Summary
뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.
Abstract
대뇌 피 질을 포함 하는 출생 결함-대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형으로 알려진-어린 시절에 지적 장애 및 간 질 약물 내성의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. 고해상도 뇌 영상 vivo에서 상승할 고기의 큰 그룹의 식별을 용이 있다. 뇌 이미징, 게놈 분석 및 동물 모델의 발전에도 불구 하 고 간단한 워크플로 putative 돌연변이의 기능 효과 테스트 하 고 체계적으로 후보 유전자를 우선 순위를 없습니다. 이 문제를 해결 하려면 MCD에 대 한 새로운 원인 유전자의 id를 사용 하는 실험적인 전략 개발 및 검증. 식별 후보 게놈 지역 또는 배열 CGH 또는 전체-exome 시퀀싱 및 그들의 비활성화의 또는 utero 통해 설치류 두뇌 개발에 특정 변이의 overexpression의 효과 통해 유전자를 기반으로 하는이 전략 electroporation입니다. 이 방법은 뇌 결 heterotopia, 결함이 있는 신경 마이그레이션에 의해 발생 하는 MCD의 병 인에 상 상속 기공을 단백질에 대 한 인코딩 C6orf70 유전자의 id에 지도 했다.
Introduction
대뇌 피 질 인지, 지적 프로세스에서 중요 한 역할 이며 참여 감정 컨트롤, 학습 및 메모리. 그것은 따라서 놀라운 많은 신경 및 정신 질환에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형 발생 하지입니다. MCD의 병 인 모두 인수 이후 복잡 한 이며 유전적 요인 관련. MCD의 유전자 결정된 비율의 누적 보급은 약 2% 이며 대부분의 경우에서 산발적. 예를 들어, 선 천 성 뇌 dysgenesis의 발생률은 인간의 인구에 1% 보다 높은 것으로 추정 하 고 MCD의 일부 형태의 간 질을 가진 모든 환자의 14% 이상에 고 심한 또는 다루기 어려워 간 질1, 의 40%에서 관찰 된다 2.
뇌 결 Heterotopia (PNH) 가장 일반적인 MCDs 중 하나 이며 발전 대뇌 피 질에 심 실 영역 (VZ)에서 신경 세포의 비정상적인 이동에 의해 발생 합니다. 마이그레이션 결과 클러스터에는 일반적으로 자기 공명 영상 (MRI)를 사용 하 여 구상 될 수 있다 측면 뇌 실 벽을 따라 heterotopic 뉴런의 신경의 실패. PNH의 임상, 해부학 및 이미징 기능 유형이 다른 있습니다. 혹 양측을 대칭 작고 일방적인에서 범위 수 있습니다. 일반적인 임상 sequelae 포함 간 질과 지적 장애3. Xq28에 지도, Filamin A (또는 FLNA) 유전자에 돌연변이 산발적 환자3,4의 26%에서 양측 PNH X 연결 된 가족의 100%에 발견 했다. 20q13에 지도 하는 ARFGEF2 유전자에 있는 돌연변이 기인한 PNH의 희귀, 열성 형태 두 consanguineous 가족5에 보고 되었습니다. 최근, biallelic 돌연변이 유전자 DCHS1 및 FAT4 수용 체 ligand cadherin 쌍을 인코딩 PNH6을 포함 하는 multisystemic 장애에 의해 영향을 받는 9 환자에서 확인 되었습니다. PNH 또한 연관 되어 연약한 X 증후군7, 윌리엄스 증후군8, 22q11 microdeletion 증후군9, 5 p 1510중복, 삭제 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 및 6q 터미널 삭제 증후군14,15,,1617,18,19, 추가 원인 유전자 흩어져 있습니다 제안 전체 게놈. 그러나, 약 74%의 산발적 PNH 환자에 대 한 유전으로 해명된17수 남아 있습니다.
그러나 고아 한 유전자 매핑 접근 배열 비교 Genomic 교 잡 (배열 CGH) 입증 하위 미세한 염색체 이상,,이 접근을 사용 하 여 식별 하는 게놈 영역 검출을 위한 강력한 도구와 같은 종종 큰 많은 유전자를 포함 하 고.
대규모 병렬 시퀀싱 기술 (즉, 전체 Exome 시퀀싱 (WES) 그리고 전체 게놈 시퀀싱 (WGS))의 출현은 실질적으로 비용 및 전체 인간의 exome 또는 게놈을 시퀀싱 하는 데 필요한 시간이 감소 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 웨스와 WGS 데이터의 해석 데이터 필터링에서 각 환자 수만 수백 (또는 수천, 분석의 유형에 따라) 변종 등장에 대 한 이후 대부분의 경우에 도전 남아 있습니다.
소설 상승할 원인이 유전자, 배열 CGH를 결합 하 여 새로운 체계적인 전략을 식별의 과정을 속도를, 후보 유전자의 웨스와 utero에서 electroporation (IUE) 심사 설계 되었습니다. IUE 있게 선택적으로 비활성화 (또는 overexpress) 특정 유전자 돌연변이 설치류 두뇌에 corticogenesis18,19에 있는 그들의 관련의 급속 한 평가 사용 합니다. RNAi 중재 최저 또는 하나 이상의 후보 유전자의 overexpression 발생할 유전자 관련 질병 개발, 신경 마이그레이션 또는 성숙에 지역화 된 결함은 예상 된다. 누구의 비활성화 (또는 overexpression) 재현 설치류에 환자에서 관찰 표현 형 유전자의 식별에 따라 상승할 산발적 인 환자에서 심사에 대 한 뛰어난 후보 된다. 우리 최근 환자 6q27 염색체 삭제16오 병 인 PNH에 C6orf70 유전자 (일컬어 ERMARD)의 중요 한 기여를 밝혀이 접근을 사용 하 여.
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Protocol
윤리 성명: Wistar 쥐 성관계, 유지 되었고 INMED 동물 시설, 유럽 연합 및 프랑스 법안 동의에서 사용.
1. DNA 추출 및 배열 CGH와 웨스에 대 한 정량화
- 자동된 DNA 분리 로봇 또는 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 수동 DNA 추출 키트를 사용 하 여 환자에서 인간의 혈액 백혈구에서 게놈 DNA (gDNA)를 추출 합니다. 계량 한 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 샘플.
2. 배열 CGH 프로토콜
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GDNA의 제한 소화
- 환자 및 2 h 37 ° c.에 대 한 상용 인간의 제어 RsaI와 AluI DNA에서 순화 gDNA의 두 배 다이제스트 500 ng 10 U/μ 효소의 0.5 μ를 사용 하 여 각 반응에 대 한. 효소를 비활성화 하 여 얼음 샘플 튜브를 이동 65 ° C에서 20 분 동안 품 어.
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샘플 라벨
- 각 반응 관 (예: 5 1 팩, 2 팩, 4 팩 microarrays에 µ l)을 사용 하 고 있는 microarray 형식에 필요한 임의의 뇌관의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
- 열 cycler에 샘플 튜브를 전송. 그리고 5 분 동안 4 ° C에서 3 분 동안 95 ° C에 품 어.
- 준비 한 cyanine 3 및 한 cyanine 5 다음 볼륨을 혼합 하 여 얼음에 마스터 믹스 라벨: 10.0 µ l 5 배 반응 버퍼, 5.0 µ l 10 x dNTPs, 3.0 µ l Cyanine 3 dUTP 또는 Cyanine 5-dUTP 및 1.0 µ l 엑 소 (-) Klenow 효소, 2.0 µ l Nuclease 무료 물. Microarray 형식에 따라 각 시의 볼륨 사용을 선택 합니다.
- gDNA를 포함 하는 각 반응 관에 라벨 마스터 믹스를 추가 합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
- 샘플 튜브 열 cycler에 전송 하 고 2 시간, 10 분 동안 65 ° C에서 37 ° C에서 품 어 다음 4 ° c.에 샘플을 유지
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이라는 gDNA의 정화
- 각 반응 관에 1 x 테 (pH 8.0)의 430 µ l를 추가 합니다.
- 2 mL 컬렉션 튜브로 정화 열을 배치 하 고 라벨 열을 적절 하 게. 정화 열에 각 이라는 gDNA를 로드 합니다.
- 실 온에서 microcentrifuge에 14000 x g에서 10 분 원심 분리기. 흐름을 통해 삭제 하 고 다시 2 ml 컬렉션 튜브에에서 열을 배치.
- 각 열에 1 x 테 (pH 8.0)의 480 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 microcentrifuge에 14000 x g에서 10 분 원심 분리기. 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 신선한 2 mL 컬렉션 튜브 및 순화 된 샘플 수집을 실 온에서 microcentrifuge에 1000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기로 열 반전.
- 집중 장치를 사용 하 여 또는 1 x 테 (pH 8.0) 추가 사용에 microarray 형식에 대 한 요청을 샘플 볼륨을가지고. 예를 들어 1 팩 microarray가지고 볼륨 80.5 대 한 µ L. 5 분 동안 얼음에 샘플을 품 어 그리고 10 번 위아래로 솔루션 플라스틱.
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교 잡에 대 한 이라는 gDNA의 준비
- 테스트 및 참조 샘플 RNase 무료 신선한 1.5 mL 튜브에 적절 한 cyanine 5 표시 샘플 및 cyanine 3에 표시 된 샘플을 사용 하 여 결합 합니다. 예를 들어, 1-팩 microarray 있도록 최종 볼륨에 대 한 158 µ L. 사용에서 microarray 형식에 따라 각 샘플의 볼륨 선택입니다.
- 수율, A260 nm (DNA), a 550 nm (cyanine 3), 및 (cyanine 5) A650 nm에서 흡 광도 측정 하 여 라벨 또는 특정 활동의 정도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.
- 수식을 사용 하 여 수율 계산: [샘플 볼륨 (µ l) x DNA concentration(ng/µl)] / 1000 (ng / µ g). 계산 하는 수식을 사용 하 여 특정 활동: pmol gDNA의 µ l 당 염료 / µ g의 µ l 당.
참고: 예를 들어 입력 DNA의 0.5 µ g에 대 한 수익률 8 ~ 11 µ g 고 Cyanine 3 표시 샘플 및 20 ~ 35 Cyanine 5 이라는 샘플에 대 한 특정 활동 (pmol / µ g) 25 ~ 40 이어야 한다.
- 수식을 사용 하 여 수율 계산: [샘플 볼륨 (µ l) x DNA concentration(ng/µl)] / 1000 (ng / µ g). 계산 하는 수식을 사용 하 여 특정 활동: pmol gDNA의 µ l 당 염료 / µ g의 µ l 당.
- 교 잡 마스터 믹스 사용에서 microarray 형식에 필요한 금액, 혼합 준비 다음 시 약: 50 µ L 침대 1 DNA (1.0 mg/ml), aCGH 차단 에이전트 및 260 µ l 2 x 52 µ L 10이 RPM 교 잡 버퍼 x.
- 사용에서 microarray 형식에 필요한 총 볼륨 이라는 gDNA를 포함 RNase 무료 1.5 ml 튜브에 적절 한 양의 교 잡 마스터 믹스를 추가 합니다. 예를 들어 1 팩 microarray에 대 한 각 반응에 대 한 최종 볼륨 362 µ l 인지 확인 합니다.
- 아래로, pipetting으로 샘플을 혼합 후 신속 하 게 14000 x g에서 원심 고와 30 분 동안 37 ° C에서 95 ° C에서 3 분 동안 품 어.
-
챔버 및 교 잡
- 가스 켓 레이블이 위로 향하도록 하 고 챔버 기지의 직사각형 섹션 정렬 챔버 베이스에 깨끗 한 가스 켓 슬라이드를 로드 합니다. 가스 켓 슬라이드 챔버 기반 플러시 이며 열려 되지 않습니다 확인 하십시오.
- 가스 켓 음, 샘플 균일 하 게 분산 되어 있는지에 교 잡 견본 혼합물을 분배.
- 가스 켓 슬라이드 평가 샌드위치-쌍 올바르게 정렬에 microarray 슬라이드를 내려 놔. 그런 다음 샌드위치 슬라이드에 커버 하 고 손을 강화 클램프 반응 챔버 조립.
- 일로 조립된 챔버를 수직으로 회전 하 여 슬라이드를 확인 합니다. 거품이 챔버에 존재 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 필요한 경우, 하드 표면에 어셈블리 고정 거품 이동을 누릅니다.
- 20 rpm에 회전 설정 회전 랙에서 조립된 슬라이드 챔버를 넣어. 오븐에서 교 잡 챔버를 넣고 microarray 형식 사용에 따라 24 또는 40 h 65 ° C에서 교 잡 수행.
-
Microarray 세척 및 스캔
- 오븐에서 교 잡 실 고 워시 버퍼 1에서에서 잠수함. 그것의 분해를 진행 합니다.
- Microarray 슬라이드를 제거 하 고 신속 하 게 슬라이드 랙 워시 버퍼 1 실내 온도에 그것을 넣어.
- 교 반 (사용 벼룩과 자기 활동가)와 5 분 동안 배열 슬라이드를 씻어. 너무 활발 한 혼합 하지만 좋은 4 (중간 속도), 설정 교 반기 속도 조정 됩니다.
- 워시 버퍼 2 90 s 감동에 대 한 배열 슬라이드를 씻어. (그것은 건조 등장 한다) 버퍼에서 슬라이드를 부드럽게 복구 슬라이드 홀더 슬라이드 보호자의 도움으로 그것을 로드.
- 배열 스캐너로 슬라이드를 로드 하 고 배열 제조업체의 지침에 따라 검색을 수행.
- 제조업체의 지침 (V.9.1.3.1)에 따라 사용 중인 스캐너와 함께 제공 되는 추출 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 합니다.
3. 웨스 프로토콜
- 대상 농축
- DsDNA BR 분석 결과 사용 하 여 악기 프로토콜에 따라 gDNA 샘플의 농도 결정.
- 1 x 1.5 mL 낮은 바인딩 튜브 50 µ L의 전체 볼륨에 낮은 테 버퍼와 높은-품질 이중 가닥 DNA의 5 µ g을 희석.
- sonicator를 설정 하 고 제조업체의 지시에 따라 로드 및 언로드 역에는 microtube를 넣어. 관에 뚜껑을 유지.
- 천천히 거품 소개 없이 미리 분할된 septa 통해 50 µ l DNA 샘플을 전송.
- Sonicator의 제조 업체에서 권장 하는 설정에 따라 DNA를 전단 하 고 제조업체의 지시에 따라 Bioanalyzer을 사용 하 여 품질 평가. 대상 DNA 조각 크기는 150 ~ 200 bp.
- DNA의 복구 끝
- 10 µ L 최종 수리 올리고 혼합의와 최종 수리 효소 혼합의 40 µ L를 혼합 하 여 최종 수리 반응 혼합을 준비 합니다. 와 동 믹서에 잘 섞는다.
- 열 cycler에서 30 분 동안 20 ° C에서 샘플을 품 어와 다음 4 ° c.에서 그들을 잡아합니다 열띤된 뚜껑을 사용 하지 마십시오.
- 50 µ L 단계 3.2.1 각 50 µ L에서에서 준비 끝 복구 반응 혼합의 전단 DNA 샘플 잘 추가 합니다. 믹스 잘 아래로 pipetting 또는 부드러운 vortexing.
- 기반으로 하는 구슬 정화 키트 제조 업체 프로토콜에 따라 샘플을 정화.
- 3'의 Polyadenylation 끝납니다.
- 각 엔드 수리, 순화 된 DNA 샘플 (약 20 µ L)를 다 미행 마스터 믹스 20 µ l를 추가 합니다.
- 믹스 잘 아래로 pipetting 또는 부드러운 vortexing.
- 37 ° c 열 cycler에서 샘플을 품 어 누르고 4 ° c.에 열띤된 뚜껑을 사용 하지 마십시오.
- 캡처 전 인덱싱 어댑터 결 찰이 고
- 각 A 꼬리 DNA 샘플을 결 찰 마스터 믹스의 5 µ L를 추가 합니다.
- 각 샘플에 적절 한 사전 캡처 인덱스 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다.
- 우물을 밀봉 하 고 5 s. 짧게 원심 분리기 샘플에 대 한 vortexing에 의해 철저 하 게 혼합.
- 열 cycler에서 15 분 동안 20 ° C에서 샘플을 품 어와 다음 4 ° c.에서 개최 열띤된 뚜껑을 사용 하지 마십시오.
- 기반으로 하는 구슬 정화 키트 제조 업체 프로토콜에 따라 샘플을 정화.
- 인덱싱된 라이브러리 증폭
- 뇌관 믹스의 1 µ L PCR 주인 혼합의 25 µ L를 혼합 하 여 캡처 전 PCR 반응 혼합의 적절 한 볼륨을 준비 합니다. 와 동 믹서에 잘 섞는다.
- 26 µ L PCR 접시의 별도 우물에 증폭 혼합물의 각 인덱싱된 gDNA 라이브러리 샘플의 24 µ L을 결합.
- PCR 프로그램을 실행 하는 다음 단계: 30 98 ° C에서 2 분 동안 98 ° C, 5 사이클 s, 60 ° C 30 s 및 1 min과 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 위한 72 ° C 샘플 4 ° c.에서 개최
- 기반으로 하는 구슬 정화 키트 제조 업체 프로토콜에 따라 샘플을 정화.
- Bioanalyzer 제조 업체 프로토콜에 따라 품질을 평가 합니다.
- 교 잡에 대 한 인덱싱된 DNA 샘플의 풀링
- 각 캡처 반응 풀에 PCR 접시의 한 잘 각 인덱싱된 gDNA 라이브러리 샘플의 적절 한 볼륨을 결합 한다. 예를 들어 인간 또는 마우스 모든 Exon 캡처 라이브러리, 187.5를 사용 하 여 풀 당 8 라이브러리 결합 각 인덱싱된 라이브러리의 ng. 각 최종 캡처 반응 풀 1500 포함 되어 있는지 확인의 인덱싱된 gDNA ng.
- 잘 각 볼륨을 줄이기 위해 < 7 µ L 진공 집중 장치를 사용 하 여. 샘플을 완전히 건조 하지 마십시오.
- 각 집중된 gDNA 풀 려 마지막 잘 볼륨 7 µ L 그리고 소용돌이 격판덮개 우물의 바닥에 액체를 수집 하는 원심 분리기 또는 미니 플레이트 회전자 30 s. 원심 분리기에 대 한 적극적으로 gDNA를 포함 된 충분 한 nuclease 무료 물을 추가 합니다.
- 캡처 라이브러리를 gDNA 도서관 풀의 교 잡
- 각 인덱스 7 µ L gDNA 풀 믹스 차단의 9 µ l를 추가 합니다. 아래로 혼합 플라스틱.
- 우물 뚜껑 봉인된 플레이트 열 cycler에 gDNA를 포함 전송 그리고 5 분 동안 95 ° C에서 품 어, 65 ° c.에서 개최 접시 적어도 5 분 동안 65 ° C에서 개최 됩니다 있는지 확인 합니다.
- 캡처 라이브러리의 크기에 근거 하 여 RNase 블록의 적절 한 희석을 준비 (< 3.0 Mb와 25% 희석 라이브러리 > 라이브러리에 대 한 10% 희석 3.0 Mb).
- 캡처 라이브러리 크기에 따라 적절 한 양의 캡처 라이브러리를 결합 하 고 얼음에 보관 하는 PCR 접시에서 RNase 블록 솔루션을 희석. Pipetting으로 잘 섞는다. 캡처 라이브러리에 대 한 < 3.0 Mb, 라이브러리의 사용 2 µ l와 10% 희석에서 RNase 블록의 5 µ L. 캡처 라이브러리 > 라이브러리의 사용 5 µ l 및 25% 희석에서 RNase 블록의 2 µ l 3.0 Mb.
- 각 잘 캡처 라이브러리/RNase 블록 믹스의 7 µ L을 포함 하 게 교 잡 버퍼의 37 µ L를 추가 합니다. Pipetting으로 잘 혼합 하 고 혼합을 포함 하는 접시를 간단히 원심.
- 단계의 3.7.5 gDNA 풀 플레이트의 각 샘플 캡처 라이브러리 혼합물의 전체 44 µ L를 전송 하는 멀티 채널 피 펫을 사용 하는 동안 65 ° C에서 gDNA 풀 플레이트를 유지 합니다. 천천히 10 번에 8 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
- 돔형된 스트립 모자 우물을 봉인. 모든 우물은 완전히 봉인 되어 다는 것을 확인 하십시오. 압축 매트 열 cycler에서 PCR 접시를 놓습니다.
- 65 ° c.에 24 h에 대 한 교 잡 혼합물을 품 어 참고: 샘플 최대 72 h에 대 한 때 교배 될 수 있지만 확장된 교 잡 샘플 우물에서 광범위 한 증발을 발생 하지 않습니다 확인 해야 합니다.
- 마그네틱 구슬 streptavidin 입히는의 준비
- 워시 버퍼 2 물 목욕 또는 열 블록에서 65 ° C에서 prewarm
- 적극적으로 소용돌이 믹서에 Streptavidin 자석 구슬 resuspend. 마그네틱 구슬 보관 시 정착.
- 각 교 잡 샘플을 PCR 격판덮개의 우물에 resuspended 구슬의 50 µ L를 추가 합니다.
- 비즈를 세척 하 고 바인딩 버퍼의 200 µ L에 그들을 resuspend.
- Streptavidin 비즈를 사용 하 여 교배 DNA의 캡처.
- 예상 하 고 24 시간 배양 후 남아 있는 교 잡 솔루션의 볼륨을 기록 합니다.
- 65 ° C에서 교 잡 플레이트를 유지 하 고 전체 볼륨 (약 60 µ L) 전송 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 씻어 streptavidin 구슬의 200 µ L을 포함 하는 접시 우물에 각 교 잡 혼합물의. 3 5 번 위아래로 천천히 pipetting으로 잘 섞는다.
- 우물 뚜껑 하 고 캡처 접시 Nutator 믹서 또는 상응 하는 실 온에서 30 분 동안에 품 어. 샘플 제대로 우물에 혼합 하는 다는 것을 확인 하십시오.
- 짧게 원심 분리기 또는 미니 플레이트 회전자에 캡처 접시.
- 현 탁 액에서 구슬 수집 하 자석 분리기에 캡처 접시를 넣어. 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
- 워시 버퍼 1의 200 µ L에 구슬 resuspend. 비즈는 완전히 resuspended 때까지 아래로 pipetting으로 혼합.
- 짧게 원심 분리기는 원심 분리기 또는 미니 플레이트 회전자에.
- 자석 분리기에 접시를 넣어.
- 취소, 다음 제거 하 고 삭제는 상쾌한 솔루션에 대 한 기다립니다.
- 후 샘플 다중화 시퀀싱에 대 한 처리를 캡처합니다
- 다음 혼합 하 여 PCR 반응 혼합물의 적절 한 볼륨을 준비: 9 µ L Nuclease 무료 물, 25 µ L 뇌관 확대의 수에 따라 믹스 마스터 믹스와 1 µ L. 와 동 믹서를 사용 하 여 잘 혼합 하 고 얼음에 계속.
- 각 증폭 반응, PCR 격판덮개의 우물에서 35 µ L 단계 3.10.1에서에서 PCR 반응 혼합물의 장소.
- 각 구슬 서 스 펜 션은 균질 되도록 아래로 구슬 바인딩된 캡처된 도서관 풀 샘플 플라스틱.
- 적절 한 PCR 반응 혼합물에 잘 각 캡처된 도서관 풀 비드 서 스 펜 션의 15 µ L를 추가 합니다. 구슬 서 스 펜 션은 균질까지 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
- 포인트 열 cycler에서 3.10.2 준비 접시를 놓고 다음 PCR 증폭 프로그램 실행: 2 분, 30 대 98 ° C에서 8 ~ 11 사이클 동안 98 ° C s, 60 ° C 30 s, 1 분에 72 ° C에 대 한 다음 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장. 샘플 4 ° c.에서 개최
- 샘플 제조 업체 프로토콜에 따라 구슬 기반으로 정화와 정화.
- Bioanalyzer 제조 업체 프로토콜에 따라 품질을 평가 합니다.
- 시퀀싱 다중화 샘플 준비
참고: 최종 농축된 샘플 포함 8 또는 16 인덱싱된 라이브러리, 캡처 라이브러리 크기에 따라 전략을 풀링 캡처 전 결과의 풀. 인덱싱된 라이브러리를 단일 연속 차선에 멀티플렉스 수의 총 수는 시퀀싱 데이터 캡처 라이브러리에 필요한 금액을 함께 사용 하는 플랫폼의 출력 사양에 의해 결정 됩니다.- 플랫폼의 용량에 따라 레인, 당 결합 될 수 있는 인덱스 수를 계산 합니다. 인덱싱된 라이브러리를 단일 연속 차선에 멀티플렉스 수의 총 수는 시퀀싱 데이터 캡처 라이브러리에 필요한 금액을 함께 사용 하는 플랫폼의 출력 사양에 의해 결정 됩니다. 예를 들어 인간의 모든 Exon v5 라이브러리에 대 한 인덱스 라이브러리 당 권장 시퀀싱 데이터는 4gb 이며 캡처 전 풀 당 권장 시퀀싱 데이터 32 기가바이트 (8-인덱스 풀).
- 라이브러리를 시퀀스.
- 선택의 차세대 시퀀싱 플랫폼에 라이브러리를 로드 하 고 시퀀싱 장비 사양에 따라 실행을 수행 합니다.
- Exome 시퀀싱 데이터를 분석 합니다.
- 파이프라인 및 기본 통화에 대 한 선택의 소프트웨어를 실행 합니다. 예를 들어 읽기20지도, 피 (http://broadinstitute.github.io/picard/)와 중복을 제거 하 고 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 및 삽입 또는 삭제 오리너구리21(indels)의 식별에 Stampy를 사용 합니다. 동의어 이체와는 대립 유전자 주파수에 관찰을 필터링 < 5%와 비교 데이터 드 노 보 이체를 식별 하기 위해 부모의 exomes에서.
4. 플라스 미드 DNA 준비 Electroporation Utero에 대 한
- 디자인 코딩 시퀀스 또는 3' UTR 앞에서 설명한22후보 유전자의 대상으로 몇 가지 짧은 머리 핀 RNAs (shRNAs).
- 목표 방지 효과 폭발 검색 표준 방법을 사용 하 여 데이터베이스에 대해 shRNAs 특이성을 테스트. 다른 쥐 유전자 complementarity의 50% 이상 표시 하는 shRNAs를 제외 합니다.
- 로 mU6 프로 벡터에 클론 단련 oligonucleotides23이전 설명.
- 제조업체의 지침에 따라 맥시 준비와 함께 DNA 플라스 미드 정화 하 고 3 µ g / µ L의 최종 농도 확인.
- DNA (0.5 mg/ml pCAGGS-GFP 혼자 또는 1.5 mg/ml shRNA의 구성 중 하나)의 aliquot 20 µ l의 빠른 2 µ L을 추가 하 고 녹색 염료 (2 mg/mL) 주입의 비주얼 모니터링 허용.
5. Electroporation Utero에서
-
외과 절차
- E15.5 임신 여성 쥐 (E0 정자 긍정적인 질 플러그의 확인 당일으로 정의 되었다), 케 타 민/xylazine의 혼합물으로 결합을 사용 하 여 anesthetize (0.1과 0.01 mg 바디 당 무게, 각각),이 한 복을 통해 주어진 다 마 취 유도 주입
- 동물 발가락 핀치 반사의 실종을 관찰 하 여 완전히 마 취 다는 것을 확인 하십시오.
- 동물의 아랫 배 모피를 제거 하는 클리퍼를 사용 하 여 면도. Povidone-요오드와 70% 알코올의 스크럽을 사용 하 여 피부를 소독. 수 의사 연 고 마 취 상태에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
- 열원에는 동물을 배치 하 고 절 개 사이트에 (중간에 4-5 cm의 열린 창)와 살 균 드 레이프를 넣어. 검, 실험실 외 투, 모자, 그리고 무 균 수술 장갑을 착용 하십시오. 수술의 끝까지 불 임을 유지 합니다.
- 수직 절 개 (2-2.5 cm) 꼬리 복 부에서 정중 선 따라 피부에서 확인 하 고 다음 피부 아래 근육 벽의 절 개를 날카로운가 위를 사용 하 여-2.5 c m의도-중간 선 따라.
- 신중 하 게 복 부 구멍에서 한 자 궁 경적 노출. 37 ° C 배아 수 분을 미리 데워 정상적인 염 분 해결책을 드롭. 계속 자 궁 습 한 모든 시간.
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DNA와 electroporation의 주입
- 부드럽게 낀된 집게와 자 궁 뿔 중 하나를 보유 하 고 하나의 배아 자 궁 벽에 밀어. 태아 한 손으로 다른 손 삽입와 신중 하 게 유리 모 세관 1 m m는 중간에서 왼쪽된 측면 뇌 실 (2-3 밀리미터 깊은)으로 누른 주사 주사를 사용 하 여 시각적 모니터링 수 있도록 빠른 그린으로 DNA의 약 1 µ L를 microinjector입니다.
- 3 x 7 mm2 전극 표면에 정상적인 염 분 해결책을 드롭. 우 심 실에 삽입 된 측 (왼쪽된 측면 뇌 실)에 긍정적인 살 균 전극과 음수 살 균 전극을 놓습니다. 발 통제 페달 (4000 mF 커패시터 40 V는 electroporator 청구)와 950 ms 간격 5 전기 펄스를 제공 합니다.
-
게시물 electroporation 절차
- 다시 자 궁 뿔 복 부 구멍, 자가 유체 손실에 대 한 고려를 배아 더 자연스럽 게 배치 하 고 구멍에 정상적인 염 분 해결책의 방울을 추가 합니다.
- 다음 흡수 수술 봉합, 복 부 근육 벽 간단한 중단 스티치를 사용 하 여 피부를 닫습니다.
- 쥐 감 금 소에 다시 넣어 고는 마 취에서 나온다 때까지 동물을 모니터링 합니다.
- 통증 관리에 대 한 관리 buprenorphine (0.03 mg/kg) 동물 피하 주입에 의해 매 8-12 h 48 h에 대 한.
6. 두뇌 샘플 준비
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고정 방법
- 가스 마 취 (isoflurane) 빠른 자 궁 경관 탈 구 다음을 사용 하 여 수술 후 5 일 임신 쥐를 희생.
- 다시 복 부 구멍을 열고 수직 절 개를 확인 합니다.
- 노출 자 궁 뿔, 자 궁에서 태아를 제거 하 고 그들을 침 살 할 날카로운가 위를 사용 하 여.
- 조직에 최소한의 손상으로 두뇌를 제거: 후부 (소 뇌)을 따라 작은 절 개 / 피어스는 피부와 두개골, 집게의 쌍을 사용 하 여 머리의 앞쪽 (후 근) 축 벗 겨 폭로 두개골 날카로운가 위를 사용 하는 뇌 고 작은 주걱을 사용 하 여 제거 합니다.
- 두뇌는 4%에 4 ° C에 하룻밤을 담가 Paraformaldehyde 인산 Buffered 식 염 수 (PBS) x 1에서.
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뇌 단면
- 10 분의 1 x PBS에 머리를 씻어.
- 플라스틱 금형을 포함 한 천 4%에에서 두뇌를 포함 합니다.
- 5 미 발달 두뇌를 포함에 대 한 1 x PBS에 4 %agar 50 mL를 준비 합니다. 더 이상 50 ° c.에 그 녹은 agarose 확인
- 4 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 유해를 agarose에서 두뇌를 유지 뇌 주변의 초과 agarose를 제거 합니다.
- 두뇌를 뇌의 앞쪽/후부 축 블레이드에 수직 이므로 지향 vibratome 베이스 플레이트에 붙입니다. 건조 하 고 붙어 뇌와 플레이트 vibratome 챔버를 접착제에 대 일 분 정도 기다립니다.
- 1 x PBS로는 vibratome를 채우십시오. 100 µ m 두꺼운 부분을 슬라이스.
- 슬라이드에 뇌 조각을 옮기고 과잉 액체를 제거, 설치 매체의 몇 방울을 추가 하 고 머리 위에 coverslip 장소
7. confocal 영상 및 정량 분석
- 하룻밤 전에 이미징 장착 중간 건조 하자. 레이저 검사 confocal 현미경에 X 10에 이미지 섹션입니다.
- 양적 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 8 비트, 선택 한 대표적인 GFP 긍정적인 형광 셀에 이미지를 변환 하 고 그 모양을 수동으로 정의. 이렇게 하려면 "견적"에 클릭 하 고 자유형 선택 도구를 사용 하 여 셀의 테두리를 그립니다. 이 방법은 직경 및 셀의 강도 임계값 자동으로 유지 됩니다 소프트웨어.
- 클릭 "찾기 셀"에 transfected 세포 피 질을 통해 지역화를 소프트웨어 수 있도록. 그런 다음 필요한 경우 수동으로 가양성 제거 합니다.
- 8 관심 분야의 개별 섹션에 정규화에 외피의 전체 두께 나눕니다. 이 위해 "지역 도구"를 클릭, 선택 8 "지역 줄무늬"를 (1) 첫 번째 및 마지막 (8) 줄무늬는 각각 VZ 하 고 CP의 상단에 해당. 전체 피 질에서 GFP 페 셀의 상대 위치를 계산 하는 소프트웨어를 허용 하도록 "적용"을 클릭 하십시오. 마지막으로 분석을 위한 Excel 파일에서 데이터를 내보내려면 "정량화 저장"을 클릭 하십시오.
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Representative Results
소설 상승할 원인 유전자를 식별 하도록 설계 된 실험 전략은 그림 1에서 지.
변함없이 PNH (그림 2A), 신체 callosum dysgenesis, colpocephaly, 소 뇌 hypoplasia 및 간 질와 관련 된 polymicrogyria를 결합 하는 발달 두뇌 이상으로 155 환자의 코 호트에서 배열 CGH를 수행 하 여 증 및 인지 장애, 우리는 12 환자 (그림 2B)21에 의해 공유 하는 6q27에 1.2 m b의 최소한의 중요 한 삭제를 확인. 게놈 지역 포함 4 개의 알려진된 유전자 (THBS2, PHF10, TCTE3 및 DLL1)와 2 유전자 (WDR27 및 C6orf70) 예측 (그림 2B).
배열 CGH를 병렬로 14 고립 된 양자 PNH 환자에 없음 복사 번호 유사 분석 웨스 분석 실시 되었다, de novo 돌연변이 한 환자 식별 (c.752T > a: pIle250Asn) 예측 C6orf70 유전자 ( 은행 승인 번호 NM_018341.1) (그림 3).
C6orf70 에서 확인 된 돌연변이 PNH에 원인이 되는 역할을 했다 확인 하 고 haploinsufficiency 6q27에 매핑 다른 유전자의 표현 형 영향 여부 조사, 그들의 역할을 vivo에서 신경 마이그레이션에 탐험 했다 utero에 RNAi 중재 최저의 접근23,24 를 사용 하 여 그들의 식 쥐 대뇌 피 질의 신경 창시자에 침묵. 개발 쥐 피 질, PHF10, C6orf70 및 DLL1에 표현 된 유전자만 시험 되었다 (그림 4A). 다른 짧은 머리 핀 RNAs (shRNAs)이 3 개의 유전자의 코딩 시퀀스를 대상으로 생성 했다. ShRNAs 다음로 소개 되었다 쥐 피 질에서 neuroprogenitors electroporation utero에 의해 배아 하루 15 (E15)에서 뉴런 대뇌 피 질의 상층 최선을 다하고 생성 되 면. 녹색 형광 단백질 transfection 기자로 서 사용 되었다. GFP-긍정적인 세포의 상대 분포 electroporation 후 5 일을 시험 했다. 광선 신경 마이그레이션 (데이터 표시 되지 않음), 약간의 지연 귀착되 었 다 최저 Dll1 과 Phf10 의 C6orf70 의 최저 장애 신경 마이그레이션 및 높은 heterotopic 혹의 개발에 상승 했다 반면 Flna 최저의 모델 (그림 4B)24에서 그의 연상. 반대로, 비 효과 C6orf70 불일치 shRNA와 transfections 신경 마이그레이션 (그림 4B)에 명백한 영향을 했다.
그림 1: 소설 상승할 원인이 유전자 식별의 식별에 대 한 워크플로. 소설 질병을 일으키는 유전자를 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 다른 접근의 도식 적인 표현입니다. 상자 색 노란색 대표에 현재 종이에 설명 된 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 6q27 삭제 PNH 비정상적인 두뇌 개발 원인. (A) 환자 2입니다. T2 무게 화관 (왼쪽된 패널) 그리고 T1 무게 축 (오른쪽 패널) 섹션 보여주는 PNH 펼친된 섬 피 질 아래 왼쪽된 측 두 엽 (흰색 및 검은색 화살표)의 벽을 안 감. (B) 환자 11입니다. T1-가중치 코로나 섹션, 일시적인 뿔 (흰색 화살표)의 벽을 따라 양측 heterotopic 혹을 보여주는. (C) 환자 12입니다. T2 무게 코로나 섹션입니다. 왼쪽에 PNH 여전히 표시 (검은 화살표) 이며 심 크기. PNH 환자 배열 CGH (상단 부분)을 사용 하 여 식별 6q27 영역의 삭제 (D) 도식 표현입니다. 수평, 점선 라인 삭제를 환자에서 확인 된 나타냅니다. 크기는 최소한의 중요 한 삭제 지역 또한 표시 되 고 4 개의 알려진된 유전자를 포함: THBS2, PHF10, TCTE3 및 DLL1 과 두 예측된 유전자: WDR27 및 C6orf70 (상단 부분). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 시퀀싱 결과. ( ) T 2가 중 정면 뿔 (흰색 화살표)에서 양측 PNH 환자는 c.752T를 들고 보여주는 축 섹션 > C6orf70에 돌연변이. (B) 생어 시퀀싱 보여주는 웨스 식별 돌연변이 드 노 보가 발생 했습니다. 돌연변이의 위치는 검은 화살촉으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 6q27 최소한 중요 한 지역 및 C6orf70-최저에 유전자의 표정 분석 변경 대뇌 피 질의 뉴런의 방사형 마이그레이션. (A) 양적 RT-PCR 쥐 대뇌 피 질에서 6q27 중요 영역에 포함 된 유전자의 표정을 보여주는. Cyclophilin A는 정규화를 위해 사용 되었다. (B) 대표 neocortical 코로나 섹션의 E20 쥐 두뇌 중 녹색 형광 단백질 electroporation 후 5 일 혼자 (제어), 구성 또는 shRNA C6orf70 코딩 시퀀스 (C6orf70-shCDS)를 대상으로 결합 또는 상대적 효과 부정합 (C6orf70-shCDSmm)를 구성 합니다. Flna-최저 (FLNA-shCDS)는 장애인된 신경 이동의 제어로 사용 되었다. C6orf70-shCDS 또는 FLNA shCDS utero electroporation 심 실 영역 (VZ) (흰색 화살표) 내에서 GFP-긍정적인 세포의 체포를 유도, GFP 하거나 불일치와 함께 표현 하는 세포를 생성 하는 반면 변경 되지 않았다 신경 마이그레이션입니다. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
MCDs는 지적 장애 및 약물 내성 유년기 간 질1,2의 20-40 %의 중요 한 원인이 있습니다. MCDs에 관심 두 가지 주요 요인으로 인해 지난 10 년 동안 극적으로 증가 했다. 첫 번째는 개선 의사와 과학자는 이전 인식 하지 많은 두뇌 기형의 시각화 하을 수 있는 이미징 (특히 MRI) 두뇌에서. 다른 많은 소설 상승할 원인이 유전자의 id 허용 유전 도구의 발전 이다. 이것은 크게 기초 두뇌 개발 및 기능, 그리고 더 정확한 유전 상담에 대 한 허용 하는 메커니즘의 우리의 지식을 향상.
과거에는, 연구원은 나중 단계에 두뇌 개발에 그들의 역할을 명확 하 게 기능적인 분석 실험의 디자인을 떠나 원인 유전자 식별에 주로 그들의 노력을 집중. 이 메서드는 의무가 찾는 어떤 전통적인 유전자에 대 한 보다 일반적인 산발적 장애, 재발 성 유전 질환의 연구에서 진행으로 인해 어렵게 되고있다. 종종 원인 유전자를 식별 하기 위해 현재 접근 수많은 유전자 (배열 CGH) 또는 여러 변종 웨스 (WGS)의 유효성을 검사 하기 어려운 후보 유전자의 수에 포함 하는 게놈의 비교적 큰 지역 식별을 수 있습니다.
배열 CGH와 웨스 (WGS) 접근 많은 유전 질환에 대 한 돌연변이 스펙트럼을 확대 했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 몇 가지 중요 한 제한이 아직도 남아 있다. 예를 들어, 배열 CGH 양질의 DNA 고 균형된 translocations 또는 작은 삭제/중복 한 유전자의 하나 또는 몇 exons를 포함 포함 하 여 식별 하는 데 실패. 이 문제를 해결 하려면 배열 CGH 기존의 프로브 간격 (예: 1 M 배열 CGH 키트를 사용 하 여) 보다 더 높은 해상도에서 수행 또는 SNP 배열 분석 대체 될 수 있습니다. 웨스 종종 큰 intragenic 지구를 커버 하지 않는 하 고 깊은 intronic 돌연변이 식별 하기 위해 실패 합니다. 또한, 때로는 범위 너무 낮은 (특히 mosaicism의 낮은 백분율을 가진 돌연변이)의 경우 원인이 돌연변이 확인 수 있습니다. 웨스에 대 한 또 다른 중요 한 단계가 이다 데이터 분석 및 필터링 여전히 상당한 노력 필요. 웨스의 범위를 증가, 단일 실험에서 환자의 수를 줄일 수 있습니다 또는 다른 캡처 키트는 동시에 사용할 수 있습니다.
IUE는 유전자 최저 신경 마이그레이션에 미치는 영향을 분석 하 고 가장 적절 한 접근 이다. 그러나, 발달, 성체 등 신경 성숙, 외피의 다른 단계에 대 한 조사는 몇 가지 기술적인 제한에 의해 방해 됩니다. 실제로, IUE 수행 E13은 종종 성공적인 반면 조사 나중 단계에서이 절차에 관련 된 출생 후 치 사 율의 높은 속도 의해 제한 됩니다. 또한, 유전자-최저 효율 electroporated 배아 상당한 phenotypic이 이어지는 사이에서 달라질 수 있습니다.
전반적으로, 현재 프로토콜에는 4 개의 주요 중요 한 단계가 있습니다. 비록 현재 종이에 설명 된 프로토콜의 일부가 아니에요, 우리는 고려 되어야 하는 첫 번째 근본적인 단계는 이러한 연구에 등록 환자의 선택 해야 합니다. 실제로, 소설 상승할 유전자를 식별 하는 프로세스는 누구를 위한 phenotype 가능한 균질 이어야 한다 환자의 코 호트에서 임상 및 이미징 조사를 필요 합니다. 매우 균질 표현 형을 가진 환자를 수집 주어진된 유전자에 돌연변이 원인이 식별의 가능성이 높아집니다. 그러나, 최소한의 성공을 달성 하기 위해 같은 연구에 등록 환자 크게 다른 유전자의 돌연변이 비율에 달려 있기 때문에 예측 하기 어렵다. 예를 들어 FLNA, X 연결 된 양측 PNH의 가족 경우의 100%에 산재 환자의 26%에 변이,이 같은 유전자는 유전자에 여러 개의 안타를 식별 하는 데 필요한 환자의 수 상대적으로 낮은 있습니다. 반대로, 낮은 돌연변이 속도 유전자, 상영 될 환자 수가 높다. 예를 들어 , C6orf70 의 경우 우리 64 환자 검사 시 단일 원인 돌연변이 식별할 수 있었다 (14 웨스와 기존의 Sanger 통해 50 통해 시퀀싱)16, 약 1.5%의이 유전자의 돌연변이 속도 예측. 두 번째 중요 한 단계 새로운 원인 유전자를 확인 하기 위해 모든 알려진된 상승할 유전자에 있는 돌연변이 제외입니다. 새로운 차세대 시퀀싱 기술의 출현 덕분에 알려진와 후보 유전자의 돌연변이 검사 이제 단일 실험에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 적절 한 변형은 필터링을 실험적으로 확인 하 고 잠재적인 원인 돌연변이를 가양성의 과도 한 수의 존재를 피하기 위해 사용 되어야 한다. 실제로, 후보 유전자/변종 수 웨스 실험에서 특히 높다. 주어진된 유전자의 관련을 의심 하는 경우 돌연변이 검사는 MLPA 분석, microdeletions 또는 microduplications을 제외 하도 보완 될. 세 번째 중요 한 포인트는 사실 이다 염색체 재배열은 중단점의 위치에 의해 강하게 영향을. 이러한 맥락에서 그것은 가치가 가장 큰 가능한 범위 내에서, 중단 또는 cis 규제 요소 삭제/복제에 포함 되지 않습니다 유전자 원심의 변위를 제외 하. 마지막으로, RNAi 실험 vivo에서 원인 유전자 배아 단계 동안 신경 마이그레이션에 직접적인 역할을 할 가정 합니다. 그러나, 상승할, PNH를 포함 하 여의 병 인 이기종 이며 utero에 접근 신경 확산 또는 세포 생존을 포함 하 여 발달 단계에 관련 된 유전자의 효과 검색에 실패할 수 있습니다. 또한, 설치류 두뇌의 낮은 복잡성 최저의 영향 또는 인간의 두뇌에 더 분명 있을 수 있습니다, 특정된 후보 유전자의 overexpression 마스크 수 있습니다.
우리는 게놈 그리고 vivo에서 기능 연구의 통합 새로운 상승할 원인이 유전자의 식별에 대 한 새로운 진단 도구 개발에 도움이 될 것입니다 믿습니다. 이 전략 또한가지고 지금까지 제한 되어 실험 모델 및 제한 된 액세스의 부족에 의해 뇌 조직에 영향을 받는 환자에서 치료 목표를 테스트 하 여 상승할, 이상 이해 새로운 동물 모델을 제공할 수 있습니다. 상승할에 연관 된 분자 경로 해독 장애 또한 제공 합니다 생리 적인 두뇌 개발에 대 한 중요 한 새로운 정보 일반적.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 박사 G. McGillivray 감사 홍보 제이 클레이튼-스미스, 홍보 P. Striano, 홍보 즉 Scheffer, 홍보 S.P. Roberston, 홍보 W.B. Dobyns 상승할 환자를 제공 하기 위한 홍보 김포 Berkovic. 우리 기술 조언 및 도움에 대 한 박사 F. 미셸과 디 메이 감사합니다. 이 작품은 EU의 7 프레임 워크 프로그램에서 자금에 의해 지원 되었다 욕망 프로젝트, 계약 번호: 건강-F2-602531-2013 년 (V.C., 립에 아칸소, A.F. 및 참조), INSERM (아칸소를 참조), Fondation 제롬 Lejeune (A.F, E.P.P 및 많은 R13083AA)와 지구의 프로방스 알프 코트 다쥐르 (APO2014-DEMOTIC 참조 및 A.A.D) D.A.K EMBO 젊은 수 사관 이며 뒷받침 FWF 부여 (I914 및 P24367).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
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- Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
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- Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
- Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
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