Summary
Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.
Abstract
מומים מולדים המערבות קליפת המוח – המכונה גם מומים של פיתוח בקליפת המוח (MCD) — הם גורמים חשובים מוגבלות ועל חשבון עבור 20-40% של אפילפסיה עמידים לתרופות בילדות. הדמיה מוחית ברזולוציה גבוהה הנחתה ויוו זיהוי של קבוצה גדולה של פנוטיפים MCD. למרות ההתקדמות הדמיה מוחית, אנליזה גנומית, דור של מודלים בעלי חיים, זרימת עבודה פשוטה כדי לקבוע עדיפויות באופן שיטתי של המועמד גנים, כדי לבדוק את ההשפעות פונקציונלי של מוטציות בשם חסר. כדי להתגבר על בעיה זו, אסטרטגיית ניסיוני המאפשרים הזיהוי של הרומן גנים סיבתי עבור MCD פיתח, לאמת. אסטרטגיה זו מבוסס על זיהוי אזורים גנומית המועמד או גנים באמצעות מערך-CGH או כל-exome רצף ואפיון את ההשפעות של איון שלהם או של ביטוי של מוטציות ספציפיות בפיתוח המוח מכרסמים באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה. גישה זו הובילה הזיהוי של הגן C6orf70 , קידוד עבור חלבון בשם vesicular, בפתוגנזה של הטרוטופיה קשרי periventricular, MCD הנגרמת על ידי הגירה העצבית פגומה.
Introduction
קליפת המוח ממלא תפקיד מרכזי בתהליכי קוגניטיבית ואינטלקטואלית, ומעורב שליטה רגשית כמו גם בלמידה ובזיכרון. לכן זה לא מפתיע כי מחלות והפרעות פסיכיאטריות רבות תוצאה של מומים של פיתוח בקליפת המוח (MCD). האטיולוגיה של MCD מורכבים מאז רכשה, מעורבים גורמים גנטיים. השכיחות המצטברת של שיעור נקבע גנטית MCD היא כ- 2% והם סדיר ברוב המקרים. למשל, השכיחות של מוח מולדים dysgenesis נאמד להיות גבוה מ- 1% באוכלוסייה האנושית ולאחר כמה צורות של MCD הם נצפו יותר מ 14% של כל חולי אפילפסיה ו- 40% של אפילפסיה חמורה או סורר1, 2.
Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) הוא אחד MCDs הנפוצה ביותר והיא נגרמת על ידי העברה חריגה של נוירונים מאזור חדרית (VZ) אל קליפת המוח המתפתח. הכשל של נוירונים להעברת תוצאות אשכולות של נוירונים הטרוטופי לאורך קירות החדרים הצדדיים אשר בדרך כלל ניתן לאבחן באמצעות תהודה מגנטית (MRI). המאפיינים הקליניים, אנטומי, הדמיה של PNH הם הטרוגנית. גושים עשויים לנוע בין קטן ולא חד-צדדי דו צדדיות ולא סימטרי. Sequelae קליניים נפוצים כוללים לקויות אפילפסיה אינטלקטואלי3. מוטציות בגן Filamin A (או FLNA), אשר מפות ב Xq28, נמצאו ב- 100% מהמשפחות עם X-linked PNH הדו-צדדיים וב -26% של חולים סדיר3,4. צורה נדירה, רצסיבי של PNH נגרמת על ידי מוטציות בגן ARFGEF2 , אשר מפות ב- 20q13, דווח בשתי משפחות consanguineous5. לאחרונה, biallelic מוטציות בגנים קידוד הזוג קדהרין קולטן-ליגנד DCHS1 ו- FAT4 זוהו ב תשעה חולים מושפע על ידי הפרעה multisystemic הכולל PNH6. PNH הייתה קשורה גם שביר X תסמונת7, תסמונת וויליאמס8, תסמונת microdeletion 22q119, כפילויות ב 15 p 510, מחיקות-1 p 3611, 5q14.3-q1512, p 6 2513 6q מחיקה מסוף תסמונת14,15,16,17,18,19, רומז כי גנים סיבתי נוספים פזורים ברחבי הגנום. עם זאת, כ- 74% מהחולים PNH סדיר בסיס גנטי נשאר עד מבואר17.
מיפוי גנים קלאסית גישות כמו מערך הכלאה גנומית השוואתית (מערך-CGH) הוכיחו להיות כלים רבי-עוצמה הגילוי של תת-מיקרוסקופיים העיוותים כרומוזומלית, אולם האזורים גנומית מזוהה באמצעות גישה זו הם לעיתים קרובות גדולים מכילים גנים רבים.
כניסתו של רצף מקביל מסיבית טכניקות (כלומר רצף שלם-Exome (ווס) ואת כל הגנום רצפי (WGS)) הפחיתה באופן משמעותי הן את העלות והן את הזמן הנדרש כדי רצף של exome האנושי כולו או גנום. יחד עם זאת, הפרשנות של ווס ונתונים WGS נותר מאתגר ברוב המכריע של המקרים, מאז עבור כל גרסאות החולה עשרות עד מאות (או אפילו אלפים, תלוי מתוך הסוג של ניתוח) מגיחים סינון נתונים.
כדי להאיץ את התהליך של זיהוי הרומן גנים סיבתי של MCD, אסטרטגיה שיטתית חדשניים המשלבים CGH מערך, ווס, בתוך הרחם ההקרנה אלקטרופורציה (הצמיגים) של המועמד גנים תוכנן. . הצמיגים מאפשר להשבית באופן סלקטיבי (או overexpress) גנים ספציפיים או מוטציות במוח מכרסמים, ראפיד הערכה מעורבותן18,corticogenesis19. RNAi בתיווך מצרי-נוקאאוט או ביטוי של גנים מועמד אחד או יותר צפוי לגרום, כאשר הגן מזוהה עם התפתחות המחלה, פגמים מקומי הגירה העצבית ו/או התבגרות. על זיהוי גנים של מי איון (או ביטוי) מתרבה על פנוטיפ אצל חולים בחולדות, הוא הופך להיות מועמד מצטיינים להקרנה בחולים סדיר עם MCD. באמצעות גישה זו, אנחנו חשפה לאחרונה את התרומה מכריע של הגן C6orf70 (הידוע גם בשם ERMARD) ב- PNH פתוגנזה בחולים יקולל מחיקות כרומוזומלית 6q2716.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אתיקה במשפט: חולדות Wistar היו הזדווגו ומתוחזק בשימוש במתקני בעלי חיים INMED, מסכים עם החקיקה באיחוד האירופי וצרפתית.
1. DNA החילוץ, כימות מערך-CGH, ווס
- תמצית הדנ א (gDNA) של דם אנושי לויקוציטים מחולים באמצעות רובוט אוטומטי של בידוד דנ א או זמינים מסחרית ערכות חילוץ ידני הדנ א על פי הפרוטוקול של היצרן. לכמת כל דוגמאות שימוש ספקטרופוטומטרים.
2. מערך-CGH פרוטוקול
-
עיכול הגבלה של gDNA
- כפול תקציר 500 ננוגרם של מטוהרים gDNA חולה, פקד האנושי זמינים מסחרית DNA עם RsaI ו- AluI עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש μl 0.5 של האנזים U/μL 10 עבור כל תגובה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 65 ° C בטל האנזימים ולעבור הצינורות דגימת קרח.
-
Labelling מדגם
- להוסיף נפח מתאים של תחל אקראי הדרושים עבור התבנית microarray בשימוש כדי כל שפופרת התגובה (למשל 5 µl עבור מיקרו-מערכים 1-pack 2-pack, רביעיית). מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות.
- להעביר צינורות מדגם הצנטרפוגה תרמי. דגירה 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- להכין cyanine 3 ואחת אחת cyanine 5 Labelling מיקס מאסטר על הקרח על ידי ערבוב אמצעי האחסון הבאים: 10.0 µl 5 X תגובת מאגר, x dNTPs µl 10 5.0, 3.0 µl Cyanine 3-dUTP או Cyanine 5-dUTP, µl 1.0 Exo (-) Klenow האנזים, µl 2.0 נוקלאז ללא מים. בחר את הנפח של כל מגיב על פי התבנית microarray בשימוש.
- להוסיף את תערובת מאסטר Labelling כל שפופרת התגובה המכיל את gDNA. מערבבים היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
- להעביר צינורות מדגם הצנטרפוגה תרמי ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לשמור את הדגימות-4 מעלות צלזיוס.
-
טיהור של gDNA עם תוויות ברורות
- להוסיף µl 430 של טה 1 x (pH 8.0) כל שפופרת התגובה.
- למקם את עמודת טיהור צינורות אוסף 2 מ"ל, תוויות העמודות כראוי. לטעון את כל gDNA עם תוויות ברורות על עמודה טיהור.
- צנטריפוגה 10 דקות-14,000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה דרך ולמקם את העמודה בחזרה בצינור אוסף 2 מ"ל.
- להוסיף µL 480 1 x TE (pH 8.0) של כל אחת מהעמודות. צנטריפוגה 10 דקות-14,000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה דרך.
- היפוך העמודה לתוך טריים mL 2 אוסף שפופרת צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 1000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר כדי לאסוף דגימת מטוהרים.
- להביא את אמצעי האחסון מדגם ביקש עבור התבנית microarray בשימוש באמצעות רכז או הוספת x 1 TE (pH 8.0). לדוגמה, עבור 1-חבילת microarray להביא את אמצעי האחסון ל- 80.5 µL. דגירה המדגם על קרח למשך 5 דקות, ואז pipette את הפתרון לכל אורך 10 פעמים.
-
הכנת gDNA עם תוויות ברורות של הכלאה
- לשלב דוגמאות בדיקה ועיון באמצעות cyanine המתאים התווית על-ידי 5 מדגם cyanine התווית על-ידי 3 מדגם צינור טריים mL 1.5 ללא RNase. לדוגמה, עבור 1-חבילת microarray להבטיח כי אמצעי האחסון הסופי הוא 158 µL. בחר את הנפח של כל דגימה על פי התבנית microarray בשימוש.
- להשתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד תפוקה, מידת פעילות labelling או ספציפי על-ידי מדידת את ספיגת A260 ננומטר (DNA), A550 nm (cyanine 3), וכן A650 nm (cyanine 5).
- חישוב תשואה תוך שימוש בנוסחה: [DNA concentration(ng/µl) x נפח דגימה (µl)] / 1,000 (ng/µg). לחשב את פעילות ספציפית באמצעות הנוסחה: pmol לכל µl של צבע/µg לכל µl של gDNA.
הערה: לדוגמה, עבור µg 0.5 של קלט ה-DNA, התשואה צריכה להיות µg 8 עד 11, פעילות ספציפית (pmol/µg) אמור להיות 25 עד 40 עבור Cyanine-3 מתויג ולדגום 20 עד 35 עבור המדגם שכותרתה Cyanine-5.
- חישוב תשואה תוך שימוש בנוסחה: [DNA concentration(ng/µl) x נפח דגימה (µl)] / 1,000 (ng/µg). לחשב את פעילות ספציפית באמצעות הנוסחה: pmol לכל µl של צבע/µg לכל µl של gDNA.
- כדי להכין את הכמות של מיקס מאסטר הכלאה הדרושים עבור התבנית microarray בשימוש, לערבב את ריאגנטים הבאים: 50 µL מתקפלת-1 DNA (1.0 mg/ml), 52 µL 10-aCGH הסוכן חסימת ו- 260 µl 2 x מאגר הכלאה HI-סל ד.
- להוסיף נפח מתאים של המיקס הכלאה מאסטר הצינור ml 1.5 ללא RNase המכיל את gDNA עם תוויות ברורות כדי להשיג את הנפח הכולל הנדרש עבור התבנית microarray בשימוש. לדוגמה, עבור microarray 1 pack, ודא שעוצמת הסופי עבור כל תגובה 362 µl.
- לערבב את הדגימה על-ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז במהירות צנטריפוגה ב 14,000 x g, תקופת דגירה של 3 דקות ב 95 ° C ו- 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
-
הכלאה והאסיפה צ'יימברס
- לטעון שקופית אטם נקי לתוך הבסיס קאמרית עם אטם את התווית פונה כלפי מעלה, מיושר עם המקטע מלבני של הבסיס קאמרית. ודא כי השקופית אטם מיושר עם הבסיס קאמרית אינה פתוחה.
- לוותר על התערובת מדגם הכלאה על הבאר gasket, מוודא כי המדגם מופץ בצורה אחידה.
- . תניח שקופית microarray על גבי השקופית אטם הערכת הכריך-הזוג מיושר כראוי לאחר מכן, להרכיב את התא התגובה לשים המכסה על השקופיות sandwiched על יד-הידוק המלחציים.
- ודא שקופיות משתין על-ידי סיבוב תא שהורכב אנכית. ודא כי בועות אינם נוכחים בבית הבליעה. במקרה הצורך, הקש על מכלול על משטח קשה להזיז את בועות נייח.
- הכניסו הצ'יימברס שקופית שהורכב מתלה מסובב להגדיר כדי לסובב במהירות של סל ד 20. לשים את התא הכלאה בתנור, לבצע הכלאה ב 65 ° C h 24 או 40 על פי התבנית microarray בשימוש.
-
כביסה Microarray וסריקה
- להוציא הכלאה קאמרית תנור ויציפו אותה במאגר שטיפת 1. המשך פירוק שלה.
- הסר את השקופית microarray, להכניס את זה לתוך ארון שקופית במאגר שטיפת 1 בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את השקופית מערך עבור חמש דקות עם ערבוב (להשתמש הפשפשים ו של פגים). כוון את מהירות קדירות להגדרה של 4 (מהירות בינונית), כדי לקבל טוב אבל לא יותר מדי נמרצת ערבוב.
- לשטוף את השקופית מערך במאגר לשטוף 2 עבור ערבוב s 90. בעדינות להתאושש השקופית המאגר (זה אמור לצאת יבש) לטעון אותו לתוך מחזיק שקופיות בסיועם של מגן שקופיות.
- לטעון את השקופית לתוך הסורק מערך ולבצע סריקה לפי הוראות היצרן מערך.
- לנתח את התוצאות תוך שימוש השזורות בתוכנת מסופק עם הסורק בשימוש על פי הוראות היצרן (V.9.1.3.1).
3. ווס פרוטוקול
- היעד העשרה
- להשתמש את dsDNA BR Assay כדי לקבוע הריכוז של הדגימה gDNA לפי הפרוטוקול כלי נגינה.
- לדלל 5 µg באיכות גבוהה כפולה גדיל DNA עם 1 x נמוך טה מאגר של צינור bind נמוך 1.5 mL הנפח הכולל של 50 µL.
- להגדיר את sonicator ושם microtube של תחנת טעינה ופריקה של-פי הוראות היצרן. תסתום את הפה ברכבת התחתית
- לאט לאט להעביר את דגימת דנ א 50 µl דרך septa מראש לפצל ללא היכרות עם בועות.
- הטיית ה-DNA בהתאם להגדרות הציע מיצרן של sonicator והערכת איכות שימוש של Bioanalyzer על פי הוראות היצרן. המטרה גודל מקטע ה-DNA היא 150-200 bp.
- תיקון ה-DNA מסתיים
- להכין את תערובת התגובה סוף תיקון על ידי ערבוב µL 40 של סיום תיקון אנזים לערבב עם µL 10 של סיום תיקון Oligo מיקס. מערבבים היטב על מערבל מערבולת.
- דגירה הדגימות ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בהצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק אותם ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
- הוסף µL 50 של המיקס התגובה תיקון סוף מוכן בשלב 3.2.1 על כל µL 50 לכסנתם דנ א. טוב. מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing עדין.
- לטהר מדגם עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
- פוליאדנילציה של 3' מסתיים.
- הוסף 20 µl של מיקס מאסטר dA-עוקב כל סוף תוקן, מטוהרים דנ א (כ-20 µL).
- מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing עדין.
- דגירה הדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק את זה ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
- מצדו של מתאם יצירת אינדקס לכידת מראש.
- להוסיף 5 µL של מיקס מאסטר מצדו כל דגימת דנ א-זנב.
- להוסיף 5 µL של הפתרון המתאים של אינדקס לכידת קדם כל דגימה.
- חותם הבארות, לערבב ביסודיות על ידי vortexing על 5 ס' בקצרה צנטריפוגה הדגימות.
- דגירה הדגימות ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות הצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
- לטהר את הדגימות עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
- הגברה של הספרייה באינדקס.
- הכן האחסון המתאים של לכידת קדם PCR התגובה מיקס על ידי ערבוב µL 1 של פריימר מיקס 25 µL של מיקס מאסטר PCR. מערבבים היטב על מערבל מערבולת.
- לשלב µL 26 של תערובת הגברה בבארות נפרדים של צלחת PCR µL 24 של כל מדגם ספריית gDNA באינדקס.
- הפעלת תוכנית ה-PCR עם השלבים הבאים: 98 ° C למשך 2 דקות, 5 מחזורים ב 98 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה ועם סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 10 דקות להחזיק את הדוגמאות על 4 מעלות צלזיוס.
- לטהר מדגם עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
- להעריך איכות עם Bioanalyzer לפי פרוטוקול היצרן.
- איגום של אינדקס דגימות די אן איי של הכלאה
- בכל בריכה התגובה לכידת, לשלב את עוצמת הקול המתאים של כל מדגם ספריה באינדקס gDNA היטב אחד של צלחת PCR. לדוגמה, עבור האדם או ספריות ללכוד אקסון-כל של העכבר, לשלב 8 ספריות לכל בריכה באמצעות 187.5 ng של כל ספריה באינדקס. להבטיח כי בכל בריכה התגובה לכידת הסופית מכילה 1,500 ng של gDNA באינדקס.
- להפחית את נפח בכל טוב ל < µL 7 באמצעות רכז ואקום. להימנע לחלוטין ייבוש המדגם.
- להוסיף מים נטולי נוקלאז מספיק בכל בריכה gDNA מרוכז כדי להביא עוצמת הקול הסופי טוב µL 7 ואז מערבולת לצלחת המכילה gDNA נמרצות עבור צנטריפוגה ס' 30 ב ספינר צנטריפוגה או בצלחת מיני כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הבארות.
- הכלאה של gDNA בריכות הספרייה לספרייה ללכוד
- לבריכת gDNA כל µL 7 אינדקס ', להוסיף µl 9 של חסימת מיקס. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
- קאפ הבארות, להעביר את הצלחת אטום המכיל gDNA כדי הצנטרפוגה תרמי, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז תחזיק על 65 ° C. ודא כי הצלחת מוחזקת 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
- להכין דילול המתאים RNase בלוק, על בסיס גודל הספרייה הלכידה (10% דילול עבור ספריות < 3.0 מגה-בתים ו- 25% דילול עבור ספריות > 3.0 Mb).
- על-פי גודל הספרייה ללכוד, לשלב את הכמות הנכונה של ספריית ללכוד ו לדלל RNase בלוק פתרון בצלחת PCR שמרה על קרח. מערבבים היטב בעזרת pipetting. עבור לכידת ספריות < 3.0 מגה, שימוש 2 µl של ספריית ו µL 5 של גוש RNase ב 10% דילול. עבור לכידת ספריות > מגה 3.0, שימוש 5 µl של ספריית ו- 2 µl של גוש RNase ב 25% דילול.
- להוסיף µL 37 הכלאה מאגר כל טוב המכיל 7 µL של לכידת בלוק ספריה/RNase מיקס. מערבבים היטב בעזרת pipetting, בקצרה centrifuge לצלחת המכילה את המיקס.
- לשמור על הלוח בריכת gDNA ב 65 ° C תוך שימוש פיפטה רב ערוצית כדי להעביר את µL 44 כל תערובת ספריית ללכוד צעד 3.7.5 כל מדגם טוב של צלחת הבריכה gDNA. מערבבים היטב בעזרת pipetting באיטיות לאורך 8-10 פעמים.
- חותם הבארות עם רצועת כיפה כיפות. ודא כי כל בארות אטומות לחלוטין. מניחים מזרון דחיסה יניף PCR ב הצנטרפוגה תרמי.
- דגירה התערובת הכלאה במשך 24 שעות ביממה ב- 65 מעלות צלזיוס. הערה: דגימות ייתכן שהוכלא על עד 72 שעות, אך עליך לוודא כי הכלאה מורחב אינו גורם אידוי נרחב ב הבארות מדגם.
- הכנת beads מגנטי מצופה streptavidin
- Prewarm מאגר לשטוף 2 ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש טורקי או חום המים.
- Resuspend נמרצות את החרוזים מגנטי Streptavidin על מערבל מערבולת. החרוזים מגנטי להתיישב במהלך האחסון.
- עבור כל דגימה הכלאה, להוסיף 50 µL של חרוזים resuspended בארות של צלחת PCR.
- לשטוף את החרוזים, resuspend אותם ב- 200 µL מאגר מחייב.
- ללכוד את ה-dna hybridized באמצעות streptavidin חרוזים.
- מעריכים ולהקליט את עוצמת הקול של פתרון הכלאה שנשאר אחרי הדגירה 24 שעות ביממה.
- לשמור על הצלחת הכלאה ב 65 ° C, שימוש פיפטה רב-ערוצי כדי להעביר את אמצעי האחסון כולו (כ-60 µL) כל התערובת הכלאה הבארות צלחת המכיל 200 µL של streptavidin שטף חרוזים. מערבבים היטב בעזרת pipetting באיטיות לאורך 3 עד 5 פעמים.
- קאפ הבארות, דגירה את הצלחת הלכידה Nutator מיקסר או שווה ערך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ודא כי הדגימות הם ערבוב כראוי בתוך הבארות.
- Centrifuge בקצרה את הצלחת הלכידה ב ספינר צנטריפוגה או מיני בצלחת.
- לשים את הצלחת הלכידה מפריד מגנטי כדי לאסוף את החרוזים מההשעיה. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend את החרוזים ב 200 µL שטיפת מאגר 1. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה עד החרוזים הם resuspended באופן מלא.
- בקצרה צנטריפוגה ב ספינר צנטריפוגה או מיני בצלחת.
- לשים את הצלחת ההפרדה מגנטי.
- המתן פתרון ברור, ואז להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- פוסט ללכוד מדגם עיבוד רצף מרובבת
- להכין את אמצעי האחסון המתאים של תערובת התגובה PCR על ידי ערבוב הבאות: מים נטולי נוקלאז µL 9, 25 µL מיקס מאסטר, 1 µL פריימר לערבב לפי מספר amplifications. מערבבים היטב בעזרת מערבל מערבולת ולשמור על קרח.
- עבור כל תגובה הגברה, מקום µL 35 של תערובת התגובה PCR מ שלב 3.10.1 הבארות של צלחת PCR.
- פיפטה כל של הדגימות בריכה ספריית שנתפסו מאוגד-חרוז למעלה ולמטה כדי להבטיח כי ההשעיה חרוז הומוגנית.
- להוסיף 15 µL של כל ספריית שנתפסו בריכה חרוז השעיה לתערובת PCR התגובה המתאימה היטב. לערבב ביסודיות על ידי pipetting עד המתלה חרוז הוא הומוגני.
- למקם את הצלחת מוכן. למשל 3.10.2 ב הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל את התוכנית הבאה של הגברה PCR: 98 ° C למשך 2 דקות, 8 עד 11 מחזורים ב 98 ° C ל 30 s, 60 ° C עבור s 30 ו-72 מעלות עבור 1 דקות, ולאחריה סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות. להחזיק את הדוגמאות על 4 מעלות צלזיוס.
- לטהר מדגם בטהרה חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
- להעריך איכות עם Bioanalyzer לפי פרוטוקול היצרן.
- מוכנות דגימות מרובב רצף
הערה: הדגימות מועשר הסופי להכיל בריכות של ספריות אינדקס 8 או 16, של בהתבסס על גודל הספרייה ללכוד וכתוצאה לכידת מראש איגוד האסטרטגיה. המספר הכולל של ספריות אינדקס עשוי להיות מרובב בסמטה רצף יחיד נקבע לפי המפרט פלט של פלטפורמת בהם, יחד עם כמות רצף הנתונים הנדרשים עבור הספריה ללכוד.- לחשב את מספר אינדקסים שניתן לשלבם לכל ליין, בהתאם לקיבולת של הפלטפורמה. המספר הכולל של ספריות אינדקס עשוי להיות מרובב בסמטה רצף יחיד נקבע לפי המפרט פלט של פלטפורמת בהם, יחד עם כמות רצף הנתונים הנדרשים עבור הספריה ללכוד. לדוגמה, בספריה v5 אקסון כל האדם, מומלץ רצף הנתונים לכל ספריה באינדקס הוא 4 Gb והוא מומלץ רצף הנתונים לכל לכידת טרום בריכה 32 ג'יגה-בתים (8-אינדקס בריכות).
- רצף של הספריות.
- לטעון את הספריות על פלטפורמת רצף הדור הבא של הבחירה ולבצע את הרצף לפעול בהתאם למפרטים כלי נגינה.
- ניתוח נתונים רצף exome.
- הפעל את הצינור התוכנה של בחירה עבור חיוג הבסיס. לדוגמה, השתמש Stampy כדי למפות קריאות20, להסרת כפילויות עם פיקארד (http://broadinstitute.github.io/picard/), לזהות נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים, ההוספה או המחיקה של בסיסים (indels) עם ברווזן21. לסנן גרסאות נרדף ואלו נצפו בתדר אלל < 5% ונתונים השוואה עם אלה של exomes הורים לזהות משתנים de novo .
4. פלסמיד DNA הכנה אלקטרופורציה בתוך הרחם
- עיצוב מספר RNAs סיכת ראש קצר (shRNAs) מיקוד או את רצף קידוד או את 3' UTR של גנים המועמד כפי שתואר לעיל22.
- כדי למנוע מהמטרה אפקטים מבחן ירידה לפרטים shRNAs על ידי חיפוש הפיצוץ מול מסדי נתונים תוך שימוש בשיטות הרגילות. הכללת shRNAs מציג יותר מ-50% משלימים את החסר עם גנים אחרים חולדה.
- שיבוט annealed oligonucleotides לתוך וקטור mU6-pro כפי שתואר לעיל23.
- לטהר פלסמיד DNA עם מקסי-הכנה לפי הנחיות היצרן ובצע ריכוז הסופי של µg 3/µL.
- Aliquot 20 µl של ה-DNA (0.5 מ"ג/מ"ל pCAGGS-GFP גם לבד או עם 1.5 מ"ג/מ"ל של shRNA לבנות) ולהוסיף 2 µL הצום גרין דיי (2 מ"ג/מ"ל) כדי לאפשר מעקב ויזואלי של הזריקה.
5. בתוך הרחם אלקטרופורציה
-
הליך כירורגי
- עזים ומתנגד E15.5 בהריון חולדות נקבות (E0 מוגדר כהיום של אישור של הכנס הנרתיק זרע-חיוביים), באמצעות שילוב עם תערובת של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (0.1 ו- 0.01 מ"ג לכל הגוף משקל, בהתאמה), אשר ניתנת דרך בקרום הבטן זריקה עבור אינדוקציה הרדמה.
- ודא כי החיה הוא מורדם לחלוטין על ידי התבוננות היעלמותו של הבוהן קמצוץ רפלקס.
- גילוח הבטן התחתונה של החיה משתמשים בטלוויזיה כדי להסיר את הפרווה. לחטא את העור באמצעות קרצוף povidone יוד, אלכוהול 70%. החל וטרינר משחה על העיניים למניעת יובש בזמן תחת הרדמה.
- במקום החיה על מקור חום ושם תלוי סטרילי (עם חלון פתוח של 4-5 ס מ באמצע) על החתך. ללבוש מסכות, חלוק המעבדה, כובעים, כפפות כירורגי סטרילי. לשמור על עקרות עד הסוף של הניתוח.
- באמצעות מספריים חדות עושים חתך אנכי (2-2.5 ס מ) של העור לאורך האמצע בבטן סימטרית ולאחר מכן לבצע חתך של הקיר שריר מתחת לעור – גם של 2.5 ס מ — לאורך הקו האמצעי.
- בזהירות לחשוף אחד הרחם הקרן חלל הבטן. ירידה 37 ° C מראש ומחוממת רגיל תמיסת לחות את העוברים. לשמור על הרחם לח כל הזמן.
-
הזרקה של DNA ו אלקטרופורציה
- בעדינות להחזיק אחד של הקרניים הרחם עם מלקחיים מחויג ודחף בזהירות אחד העובר לדופן הרחם. להחזיק את העובר ביד אחת ועם את תותב יד אחרים בקפידה נימים זכוכית 1 מ מ האמצע לתוך החדר הלטראלי השמאלי (2-3 מ מ עמוקה) ולהזריק כ 1 µL של ה-DNA עם ירוק מהר כדי לאפשר חזותי ניטור באמצעות הזרקה microinjector.
- ירידה נורמלית תמיסת מלח על פני 3 x 7 מ מ2 אלקטרודות. מניחים את האלקטרודה החיובית סטרילי בצד מוזרק (החדר הלטראלי השמאלי), סטרילי האלקטרודה השלילית על החדר הימני. לספק 5 פולסים חשמליים במרווחי זמן 950 ms עם דוושה שבשליטת רגל (לחייב 40 V עם electroporator קבל 4000 mF).
-
Post הליכים אלקטרופורציה
- תחזיר את הקרניים הרחם אל חלל הבטן, להוסיף טיפות של תמיסת מלח רגיל חלל כדי לאפשר עוברי מוצבים באופן טבעי יותר, להביא בחשבון פוסט ניתוחית לאיבוד נוזלים.
- סגור הקיר שריר הבטן בתפרים נספגים כירורגי, ואז העור בעזרת תפר פשוטה-הפרענו.
- לשים את החולדה בחזרה לכלוב ונטר החיה עד שייצא החוצה מן ההרדמה.
- לניהול כאב לנהל הבופרנורפין (0.03 נקודות מ"ג/ק"ג) לבעל-החיים על-ידי זריקה תת עורית כל ה 8-12, עבור עד 48 שעות.
6. הכנת הדוגמא המוח
-
שיטת קיבוע
- להקריב את החולדה בהריון 5 ימים לאחר הליך כירורגי באמצעות גז הרדמה (איזופלוריין) ואחריו תאמת צוואר הרחם מהירה.
- עושים חתך אנכי כדי לפתוח מחדש את חלל הבטן.
- לחשוף את הקרניים הרחם, להסיר את העוברים מן הרחם, לכרות אותם באמצעות מספריים חדות.
- מסירים את המוח עם מינימום נזק לרקמת: באמצעות מספריים חדות, עושים חתך קטן לאורך הצד האחורי (המוח הקטן) / ציר קדמי (נורות olfactive) של הראש כדי לחדור את העור ואת הגולגולת, ולאחר מכן שימוש זוג מלקחיים הקילוף הגולגולת כדי לחשוף המוח, להסיר אותו באמצעות מרית קטנה.
- לטבול המוח בין לילה ב 4 ° C ב- a 4% Paraformaldehyde 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS).
-
המוח חלוקתה
- לשטוף את המוח ב- PBS 1 x 10 דקות.
- להטביע את המוח ב- 4% אגר פלסטיק והטבעה בתבניות.
- להכין 50 מ של 4% אגר ב- 1 x PBS הטבעה המוח העוברי 5. להבטיח את agarose מומס ב יותר מ 50 º C.
- לשמור על המוח ב- agarose כדי פולימריזציה במשך לפחות שעה ב 4 º C. להסיר את עודף agarose סביב המוח.
- הדבק את המוח ללוחית התחתונה vibratome, בכיוון הציר הקדמי/אחוריים של המוח הוא בניצב הלהב. המתן מספר דקות על הדבק לייבש מקום לצלחת עם המוח מודבק אל החדר vibratome.
- למלא את vibratome 1 x PBS. פורסים 100 מיקרומטר מקטעים עבה.
- העברת פרוסות המוח בשקופיות, להסיר עודפי נוזלים, להוסיף כמה טיפות של הרכבה בינונית, מקום של coverslip על המוח
7. קונאפוקלית הדמיה וניתוח כמותי
- תן את יבש הרכבה בינונית למשך הלילה לפני הדמיה. התמונה סעיפים 10 X במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
- באמצעות תוכנה לניתוח תמונה כמותית, המירו את התמונה בתא 8 סיביות, בחר אחד נציג GFP חיובי פלורסנט ולהגדיר באופן ידני את צורתו. לשם כך, לחץ על "הערכה" וצייר את הגבול של התא בעזרת כלי הבחירה ביד חופשית. זה דרך הקוטר ואת עוצמת סף של התא נשמרות באופן אוטומטי על-ידי התוכנה.
- לחץ על "חיפוש תאים" כדי לאפשר את התוכנה להתאים לשפה transfected תאים בכל רחבי קליפת המוח. לאחר מכן, אם יש צורך, להסיר באופן ידני תוצאות חיוביות שגויות.
- לחלק כל עובי הקליפה 8 תחומי עניין מנורמל במקטעים בודדים. כדי להשיג זאת, לחץ על "אזור כלי", בחר 8 "אזור פסים" איפה הראשון (1) והאחרונה (8) פסים תואמים את VZ וכדי העליון של CP בהתאמה. לחץ על "החל" כדי לאפשר את התוכנה לספור את המיקום היחסי של GFP transfected תאים בקליפת שלם. ולבסוף ללחוץ על "שמור כימות" לייצא את הנתונים בקובץ Excel לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האסטרטגיה הניסיונית נועדה לזהות גנים סיבתי הרומן של MCD היא recapitulated באיור1.
על ידי ביצוע מערך-CGH במדגם של 155 חולים עם הפרעות התפתחותיות במוח variably המשלב PNH (איור 2 א), כפיס המוח dysgenesis, colpocephaly, אסטרוציטומה hypoplasia and polymicrogyria הקשורים עם אפילפסיה, אטקסיה, פגיעה קוגניטיבית, זיהינו מחיקה מינימלי 1.2 Mb קריטי ב 6q27 משותף על ידי 12 חולים (איור 2B)21. האזור גנומית מכילה ארבעה גנים ידועים (THBS2, PHF10, TCTE3 ו- DLL1), ניבא שני גנים (WDR27 and C6orf70) (איור 2B).
במקביל מערך-CGH, ניתוח וס ב 14 חולי מבודד PNH הדו-צדדיים וניתוח עותק מספר וריאציות לא בוצע, זיהוי חולה אחד עם מוטציה דה נובו (c.752T > ת pIle250Asn) ב (ג'ין החזוי C6orf70 מספר גישה Genbank NM_018341.1) (איור 3).
כדי לאשר המוטציה שתוארה C6orf70 היה. תפקיד סיבתי PNH לחקור אם haploinsufficiency של גנים אחרים מיפוי 6q27 עשויים להשפיע על פנוטיפ, שלהם תפקיד ויוו על הגירה העצבית היה חקר שימוש בתוך הרחם מציאה RNAi בתיווך הגישה תמונות ציפורים23,24 להשתקת ביטוי במעשים עכברוש אבות עצביים בקליפת המוח. רק גנים ביטוי בקליפת עכברוש המתפתח, PHF10, C6orf70 , DLL1, נבדקו (איור 4A). סיכת ראש קצר שונים RNAs (shRNAs) נוצרו מיקוד הרצפים קידוד של שלושה גנים אלה. ShRNAs ואז הוכנסו לתוך neuroprogenitors של קליפת עכברוש מאת בתוך הרחם אלקטרופורציה עובריים ביום 15 (E15), כאשר נוצרים נוירונים מחויבת שכבות בקליפת המוח העליון. חלבון פלואורסצנטי ירוק שימש כתב תרביות תאים. יחסית חלוקת תאים GFP-חיוביות נבחנה 5 ימים לאחר אלקטרופורציה. נוקאאוט של Dll1 , Phf10 , גרמו עיכוב קל של הגירה העצבית רדיאלי (נתונים לא מוצג), ואילו נוקאאוט של C6orf70 לקוי הגירה העצבית, הולידה הפיתוח של גושים הטרוטופי מאוד המזכירים את אלה נצפו Flna דגם תמונות ציפורים (איור 4B)24. לעומת זאת, transfections עם shRNA אי-התאמה של יעילות C6orf70 היה ללא השפעה ברורה על הגירה העצבית (איור 4B).
איור 1: זרימת העבודה לצורך זיהוי הרומן זיהוי גנים סיבתי MCD. ייצוג סכמטי של הגישות השונות שיכול לשמש כדי לזהות הרומן מחלה הגורמת גנים. תיבות בצבע צהוב מייצג את הגישות המתוארות המאמר הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: 6q27 מחיקות לגרום לפיתוח המוח תקינה עם PNH. (א) החולה 2. הפרונטליים שקל-T2 (החלונית הימנית) וסעיפים שקל-T1 צירית (נכון לוח) מציג PNH רירית הקיר של האונה הטמפורלית השמאלית (חץ לבן ושחור) מתחת קליפת המוח מבודדים פרש. החולה (B) 11. משוקלל T1 הילתית סעיף, מציג דו צדדיים גושים הטרוטופי לאורך הקירות של הקרניים טמפורלית (חץ לבן). (ג) החולה 12. סעיף הילתית T2-שקל. בצד השמאל, PNH עדיין גלויים (חץ שחור), החדרים מורחבים. (ד) ייצוג סכמטי של מחיקות של האזור 6q27 זיהה PNH חולים באמצעות מערך-CGH (החלק העליון). הקווים האופקיים, מקווקו מייצגות מחיקות זיהו בחולים. האזור בגודל של מינימום קריטי למחוק גם מציינים ומכיל ארבעה גנים ידועים: THBS2, PHF10, TCTE3 ו DLL1 , שני גנים החזוי: WDR27 ו- C6orf70 (החלק העליון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: רצף תוצאות. ( ) משוקלל סעיף צירית מציג PNH דו צדדיים של הקרניים פרונטלי (חץ לבן) אצל המטופל נושאת את c.752T T2 > מוטציה בגן C6orf70. סנגר (B) רצף כי המוטציה המזוהה על-ידי וס אירעה דה נובו. המיקום של המוטציה מסומן על ידי חץ שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ניתוח ביטוי של גנים מקומי אזור קריטי מינימלי 6q27 ו C6orf70-נוקאאוט הפיצולים ההעברה רדיאלי של נוירונים בקליפת המוח. (א) כמותית RT-PCR מציג את הביטוי של גנים הכלולים באזור קריטי 6q27 בקליפת חולדה. Cyclophilin א שימש נורמליזציה. (B) נציג הילתית קטעים neocortical של המוח עכברוש E20 5 ימים לאחר אלקטרופורציה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק או לבנות לבד (בקרה), או בשילוב עם shRNA מיקוד C6orf70 קידוד רצף (C6orf70-shCDS) או עם ההתאמה לא יעיל יחסית לבנות (C6orf70-shCDSmm). Flna -נוקאאוט (FLNA-shCDS) שימש שליטה של הגירה העצבית לקוי. אלקטרופורציה ברחם עם C6orf70-shCDS או FLNA-shCDS המושרה מעצרו של תאים GFP-חיובית בתוך האזור חדרית (VZ) (החצים הלבנים), ואילו התאים לבטא GFP לבד או בשילוב עם ההתאמה לבנות לא תשנה הגירה העצבית. גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCDs הם גורמים חשובים מוגבלות ועל חשבון עבור 20-40% של הילדות עמידים לתרופות-אפילפסיה-1,-2. עניין MCDs גדל באופן דרמטי בעשור האחרון בשל שני גורמים עיקריים. הראשון הוא השיפור המוח הדמיה (MRI במיוחד), מה שמאפשר רופאים ומדענים לדמיין הרבה מומים המוח לא הכיר קודם לכן. השני הוא ההתפתחות של כלים גנטיים אשר אפשרו את הזיהוי של הרומן MCD סיבתי גנים רבים. זה השתפר בהרבה, הידע שלנו על המנגנון מושתתות התפתחות המוח ותפקוד ולאחר המותר עבור ייעוץ גנטי מדויק יותר.
בעבר, חוקרים התמקדו מאמציהם בעיקר ג'ין סיבתי זיהוי, עוזב את העיצוב של מבחני פונקציונליות כדי להבהיר את תפקידם בהתפתחות המוח כדי בשלבים מאוחרים יותר. זה הפך קשה יותר עקב ההתקדמות מן המחקר של הפרעות גנטיות נדירות, חוזרים ונשנים להפרעות סדיר נפוץ יותר עבור אילו גנים מסורתיים מציאת שיטות לא ממושמעים. לגישות לזיהוי גנים סיבתי לעיתים קרובות מאפשרים זיהוי אזורים גדולים יחסית של הגנום המכיל גנים רבים (מערך-CGH) או גרסאות שונות במספר גנים מועמד אשר קשה לאמת (ווס או WGS).
מערך-CGH ו ווס (או WGS) גישות התעשרו הספקטרום מוטציה שהפרעות גנטיות רבות. יחד עם זאת, נותרו עדיין כמה מגבלות קריטי. למשל, מערך-CGH צריך דנ א באיכות גבוהה, לא יצליח לזהות translocations מאוזנת או קטן מחיקות/כפילויות כולל אלה מעורבים אחד או כמה exons של גן יחיד. כדי להתגבר על בעיה זו, מערך-CGH עשוי להיות המבוצעת ברזולוציה גבוהה יותר מאשר בדיקה קונבנציונליות מרווח (למשל באמצעות ערכת מערך-CGH 1 מ') או שהוחלפו עם ניתוח מערך הסנ פ. ווס לעתים קרובות אינו מכסה אזורים intragenic גדולים, לא יצליח לזהות מוטציות intronic עמוק. בנוסף, לפעמים הכיסוי עשוי להיות נמוך מדי כדי לזהות מוטציות סיבתי (במיוחד במקרה של מוטציות עם אחוז נמוך של פסיפס). עוד צעד קריטי עבור ווס הוא כי ניתוח הנתונים וסינון עדיין דורשים מאמץ ניכר. כדי להגדיל את הכיסוי של ווס, ניתן להפחית את מספר המטופלים בניסוי יחיד או ערכות לכידה שונות עשוי לשמש בו זמנית.
. הצמיגים הוא הגישה המתאימה ביותר כדי לנתח את השפעת גנים נוקאאוט על הגירה העצבית. עם זאת, חקירות על צעדים נוספים של קורטיקלית התפתחותיים, כגון נוירוג'נסיס ההבשלה עצביים, הן מוגבל בשל כמה מגבלות טכניות. אכן, הצמיגים לבצע לפני E13 הוא לעתים קרובות לא מוצלח ואילו חקירות בשלבים מאוחרים יותר מוגבלים על ידי השיעור הגבוה של lethality כמחנכת הקשורים הליך זה. בנוסף, ג'ין-נוקאאוט יעילות עשויות להיות שונות בין עוברי electroporated שמוביל הטרוגניות פנוטיפי משמעותי.
בסך הכל, בפרוטוקול הנוכחי יש ארבעה שלבים קריטיים עיקריים. למרות שהוא לא חלק הפרוטוקול המתואר המאמר הנוכחי, אנו חייבים לציין כי הצעד הבסיסי הראשון כדי לקחת בחשבון הוא הבחירה של חולים כדי להיות רשום ללימודים כאלה. ואכן, התהליך של זיהוי גנים MCD הרומן דורש חקירות קליני, הדמיה במדגם של מטופלים שעבורם פנוטיפ צריכה להיות כמו הומוגניות ככל האפשר. איסוף חולים עם פנוטיפ מאוד הומוגנית מגדילה את הסיכוי לזיהוי מוטציות סיבתי גן נתון. עם זאת, המספר המינימלי של חולים כדי להיות רשום ללימודים כאלה כדי להשיג הצלחה קשה לנבא, כיוון שהוא תלוי במידה רבה על קצב מוטציה של גנים שונים. לדוגמה, עבור גנים כגון FLNA, אשר הוא מוטציה ב- 100% מהמקרים משפחתית של X-linked PNH הדו-צדדיים וב -26% מהחולים סדיר, מספר החולים נחוץ כדי לזהות מספר רב של להיטים בגן יכול להיות נמוך יחסית. לעומת זאת, עבור גנים עם קצב מוטציה נמוכים, מספר החולים שיוקרנו הוא גבוה יותר. לדוגמה, במקרה של C6orf70, היינו מסוגלים לזהות מוטציה סיבתי יחיד רק על הקרנת חולים 64 (14 עד וס ו- 50 דרך סנגר קונבנציונאלי רצף)16, הערכת קצב מוטציה של גן זה של 1.5%. השלב הקריטי השני הוא הכללת מוטציות בגנים MCD ידוע כל כדי לזהות גנים סיבתי הרומן. בזכות הופעתו של טכנולוגיות רצף הדור הבא, מוטציה ההקרנה של גנים ידועים לבין המועמד כעת ניתן לבצע בניסוי יחיד. עם זאת, משתנים המתאימים סינון אמור לשמש כדי למנוע את הנוכחות של מספר מופרז של תוצאות חיוביות שגויות להיות מאושרות השפעול וכדי לסנן מוטציות סיבתי פוטנציאליים. אכן, המספר של המועמד גנים/משתנים הוא גבוה במיוחד בניסויים ווס. אם חשוד במעורבות גן נתון, יש מוטציה הקרנה גם השלמה על ידי ניתוח MLPA, כדי לא לכלול microdeletions או microduplications. הנקודה השלישית היא העובדה rearrangements כרומוזומליות מושפעים בחריפות המיקום של העצירה. בהקשר זה, ראוי לכלול, במידה האפשר הגדול, ערעור או העקירה של cis-רגולציה אלמנטים דיסטלי אל הגנים לא כלול בתוך המחיקה/הכפילות. לבסוף, אין ויוו RNAi ניסויים מניחים כי גנים סיבתי לשחק תפקיד ישיר הגירה העצבית בשלבים עובריים. עם זאת, האטיולוגיה של MCD, כולל PNH, הטרוגניות, הגישה בתוך הרחם יכול להיכשל לזהות את ההשפעות של גנים המעורבים בשלבים התפתחותיים לרבות הישרדות התפשטות או תאים עצביים. בנוסף, המורכבות נמוך של המוח מכרסמים יכולה להסוות את השפעת נוקאאוט או על ביטוי גנים מועמד נתון, אשר עשוי להיות ניכרת יותר במוח האנושי.
אנו מאמינים כי השילוב של מחקרים פונקציונלי גנומיקה, ויוו יעזור לפתח כלי אבחון חדשים לצורך זיהוי גנים סיבתי חדשים של MCD. אסטרטגיה זו יכול גם לספק מודלים בבעלי חיים חדשים מטרות טיפולית ולבחון הפתופיזיולוגיה של MCD, להבין אשר יש עד כה היה מוגבל על-ידי חוסר ניסיוניות וגישה מוגבלת על רקמת המוח מחולים המושפעת. פיענוח מסלולים מולקולריים הקשורים MCD הפרעות גם תספק מידע בעל ערך חדש על התפתחות המוח פיזיולוגיים באופן כללי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר ג'י McGillivray, pr. ג'יי קלייטון-סמית '..., pr. פינצ'יאוטי Dobyns, pr. פ Striano, pr. קרי שפר, pr. פ מ Roberston ו- pr. S.F. Berkovic למתן חולים MCD. אנו מודים מישל פ ד ר ומיי ד על עצות טכניות ולעזור. עבודה זו נתמכה על ידי מימון 7 בתכנית המסגרת של האיחוד האירופי, הרצון בפרוייקט, מספר חוזה: בריאות-F2-602531-2013, (כדי וייטקונג, R.G., ע. ר, פ. ס. ס), INSERM (לס. ס. ע. ר), לז'ן ג'רום Fondation (R13083AA A.F, E.P.P, C.C), Région פרובנס אלפ Côte d ' azur (APO2014 - דמוטית ס. ס, A.A.D). D.A.K חוקר צעיר EMBO והיא נתמכת על-ידי FWF מעניקה (I914 ו- P24367).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
- Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
- Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
- Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
- Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
- Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
- Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
- Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
- Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
- van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
- Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
- Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
- Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
- Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
- Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
- Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
- Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
- Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
- Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
- Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
- Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
- Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).
