Summary
تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو الشكل الأكثر شيوعاً لتشوه التنمية القشرية (MCD) في مرحلة البلوغ ولكن الأساس الجيني لا يزال غير معروف في بعض الحالات المتفرقة أكثر. مؤخرا قمنا بتطوير استراتيجية لتحديد الجينات المرشحة رواية ل MCDs وتؤكد على دور العامل المسبّب في فيفومباشرة.
Abstract
العيوب الخلقية التي تنطوي على قشرة الدماغ – المعروف أيضا التشوهات القشرية التنمية (MCD) – أهم أسباب الإعاقة الفكرية وحساب 20-40% من الصرع المقاوم للعقاقير في مرحلة الطفولة. ويسرت تصوير الدماغ عالية الدقة في فيفو تحديد مجموعة كبيرة من MCD تعمل. وعلى الرغم من التقدم الذي تحقق في تصوير الدماغ وتحليل الجينوم وتوليد نماذج حيوانية، سير عمل مباشرة إلى إعطاء الأولوية للجينات المرشحة بشكل منهجي واختبار الآثار الفنية للطفرات المفترضة مفقود. للتغلب على هذه المشكلة، ووضعت استراتيجية تجريبية لتمكين تحديد الجينات المسببة رواية ل MCD والتحقق من صحتها. وتقوم هذه الاستراتيجية على تحديد مناطق الجينوم المرشح أو الجينات عبر الصفيف CGH أو عزمي كل تسلسل ووصف آثار هذه المنظمة أو overexpression من طفرات محددة في تطوير أدمغة القوارض عن طريق الرحم انهانسر. أدى هذا النهج إلى تحديد الجينات C6orf70 ، الترميز لبروتين حويصلية المفترضة، أن الآلية المرضية لتلين عقيدية هيتيروتوبيا، MCD الناجمة عن هجرة الخلايا العصبية التالفة.
Introduction
قشرة الدماغ يلعب دوراً رئيسيا في العمليات الإدراكية والفكرية والمشاركة في التحكم العاطفي، فضلا عن التعلم والذاكرة. ولذلك فإنه ليس من المستغرب أن العديد من الأمراض العصبية والنفسية نتيجة للتشوهات القشرية التنمية (MCD). مسببات MCD معقدة منذ حصلت على حد سواء وتشارك العوامل الوراثية. انتشار نسبة مصممة وراثيا من MCD التراكمي هو حوالي 2% ومتفرقة في معظم الحالات. على سبيل المثال، قدرت حالات الإصابة بخلل الدماغ الخلقي تكون أعلى من 1 في المائة في السكان، ولوحظت بعض أشكال MCD في أكثر من 14 في المائة من جميع المرضى المصابين بالصرع، وفي 40% من الصرع الشديدة أو مستعصية على الحل1، 2.
تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو واحد من MCDs الأكثر شيوعاً وهو الناجمة عن الهجرة غير طبيعي للخلايا العصبية من منطقة البطين (VZ) إلى قشرة الدماغ النامي. فشل الخلايا العصبية لترحيل النتائج في مجموعات من الخلايا العصبية هيتيروتوبيك على طول جدران البطينين الجانبية التي يمكن تصور عادة باستخدام "التصوير بالرنين المغناطيسي" (التصوير بالرنين المغناطيسي). السمات السريرية والتشريحية والتصوير ليتبعها غير متجانسة. قد تتراوح العقيدات الصغيرة والاحادية الثنائية ومتماثل. عقابيل السريرية شيوعاً تشمل الإعاقة الفكرية والصرع3. تم العثور على الطفرات في الجين A فيلامين (أو فلنا)، التي تقوم بتعيين في Xq28، في 100 في المائة أسر التي يتبعها الثنائية المرتبطة بالعاشر وفي 26% من المرضى متفرقة3،4. نموذج نادرة والمتنحية ليتبعها الناجم عن الطفرات في الجينات ARFGEF2 ، التي تقوم بتعيين في 20q13، أبلغ في اثنين من الأقارب الأسر5. مؤخرا، تم تحديد بياليليك الطفرات في الجينات ترميز زوج كادهيرين يجند مستقبلات DCHS1 و FAT4 في تسعة من المرضى المصابين باضطراب مولتيسيستيميك التي تتضمن يتبعها6. ارتبط أيضا يتبعها الهش × متلازمة7، متلازمة ويليامز8، متلازمة ميكروديليشن 22q119، والازدواجية في 5 ف 1510، الحذف في 1 ف 3611، 5q14.3-q1512, 6 ف 2513 و 6q حذف المحطة الطرفية متلازمة14،15،16،17،،من1819، مما يوحي بأن الجينات المسببة الإضافية متناثرة في جميع أنحاء الجينوم. ومع ذلك، يبقى الأساس الوراثي حوالي 74 في المائة من المرضى يتبعها متفرقة أن أوضحت17.
نهج تعيين الجينات الكلاسيكية مثل مصفوفة "التهجين الجينومي المقارن" (صفيف-CGH) أثبتت أن تكون أدوات قوية للكشف عن مجهرية دون تشوهات كروموسومية، بيد مناطق الجينوم وحدد استخدام هذا النهج كبيرة في كثير من الأحيان، وتحتوي على العديد من الجينات.
ظهور تقنيات ضخمة يسلسل موازية (أي كل عزمي التسلسل (ويس) وكل الجينوم تسلسل (WGS)) خفضت إلى حد كبير كل من التكلفة والوقت اللازم لتسلسل أكمله عزمي البشرية أو الجينوم. على الرغم من ذلك، يظل تفسير البيانات ويس والأفرقة العاملة للطعن في معظم الحالات، منذ لكل المتغيرات المريض عشرات إلى مئات (أو حتى الآلاف، واعتماداً من نوع التحليل) الخروج من تصفية البيانات.
لتسريع عملية تحديد الجينات المسببة MCD الجديدة، استراتيجية منهجية رواية الجمع بين CGH صفيف، صمم ويس و في الرحم انهانسر (IUE) فحص الجينات المرشحة. يسمح IUE شكل انتقائي إلغاء تنشيط (أو أوفيريكسبريس) جينات معينة أو الطفرات في أدمغة القوارض، تمكين التقييم السريع لمشاركتهم في18،كورتيكوجينيسيس19. [رني] وساطة-ضربة قاضية أو overexpression من واحد أو أكثر من الجينات المرشحة يتوقع أن يتسبب، عندما يكون مرتبطاً بتطوير المرض، وعيوب مترجمة في الهجرة العصبية و/أو النضج الجينات. عند تحديد الجينات التي المنظمة (أو أوفيريكسبريشن) يستنسخ النمط الظاهري لوحظ في المرضى في القوارض، فإنه يصبح أحد المرشحين معلقة لفحص المرضى متفرقة مع MCD. باستخدام هذا النهج، ونحن مؤخرا كشفت مساهمة حاسمة من الجينات C6orf70 (يعرف أيضا باسم ارمارد) في يتبعها المرضية في المرضى إيواء العناصر المحذوفة الصبغية 6q2716.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: ويستار كانت تزاوج صيانتها واستخدامها في مرافق الحيوانات إينميد، باﻻتفاق مع تشريعات الاتحاد الأوروبي والفرنسي.
1. استخراج الحمض النووي والتحديد الكمي ل CGH الصفيف وويس
- استخراج "الحمض النووي" (جدنا) من الكريات البيضاء في الدم البشري من المرضى الذين يستخدمون روبوت الآلي في عزل الحمض النووي أو مجموعات استخراج الحمض النووي دليل المتاحة تجارياً وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. قياس جميع العينات باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
2-مجموعة-CGH البروتوكول
-
الهضم التقييد من جدنا
- ضعف هضم 500 نانوغرام من جدنا المنقي من مريض وسيطرة بشرية متاحة تجارياً الحمض النووي مع رساي والوي ح 2 في 37 درجة مئوية. استخدام 0.5 ميكروليتر من إنزيم يو/ميكروليتر 10 لكل رد فعل. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية إلغاء تنشيط الإنزيمات ونقل أنابيب عينات الجليد.
-
وضع نموذج العلامات
- إضافة وحدة التخزين المناسبة كبسولة تفجير عشوائي بحاجة لتنسيق ميكرواري في الاستخدام لكل أنبوبة رد فعل (مثلاً 5 ميليلتر لحزمة 1 و 2-حزمة 4-حزمة [ميكروارس]). مزيج جيد من قبل بيبيتينج إلى أعلى وأسفل برفق.
- نقل أنابيب عينة cycler حرارية. تبني على 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ثم على 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إعداد سينين سينين 3 وواحدة واحدة 5 "ميكس ماجستير الوسم" على الجليد بمزج وحدات التخزين التالية: 10.0 ميليلتر 5 X رد فعل المخزن المؤقت، 5.0 ميليلتر 10 x dNTPs، ميليلتر 3.0 سينين 3-dUTP أو سينين 5-dUTP و 1.0 ميليلتر أكسو (-) الإنزيم كلينوو، ميليلتر 2.0 خالية من نوكلاس "المياه". اختر حجم كل كاشف وفقا للشكل ميكرواري قيد الاستخدام.
- إضافة "مزيج الرئيسي وضع العلامات" لكل أنبوبة رد الفعل الذي يتضمن جدنا. مزيج جيد من قبل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- نقل أنابيب العينات إلى cycler حرارية واحتضان في 37 درجة مئوية ح 2، 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وثم المحافظة على العينات عند 4 درجة مئوية.
-
تنقية المسمى جدنا
- إضافة ميليلتر 430 1 x الشركة المصرية للاتصالات (pH 8.0) لكل أنبوبة رد فعل.
- ضع عمود تنقية في أنابيب جمع 2 مل وتسمية الأعمدة شكل مناسب. تحميل كل المسمى جدنا على عمود تنقية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 14,000 ز س في ميكروسينتريفوجي عند درجة حرارة الغرفة. تجاهل-التدفق عبر ومكان العمود مرة أخرى في أنبوب جمع 2 مل.
- إضافة ميليلتر 480 1 x الشركة المصرية للاتصالات (pH 8.0) لكل عمود. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 14,000 ز س في ميكروسينتريفوجي عند درجة حرارة الغرفة. تجاهل في التدفق من خلال.
- عكس العمود إلى أنبوب جمع الطازجة 2 مل والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1,000 ز س في ميكروسينتريفوجي في درجة حرارة الغرفة لجمع العينات النقية.
- جعل حجم العينة التي طلبت لتنسيق ميكرواري في استخدام استخدام مركز أو إضافة 1 x TE (pH 8.0). على سبيل المثال، لإحضار ميكرواري 1-حزمة وحدة التخزين إلى 80.5 ميليلتر. احتضان العينة على الجليد لمدة 5 دقائق وثم "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً 10 مرات.
-
إعداد جدنا المسمى التهجين
- الجمع بين عينات الاختبار ومرجع باستخدام عينة المسمى 5 سينين المناسبة وعينه المسمى 3 سينين في أنبوب مل 1.5 جديدة خالية من رناسي. على سبيل المثال، ميكرواري حزمة 1 التأكد من أن وحدة التخزين النهائي 158 ميليلتر. اختر حجم كل عينة وفقا للشكل ميكرواري قيد الاستخدام.
- استخدام جهاز المطياف الضوئي قياس العائد، درجة من النشاط وضع العلامات أو محددة عن طريق قياس امتصاص في A260 شمال البحر الأبيض المتوسط (DNA) وشمال البحر الأبيض المتوسط A550 (سينين 3) A650 نانومتر (سينين 5).
- حساب العائد باستخدام الصيغة: [الحمض النووي concentration(ng/µl) x حجم العينة (ميليلتر)]/1,000 (نانوغرام/ميكروغرام). حساب "نشاط معين" استخدام الصيغة: بمول كل ميليلتر لصبغ/ميكروغرام كل ميليلتر جدنا.
ملاحظة: على سبيل المثال، عن 0.5 ميكروغرام لإدخال الحمض النووي، العائد ينبغي ميكروغرام 8 إلى 11 والنشاط المحدد (pmol/ميكروغرام) ينبغي أن يكون 25 إلى 40 سينين-3 وصف العينة و 20 إلى 35 للعينة توسم سينين-5.
- حساب العائد باستخدام الصيغة: [الحمض النووي concentration(ng/µl) x حجم العينة (ميليلتر)]/1,000 (نانوغرام/ميكروغرام). حساب "نشاط معين" استخدام الصيغة: بمول كل ميليلتر لصبغ/ميكروغرام كل ميليلتر جدنا.
- إعداد مقدار ميكس ماجستير التهجين بحاجة لتنسيق ميكرواري في الاستخدام، مزيج الكواشف التالية: 50 ميليلتر عند استخدام سرير-1 "الحمض النووي" (1.0 ملغ/مل)، ميليلتر 52 10 × أكغ عامل حجب وميليلتر 260 2 × "العازلة التهجين" مرحبا-دورة في الدقيقة.
- إضافة ملائمة حجم ميكس ماجستير التهجين إلى أنبوب 1.5 مل خالية رناسي يحتوي على جدنا المسمى للحصول على الحجم الإجمالي المطلوب لتنسيق ميكرواري قيد الاستخدام. على سبيل المثال، ميكرواري حزمة 1، تأكد أن الحجم النهائي لكل رد فعل 362 ميليلتر.
- خلط العينة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ثم بسرعة الطرد المركزي في 14,000 س ز واحتضان لمدة 3 دقائق على 95 درجة مئوية وعلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
-
الجمعية الدوائر والتهجين
- تحميل شريحة طوقا نظيفة في قاعدة الدائرة مع التسمية طوقا مواجهة والانحياز في القسم مستطيلة بقاعدة الدائرة. التأكد من أن الشريحة طوقا دافق بقاعدة الدائرة وليس أجار.
- الاستغناء عن التهجين عينة المخلوط على البئر طوقا والتأكد من أن يتم توزيع النموذج موحد.
- إخماد شريحة ميكرواري على تقييم الشريحة طوقا أن ساندويتش-الزوج هو محاذاة بشكل صحيح. بعد ذلك، تجميع الدائرة رد فعل بوضع الغطاء على الشرائح تقع ومن ناحية شد المشبك.
- تأمين الشرائح ترطيب بتدوير الدائرة مجمعة رأسياً. تأكد من أن الفقاعات ليست موجودة في الدائرة. إذا لزم الأمر، انقر على الجمعية على سطح صلب لتحريك فقاعات ثابتة.
- وضعت الدوائر المجتمعة الشريحة على حامل المدورة لتدوير 20 لفة في الدقيقة. وضعت الدائرة التهجين في فرن وأداء التهجين عند 65 درجة مئوية ح 24 أو 40 وفقا للشكل ميكرواري قيد الاستخدام.
-
ميكرواري الغسيل والمسح
- تتخذ الدائرة التهجين من الفرن وتغرق فإنه يغسل المخزن المؤقت 1. الشروع في التفكيك.
- إزالة الشريحة ميكرواري ووضعها بسرعة في حامل شريحة في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الشريحة الصفيف لمدة 5 دقائق مع التحريك (استخدام برغوث ومحرض مغناطيسية). ضبط سرعة محرض لإعداد 4 (متوسط السرعة)، للحصول على جيد، ولكن خلط غير نشطة جداً.
- تغسل الشريحة الصفيف في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2 للتحريك s 90. استعادة الشريحة بلطف من المخزن المؤقت (أنه ينبغي أن تظهر الجافة) وتحميله في حامل شريحة مع المعونة من حامية الشريحة.
- تحميل الشريحة في الماسح الضوئي الصفيف وإجراء المسح وفقا لإرشادات الشركة المصنعة الصفيف.
- تحليل النتائج باستخدام استخراج البرامج المتوفرة مع الماسح الضوئي في الاستخدام وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (V.9.1.3.1).
3-ويس البروتوكول
- هدف الإثراء
- استخدام دسدنا فرع التحليل لتحديد تركيز العينة جدنا وفقا للبروتوكول الصك.
- تمييع 5 ميكروغرام من جودة عالية مزدوجة حبلا الحمض النووي مع 1 × العازلة TE منخفضة في أنبوب 1.5 مل ربط انخفاض في إجمالي حجم 50 ميليلتر.
- سونيكاتور ووضع microtube إلى محطة التحميل والتفريغ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحفاظ الغطاء على الأنبوب.
- بطء نقل العينة 50 ميليلتر الحمض النووي عن طريق سيتا قبل الانقسام دون إدخال الفقاعات.
- قص الحمض النووي طبقاً لإعدادات اقترح من الشركة المصنعة سونيكاتور وتقييم الجودة باستخدام بيواناليزير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حجم جزء الحمض النووي والهدف هو 150 إلى 200 شركة بريتيش بتروليوم.
- ينتهي إصلاح الحمض النووي
- إعداد "مزيج رد فعل الإصلاح نهاية" بخلط 40 ميليلتر من "نهاية إصلاح إنزيم ميكس" مع 10 ميليلتر من نهاية إصلاح اليغو ميكس. تخلط جيدا في خلاط دوامة.
- احتضان هذه العينات في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في cycler حرارية وثم عقد لهم في 4 درجات مئوية. عدم استخدام غطاء دافئ.
- إضافة 50 ميليلتر من "مزيج رد فعل الإصلاح نهاية" إعدادها في الخطوة 3.2.1 لكل ميليلتر 50 المنفصمة عينة الحمض النووي أيضا. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو بواسطة فورتيكسينج لطيف.
- تنقية العينة مع مجموعة تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
- وينتهي بوليادينيليشن من 3 '.
- إضافة 20 ميليلتر من مزيج ماجستير دا-تراجع إلى كل نهاية إصلاحه، وتنقية الحمض النووي عينة (حوالي 20 ميليلتر).
- مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو بواسطة فورتيكسينج لطيف.
- احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية في cycler حرارية والاحتفاظ بها ثم في 4 درجات مئوية. عدم استخدام غطاء دافئ.
- ربط محول التقاط ما قبل الفهرسة.
- إضافة 5 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط لكل عينة الذيل بالحمض النووي.
- إضافة 5 ميليلتر من الحل فهرس التقاط قبل المناسبة لكل عينة.
- ختم الآبار ومزيج دقيق من فورتيكسينج عن 5 س بإيجاز أجهزة الطرد المركزي هذه العينات.
- احتضان هذه العينات في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في cycler حرارية وثم اضغط على 4 درجة مئوية. عدم استخدام غطاء دافئ.
- تنقية العينات مع مجموعة تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
- تضخيم المكتبة المفهرسة.
- إعداد حجم مناسب قبل التقاط بكر رد فعل مزيج من طريق خلط 1 ميليلتر من "التمهيدي مزيج" و 25 ميليلتر من مزيج PCR ماجستير. تخلط جيدا في خلاط دوامة.
- الجمع بين 26 ميليلتر من خليط التضخيم في آبار منفصلة من صفيحة بكر وميليلتر 24 من كل عينة مكتبة جدنا المفهرسة.
- تشغيل برنامج PCR مع الخطوات التالية: 98 درجة مئوية لمدة دقيقة 2، 5 دورات في 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 s و 72 درجة مئوية 1 دقيقة وتمديد نهائي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 10 عقد العينات عند 4 درجة مئوية.
- تنقية العينة مع مجموعة تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
- تقييم جودة مع بيواناليزير وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
- تجميع عينات الحمض النووي مفهرس التهجين
- لكل تجمع رد فعل الالتقاط، تجمع بين ملائمة حجم كل عينة مكتبة جدنا المفهرسة في بئر واحدة من صفيحة PCR. على سبيل المثال، للإنسان أو مكتبات التقاط جميع إكسون الماوس، ضم مكتبات 8 كل مجموعة باستخدام 187.5 نانوغرام لكل مكتبة مفهرسة. تأكد من أن كل تجمع رد فعل الاستيلاء النهائي يحتوي على 1,500 نانوغرام جدنا المفهرسة.
- تقليل الحجم في كل جيدا إلى < ميليلتر 7 استخدام مركز فراغ. تجنب جفاف العينة تماما.
- أضف كمية كافية من المياه خالية من نوكلاس لكل تجمع جدنا مركزة لتحقيق حجم جيدا النهائي 7 ميليلتر ودوامه ثم لوحة تحتوي على جدنا لقوة الطرد المركزي س. 30 في زيادة أو نقصان الطرد المركزي أو لوحة صغيرة لجمع السائل في الجزء السفلي من الآبار.
- تهجين برك مكتبة جدنا إلى "مكتبة التقاط"
- لكل تجمع جدنا ميليلتر 7 مفهرسة، إضافة 9 ميليلتر لمنع المزيج. "الماصة؛" صعودا ونزولاً المزيج.
- كاب الآبار ونقل لوحة مختومة تحتوي على جدنا إلى cycler الحرارية واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم أنه عقد في 65 درجة مئوية. تأكد من أن اللوحة يقام في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
- إعداد مناسبة إضعاف "كتلة رناسي"، استناداً إلى حجم المكتبة التقاط (10 ٪ تمييع لمكتبات < تمييع 3.0 ميغا بايت و 25% للمكتبات > 3.0 ميغابايت).
- وفقا "حجم المكتبة التقاط"، الجمع بين كمية مناسبة من "القبض على مكتبة" وتمييع الحل "كتلة رناسي" في صفيحة بكر أبقى على الجليد. مزيج جيد من قبل بيبيتينج. لمكتبات التقاط < 3.0 ميغابايت، استخدام 2 ميليلتر من مكتبة و 5 ميليلتر من "كتلة رناسي" في التخفيف 10 ٪. لالتقاط المكتبات > 3.0 ميغابايت، استخدام 5 ميليلتر من مكتبة و 2 ميليلتر من "كتلة رناسي" في تخفيف نسبة 25 في المائة.
- إضافة 37 ميليلتر من "التهجين المخزن المؤقت" لكل بئر يحتوي على 7 ميليلتر من مزيج "التقاط كتلة" المكتبة/رناسي. مزيج جيد من قبل بيبيتينج والطرد المركزي باختصار لوحة تحتوي على المزيج.
- الحفاظ على لوحة تجمع جدنا عند 65 درجة مئوية أثناء استخدام ماصة متعددة القنوات نقل ميليلتر 44 أسرة "مكتبة التقاط" خليط من الخطوة 3.7.5 لكل نموذج جيد لصفيحة بركة جدنا. مزيج جيد من قبل بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً 8 إلى 10 مرات.
- ختم الآبار مع قبعات قطاع القبة. تأكد من أن يتم إغلاق جميع الآبار تماما. ضع حصيرة ضغط على لوحة بكر في cycler الحرارية.
- احتضان هذا الخليط التهجين عن 24 ساعة عند 65 درجة مئوية. ملاحظة: العينات قد تهجين ليصل إلى 72 ساعة، ولكن يجب التحقق من أن التهجين الموسعة لا يسبب تبخر واسعة في الآبار عينة.
- إعداد حبات مغناطيسية المغلفة ستريبتافيدين
- بريوارم أغسل المخزن المؤقت 2 عند 65 درجة مئوية في كتلة مياه حمام أو الحرارة.
- قوة ريسوسبيند الخرز المغناطيسية ستريبتافيدين في خلاط دوامة. تسوية الخرز المغناطيسي أثناء التخزين.
- لكل عينة التهجين، إضافة 50 ميليلتر من الخرز ريسوسبينديد إلى الآبار لصفيحة PCR.
- أغسل الخرز وريسوسبيند لهم في 200 ميليلتر من "المخزن المؤقت ملزم".
- التقاط من الحمض النووي المهجن استخدام الخرز ستريبتافيدين.
- تقدير وسجل حجم الحل التهجين التي لا تزال بعد الحضانة ح 24.
- الحفاظ على لوحة التهجين عند 65 درجة مئوية، واستخدام ماصة متعددة القنوات لنقل وحدة التخزين بأكملها (حوالي 60 ميليلتر) من كل خليط التهجين إلى الآبار صفيحة تحتوي على 200 ميليلتر من حبات ستريبتافيدين غسلها. مزيج جيد من قبل بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً 3 إلى 5 مرات.
- كاب الآبار واحتضان لوحة الالتقاط في خلاط نوتاتور أو ما يعادلها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من بشكل صحيح يتم خلط العينات في الآبار.
- الطرد المركزي باختصار لوحة الالتقاط في زر الزيادة ونقصان للطرد المركزي أو لوحة صغيرة.
- وضع لوحة الالتقاط في فاصل مغناطيسي لجمع الخرز من التعليق. إزالة وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الخرز في 200 ميليلتر ليغسل المخزن المؤقت 1. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً حتى حراكه الخرز الكامل.
- بإيجاز للطرد المركزي في زر الزيادة ونقصان للطرد المركزي أو لوحة صغيرة.
- وضع اللوحة في الفاصل المغناطيسي.
- انتظر الحل لمسح، ثم إزالة وتجاهل المادة طافية.
- بعد التقاط عينة معالجة لتسلسل متعدد
- إعداد حجم مناسب من مزيج تفاعل PCR بخلط ما يلي: المياه خالية من نوكلاس ميليلتر 9، 25 ميليلتر ميكس ماجستير و 1 ميليلتر التمهيدي مزيج وفقا للعدد من إيضاحات مسهبة. خلط جيدا باستخدام خلاط دوامة والحفاظ على الجليد.
- لكل رد فعل التضخيم، ضع 35 ميليلتر من خليط تفاعل PCR من الخطوة 3.10.1 في آبار صفيحة PCR.
- ماصة كل العينات تجمع مكتبة تم التقاطها حبة زمنياً صعودا وهبوطاً للتأكد من أن تعليق حبة متجانسة.
- إضافة 15 ميليلتر من كل تعليق حبة بركة مكتبة تم التقاطها إلى الخليط تفاعل PCR المناسبة جيدا. مزيج دقيق من بيبيتينج حتى يتم تعليق حبة متجانسة.
- ضع لوحة أعدت في النقطة 3.10.2 في cycler حرارية وتشغيل البرنامج التضخيم PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة دقيقة 2, 8 إلى 11 دورات في 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية عن 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، متبوعة بملحق نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. عقد العينات عند 4 درجة مئوية.
- تنقية العينة مع تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
- تقييم جودة مع بيواناليزير وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
- إعداد العينات لمتعدد التسلسل
ملاحظة: العينات المخصب النهائية التي تحتوي على تجمعات المكتبات المفهرسة أما 8 أو 16، استناداً إلى حجم "مكتبة التقاط" وينتج عن ذلك قبل التقاط تجميع استراتيجية. إجمالي عدد المكتبات المفهرسة التي قد يكون متعدد في ممر تسلسل واحد يتحدد بمواصفات الإنتاج من منهاج العمل المستخدمة، جنبا إلى جنب مع كمية تسلسل البيانات المطلوبة "المكتبة التقاط".- حساب عدد الفهارس التي يمكن الجمع بين كل حارة، وفقا لقدرة النظام الأساسي. إجمالي عدد المكتبات المفهرسة التي قد يكون متعدد في ممر تسلسل واحد يتحدد بمواصفات الإنتاج من منهاج العمل المستخدمة، جنبا إلى جنب مع كمية تسلسل البيانات المطلوبة "المكتبة التقاط". على سبيل المثال، لمكتبة v5 "إكسون جميع البشر"، هو 4 غيغا بايت من "البيانات تسلسل أوصى" كل "مكتبة مفهرسة" وأوصى تسلسل البيانات كل "تجمع" ما قبل التقاط 32 جيجابايت (8-فهرس برك).
- التسلسل في المكتبات.
- تحميل المكتبات على منصة تسلسل الجيل القادم لاختيار وتنفيذ تسلسل تشغيل وفقا لمواصفات الصك.
- تحليل عزمي تسلسل البيانات.
- تشغيل خط الأنابيب والبرنامج المفضل للاتصال الأساسي. على سبيل المثال، استخدم ستامبي لخريطة ما يلي:20، وإزالة التكرارات مع بيكار (http://broadinstitute.github.io/picard/) وتحديد النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة والإدراج أو الحذف من القواعد (إينديلس) مع خلد الماء21. تصفية المتغيرات مترادفين، وتلك التي لوحظت في تردد اليل < 5% والبيانات مقارنة مع تلك من اكسوميس الوالدين لتحديد المتغيرات حيثياته .
4-بلازميد الحمض النووي التحضير انهانسر في الرحم
- تصميم عدة دبوس الشعر القصير الكشف (شرناس) تستهدف أما تسلسل الترميز أو 3 ' UTR الجينات المرشحة كما هو موضح سابقا22.
- لمنع إيقاف الهدف اختبار آثار خصوصية شرناس بالبحث عن الانفجار ضد قواعد البيانات باستخدام الطرق القياسية. استبعاد شرناس عرض أكثر من 50% تكامل مع جينات الفئران الأخرى.
- النوكليوتيد استنساخ تعتيق إلى ناقل mU6-برو كالموصوفة سابقا23.
- تنقية بلازميد الحمض النووي مع ماكسي الإعدادية طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة، وجعل تركيز نهائي من 3 ميكروغرام/ميليلتر.
- الكوة ميليلتر 20 من الحمض النووي (0.5 ملغ/مل بكاجس-التجارة والنقل أما وحدها أو مع 1.5 ملغ/مل من شرنا بناء) وإضافة 2 ميليلتر من سرعة الخضراء صبغة (2 مغ/مل) للسماح بالرصد البصري للحقن.
5- في الرحم انهانسر
-
إجراء العمليات الجراحية
- تخدير E15.5 الحوامل إناث الفئران (E0 يعرف أنه يوم تأكيد للتوصيل المهبلية الحاملات للحيوانات المنوية)، باستخدام مزيج مع خليط من الكيتامين/إكسيلازيني (0.1 و 0.01 ملغ في الجسم الوزن، على التوالي)، الذي يعطي عن طريق داخل حقن مخدر التعريفي.
- تأكد من أن الحيوان تخديره هو تماما بملاحظة اختفاء منعكس قرصه أخمص القدمين.
- يحلق أسفل البطن للحيوان باستخدام ماكينة إزالة الفراء. تطهير الجلد باستخدام الدعك بوفيدون والكحول 70%. تطبيق مرهم طبيب بيطري في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- ضع الحيوان على مصدر حرارة ووضع ثني عقيمة (مع نافذة مفتوحة من 4-5 سم في الوسط) عبر موقع شق. ارتداء معطف مختبر وقبعات، فاسيماسكس والقفازات الجراحية المعقمة. الاحتفاظ بالعقم حتى نهاية عملية جراحية.
- باستخدام مقص حاد شق عمودي (2-2.5 سم) في الجلد على طول خط الوسط في البطن والذيلية وتجعل ثم شق جدار العضلات تحت الجلد – أيضا من 2.5 سم – على طول خط الوسط.
- كشف القرن الرحم واحد من تجويف البطن بعناية. إسقاط 37 درجة مئوية قبل حرارة المحلول الملحي العادي لترطيب الأجنة. إبقاء الرحم رطبة طوال الوقت.
-
حقن الحمض النووي وانهانسر
- عقد واحد من قرون الرحم بلطف مع الملقط الحلقية وادفع واحد الجنين بجدار الرحم. عقد الجنين في جهة ومع إدراج اليد الأخرى بعناية الزجاج الشعيرات الدموية 1 مم من خط الوسط في البطين الجانبي الأيسر (2-3 مم العميق) وتضخ حوالي 1 ميليلتر من الحمض النووي مع "الأخضر سريع" للسماح بالرصد البصري لاستخدام حقن ميكروينجيكتور.
- قطره المحلول الملحي العادي على سطح الأقطاب الكهربائية2 3 × 7 ملم. ضع مسرى العقيمة الإيجابية على الجانب المحقون (البطين الجانبي الأيسر) ومسرى العقيمة السلبية في البطين الأيمن. تسليم النبضات الكهربائية 5 في فترات 950 مللي ثانية مع دواسة القدم تسيطر (4000 وسط مكثف تحمل 40 الخامس مع اليكتروبوراتور).
-
إجراءات انهانسر بوست
- إعادة وضع ابواق الرحم إلى تجويف البطن، وإضافة قطرات المحلول الملحي العادي إلى تجويف للسماح للأجنة في وضع أكثر من الطبيعي وحساب فقدان السوائل الموضعية.
- إغلاق جدار البطن العضلات مع خيوط جراحية قابلة للامتصاص، ثم الجلد باستخدام غرزة توقف بسيطة.
- وضع الفئران مرة أخرى إلى القفص ومراقبة الحيوان حتى يتضح من التخدير.
- لعلاج الآلام إدارة البوبرينورفين (0.03 مغ/كغ) للحيوان عن طريق حقن تحت الجلد كل ح 8-12، ليصل إلى 48 ساعة.
6-إعداد نموذج الدماغ
-
أسلوب التثبيت
- التضحية الفئران الحوامل 5 أيام بعد العملية الجراحية باستخدام غاز التخدير (إيسوفلوراني) متبوعاً تفكك سريع عنق الرحم.
- جعل شق عمودي لإعادة فتح تجويف البطن.
- فضح ابواق الرحم وإزالة الأجنة من الرحم وقطع رأس لهم باستخدام مقص حاد.
- إزالة الدماغ مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة: باستخدام مقص حاد، جعل شق صغير على طول الخلفي (المخيخ)/المحور الأمامي (لمبات أولفاكتيفي) رئيس لاختراق الجلد والجمجمة، ثم باستخدام زوج من الملقط قشر خارج الجمجمة لفضح الدماغ وإزالته باستخدام ملعقة صغيرة.
- تزج العقول بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في نسبة 4% بارافورمالدهيد في 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS).
-
تقطيع الدماغ
- غسل أدمغة في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
- تضمين العقول في أجار 4 ٪ في تضمين قوالب من البلاستيك.
- إعداد 50 مل أجار 4% في برنامج تلفزيوني x 1 لتضمين أدمغة الأجنة 5. التأكد من أن [اغروس] الذائبة في أي أكثر من 50 درجة مئوية.
- تبقى العقول في [اغروس] بلمرة ح 1 على الأقل في 4 درجات مئوية. إزالة الزائدة [اغروس] حول الدماغ.
- الصق في الدماغ للصفيحة القاعدية فيبرتوم، موجهة نحو ذلك المحور الأمامي/الخلفي للدماغ عمودي على الشفرة. انتظر لبضع دقائق للغراء لتجف ووضع اللوحة بالدماغ ملتصقاً في قاعة فيبرتوم.
- ملء فيبرتوم مع برنامج تلفزيوني 1 x. شريحة 100 ميكرومتر سميكة المقاطع.
- نقل شرائح المخ على الشرائح وإزالة السائل الزائد وإضافة بضع قطرات من تصاعد المتوسطة ومكان ساترة على رأس العقول
7-[كنفوكل] التصوير والتحليل الكمي
- واسمحوا تصاعد الجافة المتوسطة بين عشية وضحاها من قبل التصوير. أقسام الصورة في 10 X في مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
- باستخدام البرمجيات لتحليل الصورة الكمية، تحويل الصورة في 8-بت، حدد خلية واحدة على الممثل بروتينات فلورية خضراء إيجابية فلورسنت ويدويًا تحديد شكله. للقيام بذلك، انقر فوق "التقدير" ورسم حدود الخلية باستخدام أداة التحديد اليدوي. في هذا يتم الاحتفاظ طريقة القطر وعتبة كثافة الخلية تلقائياً من قبل البرنامج.
- انقر فوق "البحث عن خلايا" للسماح للبرنامج لتعريب transfected الخلايا في جميع أنحاء القشرة. ثم، إذا لزم الأمر، يدوياً إزالة المغلوطة.
- تقسيم كامل سمك القشرة إلى 8 مجالات الاهتمام التي طبعت في المقاطع الفردية. لتحقيق هذا الهدف، انقر فوق "أداة المنطقة"، حدد "خطوط المنطقة" 8 حيث الأول (1) وآخر (8) تتوافق مع المشارب VZ والجزء العلوي من حزب المحافظين على التوالي. انقر فوق "تطبيق" للسماح للبرنامج لحساب الموضع النسبي للتجارة والنقل transfected الخلايا في قشرة كله. وأخيراً انقر على "حفظ التحديد الكمي" لتصدير البيانات في ملف Excel للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هو لخص استراتيجية تجريبية تهدف إلى التعرف على الجينات المسببة MCD الجديدة في الشكل 1.
قبل تنفيذ CGH الصفيف في مجموعة مرضى 155 بتشوهات الدماغ إنمائية مغايرة الجمع بين يتبعها (الشكل 2A)، وخلل تكون كلثوم الإحضار، كولبوسيفالي، ونقص تنسج الدماغ وبوليميكروجيريا المرتبطة بالصرع، ترنح و ضعف الإدراك، وقد حددنا حذف حرجة دنيا 1.2 ميغا بايت في 6q27 تتقاسمها 12 مريضا (الشكل 2)21. منطقة الجينوم يحتوي على أربعة جينات معروفة (THBS2، PHF10، TCTE3 و DLL1) وهما توقع الجينات (WDR27 و C6orf70) (الشكل 2).
بالتوازي مع صفيف CGH، ويس في 14 مرضى يتبعها الثنائية معزولة ولا يوجد تحليل "الاختلافات عدد نسخ" قد أجرى التحليل، تحديد مريض واحد مع طفرة حيثياته (c.752T > ج: pIle250Asn) في (الجين C6orf70 المتوقعة بنك الجينات انضمام عدد NM_018341.1) (الشكل 3).
للتأكد من أن الطفرة حددت في C6orf70 دور المسبّب للمرض في هايتي والتحقيق في ما إذا كان هابلوينسوفيسينسي جينات أخرى رسم الخرائط في 6q27 قد تؤثر النمط الظاهري، دور في فيفو على الهجرة العصبية تم استكشاف استخدام في الرحم نهج ضربة قاضية بوساطة [رني]23،24 لإسكات التعبير عنها في الفئران المتكفل العصبية القشرية. تم اختبار الجينات فقط في قشرة الفئران النامية، PHF10، C6orf70 و DLL1، وأعرب عن (الشكل 4 أ). دبوس الشعر القصير مختلفة الكشف (شرناس) تم إنشاؤها في استهداف الترميز تسلسل هذه الجينات الثلاثة. شرناس ثم أدخلت في نيوروبروجينيتورس في اللحاء الجديد الفئران التي في الرحم انهانسر الجنينية يوم 15 (E15)، عندما يتم إنشاء الخلايا العصبية التي ارتكبت للطبقات القشرية العليا. البروتينات الفلورية الخضراء كمراسل تعداء. التوزيع النسبي للتجارة والنقل-إيجابية الخلايا تم فحص خمسة أيام بعد انهانسر. ضربة قاضية ل Dll1 و Phf10 أدى إلى تأخير طفيف للهجرة العصبية شعاعي (البيانات لا تظهر)، بينما ضربة قاضية من C6orf70 البصر الهجرة العصبية، وأدت إلى تطوير العقيدات هيتيروتوبيك عالية تشبه تلك التي لوحظت في فلنا النموذجي ضربة قاضية (الشكل 4)24. على العكس من ذلك، كان ترانسفيكشنز مع شرنا C6orf70 غير فعالة على عدم تطابق لا أثر واضح على الهجرة العصبية (الشكل 4 باء).
رقم 1: سير العمل للتعرف على رواية MCD تحديد الجينات المسببة. التمثيل التخطيطي للنهج المختلفة التي يمكن استخدامها لتحديد المرض رواية تسبب الجينات. المربعات الملونة في الأصفر وتمثل النهج المبينة في هذه الورقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الحذف 6q27 تسبب نمو الدماغ الشاذة مع يتبعها. (أ) المريض 2. أقسام T1 وزن محوري (اللوحة اليمنى) عرض يتبعها بطانة جدار الفص الصدغي الأيمن (السهم الأسود والأبيض) أدناه قشرة جزر تكشفت ووزنه T2 coronal (اللوحة اليمنى). (ب) المريض 11. T1 المرجحة الاكليلية القسم، تظهر العقيدات هيتيروتوبيك الثنائية على طول الجدران لقرون الزمانية (رؤوس بيضاء). (ج) المريض 12. قسم الاكليلية وزنه T2. على اليسار، يتبعها لا تزال مرئية (السهم الأسود) وهي متسعة في البطينين. (د) التمثيل التخطيطي لحذف منطقة 6q27 المحددة في المرضى يتبعها استخدام صفيف-CGH (الجزء العلوي). خطوط أفقية، متقطع تمثل العناصر المحذوفة التي تم تحديدها في المرضى. حجم الحد الأدنى الحرج حذف المنطقة يشار أيضا ويحتوي على الجينات المعروفة أربعة: THBS2، PHF10، TCTE3 و DLL1 واثنين من الجينات المتوقعة: WDR27 و C6orf70 (الجزء العلوي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ترتيب النتائج. ( ) T2 مرجح القسم المحوري لائحة يتبعها الثنائية في قرون أمامي (رؤوس بيضاء) في المريض تحمل c.752T > طفرة في C6orf70. (ب) سانغر التسلسل تبين أن الطفرة حددها ويس حدث حيثياته. يتم الإشارة إلى موقف الطفرة رؤوس سوداء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: تحليل تعبير الجينات المترجمة في المنطقة الحرجة الدنيا 6q27 وضربه قاضية C6orf70 يغير شعاعي الهجرة من الخلايا العصبية القشرية. (أ) الكمية RT-PCR عرض التعبير عن الجينات الواردة في المنطقة الحرجة 6q27 في قشرة الدماغ الفئران. واستخدمت سيكلوفيلين أ للتطبيع. (ب) أقسام الاكليلية نيوكورتيكال الممثل لأدمغة الفئران E20 5 أيام بعد انهانسر مع أما "البروتينات الفلورية الخضراء" بناء وحدها (مراقبة)، أو جنبا إلى جنب مع شرنا استهداف C6orf70 الترميز تسلسل (C6orf70-شكدس) أو مع عدم التطابق عديمة الفعالية النسبية بناء (C6orf70-شكدسم). فلنا-ضربة قاضية (فلنا-شكدس) كمراقبة الهجرة العصبية البصر. انهانسر في الرحم مع C6orf70-شكدس أو شكدس فلنا الناجم عن إلقاء القبض على خلايا الحاملات للتجارة والنقل داخل منطقة البطين (VZ) (الأسهم البيضاء)، ولم يغير شيئا حين بناء الخلايا معربا عن التجارة والنقل وحدها أو بالاقتران مع عدم التطابق الهجرة العصبية. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCDs أهم أسباب الإعاقة الفكرية وحساب 20-40 في المائة من الطفولة المقاوم للأدوية الصرع1،2. وقد تزايد الاهتمام ب MCDs هائلة خلال العقد الماضي نتيجة لعاملين رئيسيين. الأول هو التحسن في الدماغ التصوير (لا سيما التصوير بالرنين المغناطيسي)، الذي يسمح للأطباء والعلماء تصور العديد من التشوهات في الدماغ التي لا يعترف بها سابقا. والآخر هو تطور أدوات الجينية التي تسمح تحديد العديد من الجينات المسببة MCD رواية. وهذا قد طرأ تحسن معرفتنا بالآليات التي تكمن وراء نمو الدماغ ووظيفة، وسمح للمشورة الوراثية أكثر دقة.
في الماضي، ركز الباحثون جهودهم أساسا على تحديد الجينات المسببة، ترك تصميم الاختبارات الوظيفية لتوضيح دورها في نمو الدماغ في مراحل لاحقة. وقد أصبح هذا أكثر صعوبة بسبب التطور من الدراسة الاضطرابات الوراثية النادرة، والمتكررة لاضطرابات متفرقة أكثر شيوعاً للجينات التقليدية التي العثور على أساليب غير قابلة. النهج الحالي لتحديد الجينات المسببة غالباً ما تسمح بتحديد مناطق كبيرة نسبيا من الجينوم التي تحتوي على العديد من الجينات (صفيف-CGH) أو متغيرات عدة في عدد من الجينات المرشحة التي يصعب من التحقق من صحة (ويس أو الأفرقة العاملة).
ووسعت النهج الصفيف-CGH وويس (أو الأفرقة العاملة) الطيف طفرة للعديد من الاضطرابات الوراثية. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود الحرجة. على سبيل المثال، CGH صفيف يحتاج الحمض النووي عالي الجودة ويفشل لتحديد المولدة متوازنة أو الحذف/الازدواجية الصغيرة بما في ذلك تلك التي تنطوي على exons واحد أو عدد قليل من الجينات واحدة. للتغلب على هذه المشكلة، قد يقوم بدقة أعلى من التحقيق التقليدية التباعد (مثلاً باستخدام مجموعة الصفيف-CGH م 1) CGH الصفيف أو استبداله بتحليل مصفوفة SNP. ويس غالباً ما لا يغطي مناطق إينتراجينيك كبير ويفشل لتحديد الطفرات إينترونيك عميقة. وباﻹضافة إلى ذلك، التغطية قد يكون أحياناً منخفض للغاية للتعرف على الطفرات المسببة (لا سيما في حالة حدوث الطفرات مع انخفاض النسبة المئوية ل mosaicism). آخر خطوة حاسمة للمياه والتصحاح البيئي أن تحليل البيانات وتصفية ما زالت تتطلب جهدا كبيرا. لزيادة تغطية ويس، قد خفضت عدد المرضى في تجربة واحدة، أو يمكن استخدام مجموعات التقاط مختلف في نفس الوقت.
IUE هو النهج الأكثر ملاءمة تحليل أثر ضربة قاضية الجينات المتعلقة بالهجرة العصبية. ومع ذلك، إعاقة تحقيقات عن الخطوات الأخرى من القشرية التنموية، مثل الخلايا ونضج الخلايا العصبية، بعض القيود التقنية. وفي الواقع، إجراء IUE قبل E13 غالباً ما لم تنجح بينما التحقيقات في مراحل لاحقة مقيدة بارتفاع معدل الفتك بعد الولادة المرتبطة لهذا الإجراء. وبالإضافة إلى ذلك، قد تختلف كفاءة الجينات-ضربة قاضية بين اليكتروبوراتيد الأجنة مما يؤدي إلى عدم تجانس المظهرية كبيرة.
وعموما، هذا البروتوكول قد أربع خطوات حاسمة الرئيسية. على الرغم من أنها ليست جزءا من البروتوكول، المذكورة في هذه الورقة، علينا أن نشير إلى أن الخطوة الأساسية الأولى تؤخذ في الاعتبار اختيار المرضى الالتحاق بمثل هذه الدراسات. وفي الواقع، يتطلب عملية تحديد الجينات MCD الجديدة التحقيقات السريرية والتصوير في مجموعة من المرضى الذين ينبغي أن يكون النمط الظاهري متجانسة قدر الإمكان. جمع المرضى الذين يعانون من النمط الظاهري متجانسة إلى حد كبير يزيد من فرصة تحديد الطفرات المسببة في جين معين. ومع ذلك، الحد الأدنى لعدد من المرضى الالتحاق بمثل هذه الدراسات لتحقيق النجاح الصعب التنبؤ، حيث أنه يعتمد إلى حد كبير على معدل الطفرات جينات مختلفة. على سبيل المثال، للجينات مثل فلنا، الذي هو تحور في 100% حالات الأسرية ليتبعها الثنائية المرتبطة بالعاشر وفي 26% من المرضى متفرقة، عدد المرضى الذين بحاجة إلى تحديد مرات متعددة في الجينات يمكن أن تكون منخفضة نسبيا. على العكس من ذلك، عدد المرضى فحص للجينات، ومع الطفرة انخفاض معدل أعلى. على سبيل المثال، في حالة C6orf70، كنا قادرين على تحديد طفرة المسبّب واحد فقط عند فحص المرضى 64 (14 من خلال ويس و 50 من خلال التقليدية سانغر التسلسل)16، تقدير معدل الطفرات لهذه الجينات من حوالي 1.5%. الخطوة الحاسمة الثانية هو استبعاد الطفرات في الجينات MCD المعروفة كافة بغية تحديد الجينات المسببة الرواية. وبفضل ظهور تسلسل تقنيات الجيل التالي الرواية، قد يتم تنفيذ فحص تحور الجينات المعروفة والمرشح الآن في تجربة واحدة. ومع ذلك، ينبغي استخدام المتغيرات المناسبة تصفية لتجنب وجود عدد مفرط من إيجابيات كاذبة لتأكيد تجريبيا وتصفية الطفرات المسببة المحتملة. وفي الواقع، عدد الجينات المرشحة/المتغيرات مرتفع خاصة في تجارب ويس. في حالة الاشتباه في تورط جين معين، ينبغي أن يستكمل فحص التحور أيضا بتحليل قانون منع غسل الأموال، استثناء ميكروديليتيونس أو ميكرودوبليكيشنز. والنقطة الحرجة الثالثة هو حقيقة أن الصبغية ترتيبات جديدة تتأثر بشدة بموقع نقطة التوقف. وفي هذا السياق، من الجدير لاستبعاد، إلى أقصى حد ممكن، تعطل أو تشريد عناصر رابطة الدول المستقلة التنظيمية البعيدة للجينات التي لم تدرج في الحذف/الازدواج. وأخيراً، تفترض في فيفو تجارب [رني] أن الجينات المسببة تلعب دوراً مباشرا في الهجرة العصبية أثناء المراحل الجنينية. ومع ذلك، مسببات MCD، بما في ذلك هايتي، غير متجانسة والنهج في الرحم يمكن أن تفشل في الكشف عن آثار الجينات المشتركة في الخطوات الإنمائية بما في ذلك بقاء انتشار أو الخلايا العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تخفي تعقيد الدماغ القوارض منخفضة أثر ضربة قاضية أو overexpression من الجينات مرشح معين، قد تكون أكثر وضوحاً في الدماغ البشري.
ونحن نعتقد أن إدماج الدراسات الفنية علم الجينوم و في فيفو سيساعد على استحداث أدوات تشخيصية جديدة للتعرف على الجينات المسببة MCD الجديدة. يمكن أن توفر هذه الاستراتيجية الجديدة نماذج حيوانية لاختبار الأهداف العلاجية وفهم الفسيولوجيا المرضية ل MCD، التي حتى الآن كانت محدودة بعدم وجود نماذج تجريبية، ومحدودية الوصول إلى أنسجة المخ من المرضى المتضررين. فك المسارات الجزيئية التي تقترن MCD اضطرابات أيضا ستوفر معلومات جديدة قيمة حول تطور الدماغ الفيزيولوجية بشكل عام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور غ. مكجيليفراي، العلاقات العامة. ج. كلايتون-سميث، دوبينس البنك الدولي العلاقات العامة.، ستريانو ص العلاقات العامة.، و "العلاقات العامة أي" شيفر، روبرستون ل. س العلاقات العامة. والأمير S.F. بركوفيتش لتزويد المرضى MCD. ونشكر الدكتور ميشال واو ودال مي للمشورة التقنية والمساعدة. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من "البرنامج الإطاري سبعة" من الاتحاد الأوروبي، والرغبة في المشروع، والعقد رقم: الصحة-F2-602531-2013، (إلى الخامس، النمو الحقيقي، أ. ر.، والعربية، وجيم)، INSERM (إلى أ. ر. وجيم)، ومؤسسة جيروم لوجون (R13083AA A.F و E.P.P و C.C) و منطقة بروفنس الب كوت دازور (APO2014-DEMOTIC A.A.D وجيم). D.A.K هو "محقق الشباب التطريز" ومعتمد من قبل FWF المنح (I914 و P24367).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
- Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
- Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
- Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
- Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
- Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
- Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
- Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
- Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
- van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
- Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
- Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
- Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
- Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
- Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
- Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
- Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
- Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
- Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
- Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
- Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
- Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).
