat. , (2012).
