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Neuroscience

एक उपंयास रणनीति सरणी के संयोजन-CGH, पूरे exome अनुक्रमण और कुतर में Utero Electroporation में मस्तिष्क विकृतियों के लिए करणीय जीन की पहचान करने के लिए में

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/53570
Automatic Translation
*1, *2,3,15, 2,3,4, 5,6,7, 2,3,8, 1, 2,3, 2,3, 2,3,8, 9, 10, 10, 11, 10, 9,12, 2,3, 13, 1,14, 2,3, 2,3
1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Periventricular गांठदार heterotopia (PNH) वयस्कता में cortical development (MCD) की कुरूपता का सबसे सामान्य रूप है लेकिन इसका आनुवंशिक आधार सबसे अधिक छिटपुट मामलों में अज्ञात रहता है. हमने हाल ही में एमसीडी के लिए उपंयास उंमीदवार जीन की पहचान करने के लिए और सीधे vivo मेंअपने करणीय भूमिका की पुष्टि करने की रणनीति विकसित की है ।

Abstract

जंम दोष है कि मस्तिष्क प्रांतस्था-भी cortical विकास (एमसीडी) की विकृतियों के रूप में जाना शामिल-बौद्धिक विकलांगता और बचपन में दवा प्रतिरोधी मिर्गी के 20-40% के लिए खाते के महत्वपूर्ण कारण हैं । हाई-रिजोल्यूशन ब्रेन इमेजिंग ने वीवो में एमसीडी phenotypes के एक बड़े समूह की पहचान की सुविधा दी है । मस्तिष्क इमेजिंग में अग्रिम के बावजूद, जीनोमिक विश्लेषण और पशु मॉडलों की पीढ़ी, एक सीधा कार्यप्रवाह व्यवस्थित उंमीदवार जीन को प्राथमिकता देने के लिए और ख्यात उत्परिवर्तनों के कार्यात्मक प्रभाव परीक्षण के लिए याद आ रही है । इस समस्या को दूर करने के लिए, एमसीडी के लिए उपंयास करणीय जीन की पहचान को सक्षम करने के लिए एक प्रयोगात्मक रणनीति विकसित और मान्य किया गया था । इस रणनीति के आधार पर उंमीदवार जीनोमिक क्षेत्रों या सरणी-CGH या पूरे exome अनुक्रमण के माध्यम से जीन की पहचान करने और उनके निष्क्रियता के प्रभाव या निस्र्पक के माध्यम से कुतर दिमाग विकसित करने में विशिष्ट उत्परिवर्तनों के व्यक्त करने पर आधारित है utero electroporation । इस दृष्टिकोण C6orf70 जीन की पहचान के लिए नेतृत्व किया, एक ख्यात vesicular प्रोटीन के लिए एंकोडिंग, periventricular गांठदार heterotopia, एक एमसीडी दोषपूर्ण ंयूरॉंस प्रवास के कारण की रोगजनन के लिए ।

Introduction

सेरेब्रल प्रांतस्था संज्ञानात्मक और बौद्धिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और भावनात्मक नियंत्रण में शामिल है और साथ ही सीखने और स्मृति । इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि कई स्नायविक और मनोरोग रोगों cortical विकास (एमसीडी) की विकृतियों से परिणाम है । दोनों के अधिग्रहण और आनुवंशिक कारकों से जुड़े होने के बाद से एमसीडी का एटियलजि जटिल है । एमसीडी के आनुवंशिक रूप से निर्धारित अनुपात की संचई व्यापकता के बारे में 2% है और वे ज्यादातर मामलों में छिटपुट हैं । उदाहरण के लिए, जन्मजात मस्तिष्क dysgenesis की घटना मानव आबादी में 1% से अधिक होने का अनुमान था, और एमसीडी के कुछ रूपों में मिर्गी के साथ सभी रोगियों के 14% से अधिक में मनाया जाता है और गंभीर या असभ्य मिर्गी के ४०% में1, 2.

Periventricular गांठदार Heterotopia (PNH) सबसे आम एमसीडी में से एक है और न्यूरॉन्स के वेंट्रिकुलर क्षेत्र (VZ) से विकासशील सेरेब्रल प्रांतस्था के असामान्य प्रवास के कारण होता है. न्यूरॉन्स की विफलता पार्श्व निलय की दीवारों के साथ heterotopic न्यूरॉन्स के समूहों में परिणाम स्थानांतरित करने के लिए जो आम तौर पर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग कर visualized किया जा सकता है. PNH के नैदानिक, शारीरिक और इमेजिंग विशेषताएं विषम हैं । पिंड छोटे और एकतरफा द्विपक्षीय और सममित से सीमा हो सकती है । कॉमन क्लिनिकल sequelae में मिर्गी और बौद्धिक शक् ति3शामिल है । Filamin एक (या FLNA) जीन में उत्परिवर्तनों, जो Xq28 में नक्शे, एक्स के साथ परिवारों के १००% में पाया गया द्विपक्षीय PNH और छिटपुट रोगियों के 26% में3,4से जुड़े थे । PNH के एक दुर्लभ, अवकाश के रूप में ARFGEF2 जीन है, जो 20q13 में नक्शे में उत्परिवर्तनों की वजह से, दो आशावादी परिवारों में सूचित किया गया है5। हाल ही में, रिसेप्टर एंकोडिंग जीन में biallelic उत्परिवर्तनों-ligand cadherin जोड़ी DCHS1 और FAT4 नौ एक multisystemic विकार है कि PNH6शामिल से प्रभावित रोगियों में पहचान की गई है । PNH भी नाजुक एक्स सिंड्रोम के साथ जुड़ा हुआ है7, विलियंस सिंड्रोम8, 22q11 microdeletion सिंड्रोम9, 5p15 पर दोहराव10, 1p3611में विलोपन, 5q 14.3-q1512, 6p2513 और 6q टर्मिनल विलोपन सिंड्रोम14,15,16,17,18,19, सुझाव है कि अतिरिक्त करणीय जीन बिखरे हुए हैं जीनोम के दौरान । तथापि, लगभग ७४% छिटपुट PNH रोगियों के आनुवंशिक आधार के लिए17का आविर्भाव होना शेष रहता है.

इस तरह के सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सरणी-CGH) के रूप में शास्त्रीय जीन मानचित्रण दृष्टिकोण उप सूक्ष्म गुणसूत्र विषमताओं का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित किया है, तथापि, जीनोमिक क्षेत्रों की पहचान इस दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे है अक्सर बड़े और कई जीन होते हैं ।

बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण तकनीक के आगमन (यानी पूरे-Exome अनुक्रमण (वेस) और पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS)) काफी लागत और एक पूरे मानव Exome या जीनोम अनुक्रम करने के लिए आवश्यक समय कम हो गया है । फिर भी, वेस और WGS डेटा की व्याख्या मामलों के बहुमत में चुनौतीपूर्ण रहता है, के बाद से सैकड़ों के लिए प्रत्येक रोगी दसियों के लिए (या भी हजारों, विश्लेषण के प्रकार के आधार पर) वेरिएंट डेटा फ़िल्टरिंग से उभरने ।

उपंयास एमसीडी करणीय जीन की पहचान की प्रक्रिया को गति देने के लिए, एक उपंयास व्यवस्थित सरणी-CGH, वेस और utero electroporation (IUE) उंमीदवार जीन की स्क्रीनिंग के संयोजन की रणनीति डिजाइन किया गया था । IUE चुनिंदा निष्क्रिय करने के लिए अनुमति देता है (या एक्सप्रेस) कुतर दिमाग में विशिष्ट जीन या उत्परिवर्तनों, corticogenesis18,19में उनकी भागीदारी के तेजी से मूल्यांकन को सक्षम करने से । RNAi मध्यस्थता-पछाड़ना या एक या एक से अधिक उंमीदवार जीन के व्यक्त करने का कारण है, जब जीन रोग विकास के साथ जुड़ा हुआ है की उंमीद है, ंयूरॉन प्रवास में स्थानीय दोषों और/ एक जीन की पहचान पर जिसकी निष्क्रियता (या एक्सप्रेस) कुतर में रोगियों में मनाया phenotype reproduces, यह एमसीडी के साथ छिटपुट रोगियों में स्क्रीनिंग के लिए एक उत्कृष्ट उंमीदवार बन जाता है । इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम हाल ही में C6orf70 जीन के महत्वपूर्ण योगदान का पता चला (भी ERMARDके रूप में जाना जाता है) रोगियों में PNH रोगजनन में पोस 6q27 गुणसूत्र विलोपन16।

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Protocol

नैतिकता बयान: Wistar चूहों साथी, बनाए रखा और INMED पशु सुविधाओं में इस्तेमाल किया, यूरोपीय संघ और फ्रांसीसी कानून के साथ समझौते में थे ।

1. डीएनए निष्कर्षण और सरणी के लिए ठहराव-CGH और वेस

  1. एक स्वचालित डीएनए अलगाव रोबोट या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैनुअल डीएनए निष्कर्षण किट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार का उपयोग कर रोगियों से मानव रक्त ल्यूकोसाइट्स से जीनोमिक डीएनए (gDNA) निकालें । एक spectrophotometer का उपयोग सभी नमूनों को बढ़ाता है ।

2. सरणी-CGH प्रोटोकॉल

  1. gDNA की पाबन्दी पाचन
    1. डबल डाइजेस्ट ५०० एक रोगी से शुद्ध gDNA के एनजी और ्सै और AluI के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव नियंत्रण डीएनए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए । प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए ०.५ μl के 10 यू/μl एंजाइम का उपयोग करें । ६५ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन को निष्क्रिय एंजाइमों और बर्फ के लिए नमूना ट्यूबों चाल ।
  2. नमूना ्र
    1. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए उपयोग में microarray प्रारूप के लिए आवश्यक यादृच्छिक प्राइमरों की उचित मात्रा जोड़ें (1-पैक, 2 पैक, और 4 पैक microarrays के लिएउदा 5 µ एल). धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
    2. एक थर्मल साइकिल चालक के लिए नमूना ट्यूबों स्थानांतरण । 3 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर और फिर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    3. निम्नलिखित संस्करणों को मिलाकर बर्फ पर एक cyanine 3 और एक cyanine 5 लेबलिंग मास्टर मिश्रण तैयार करें: १०.० µ एल 5x रिएक्शन बफर, ५.० µ l 10x dNTPs, ३.० µ l cyanine 3-dUTP या cyanine 5-dUTP और १.० µ l Exo (-) Klenow एंजाइम, २.० µ l Nuclease-फ्री वॉटर. उपयोग में microarray स्वरूप के अनुसार प्रत्येक एजेंट का वॉल्यूम चुनें ।
    4. gDNA युक्त प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए लेबलिंग मास्टर मिश्रण जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting से अच्छी तरह मिलाएं ।
    5. एक थर्मल साइकिल चालक के लिए नमूना ट्यूबों स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए 2 एच, ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने बनाए रखने के लिए ।
  3. बला gDNA का शुद्धिकरण
    1. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए 1x ते (पीएच ८.०) के ४३० µ एल जोड़ें ।
    2. 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में एक शुद्धि कॉलम प्लेस और कॉलम उचित लेबल । एक शुद्धि कॉलम पर प्रत्येक लेबल gDNA लोड ।
    3. 10 मिनट के लिए १४,००० x g पर कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में के लिए केंद्रापसारक । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में वापस कॉलम जगह है ।
    4. प्रत्येक कॉलम में 1x ते (pH ८.०) के ४८० µ l को जोड़ें । 10 मिनट के लिए १४,००० x g पर कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में के लिए केंद्रापसारक । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    5. एक ताजा 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में कॉलम पलटना और एक microcentrifuge में १,००० x g पर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शुद्ध नमूना इकट्ठा करने के लिए केंद्रापसारक ।
    6. एक ध्यानी का उपयोग कर या 1x TE (pH ८.०) को जोड़ने में microarray स्वरूप के लिए अनुरोध करने के लिए नमूना वॉल्यूम लाएं । उदाहरण के लिए, 1-पैक microarray के लिए वॉल्यूम लाने के लिए ८०.५ µ l. मशीन 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना और फिर समाधान पिपेट ऊपर और नीचे 10 बार.
  4. संकरण के लिए बला gDNA की तैयारी
    1. उपयुक्त cyanine 5-लेबल वाले नमूने का उपयोग करके परीक्षण और संदर्भ नमूने संयोजित करें और cyanine 3-लेबल्ड नमूना एक ताजा १.५ मिलीलीटर RNase-मुक्त ट्यूब में । उदाहरण के लिए, 1-पैक microarray के लिए सुनिश्चित करें कि अंतिम खंड १५८ µ है l उपयोग में microarray स्वरूप के अनुसार प्रत्येक नमूने की मात्रा चुनें ।
    2. A260 एनएम (डीएनए), A550 एनएम (cyanine 3), और A650 एनएम (cyanine 5) में अवशोषण को मापने के द्वारा उपज, लेबल या विशिष्ट गतिविधि की डिग्री को मापने के लिए एक spectrophotometer का प्रयोग करें ।
      1. सूत्र का उपयोग कर उपज की गणना: [डीएनए एकाग्रता (एनजी/µ एल) एक्स नमूना मात्रा (µ एल)]/1000 (एनजी/µ जी) । सूत्र का उपयोग करते हुए विशिष्ट गतिविधि परिकलित करें: pmol प्रति µ l के डाई/µ g के प्रति µ l का gDNA.
        नोट: उदाहरण के लिए, इनपुट डीएनए के ०.५ µ g के लिए, उपज 8 से 11 µ जी होनी चाहिए और विशिष्ट कार्यकलाप (pmol/µ g) के लिए 25 से ४० होना चाहिए Cyanine-3 बला का नमूना और 20 से ३५ Cyanine के लिए-5 बला का नमूना ।
    3. उपयोग में microarray प्रारूप के लिए आवश्यक संकरण मास्टर मिश्रण की मात्रा को तैयार करने के लिए, निम्नलिखित एजेंट मिश्रण: ५० µ एल खाट-1 डीएनए (१.० मिलीग्राम/एमएल), ५२ µ एल 10x aCGH अवरुद्ध एजेंट और २६० µ एल 2x हाय-RPM संकरण बफर ।
    4. संकरण मास्टर मिश्रण की उचित मात्रा में जोड़ें १.५ मिलीलीटर RNase-मुक्त ट्यूब जिसमें बला gDNA उपयोग में microarray स्वरूप के लिए आवश्यक कुल वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए । उदाहरण के लिए, 1 पैक microarray के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए अंतिम वॉल्यूम ३६२ µ l है ।
    5. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूना मिश्रण है, तो जल्दी से १४,००० x g पर केंद्रापसारक और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  5. चेंबर्स विधानसभा और संकरण
    1. पाल गैसकेट ऊपर का सामना करना पड़ लेबल के साथ चैंबर आधार में एक साफ गैसकेट स्लाइड लोड और चैंबर आधार के आयताकार अनुभाग के साथ गठबंधन । सुनिश्चित करें कि गैसकेट स्लाइड चैंबर आधार के साथ फ्लश है और अझर नहीं है ।
    2. संकरण नमूना मिश्रण गैसकेट पर वितरण अच्छी तरह से, सुनिश्चित करें कि नमूना समान रूप से वितरित किया जाता है बना ।
    3. एक microarray स्लाइड गैसकेट स्लाइड पर नीचे रखो का आकलन है कि सैंडविच जोड़ी ठीक से गठबंधन है । फिर, प्रतिक्रिया करने के लिए सैंडविच स्लाइड और हाथ पर कवर लगाने चैंबर इकट्ठा-दबाना कस ।
    4. सुनिश्चित करें कि इकट्ठे चैंबर खड़ी घूर्णन द्वारा गीला स्लाइड । सुनिश्चित करें कि बुलबुले चैंबर में मौजूद नहीं हैं । यदि आवश्यक हो, एक कठिन सतह पर विधानसभा नल स्थिर बुलबुले ले जाने के लिए ।
    5. 20 आरपीएम पर घुमाने के लिए सेट एक रोटेटर रैक में इकट्ठे स्लाइड कक्षों रखो । एक ओवन में संकरण चैंबर रखो और ६५ डिग्री सेल्सियस पर 24 या ४० एच के लिए उपयोग में microarray प्रारूप के अनुसार संकरण प्रदर्शन करते हैं ।
  6. Microarray धुलाई और स्कैनिंग
    1. ओवन से बाहर संकरण चैंबर ले लो और यह धो बफर 1 में डूब । अपने विधानसभा के लिए आगे बढ़ें ।
    2. microarray स्लाइड निकालें और जल्दी से यह एक स्लाइड रैक में धोने बफर 1 कमरे के तापमान पर में डाल दिया ।
    3. 5 मिनट के लिए सरणी स्लाइड को चमचे से धोएं (एक पिस और एक चुंबकीय चमचे का प्रयोग करें) । 4 (मध्यम गति) की एक सेटिंग के लिए सरगर्मी गति को समायोजित, अच्छा है लेकिन बहुत जोरदार मिश्रण नहीं मिलता है ।
    4. ९० s चमचे के लिए धो बफर 2 में सरणी स्लाइड धो लें । धीरे बफर से स्लाइड पुनर्प्राप्त (यह शुष्क उभरने चाहिए) और एक स्लाइड रक्षक की सहायता से एक स्लाइड धारक में लोड ।
    5. सरणी स्कैनर में स्लाइड लोड करें और सरणी निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्कैनिंग निष्पादित करें ।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग में स्कैनर के साथ प्रदान की निष्कर्षण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण (V. 9.1.3.1).

3. वेस प्रोटोकॉल

  1. लक्ष्य संवर्धन
    1. साधन प्रोटोकॉल के अनुसार gDNA नमूने की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए dsDNA बीआर परख का प्रयोग करें ।
    2. पतला 5 µ जी उच्च गुणवत्ता डबल किनारा डीएनए के साथ 1x कम ते बफर में १.५ मिलीलीटर कम बांध ट्यूब की कुल मात्रा में ५० µ l
    3. एक sonicator सेट और निर्माता के निर्देश के अनुसार लोडिंग और अनलोडिंग स्टेशन में एक microtube डाल दिया । ट्यूब पर कैप रखें ।
    4. धीरे बुलबुले शुरू करने के बिना पूर्व विभाजन सेपता के माध्यम से ५० µ एल डीएनए नमूना हस्तांतरण ।
    5. विकतरनी sonicator के निर्माता से सुझाव सेटिंग्स के अनुसार डीएनए और निर्माता के निर्देश के अनुसार एक उच्च विश्लेषक का उपयोग कर गुणवत्ता का आकलन । लक्ष्य डीएनए टुकड़ा आकार १५० से २०० bp है ।
  2. डीएनए की मरम्मत समाप्त
    1. अंत मरम्मत Oligo मिश्रण के 10 µ एल के साथ अंत की मरंमत एंजाइम मिश्रण के ४० µ एल मिश्रण से समाप्त मरम्मत प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें । एक भंवर मिक्सर पर अच्छी तरह से मिलाएं ।
    2. एक थर्मल साइकिल चालक में 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन और फिर उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । एक गर्म ढक्कन का उपयोग न करें ।
    3. जोड़ें ५० µ अंत मरंमत प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए कदम 3.2.1 में तैयार प्रत्येक ५० µ l कतरनी डीएनए नमूना अच्छी तरह से । pipetting ऊपर और नीचे या कोमल भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
    4. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक मोतियों आधारित शुद्धि किट के साथ नमूना शुद्ध ।
  3. Polyadenylation 3 ' समाप्त होता है ।
    1. प्रत्येक अंत में मरंमत, शुद्ध डीएनए नमूना (लगभग 20 µ एल) के लिए दा-पूंछ मास्टर मिश्रण के 20 µ एल जोड़ें ।
    2. pipetting ऊपर और नीचे या कोमल भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
    3. एक थर्मल साइकिल चालक में ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन और फिर यह 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । एक गर्म ढक्कन का उपयोग न करें ।
  4. प्री-कैप्चर अनुक्रमण एडेप्टर का बंधाव ।
    1. प्रत्येक एक पूंछ डीएनए नमूने के लिए बंधाव मास्टर मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें ।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए उपयुक्त पूर्व-कैप्चर अनुक्रमणिका समाधान के 5 µ l जोड़ें ।
    3. कुओं को सील करें और 5 एस के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण है । संक्षेप में नमूनों को केंद्रापसारक ।
    4. एक थर्मल साइकिल चालक में 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । एक गर्म ढक्कन का उपयोग न करें ।
    5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक मोतियों आधारित शुद्धि किट के साथ नमूनों को शुद्ध करें ।
  5. अनुक्रमणित लाइब्रेरी का प्रवर्धन ।
    1. पीसीआर मास्टर मिक्स के प्राइमरी मिक्स और 25 µ एल के 1 µ l को मिक्स करके प्री-कैप्चर पीसीआर रिएक्शन मिक्स की उपयुक्त मात्रा तैयार करें । एक भंवर मिक्सर पर अच्छी तरह से मिलाएं ।
    2. एक पीसीआर प्लेट के अलग कुओं में प्रवर्धन मिश्रण के 26 µ l का मिश्रण और प्रत्येक अनुक्रमित gDNA पुस्तकालय नमूना के 24 µ एल.
    3. निंनलिखित चरणों के साथ एक पीसीआर कार्यक्रम चलाने के लिए: ९८ ° c 2 मिनट के लिए, ९८ डिग्री सेल्सियस पर 5 चक्र के लिए 30 s, ६० ° c के लिए 30 s और ७२ ° c 1 मिनट के लिए और ७२ ° c पर एक अंतिम विस्तार के लिए 10 min. 4 ° c पर नमूने पकड़ो ।
    4. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक मोतियों आधारित शुद्धि किट के साथ नमूना शुद्ध ।
    5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक उच्च विश्लेषक के साथ गुणवत्ता का आकलन करें ।
  6. संकरण के लिए अनुक्रमित डीएनए नमूनों की पूलिंग
    1. प्रत्येक कैप्चर प्रतिक्रिया पूल के लिए, एक पीसीआर प्लेट के एक कुआं में प्रत्येक अनुक्रमित gDNA पुस्तकालय नमूना के उपयुक्त मात्रा गठबंधन । उदाहरण के लिए, मानव या माउस अखिल एक्सॉन कब्जा पुस्तकालयों के लिए, प्रत्येक अनुक्रमित पुस्तकालय के १८७.५ एनजी का उपयोग कर पूल प्रति 8 पुस्तकालयों गठबंधन । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अंतिम कैप्चर प्रतिक्रिया पूल १,५०० अनुक्रमित gDNA के एनजी शामिल हैं ।
    2. एक वैक्यूम संकेन्द्रण का उपयोग करके प्रत्येक well में वॉल्यूम को < 7 µ l में कम करें । सैंपल को पूरी तरह से सूखने से बचें ।
    3. प्रत्येक केंद्रित gDNA पूल के लिए पर्याप्त nuclease-मुफ्त पानी जोड़ें 7 µ एल को अंतिम अच्छी तरह से मात्रा लाने के लिए और फिर भंवर gDNA युक्त प्लेट 30 एस के लिए जोरदार एक केंद्रापसारक या मिनी प्लेट स्पिनर के लिए कुओं के नीचे तरल इकट्ठा करने में केंद्रापसारक ।
  7. कब्जा लाइब्रेरी को gDNA लाइब्रेरी पूल का संकरण
    1. प्रत्येक 7 µ एल अनुक्रमित gDNA पूल के लिए, ब्लॉक मिश्रण के 9 µ एल जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए ।
    2. कुओं कैप, थर्मल साइकिल चालक को gDNA युक्त सील प्लेट हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन, तो ६५ डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । सुनिश्चित करें कि प्लेट ६५ ° c पर कम से 5 मिनट के लिए आयोजित किया जाता है ।
    3. RNase ब्लॉक के उपयुक्त कमजोर पड़ने पर कब्जा पुस्तकालय के आकार के आधार पर तैयार करें (पुस्तकालयों के लिए 10% कमजोर पड़ने < ३.० mb और पुस्तकालयों के लिए 25% कमजोर पड़ने > 3.0 mb) ।
    4. कब्जा पुस्तकालय के आकार के अनुसार, कब्जा पुस्तकालय की उचित मात्रा में गठबंधन और एक पीसीआर प्लेट में बर्फ पर रखा RNase ब्लॉक समाधान पतला । pipetting द्वारा अच्छी तरह मिलाएं । कैप्चर लायब्रेरीज़ < 3.0 Mb के लिए, 10% कमजोर पड़ने पर RNase ब्लॉक के लाइब्रेरी के 2 µ l और 5 µ l का उपयोग करें । कब्जा पुस्तकालयों के लिए > 3.0 एमबी, पुस्तकालय के 5 µ एल और 25% कमजोर पड़ने पर RNase ब्लॉक के 2 µ एल का उपयोग करें ।
    5. जोड़ें ३७ µ एल संकरण बफर के प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 7 µ एल कैप्चर लाइब्रेरी/RNase ब्लॉक मिक्स । pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और संक्षेप में मिश्रण युक्त थाली केंद्रापसारक ।
    6. ६५ डिग्री सेल्सियस पर gDNA पूल प्लेट बनाए रखने के लिए एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करते हुए पूरे ४४ µ एल के स्थानांतरण के लिए कदम 3.7.5 से gDNA पूल प्लेट के प्रत्येक नमूने के लिए अच्छी तरह से कब्जा पुस्तकालय के मिश्रण । अच्छी तरह से धीरे से pipetting ऊपर और नीचे 8 से 10 बार मिश्रण ।
    7. गुंबददार पट्टी टोपियां के साथ कुओं को सील । सुनिश्चित करें कि सभी कुओं पूरी तरह से सील कर रहे हैं । थर्मल साइकिल चालक में पीसीआर प्लेट पर एक संपीड़न चटाई रखें ।
    8. ६५ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संकरण मिश्रण की मशीन । नोट: नमूने ७२ h तक के लिए हाइब्रिड हो सकता है, लेकिन सत्यापित करना होगा कि विस्तारित संकरण नमूना कुओं में व्यापक वाष्पीकरण का कारण नहीं है ।
  8. streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों की तैयारी
    1. एक पानी के स्नान या गर्मी ब्लॉक में ६५ डिग्री सेल्सियस पर गर्म धोने बफर 2 ।
    2. जोरदार एक भंवर मिक्सर पर Streptavidin चुंबकीय मोती reसस्पेंड । चुंबकीय मोती भंडारण के दौरान बसा ।
    3. प्रत्येक संकरण नमूना के लिए, एक पीसीआर प्लेट के कुओं के लिए reसस्पैंड मोतियों की ५० µ एल जोड़ें ।
    4. मोती धोने और उंहें २०० µ में बाध्यकारी बफर के एल reसस्पेंड ।
  9. streptavidin मोतियों का उपयोग कर संकरित डीएनए का कब्जा ।
    1. अनुमान है और संकरण समाधान है कि 24 एच की मशीन के बाद रहता है की मात्रा रिकॉर्ड ।
    2. ६५ डिग्री सेल्सियस पर संकरण प्लेट बनाए रखें और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए पूरे खंड (लगभग ६० µ एल) प्रत्येक संकरण मिश्रण के प्लेट कुओं से युक्त २०० µ l को धोया streptavidin मोतियों की. अच्छी तरह से धीरे से pipetting ऊपर और नीचे 3 से 5 बार मिश्रण ।
    3. कुओं कैप और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक Nutator मिक्सर या समकक्ष पर कब्जा थाली मशीन । सुनिश्चित करें कि नमूने ठीक से कुओं में मिश्रण कर रहे हैं ।
    4. संक्षेप में एक केंद्रापसारक या मिनी प्लेट स्पिनर में कैप्चर प्लेट केंद्रापसारक ।
    5. निलंबन से मोतियों को इकट्ठा करने के लिए एक चुंबकीय विभाजक में कैद थाली रखो । supernatant को निकालें और छोड़ें ।
    6. धो २०० µ एल में मोतियों को reसस्पेंड 1 । pipetting ऊपर और नीचे तक मोती पूरी तरह से reसस्पैंड कर रहे है मिश्रण ।
    7. संक्षेप में एक केंद्रापसारक या मिनी प्लेट स्पिनर में केंद्रापसारक ।
    8. चुंबकीय विभाजक में थाली रखो ।
    9. समाधान के लिए प्रतीक्षा करें साफ़ करें, फिर निकालें और supernatant को छोड़ें ।
  10. मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए नमूना प्रसंस्करण के बाद कब्जा
    1. निंनलिखित मिश्रण से पीसीआर रिएक्शन मिक्सचर की उचित मात्रा तैयार करें: 9 µ l Nuclease-फ्री वॉटर, 25 µ l मास् टर मिक्स और 1 µ l प्राइमरी मिक्स प्रवर्धनों की संख् या के अनुसार । एक भंवर मिक्सर का उपयोग अच्छी तरह से मिश्रण और बर्फ पर रखना ।
    2. प्रत्येक प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए, एक पीसीआर प्लेट के कुओं में कदम 3.10.1 से पीसीआर रिएक्शन मिक्सचर के ३५ µ l प्लेस ।
    3. मनका के प्रत्येक पिपेट-बाध्य पर कब्जा कर लिया पुस्तकालय पूल नमूने ऊपर और नीचे सुनिश्चित करें कि मनके निलंबन सजातीय है ।
    4. प्रत्येक पर कब्जा कर लिया पुस्तकालय पूल मनका निलंबन के 15 µ एल जोड़ें उपयुक्त पीसीआर रिएक्शन मिश्रण को अच्छी तरह से । pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण जब तक मनका निलंबन सजातीय है ।
    5. एक थर्मल साइकिल चालक में बिंदु 3.10.2 में तैयार थाली प्लेस और निंनलिखित पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम चलाते हैं: ९८ ° c के लिए 2 मिनट, 30 एस के लिए ९८ ° c पर 8 से 11 चक्र, के लिए ६० ° c 30 s और 1 मिनट के लिए ७२ ° c, 10 मिनट के लिए ७२ ° c पर एक अंतिम विस्तार के द्वारा पीछा किया । 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने पकड़ो ।
    6. एक मोती आधारित शुद्धि के साथ नमूना शुद्ध निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    7. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक उच्च विश्लेषक के साथ गुणवत्ता का आकलन करें ।
  11. मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार
    नोट: अंतिम समृद्ध नमूने या तो 8 या 16 अनुक्रमित पुस्तकालयों के पूल होते हैं, पर कब्जा पुस्तकालय के आकार पर आधारित है और पूर्व के परिणामस्वरूप-पूलिंग रणनीति पर कब्जा । किसी एकल sequencing लेन में मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है अनुक्रमणित लायब्रेरी की कुल संख्या का उपयोग प्लेटफ़ॉर्म के आउटपुट विनिर्देशों द्वारा कैप्चर लायब्रेरी के लिए आवश्यक sequencing डेटा की मात्रा के साथ निर्धारित होता है ।
    1. सूचकांक की संख्या है कि प्रति लेन संयुक्त किया जा सकता है की गणना, मंच की क्षमता के अनुसार । किसी एकल sequencing लेन में मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है अनुक्रमणित लायब्रेरी की कुल संख्या का उपयोग प्लेटफ़ॉर्म के आउटपुट विनिर्देशों द्वारा कैप्चर लायब्रेरी के लिए आवश्यक sequencing डेटा की मात्रा के साथ निर्धारित होता है । उदाहरण के लिए, मानव सभी एक्सॉन v5 लायब्रेरी के लिए, 4 gb प्रति अनुक्रमणित sequencing डेटा अनुशंसित है और पूर्व-कैप्चर पूल प्रति अनुशंसित sequencing डेटा ३२ gb (8-अनुक्रमणिका पूल्स) है ।
  12. लायब्रेरीज़ अनुक्रम ।
    1. पसंद की अगली पीढ़ी sequencing मंच पर पुस्तकालयों लोड और साधन विनिर्देशों के अनुसार चलाने के sequencing प्रदर्शन करते हैं ।
  13. exome sequencing डेटा का विश्लेषण करें ।
    1. पाइपलाइन और बेस कॉलिंग के लिए पसंद का सॉफ़्टवेयर चलाएं । उदाहरण के लिए, स्टैंपिंग का उपयोग मैप करने के लिए20पढ़ता है, डुप्लिकेट को Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) के साथ निकालें और एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं और सम्मिलन या कुर्सियां (indels) Platypus21के साथ हटाने की पहचान करें । समानार्थी वेरिएंट और उन पर एक एलील आवृत्ति < 5% फिल्टर और माता पिता exomes से उन लोगों के साथ डेटा की तुलना de नोवो वेरिएंट की पहचान करने के लिए फ़िल्टर ।

4. Utero Electroporation में प्लाज्मिड DNA तैयार करने के लिए

  1. डिजाइन कई लघु कांटा RNAs (shRNAs) या तो कोडिंग अनुक्रम या 3 ' UTR उंमीदवार जीन के रूप में पहले22वर्णित लक्ष्यीकरण ।
  2. मानक तरीकों का उपयोग कर डेटाबेस के खिलाफ विस्फोट खोज द्वारा लक्ष्य प्रभाव परीक्षण shRNAs विशिष्टता बंद को रोकने के लिए । अंय चूहे जीन के साथ complementarity के अधिक से अधिक ५०% प्रदर्शित shRNAs बाहर ।
  3. क्लोन annealed oligonucleotides में एक mU6-प्रो सदिश के रूप में वर्णित पहले23।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मैक्सी-प्रस्तुत करने के साथ प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध और 3 µ g/µ एल के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए
  5. डीएनए के Aliquot 20 µ एल (०.५ मिलीग्राम/एमएल pCAGGS-GFP या तो अकेले या १.५ के साथ mg/shRNA के निर्माण) और इंजेक्शन की दृश्य निगरानी की अनुमति देने के लिए फास्ट ग्रीन डाई (2 मिलीग्राम/एमएल) के 2 µ एल जोड़ें ।

5. Utero Electroporation में

  1. सर्जिकल प्रक्रिया
    1. Anesthetize ई 15.5 गर्भवती महिला चूहों (E0 शुक्राणु सकारात्मक योनि प्लग की पुष्टि के दिन के रूप में परिभाषित किया गया था), ketamine/xylazine के मिश्रण के साथ एक संयोजन का उपयोग (०.१ और ०.०१ मिलीग्राम शरीर के वजन के अनुसार, क्रमशः), जो एक intraperitoneal के माध्यम से दिया जाता है संवेदनाहारी प्रेरण के लिए इंजेक्शन ।
    2. सुनिश्चित करें कि जानवर पूरी तरह से पैर की अंगुली चुटकी पलटा के पेडों को देख कर anesthetized है ।
    3. जानवर के निचले पेट दाढ़ी एक क्लिपर का उपयोग कर फर को दूर करने के लिए । povidone-आयोडीन और ७०% अल्कोहल की सफ़ाई का उपयोग कर त्वचा को संक्रमित । संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशुचिकित्सा मरहम लागू करें ।
    4. एक गर्मी स्रोत पर पशु प्लेस और चीरा साइट पर (बीच में 4-5 सेमी की एक खुली खिड़की के साथ) एक बाँझ कपड़ा डाल दिया । पहनें facemasks, लैब कोट, टोपियां, और बाँझ सर्जिकल दस्ताने. सर्जरी के अंत तक बाँझ बनाए रखें ।
    5. तेज कैंची का प्रयोग caudal पेट में midline के साथ त्वचा में एक ऊर्ध्वाधर चीरा (2-२.५ सेमी) बनाने के लिए और फिर त्वचा के नीचे मांसपेशियों की दीवार का एक चीरा बनाने-२.५ सेमी की भी-midline के साथ ।
    6. ध्यान से उदर गुहा से एक गर्भाशय सींग बेनकाब । ड्रॉप ३७ ° c पूर्व गरम सामांय खारा समाधान भ्रूण moisturize करने के लिए । हर समय गर्भाशय नम रखें ।
  2. डीएनए और electroporation के इंजेक्शन
    1. धीरे बज संदंश के साथ गर्भाशय सींग की एक पकड़ और ध्यान से गर्भाशय की दीवार को एक भ्रूण धक्का । एक हाथ में भ्रूण पकड़ो और दूसरे हाथ डालने के साथ ध्यान से ग्लास केशिकाओं 1 मिमी midline से बाएँ पार्श्व निलय में (2-3 mm गहरी) और इंजेक्शन के दृश्य निगरानी की अनुमति देने के लिए तेजी से हरे रंग के साथ डीएनए के लगभग 1 µ l सुई एक का उपयोग microinjector ।
    2. 3 x 7 मिमी2 इलेक्ट्रोड सतह पर सामांय खारा समाधान छोड़ें । इंजेक्शन पक्ष (बाएँ पार्श्व निलय) और सही निलय पर नकारात्मक बाँझ इलेक्ट्रोड पर सकारात्मक बाँझ इलेक्ट्रोड प्लेस... ९५० एमएस अंतराल पर एक पैर से नियंत्रित पेडल (४००० mF संधारित्र ४० वी करने के लिए एक electroporator के साथ चार्ज) के साथ 5 बिजली दालों उद्धार ।
  3. पोस्ट electroporation कार्यविधियां
    1. उदर गुहा के लिए वापस गर्भाशय सींग रखो, गुहा के लिए सामांय खारा समाधान की बूंदें जोड़ने के लिए और स्वाभाविक रूप से और intraoperative द्रव नुकसान के लिए खाते में तैनात भ्रूण की अनुमति ।
    2. अवशोषित सर्जिकल टांके के साथ पेट की मांसपेशी दीवार बंद करें, तो एक सरल-बाधित सिलाई का उपयोग त्वचा ।
    3. चूहा पिंजरे में वापस रखो और जानवर की निगरानी जब तक यह संज्ञाहरण से उभर रहे हैं ।
    4. के लिए दर्द प्रबंधन प्रशासन buprenorphine (०.०३ मिलीग्राम/) एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन हर 8-12 एच, ४८ एच तक के लिए द्वारा पशु को ।

6. ब्रेन सैंपल तैयार करना

  1. निर्धारण विधि
    1. एक त्वरित गर्भाशय ग्रीवा के बाद गैस संज्ञाहरण (isoflurane) का उपयोग शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के बाद गर्भवती चूहे की बलि 5 दिन ।
    2. उदर गुहा को पुनः खोलने के लिए एक ऊर्ध्वाधर चीरा लगाएं ।
    3. गर्भाशय के सींग का पर्दाफाश, गर्भाशय से भ्रूण को हटाने और उंहें तेज कैंची का उपयोग कर decapitate ।
    4. ऊतक को ंयूनतम क्षति के साथ मस्तिष्क निकालें: तेज कैंची का उपयोग कर, पीछे (सेरिबैलम) के साथ एक छोटा सा चीरा/पूर्वकाल (महक बल्ब) सिर की त्वचा और खोपड़ी पियर्स करने के लिए, तो संदंश छील की एक जोड़ी का उपयोग दूर खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए मस्तिष्क और एक छोटे से रंग का उपयोग कर इसे हटा दें ।
    5. 1x फास्फेट (पंजाब) में एक 4% Paraformaldehyde में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात दिमाग विसर्जित कर दिया ।
  2. ब्रेन सेक्शनिंग
    1. 10 मिनट के लिए 1x पंजाब में दिमाग धो लो ।
    2. प्लास्टिक embedding मोल्ड में 4% आगर में दिमाग एंबेड करें ।
      1. 5 भ्रूण दिमाग embedding के लिए 1x पंजाब में 4% आगर के ५० मिलीलीटर तैयार करें । यह सुनिश्चित करें कि भंग agarose से अधिक नहीं ५० डिग्री सेल्सियस पर है ।
    3. agarose में दिमाग को 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटे के लिए polymerize में रखें । मस्तिष्क के आसपास अतिरिक्त agarose निकालें ।
    4. vibratome बेस प्लेट के लिए मस्तिष्क गोंद, उन्मुख तो पूर्वकाल/मस्तिष्क के पीछे धुरी ब्लेड करने के लिए सीधा है । गोंद के लिए कुछ ही मिनटों रुको सूखी और vibratome कक्ष में चिपके मस्तिष्क के साथ थाली जगह है ।
    5. 1x पंजाबियों के साथ vibratome भरें । स्लाइस १०० µm मोटी वर्गों ।
    6. स्थानांतरण मस्तिष्क स्लाइसें स्लाइड पर, अतिरिक्त तरल निकालें, बढ़ते माध्यम की कुछ बूँदें जोड़ने और दिमाग के शीर्ष पर एक coverslip जगह

7. फोकल इमेजिंग और मात्रात्मक विश्लेषण

  1. बढ़ते मध्यम इमेजिंग से पहले रात भर सूखी चलो । एक लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप पर 10x में छवि वर्गों ।
  2. मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग, 8 में छवि परिवर्तित बिट, एक प्रतिनिधि GFP सकारात्मक फ्लोरोसेंट सेल का चयन करें और स्वयं अपने आकार को परिभाषित । ऐसा करने के लिए, "अनुमान" पर क्लिक करें और मुक्तहस्त चयन टूल का उपयोग करके कक्ष की बॉर्डर आरेखित करना. इस तरह से कक्ष का व्यास और तीव्रता सीमा स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा बनाए रखा जाता है ।
  3. प्रांतस्था भर में transfected कोशिकाओं को स्थानीयकृत करने के लिए सॉफ्टवेयर की अनुमति देने के लिए "सेल खोजें" पर क्लिक करें । फिर, अगर जरूरत है, मैंयुअल रूप से झूठी सकारात्मक हटा दें ।
  4. प्रांतस्था की पूरी मोटाई अलग वर्गों में सामान्यीकृत ब्याज की 8 क्षेत्रों में विभाजित । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, पर क्लिक करें "क्षेत्र उपकरण", 8 का चयन करें "क्षेत्र धारियों" जहां पहले (1) और अंतिम (8) धारियों VZ करने के लिए और सीपी के शीर्ष क्रमशः के अनुरूप है । पर क्लिक करें "लागू" पूरे प्रांतस्था में GFP transfected कोशिकाओं के रिश्तेदार की स्थिति की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर की अनुमति के लिए. अंत में विश्लेषण के लिए एक एक्सेल फ़ाइल में डेटा निर्यात करने के लिए "सहेजें ठहराव" पर क्लिक करें ।

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Representative Results

उपंयास एमसीडी करणीय जीन की पहचान करने के लिए डिज़ाइन की प्रयोगात्मक रणनीति चित्रा 1में recapitulated है ।

विकासात्मक मस्तिष्क विषमताओं के साथ १५५ रोगियों के एक पलटन में सरणी-CGH प्रदर्शन करके PNH (चित्रा 2a) का संयोजन, कॉर्पस महासंयोजिका dysgenesis, colpocephaly, अनुमस्तिष्क हाइपोप्लेसिया और मिर्गी, polymicrogyria के साथ जुड़े गतिभंग और संज्ञानात्मक हानि, हम 12 रोगियों (चित्रा 2 बी)21द्वारा साझा 6q27 में एक १.२ एमबी ंयूनतम महत्वपूर्ण विलोपन की पहचान की । जीनोमिक क्षेत्र में चार ज्ञात जीन (THBS2, PHF10, TCTE3 और DLL1) और दो अनुमानित जीन (WDR27 और C6orf70) (चित्रा बीसी) शामिल हैं.

सरणी के लिए समानांतर में-CGH, अलग द्विपक्षीय PNH और कोई प्रतिलिपि संख्या भिंनता विश्लेषण के साथ 14 रोगियों में वेस विश्लेषण किया गया था, एक डी नोवो उत्परिवर्तन (सी. 752T > एक: pIle250Asn) के साथ एक रोगी की पहचान की भविष्यवाणी की C6orf70 जीन ( Genbank पहुंच संख्या nm_ 018341.1) (आरेख 3) ।

पुष्टि करने के लिए कि उत्परिवर्तन C6orf70 में पहचान PNH में एक प्रेरणा की भूमिका की थी और जांच करने के लिए कि क्या 6q27 में अंय जीन मानचित्रण के haploinsufficiency phenotype प्रभावित हो सकता है, vivo में ंयूरॉंस प्रवास पर उनकी भूमिका का पता लगाया था utero में RNAi-मध्यस्थता पछाड़ना दृष्टिकोण23,24 चूहे cortical तंत्रिका progenitors में अपनी अभिव्यक्ति मौन का उपयोग करना । केवल विकासशील चूहे प्रांतस्था, PHF10, C6orf70 और DLL1में व्यक्त जीन, परीक्षण (चित्रा 4a) थे । विभिंन लघु कांटा RNAs (shRNAs) इन तीन जीन की कोडिंग अनुक्रम लक्ष्यीकरण उत्पंन किया गया । ShRNAs तो neuroprogenitors में चूहे neocortex में भ्रूण दिवस 15 (electroporation), जब न्यूरॉन्स ऊपरी E15 परतों के लिए प्रतिबद्ध में उत्पंन कर रहे है पर utero cortical में पेश किया गया । ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिकर्मक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के सापेक्ष वितरण 5 दिनों के बाद electroporation की जांच की गई । पछाड़ना के Dll1 और Phf10 के परिणामस्वरूप रेडियल न्यूरॉनल माइग्रेशन का एक मामूली देरी (डेटा नहीं दिखाया गया है), जबकि पछाड़ना के C6orf70 बिगड़ा न्यूरॉनल माइग्रेशन और heterotopic पिंड के विकास के लिए अत्यधिक वृद्धि दी Flna पछाड़ना मॉडल (चित्रा 4B)24में मनाया उन की याद ताजा । इसके विपरीत, अप्रभावी C6orf70 बेमेल shRNA के साथ transfections (चित्रा 4B) ंयूरॉन प्रवास पर कोई स्पष्ट प्रभाव था ।

Figure 1
चित्र 1: उपंयास एमसीडी करणीय जीन पहचान की पहचान के लिए कार्यप्रवाह। विभिंन दृष्टिकोण है कि उपंयास जीन पैदा रोग की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । पीले रंग में रंगे बक्से वर्तमान समाचार पत्र में वर्णित दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: 6q27 विलोपन PNH के साथ असामान्य मस्तिष्क विकास का कारण है । (क) रोगी 2. टी 2-तौला राज्याभिषेक (बाएँ पैनल) और T1-के सलए (दायां पैनल) वर्गों PNH बाईं लौकिक पालि की दीवार अस्तर दिखा (सफेद और काले ऐरोहेड) एक सामने आया द्वीपीय प्रांतस्था नीचे । (ख) रोगी 11. T1-भारित राज्याभिषेक अनुभाग, लौकिक सींग (सफेद ऐरोहेड) की दीवारों के साथ द्विपक्षीय heterotopic पिंड दिखा । (ग) रोगी १२. टी 2-तौला राज्याभिषेक अनुभाग । बाईं ओर, PNH अभी भी (काले ऐरोहेड) दिखाई दे रहा है और निलय फैली हुई हैं । (D) सरणी-CGH (ऊपरी भाग) का उपयोग करके PNH रोगियों में पहचाने गए 6q27 क्षेत्र के विलोपन का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । क्षैतिज, डैश्ड पंक्तियाँ रोगियों में पहचान हटाए गए का प्रतिनिधित्व करते हैं । न्यूनतम महत्वपूर्ण हटाए गए क्षेत्र के आकार भी संकेत दिया है और चार ज्ञात जीन शामिल हैं: THBS2, PHF10, TCTE3 और DLL1 और दो अनुमानित जीन: WDR27 और C6orf70 (ऊपरी भाग) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: sequencing परिणाम। () टी 2-भारित अक्षीय धारा के ललाट सींग (सफेद ऐरोहेड) में 752T ले जा रोगी में द्विपक्षीय PNH > C6orf70 में एक उत्परिवर्तन । (ख) सैंज अनुक्रमण दिखा रहा है कि वेस द्वारा पहचान उत्परिवर्तन डी नोवोहुई । उत्परिवर्तन की स्थिति काले ऐरोहेड द्वारा दर्शाई गई है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: 6q27 ंयूनतम महत्वपूर्ण क्षेत्र और C6orf70-पछाड़ना में स्थानीयकृत जीन के अभिव्यक्ति विश्लेषण cortical न्यूरॉन्स के रेडियल माइग्रेशन बदल जाता है । (A) मात्रात्मक RT-चूहा मस्तिष्क प्रांतस्था में 6q27 महत्वपूर्ण क्षेत्र में निहित जीन की अभिव्यक्ति दिखा. Cyclophilin एक सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था. (ख) प्रतिनिधि neocortical E20 चूहे दिमाग के राज्याभिषेक वर्गों 5 दिन या तो हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ electroporation के बाद अकेले (नियंत्रण) का निर्माण, या shRNA के साथ संयुक्त C6orf70 कोडिंग अनुक्रम (C6orf70-shCDS) लक्ष्यीकरण या सापेक्ष अप्रभावी बेमेल निर्माण (C6orf70-shCDSmm) के साथ । Flna-पछाड़ना (Flna-shCDS) के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया बिगड़ा ंयूरॉन प्रवास । या तो C6orf70-shCDS या FLNA-shCDS के साथ utero electroporation में GFP क्षेत्र (वेंट्रिकुलर) (सफेद तीर) के भीतर VZ-सकारात्मक कोशिकाओं की गिरफ्तारी प्रेरित है, जबकि अकेले या बेमेल निर्माण के साथ संयोजन में GFP व्यक्त कोशिकाओं बदल नहीं किया न्यूरॉन्स माइग्रेशन. स्केल बार्स = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

एमसीडी बौद्धिक विकलांगता के महत्वपूर्ण कारण है और दवा के 20-40% के लिए खाते में प्रतिरोधी बचपन मिर्गी1,2। एमसीडी में ब्याज दो प्रमुख कारकों का एक परिणाम के रूप में पिछले एक दशक में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है । पहले मस्तिष्क इमेजिंग में सुधार (विशेष रूप से एमआरआई) है, जो चिकित्सकों और वैज्ञानिकों कई मस्तिष्क विकृतियों कि पहले से मांयता प्राप्त नहीं थे कल्पना करने की अनुमति देता है । अंय आनुवंशिक उपकरण है कि कई उपंयास एमसीडी करणीय जीन की पहचान की अनुमति दी है के विकास है । यह काफी तंत्र है कि आबाद मस्तिष्क विकास और समारोह के बारे में हमारी जानकारी में सुधार हुआ है, और अधिक सटीक आनुवंशिक परामर्श के लिए अनुमति दी ।

अतीत में, शोधकर्ताओं ने अपने प्रयासों को मुख्य रूप से प्रेरणा जीन पहचान पर ध्यान केंद्रित, कार्यात्मक परख के डिजाइन छोड़ने के लिए मस्तिष्क के विकास में अपनी भूमिका के बाद के चरणों को स्पष्ट । यह अधिक आम छिटपुट विकारों के लिए दुर्लभ, आवर्तक आनुवंशिक विकारों के अध्ययन से प्रगति के कारण और अधिक कठिन हो गया है जिसके लिए पारंपरिक जीन खोजने के तरीके उत्तरदायी नहीं हैं. वर्तमान दृष्टिकोण करणीय जीन की पहचान करने के लिए अक्सर कई जीन युक्त जीनोम के अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्रों की पहचान की अनुमति (सरणी-CGH) या उंमीदवार जीन जो (वेस या WGS) को मांय करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे है की एक संख्या में कई वेरिएंट ।

सरणी-CGH और वेस (या WGS) दृष्टिकोण कई आनुवंशिक विकारों के लिए उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम चौड़ी है । फिर भी, कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं अभी तक बनी हुई हैं । उदाहरण के लिए, सरणी-CGH उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए की जरूरत है और संतुलित अनुवादन या एक एकल जीन के कुछ exons शामिल उन सहित छोटे विलोपन/दोहराव की पहचान करने में विफल रहता है । इस समस्या को दूर करने के लिए, सरणी-CGH पारंपरिक जांच रिक्ति (1m ऐरे-CGH किट का उपयोग करउदा ) या SNP-सरणी विश्लेषण के साथ प्रतिस्थापित की तुलना में एक उच्च संकल्प पर प्रदर्शन किया जा सकता है । वेस अक्सर बड़े intragenic क्षेत्रों को कवर नहीं करता है और गहरे intronic उत्परिवर्तनों की पहचान करने में विफल रहता है । इसके अलावा, कई बार कवरेज (विशेष रूप से मोज़ेक के कम प्रतिशत के साथ उत्परिवर्तनों के मामले में) करणीय उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए भी कम हो सकता है । वेस के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम यह है कि डेटा विश्लेषण और फ़िल्टरिंग अभी भी काफी प्रयास की आवश्यकता है । वेस की कवरेज को बढ़ाने के लिए, एक ही प्रयोग में रोगियों की संख्या कम हो सकता है या अलग कब्जा किट एक ही समय में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

IUE न्यूरॉन के प्रवास पर पछाड़ना जीन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण है । हालांकि, cortical विकास के अंय कदम पर जांच, जैसे neurogenesis और ंयूरॉन परिपक्वता, कुछ तकनीकी सीमाओं से बाधा है । दरअसल, IUE E13 से पहले प्रदर्शन अक्सर असफल रहा है, जबकि बाद के चरणों में जांच इस प्रक्रिया से जुड़े प्रसव घातकता की उच्च दर से प्रतिबंधित कर रहे हैं । इसके अलावा, जीन पछाड़ना क्षमता electroporated काफी phenotypic विविधता के लिए अग्रणी भ्रूण के बीच अलग हो सकता है ।

कुल मिलाकर वर्तमान प्रोटोकॉल में चार प्रमुख महत्वपूर्ण कदम हैं । हालांकि यह वर्तमान अखबार में वर्णित प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है, हमें यह कहना है कि पहले मौलिक कदम को ध्यान में रखा जाए, ऐसे अध्ययनों में दाखिल किए जाने वाले रोगियों का चयन किया जाए । दरअसल, उपंयास एमसीडी जीन की पहचान की प्रक्रिया के लिए रोगियों के एक पलटन में नैदानिक और इमेजिंग जांच की आवश्यकता है जिनके लिए phenotype के रूप में संभव के रूप में सजातीय होना चाहिए । अत्यधिक सजातीय phenotype के साथ रोगियों का संग्रह एक दिया जीन में करणीय उत्परिवर्तनों की पहचान करने का मौका बढ़ जाती है । हालांकि, रोगियों की ंयूनतम संख्या में इस तरह के अध्ययन में दाखिल होने के लिए सफलता प्राप्त करने की भविष्यवाणी कठिन है, क्योंकि यह बहुत अलग जीन के उत्परिवर्तन दर पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, ऐसे FLNAके रूप में जीन के लिए, जो एक्स के पारिवारिक मामलों के १००% में रूपांतरित द्विपक्षीय PNH और छिटपुट रोगियों के 26% में है, रोगियों की संख्या में जीन में कई हिट की पहचान की जरूरत अपेक्षाकृत कम हो सकता है । इसके विपरीत, कम उत्परिवर्तन दर के साथ जीन के लिए, रोगियों की संख्या में जांच की जानी अधिक है । उदाहरण के लिए, C6orf70 के मामले में , हम केवल ६४ रोगियों स्क्रीनिंग (14 वेस और ५० के माध्यम से पारंपरिक सैंज अनुक्रमण के माध्यम से)16, के बारे में १.५% की इस जीन के लिए एक उत्परिवर्तन दर का आकलन करने पर एक एकल प्रेरणा उत्परिवर्तन की पहचान कर रहे थे । दूसरा महत्वपूर्ण कदम सभी ज्ञात एमसीडी जीन में उत्परिवर्तनों का बहिष्कार है ताकि उपंयास करणीय जीन की पहचान के लिए । उपंयास अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के आगमन के लिए धंयवाद, ज्ञात और उंमीदवार जीन के उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग अब एक प्रयोग में किया जा सकता है । हालांकि, उचित वेरिएंट छानने के लिए गलत सकारात्मक की एक अत्यधिक संख्या की उपस्थिति से बचने के लिए प्रयोग की पुष्टि की जानी चाहिए और संभावित प्रेरणा परिवर्तन बाहर फिल्टर करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । दरअसल, उंमीदवार जीन/वेरिएंट की संख्या वेस प्रयोगों में विशेष रूप से उच्च है । यदि एक दिया जीन की भागीदारी संदिग्ध है, उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग भी MLPA विश्लेषण द्वारा पूरित किया जाना चाहिए, microdeletions या microduplications को बाहर करने के लिए । तीसरा महत्वपूर्ण बिंदु तथ्य यह है कि गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं दृढ़ता से विराम बिंदु के स्थान से प्रभावित होते हैं । इस संदर्भ में, यह बाहर करने के लिए लायक है, सबसे बड़ी संभव सीमा तक, व्यवधान या सीआईएस के विस्थापन-विनियामक तत्वों को हटाने/दोहराव में शामिल नहीं जीन के लिए बाहर । अंत में, vivo RNAi प्रयोगों में मान लिया है कि प्रेरणा का जीन भ्रूण चरणों के दौरान ंयूरॉन प्रवास में एक सीधी भूमिका निभाते हैं । हालांकि, PNH सहित एमसीडी के एटियलजि विषम है और utero दृष्टिकोण में विकासात्मक कदमों में शामिल जीन के प्रभाव का पता लगाने में विफल हो सकता है न्यूरॉन प्रसार या कोशिका अस्तित्व । इसके अलावा, मूषक मस्तिष्क की कम जटिलता पछाड़ना या किसी दिए गए उंमीदवार जीन के व्यक्तीकरण के प्रभाव को मुखौटा सकता है, जो मानव मस्तिष्क में और अधिक स्पष्ट हो सकता है ।

हमें विश्वास है कि जीनोमिक्स के एकीकरण और vivo में कार्यात्मक अध्ययन नई एमसीडी करणीय जीन की पहचान के लिए नए नैदानिक उपकरण विकसित करने में मदद मिलेगी । यह रणनीति भी नए पशु मॉडल प्रदान करने के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों का परीक्षण और एमसीडी, जो अब तक प्रायोगिक मॉडल की कमी और प्रभावित रोगियों से मस्तिष्क के ऊतकों तक सीमित उपयोग की अनुपस्थिति द्वारा सीमित किया गया है pathophysiology समझ सकता है । एमसीडी विकारों के साथ जुड़े आणविक मार्ग का गूढ़ रहस्य भी सामान्य रूप से शारीरिक मस्तिष्क विकास के बारे में बहुमूल्य नई जानकारी प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ जी McGillivray, पीआर जे क्लेटन-स्मिथ, पीआर W.B. Dobyns, पीआर. पी. Striano, पीआर. ie Scheffer, पीआर. सपा Roberston और पीआर S.F. Berkovic एमसीडी रोगियों को उपलब्ध कराने के लिए धंयवाद । हम तकनीकी सलाह और मदद के लिए डॉ एफ मिशेल और डी मेई धंयवाद । यह काम यूरोपीय संघ के सात फ्रेमवर्क कार्यक्रम से धन द्वारा समर्थित किया गया था, इच्छा परियोजना, अनुबंध संख्या: स्वास्थ्य-F2-602531-2013, (को विद्याचरण, r, A.R., A.F. और सीसी), INSERM (को A.R. और सीसी), शौकीनों Jérôme Lejeune (R13083AA को ए. एफ., ई. पी. पी और सी. सी.) और Région Provence Alpes कोटे azur (APO2014-अवनती को सीसी और ए. ए. डी.). D. A. K एक EMBO जवान अन्वेषक है और FWF पलाश (I914 and P24367) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Picospritzer III Parker Hannifin Corp P/N 051-0500-900 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0002 The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V Microm 10076838 Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300 Olympus The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software Glance Vision Technologies eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K Agilent Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K Agilent Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless Agilent Agilent p/n G2534A Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays Agilent Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven Agilent Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers Agilent Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid Agilent Agilent p/n G8800A or equivalent Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube Ambion p/n AM12400 or equivalent Microcentrifuge
Magnetic stir bar Corning p/n 401435 or equivalent Instrument for stirring
Qubit Fluorometer Life Technologies p/n Q32857 Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer Invitrogen p/n Q32850 Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes Pipetman or equivalent DNA dispensation
Vacuum Concentrator Thermo Scientific p/n DNA120-115 or
equivalent		 Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit Agilent p/n 5190-4240 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units) Agilent p/n 5190-3391 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates GE Healthcare p/n 25-9005-98 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich p/n NA1020 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA p/n G1521 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays: Promega (female) or p/n G1471 (male) Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays: Coriell p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or Agilent p/n 5188-5226 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and Agilent p/n 5188-5221 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 Agilent p/n 5188-5222 Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution Agilent p/n 5185-5979 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA Agilent p/n 5190-3393 Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner Agilent Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples Agilent p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples Agilent p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples Agilent p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples Agilent p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples Agilent p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples Agilent p/n G9622C
DNA 1000 Kit Agilent p/n 5067-1504 Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit Agilent p/n 5067-4626 Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit Kit for automated PCR purification.
5 mL Agencourt p/n A63880
60 mL Agencourt p/n A63881
450 mL Agencourt p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL Life Technologies Cat #65601
10 mL Life Technologies Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32853
Qubit assay tubes Life Technologies p/n Q32856 DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries Agilent depending on the experiment Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8800A DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8810A DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates Agilent p/n 410088 DNA amplification
Optical strip caps Agilent p/n 401425 DNA amplification
Tube cap strips, domed Agilent p/n 410096 DNA amplification
Compression mats Agilent p/n 410187 DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle Agilent p/n G2943CA DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set Agilent p/n G2947CA DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series Covaris DNA shearing
Covaris sample holders p/n 520078 DNA shearing
Nutator plate mixer BD Diagnostics p/n 421105 or equivalent Plate Mixer
GaIIx Illumina next generation sequencing machine

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३० cortical विकास की विकृतियों सरणी-CGH पूरे-exome अनुक्रमण utero electroporation पशु मॉडल आरएनए हस्तक्षेप में
एक उपंयास रणनीति सरणी के संयोजन-CGH, पूरे exome अनुक्रमण और कुतर में <em>Utero Electroporation में</em> मस्तिष्क विकृतियों के लिए करणीय जीन की पहचान करने के लिए में
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Conti, V., Carabalona, A., Pallesi-Pocachard, E., Leventer, R. J., Schaller, F., Parrini, E., Deparis, A. A., Watrin, F., Buhler, E., Novara, F., Lise, S., Pagnamenta, A. T., Kini, U., Taylor, J. C., Zuffardi, O., Represa, A., Keays, D. A., Guerrini, R., Falace, A., Cardoso, C. A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations. J. Vis. Exp. (130), e53570, doi:10.3791/53570 (2017).

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