Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En ny strategi kombinerer matrise-CGH, hel-exome sekvensering og In Utero Electroporation i Red for å identifisere forårsaker gener for hjerne misdannelser

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/53570
Automatic Translation
*1, *2,3,15, 2,3,4, 5,6,7, 2,3,8, 1, 2,3, 2,3, 2,3,8, 9, 10, 10, 11, 10, 9,12, 2,3, 13, 1,14, 2,3, 2,3
1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Periventricular nodulær heterotopia (PNH) er den vanligste formen av misdannelse i kortikale utvikling (MCD) i voksen alder, men sin genetisk grunnlag er ukjent i mest sporadiske tilfeller. Vi har nylig utviklet en strategi å identifisere roman kandidat gener for MCDs og direkte bekrefte deres forårsaker rolle i vivo.

Abstract

Fødselsskader som involverer hjernebarken-også kjent som misdannelser av kortikale utvikling (MCD) – er viktige årsaker til intellektuelle handikap og utgjør 20-40% av stoff-resistent epilepsi i barndommen. Høyoppløselig hjernen imaging har tilrettelagt i vivo identifikasjon av en stor gruppe MCD fenotyper. Til tross for fremskritt i hjernen imaging, genomisk analyse og generering av dyr modeller mangler en grei arbeidsflyt til å systematisk prioritere kandidat gener og teste funksjonelle effekter av antatte mutasjoner. Du løser dette problemet, ble en eksperimentell strategi aktivere identifikasjonen av romanen forårsaker gener MCD utviklet og godkjent. Denne strategien er basert på identifiserende kandidat genomisk regioner eller gener via matrise-CGH eller hele-exome sekvensering og karakterisere virkningene av deres inaktivering eller overuttrykte spesifikke mutasjoner i utviklingen gnager hjernen via i utero electroporation. Dette førte til identifisering av C6orf70 genet, koding for en antatte vesicula protein, til patogenesen av periventricular nodulær heterotopia, en MCD skyldes defekt neuronal migrasjon.

Introduction

Hjernebarken spiller en nøkkelrolle i kognitiv og intellektuelle og er involvert i følelsesmessige kontroll som læring og hukommelse. Det er derfor ikke overraskende at mange nevrologiske og psykiske sykdommer skyldes misdannelser av kortikale utvikling (MCD). Etiologien for MCD er komplisert siden begge ervervet og genetiske faktorer er involvert. Kumulative utbredelsen av genetisk betinget andelen MCD er om lag 2%, og de er spredt i de fleste tilfeller. For eksempel forekomsten av medfødt hjernen dysgenesis ble anslått for å være høyere enn 1% i den menneskelige befolkningen, og noen former for MCD er observert i mer enn 14% av pasientene med epilepsi og 40% av alvorlig eller vanskelige epilepsi1, 2.

Periventricular nodulær Heterotopia (PNH) er en av de vanligste MCDs og er forårsaket av unormal overføringen av neurons fra sonen ventrikkel (VZ) å utvikle hjernebarken. Svikt av neurons å overføre resultatene i klynger av heterotopic neurons langs veggene av lateral ventriklene som kan vanligvis bli visualisert bruker magnetisk resonans Imaging (MRI). Klinisk, anatomiske og tenkelig funksjonene i PNH er heterogene. Knuter kan variere fra små og ensidig til bilaterale og symmetrisk. Vanlig klinisk sekvele inkluderer epilepsi og intellektuelle funksjonshemninger3. Mutasjoner i genet Filamin A (eller FLNA), som kart i Xq28, ble funnet i 100% av familier med X-tilknyttet bilaterale PNH og 26% av sporadiske pasienter3,4. En sjelden, recessiv form av PNH forårsaket av mutasjoner i genet ARFGEF2 , som kart i 20q13, har blitt rapportert i to consanguineous familier5. Nylig har biallelic mutasjoner i gener som koder reseptor-ligand cadherin paret DCHS1 og FAT4 blitt identifisert i ni pasienter som lider av en multisystemic lidelse som inneholder PNH6. PNH har også vært forbundet med skjøre X syndrom7, Williams syndrom8, 22q11 microdeletion syndrom9, duplikasjoner på 5 p 1510, slettinger på 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 og 6q terminal sletting syndrom14,15,16,17,18,19, antyder at flere utløsende gener er spredt gjennom genomet. Imidlertid ca 74% av sporadiske PNH pasienter gjenstår genetisk grunnlag for å bli belyst17.

Klassisk genet kartlegging tilnærminger som matrise sammenlignende Genomic hybridisering (matrise-CGH) har vist seg for å være et kraftig verktøy for deteksjon av sub mikroskopiske kromosomavvik, men genomisk regionene identifisert ved hjelp av denne tilnærmingen er ofte store og inneholder mange gener.

Ankomsten av massiv parallelle sekvenser teknikker (dvs hele-Exome sekvenser (WES) og hele-Genome sekvensering (WGS)) har betydelig redusert både kostnadene og tiden det tar å sekvens en hele menneskelige exome eller genom. Likevel forblir tolkning av WES og WGS utfordrende i fleste tilfeller siden for hver pasient titalls til hundrevis (eller kanskje tusenvis, alt fra typen analyse) varianter komme ut av data filtrering.

For å fremskynde prosessen med å identifisere romanen MCD forårsaker gener, en ny systematisk strategi kombinere matrise-CGH, ble WES og i utero electroporation (IUE) screening av kandidat gener utformet. IUE kan selektivt deaktivere (eller overexpress) bestemte gener eller mutasjoner i gnager hjernen, slik at rask vurdering av deres engasjement i corticogenesis18,19. RNAi formidlet-knockdown eller overuttrykte en eller flere kandidat gener forventes å forårsake, når genet er tilknyttet sykdom utvikling, lokalisere feil i neuronal overføring og/eller modning. Ved identifisering av et gen som inaktivering (eller overuttrykte) gjengir fenotypen observert hos pasienter i gnagere, blir det en enestående kandidat for screening i sporadisk pasienter med MCD. Bruker denne tilnærmingen, viste vi nylig avgjørende bidrag av C6orf70 genet (også kjent som ERMARD) i PNH patogenesen hos pasienter harbouring 6q27 chromosomal slettinger16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Wistar rotter var paret, vedlikeholdt og brukt i INMED dyr anlegg, med EU og fransk lovgivning.

1. DNA utvinning og kvantifisering for matrise-CGH og WES

  1. Pakk ut Genomic DNA (gDNA) fra menneskelig blod leukocytter fra pasienter som bruker en automatisert DNA isolasjon robot eller kommersielt tilgjengelig manuell DNA utvinning kits i henhold til produsentens protokollen. Kvantifisere alle prøvene som bruker et spektrofotometer.

2. matrise-CGH-protokollen

  1. Begrensning fordøyelsen av gDNA
    1. Dobbel digest 500 ng av renset gDNA fra en pasient og en kommersielt tilgjengelig menneskelig kontroll DNA med RsaI og AluI for 2t på 37 ° C. Bruk 0,5 µL 10 U/μL enzymet for hver reaksjon. Inkuber etter 20 min på 65 ° C å deaktivere enzymer og flytte prøven rør til is.
  2. Eksempel merking
    1. Legge til riktige volumet av tilfeldige primere nødvendig for microarray formatet brukes til hver reaksjon tube (f.eks 5 µl for 1-pakning, 2-pack og 4-pack microarrays). Bland godt av pipettering forsiktig opp og ned.
    2. Overføre eksempel rør til en termisk cycler. Ruge på 95 ° C i 3 min og deretter på 4 ° C i 5 minutter.
    3. Forberede en cyanine 3 og en cyanine 5 merking Master Mix på isen ved å blande følgende volumer: 10,0 µl 5 X reaksjon Buffer, 5.0 µl 10 x dNTPs, 3.0 µl Cyanine 3-dUTP eller Cyanine 5-dUTP og 1,0 µl Exo (-) Klenow enzym, 2.0 µl Nuclease-fritt vann. Velg volumet av hver reagens i henhold til microarray formatet i bruk.
    4. Legge til merking Master Mix hver reaksjon rør som inneholder gDNA. Bland godt av pipettering forsiktig opp og ned.
    5. Overføre eksempel rør til en termisk cycler og ruge på 37 ° C 2 h, 65 ° C i 10 min og deretter opprettholde prøvene på 4 ° C.
  3. Rensing av merket gDNA
    1. Legge til 430 µl av 1 x TE (pH 8.0) hver reaksjon rør.
    2. Plasser en rensing kolonne i 2 mL samling rør og Merk kolonnene korrekt. Last hver merket gDNA på en rensing kolonne.
    3. Sentrifuge for 10 min 14.000 x g i en microcentrifuge ved romtemperatur. Forkaste gjennomflytsenhet og plasser kolonnen tilbake i 2 ml samling røret.
    4. Legge til 480 µL av 1 x TE (pH 8.0) i hver kolonne. Sentrifuge for 10 min 14.000 x g i en microcentrifuge ved romtemperatur. Kast gjennomflytsenhet.
    5. Invertere kolonnen i en fersk 2 mL samling rør og sentrifuge for 1 min på 1000 x g i en microcentrifuge ved romtemperatur å samle renset prøven.
    6. Ta prøven volumet til forespurt for microarray formatet i bruk bruker en konsentrator eller legge til 1 x TE (pH 8.0). For eksempel 1-pack microarray bringe volumet til 80,5 µL. ruge prøven på is 5 min og deretter Pipetter løsningen opp og ned 10 ganger.
  4. Utarbeidelse av merket gDNA for hybridisering
    1. Kombiner test og referanse prøver ved hjelp av riktig cyanine 5-merket eksempel og cyanine 3-merket utvalg i en fersk 1,5 mL RNase gratis rør. For eksempel for 1-pack microarray at det siste bindet er 158 µL. Velg volumet av hver prøve i henhold til microarray formatet i bruk.
    2. Bruk et spektrofotometer som måler avkastning, grad av merking eller bestemt aktivitet ved å måle absorbansen ved A260 nm (DNA), A550 nm (cyanine 3) og A650 nm (cyanine 5).
      1. Beregne avkastningen ved hjelp av formelen: [DNA concentration(ng/µl) x prøve volum (µl)] / 1000 (ng/µg). Beregne aktiviteten bruker formelen: pmol per µl av fargestoff/µg per µl av gDNA.
        Merk: For eksempel 0,5 µg inngang DNA, avkastningen bør være 8 til 11 µg og til aktiviteten (pmol/µg) bør være 25 til 40 for den Cyanine-3 merket utvalg og 20 til 35 for Cyanine-5 merket prøven.
    3. For å forberede mengden hybridisering Master Mix nødvendig for microarray formatet i bruk, bland følgende reagenser: 50 µL Cot-1 DNA (1.0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH blokkerer Agent og 260 µl 2 x HI RPM hybridisering Buffer.
    4. Legge til den aktuelle mengden hybridisering Master Mix 1,5 ml RNase gratis røret som inneholder den merkede gDNA for å få det totale volumet kreves for microarray formatet i bruk. For eksempel for 1 pakke microarray, kontroller at det siste bindet for hver reaksjon er 362 µl.
    5. Bland prøven av pipettering opp og ned, deretter raskt sentrifuge 14.000 x g og ruge for 3 min 95 ° C og 37 ° C i 30 min.
  5. Chambers montering og hybridisering
    1. Laste inn en ren pakning lysbildet inn i kammeret basen med pakning etiketten vender opp og justert med den rektangulære delen av kammeret base. Kontroller at pakning lysbildet er flush med kammer base og er ikke gløtt.
    2. Dispensere hybridisering eksempel blanding på pakningen brønnen, sørge for at prøven er fordelt.
    3. Sette et microarray lysbilde på pakningen lysbildet vurdere at sandwich-paret er riktig justert. Deretter samle reaksjon chamber setter dekselet på klemt lysbildene og hånd-stramme klemmen.
    4. Sikre lysbilder wetting ved å rotere montert kammeret loddrett. Kontroller at bobler ikke, finnes i kammeret. Hvis nødvendig, tapper du samlingen på en hard overflate for å flytte stasjonære bobler.
    5. Samlet lysbildet kamrene innlegge en rotator rack konfigurere til å rotere på 20 rpm. Satt hybridisering kammeret i en ovn og utfører hybridization på 65 ° C for 24 eller 40 h i henhold til microarray formatet i bruk.
  6. Microarray vask og skanning
    1. Ta hybridisering kammer av ovnen og dukke det i vaskebuffer 1. Fortsette sin demontering.
    2. Fjern microarray lysbildet og raskt inn en objektglasstativet i vaskebuffer 1 ved romtemperatur.
    3. Vask matrise lysbildet i 5 min med røring (bruk en loppe og en magnetisk rørestang). Justere rørestang hastigheten en innstilling for 4 (middels hastighet), for å få god, men ikke for sterk blanding.
    4. Vask matrise lysbildet i vaskebuffer 2 for 90 s omrøring. Forsiktig gjenopprette lysbildet fra bufferen (det skulle dukke tørr) laste det inn en lysbildeholderen ved hjelp av et lysbilde protector.
    5. Laste inn lysbildet i matrisen skanneren og utføre skanning etter matrise produsentens instruksjoner.
    6. Analysere resultatene med utvinning-programvaren som fulgte med skanneren i bruk i henhold til produsentens instruksjoner (V.9.1.3.1).

3. WES protokollen

  1. Målet berikelse
    1. Bruk dsDNA BR analysen til å bestemme konsentrasjonen av gDNA prøven i henhold til instrument-protokollen.
    2. Fortynne 5 µg høy kvalitet doble Strand DNA med 1 x lav TE buffer i en 1,5 mL lav bind rør i et totalt volum på 50 µL.
    3. Sette opp en sonicator og sette en microtube på lasting og lossing Station i henhold til produsentens instruksjoner. Beholde luea på røret.
    4. Sakte overføre 50 µl DNA-prøve gjennom pre delt septa uten å innføre bobler.
    5. Skråstille DNA i henhold til innstillingene som er foreslått fra den sonicator produsent og vurdere kvaliteten med en Bioanalyzer i henhold til produsentens instruksjoner. Målet DNA fragment størrelse er 150 til 200 bp.
  2. Reparasjon av DNA ender
    1. Forberede slutten reparasjon reaksjonen blanding ved å blande 40 µL av slutten reparasjon enzym blanding med 10 µL slutten reparasjon Oligo mix. Bland godt på en vortex mikser.
    2. Inkuber prøvene ved 20 ° C i 30 minutter i en termisk cycler og holder dem på 4 ° C. Ikke bruk en oppvarmet lokk.
    3. Legge til 50 µL av slutten reparasjon reaksjonen blanding forberedt i trinn 3.2.1 til hver 50 µL skåret DNA-prøve også. Bland godt av pipettering opp og ned eller mild vortexing.
    4. Rense prøve med en perler basert rensing kit ifølge produsenten protokollen.
  3. Polyadenylation av 3 ender.
    1. Legge til 20 µl dA Tailing Master Mix hver ende-reparert, renset DNA-prøve (ca 20 µL).
    2. Bland godt av pipettering opp og ned eller mild vortexing.
    3. Inkuber prøvene på 37 ° C i en termisk cycler og hold det på 4 ° C. Ikke bruk en oppvarmet lokk.
  4. Ligation av pre fange indeksering adapteren.
    1. Legge til 5 µL av Ligation Master Mix hver A-tailed DNA-prøve.
    2. Legge til 5 µL av den riktige løsningen for før fange-indeks i hver prøve.
    3. Forsegle brønnene og bland godt av vortexing for 5 s. kort sentrifuge prøvene.
    4. Inkuber prøvene ved 20 ° C i 15 minutter i en termisk cycler og holder på 4 ° C. Ikke bruk en oppvarmet lokk.
    5. Rense prøvene med en perler basert rensing kit ifølge produsenten protokollen.
  5. Forsterkning av indekserte biblioteket.
    1. Forberede den riktige mengden før fange PCR reaksjonen blanding ved å blande 1 µL av Primer og 25 µL av PCR Master Mix. Bland godt på en vortex mikser.
    2. Kombiner 26 µL av forsterkning blandingen i separate brønner til en PCR-plate og 24 µL av hver indeksert gDNA biblioteket prøve.
    3. Kjøre et PCR-program med følgende: 98 ° C i 2 minutter, 5 sykluser på 98 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C for 1 min og en endelig utvidelse ved 72 ° C i 10 min. holde prøvene på 4 ° C.
    4. Rense prøve med en perler basert rensing kit ifølge produsenten protokollen.
    5. Vurdere kvalitet med en Bioanalyzer ifølge produsenten protokollen.
  6. Av indekserte DNA-prøver for hybridisering
    1. For hver fange reaksjon bassenget, kombinere riktige volumet av hver indeksert gDNA biblioteket prøve i en brønn av et PCR-plate. For eksempel for Human eller musen All-ekson fange biblioteker, kombinere 8 biblioteker per adresseutvalg med 187.5 ng hver indekserte bibliotek. Kontroller at hver siste fange reaksjon bassenget inneholder 1500 ng av indeksert gDNA.
    2. Redusere volumet i hver godt til < 7 µL bruker en vakuum konsentrator. Unngå helt tørking prøven.
    3. Legge til tilstrekkelig nuclease-fritt vann hver konsentrert gDNA basseng å bringe siste godt volumet til 7 µL og deretter vortex plate inneholder gDNA kraftig for 30 s. sentrifuger i en sentrifuge eller mini plate spinner samle væske i bunnen av brønnene.
  7. Blanding av gDNA biblioteket bassenger å fange biblioteket
    1. Legge til 9 µl av blokkering Mix hver 7 µL indeksert gDNA basseng. Pipetter opp og ned for å blande.
    2. Cap brønnene, overføre forseglet plate inneholder gDNA til den termiske cycler og ruge på 95 ° C i 5 min, så hold den på 65 ° C. Kontroller at platen er avholdt ved 65 ° C i minst 5 minutter.
    3. Forberede den aktuelle fortynning av RNase blokken, basert på størrelsen på fange biblioteket (10% fortynning for biblioteker < 3,0 Mb og 25% fortynning for biblioteker > 3,0 Mb).
    4. Ifølge fange biblioteket størrelse, kombinere riktig mengde fange bibliotek og fortynne RNase blokk løsning i et PCR-plate på isen. Bland godt av pipettering. For fangst biblioteker < 3,0 Mb, bruk 2 µl av biblioteket og 5 µL RNase blokk på 10% fortynning. For fangst biblioteker > 3,0 Mb, bruk 5 µl av biblioteket og 2 µl RNase blokk på 25% fortynning.
    5. Legge til 37 µL hybridisering bufferen i hver brønn som inneholder 7 µL fange bibliotek/RNase blokk mix. Bland godt pipettering og kort sentrifuge platen inneholder mix.
    6. Opprettholde gDNA bassenget platen på 65 ° C stund benytter en flerkanals pipette overføre hele 44 µL av fange biblioteket blanding fra trinn 3.7.5 hvert utvalg godt av gDNA basseng plate. Bland godt langsomt pipettering opp og ned 8 til 10 ganger.
    7. Forsegle brønnene med hvelvet stripe caps. Kontroller at alle brønnene er fullstendig forseglet. Plass en komprimering matte over PCR platen i den termiske cycler.
    8. Inkuber hybridisering blandingen for 24 h på 65 ° C. Merk: Eksempler kan være hybridiserte for opptil 72 h, men må bekrefte at utvidet hybridization ikke forårsaker omfattende fordampning i brønnene som eksempel.
  8. Utarbeidelse av streptavidin-belagt magnetiske perler
    1. Prewarm vaskebuffer 2 på 65 ° C i en vann bad eller varme blokk.
    2. Kraftig resuspend Streptavidin magnetiske perler på en vortex mikser. De magnetiske perlene utligne under lagring.
    3. For hver hybridisering prøve, legge til 50 µL av resuspended perler brønner til en PCR-plate.
    4. Vask perler og resuspend dem i 200 µL bindende bufferen.
  9. Ta av hybridisert DNA bruker streptavidin perler.
    1. Beregne og registrere volumet av hybridisering løsning som gjenstår etter 24-timers inkubasjon.
    2. Opprettholde hybridisering platen på 65 ° C, og bruk en flerkanals pipette overføre hele volumet (ca. 60 µL) av hver hybridisering blanding plate fordelt som inneholder 200 µL av vasket streptavidin perler. Bland godt langsomt pipettering opp og ned 3 til 5 ganger.
    3. Cap brønnene og ruge fange plate, en Nutator mikser eller tilsvarende i 30 min ved romtemperatur. Kontroller at prøvene er riktig blanding i brønnene.
    4. Kort sentrifuge fange platen i en sentrifuge eller mini plate spinner.
    5. La fange platen i magnetiske skilletegn å samle perler fra suspensjon. Fjerne og slette nedbryting.
    6. Resuspend perler i 200 µL av vaskebuffer 1. Bland ved pipettering opp og ned til perlene er fullt resuspended.
    7. Kort sentrifuger i en sentrifuge eller mini plate spinner.
    8. Sett platen i magnetiske skilletegnet.
    9. Vent til løsningen Fjern, fjerne og forkaste nedbryting.
  10. Etter fange prøve behandling for multiplex sekvensering
    1. Forberede den riktige mengden PCR reaksjonsblandingen ved å blande følgende: 9 µL Nuclease-fritt vann, 25 µL Master Mix og 1 µL Primer Mix av antall amplifications. Bland godt med en vortex mikser og holde på is.
    2. For hver forsterkning reaksjon, plassere 35 µL PCR reaksjonsblandingen fra trinn 3.10.1 i brønnene av en PCR-plate.
    3. Pipetter hver perle-bundet fanget biblioteket bassenget prøvene opp og ned for å sikre at perle suspensjon er homogen.
    4. Legge til 15 µL av hver fanget biblioteket bassenget perle suspensjon i riktig PCR reaksjonsblandingen godt. Bland godt av pipettering til perle suspensjon er homogen.
    5. Plasser platen forberedt i punkt 3.10.2 i en termisk cycler og kjøre programmet for følgende PCR-forsterkning: 98 ° C i 2 minutter, 8 til 11 sykluser på 98 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C i 1 min, etterfulgt av en siste utvidelse ved 72 ° C i 10 min. Hold prøvene på 4 ° C.
    6. Rense prøve med en perler basert renselse ifølge produsenten protokollen.
    7. Vurdere kvalitet med en Bioanalyzer ifølge produsenten protokollen.
  11. Forberede prøver for multiplekset sekvensering
    Merk: De siste beriket prøvene inneholder bassenger med 8 eller 16 indekserte biblioteker, basert på fange biblioteket størrelse og resulterer pre fange pooling strategi. Totalt antall indekserte biblioteker som kan være multiplekset i en enkelt sekvensering kjørefelt bestemmes av spesifikasjonene av plattformen brukes, sammen med mengden sekvensering data kreves for fange biblioteket.
    1. Beregne antall indekser som kan kombineres per kjørefelt, ifølge kapasiteten på plattformen. Totalt antall indekserte biblioteker som kan være multiplekset i en enkelt sekvensering kjørefelt bestemmes av spesifikasjonene av plattformen brukes, sammen med mengden sekvensering data kreves for fange biblioteket. For eksempel for menneskelig alle ekson v5 biblioteket, anbefalt sekvensering dataene per indeksert bibliotek er 4 Gb og anbefalt sekvensering dataene per før fange bassenget er 32 Gb (8-indeks bassenger).
  12. Sekvens bibliotekene.
    1. Laste inn bibliotekene på neste generasjons sekvensering plattformen valgfrihet og utføre sekvensering kjøres i instrumentet spesifikasjonene.
  13. Analysere exome sekvensering data.
    1. Kjøre rørledningen og programvaren til valg for base ringer. For eksempel bruke Stampy å tilordne leser20, Fjern duplikater med Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) og identifisere single nukleotid polymorfismer og innsetting eller sletting av baser (indeler) med Platypus21. Filtrere synonymt varianter og de observert en allelet frekvens < 5% og sammenligne dataene med de fra foreldre exomes til å identifisere de novo varianter.

4. plasmider DNA forberedelse til In Utero Electroporation

  1. Utforme flere kort hårnål RNAs (shRNAs) rettet mot enten koding rekkefølgen eller den 3-' UTR i av kandidat gener som beskrevet tidligere22.
  2. For å hindre blink test effekter shRNAs spesifisitet av BLAST mot databaser med standard metoder. Utelukke shRNAs viser mer enn 50% av komplementaritet med andre rotte gener.
  3. Klone herdet oligonucleotides i en mU6-pro vektor som beskrevet tidligere23.
  4. Rense plasmider DNA med en Maxi-prep i henhold til produsentens instruksjoner og foreta en endelig konsentrasjon av 3 µg/µL.
  5. Aliquot 20 µl av DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP enten alene eller med 1.5 mg/ml shRNA konstruere) og legge 2 µL av Fast grønt fargestoff (2 mg/mL) å tillate visuell overvåking av injeksjon.

5. i Utero Electroporation

  1. Kirurgisk prosedyre
    1. Bedøve E15.5 gravid kvinner rotter (E0 ble definert som dagen for bekreftelse av sæd-positive vaginal), bruke en kombinasjon med en blanding av ketamin/xylazine (0,1 og 0,01 mg per kroppen vekt, henholdsvis), som er gitt via en intraperitoneal injeksjon for anestesi induksjon.
    2. Kontroller at dyret er fullt anesthetized ved å observere forsvinningen av tå knipe refleks.
    3. Barbere dyrets nedre buk ved hjelp av en clipper fjerne pelsen. Desinfiser huden med scrubs povidon-jod og 70% alkohol. Bruk veterinær salve øyne å hindre tørrhet under anestesi.
    4. Plassere dyret på en varmekilde, og sette en steril drapere (med et åpent vindu på 4-5 cm i midten) over snitt området. Bruk ansiktsmasker, laboratoriefrakk, caps og sterile kirurgiske hansker. Opprettholde sterilitet til slutten av operasjonen.
    5. Med skarp saks gjør en loddrett snitt (2-2.5 cm) i huden langs midtlinjen i caudal magen og deretter lage et snitt av muskel veggen under huden, også på 2,5 cm-langs midtlinjen.
    6. Nøye utsette en livmor horn fra bukhulen. Slipp 37 ° C forvarmes vanlig saltvann å fukte embryoene. Holde livmoren fuktig hele tiden.
  2. Injeksjon av DNA og electroporation
    1. Hold en av livmor hornene med ringmerket tang og skyv forsiktig en embryoet til livmor veggen. Hold embryoet i den ene hånden og med den andre hånden inn nøye glass kapillærene 1 mm fra midtlinjen i venstre lateral ventrikkel (2-3 mm dyp) og injisere ca 1 µL av DNA med Fast Green tillate visuell overvåking av injeksjon ved hjelp en microinjector.
    2. Drop vanlige saltvann på 3 x 7 mm2 elektroder overflaten. Plass positiv sterilt elektroden på injisert side (venstre lateral ventrikkel) og negative sterilt elektroden på høyre ventrikkel. Levere 5 elektriske pulser på 950 ms intervaller med en fot-kontrollerte pedal (4000 mF kondensator belastes 40 V med en electroporator).
  3. Innlegg electroporation prosedyrer
    1. Satt tilbake livmor horn bukhulen, legge dråper vanlig saltvann hulrommet å tillate embryo plassert mer naturlig og å ta hensyn til intraoperativ væsketap.
    2. Lukk bukmuskel veggen med absorberbare kirurgisk bildet, deretter huden med en enkel-avbrutt maske.
    3. Putte rotta tilbake til buret og overvåke dyret inntil det framgår av anestesi.
    4. For smertebehandling administrere buprenorfin (0,03 mg/kg) til dyret ved en subcutaneous injeksjon hver 8-12 h, for opptil 48 timer.

6. hjernen eksempel forberedelse

  1. Fiksering metode
    1. Ofre gravid rotten 5 dager etter den kirurgiske prosedyren bruker gass anestesi (isoflurane) etterfulgt av en rask cervical forvridning.
    2. Gjøre en loddrett snitt åpnes bukhulen.
    3. Utsette livmor hornene, fjerne embryoene fra livmoren og halshugge dem med skarp saks.
    4. Fjerne hjernen med minimal skade på vev: bruke skarp saks, lag et lite innsnitt langs bakre (lillehjernen) / fremre (olfactive pærer) aksen av hodet til å pierce huden og kraniet, deretter med en tang løsner skallen å avsløre den hjerne og fjerne den benytter en liten spatel.
    5. Fordype hjerner overnatting på 4 ° C i en 4% Paraformaldehyde i 1 x fosfat Buffered Saline (PBS).
  2. Hjernen snitting
    1. Vask hjerner i 1 x PBS i 10 min.
    2. Bygge hjernen i 4% agar i plast innebygging muggsopp.
      1. Forberede 50 mL av 4% agar i 1 x PBS innebygging 5 embryonale hjerner. Sikre at oppløst agarose er på mer enn 50 ° C.
    3. Holde hjernen i agarose til danner minst 1t på 4° C. Fjern overflødig agarose rundt hjernen.
    4. Fest hjernen til vibratome bunnplate, orientert så den fremre/bakre aksen av hjernen er vinkelrett på bladet. Vent noen minutter for limet å tørke og Plasser platen med limt hjernen i det vibratome kammeret.
    5. Fyll vibratome med 1 x PBS. Skjær 100 µm tykke snitt.
    6. Overføre hjernen skiver på lysbilder, fjerne overflødig væske, legge noen dråper av montering medium og Plasser en dekkglassvæske på hjernen

7. AC confocal bildebehandling og kvantitativ analyse

  1. La montering middels tørr natten før imaging. Bildedeler til 10 X på laser-skanning AC confocal mikroskop.
  2. Bruker programvare for kvantitative bildeanalyser, konverterer du bildet i 8-bit, velger en representant GFP positive fluorescerende celle og manuelt definere formen. Gjør klikk på "Estimat" og trekke grensen til cellen med Frihånd markeringsverktøyet. I denne beholdes måten diameter og intensitet terskelen til cellen automatisk av programvaren.
  3. Klikk på "Finne celler" vil gi det å lokalisere transfekterte celler i hele cortex. Deretter eventuelt manuelt Fjern falske positiver.
  4. Dele hele tykkelsen på cortex i 8 interesseområder normalisert i enkelte deler. For å oppnå dette, klikk på "Regionen verktøyet", Velg 8 "regionen striper" der først (1) og sist (8) striper samsvarer med VZ og til toppen av CP henholdsvis. Klikk på "Apply" vil gi det telle den relative plasseringen av GFP transfekterte celler i hele cortex. Til slutt Klikk på "Lagre kvantifisering" eksportere data i en Excel-fil for analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den eksperimentelle strategien utformet for å identifisere romanen MCD forårsaker gener er recapitulated i figur 1.

Ved å utføre matrise-CGH i en kohort av 155 pasienter med utviklingsmessige hjernen unormalt ulik kombinerer PNH (figur 2A), corpus callosum dysgenesis, colpocephaly, lillehjernen hypoplasia og polymicrogyria forbundet med epilepsi, ataksi og kognitiv svekkelse, vi identifisert en 1,2 Mb minimal kritiske sletting i 6q27 delt av 12 pasienter (figur 2B)21. Genomic regionen inneholder fire kjente gener (THBS2, PHF10, TCTE3 og DLL1) og to spådd gener (WDR27 og C6orf70) (figur 2B).

Parallelt med array-CGH, WES analyse i 14 pasienter med isolert bilaterale PNH og ingen kopi nummer variasjoner analyse ble gjennomført, identifisere en pasient med en de novo mutasjon (c.752T > A: pIle250Asn) i den anslåtte C6orf70 genet ( Genbank tiltredelse nummer NM_018341.1) (Figur 3).

Bekrefte at mutasjon i C6orf70 hadde en utløsende rolle i PNH og undersøke om haploinsufficiency av andre genene kartlegging i 6q27 kan påvirke fenotypen, ble deres rolle i vivo på neuronal migrasjon undersøkt bruker i utero RNAi-mediert knockdown tilnærming23,24 til taushet sine uttrykk i rotte kortikale nevrale progenitors. Bare gener som er uttrykt i utviklingsland rotte cortex, PHF10, C6orf70 og DLL1, ble testet (figur 4A). Forskjellige kort hårnål RNAs (shRNAs) ble generert målretting koding sekvenser av disse tre gener. ShRNAs ble deretter introdusert i neuroprogenitors i rotte neocortex av i utero electroporation på embryonale dag 15 (E15), når neurons forpliktet til øvre kortikale lag genereres. Grønne fluorescerende protein ble brukt som hva reporter. Relativ fordeling av GFP-positive celler ble undersøkt 5 dager etter electroporation. Knockdown Dll1 og Phf10 resulterte i en liten forsinkelse radial neuronal migrasjon (data ikke vist), mens knockdown av C6orf70 svekket neuronal migrasjon og ga opphav til utviklingen av heterotopic knuter svært minner om de observerte i Flna knockdown modell (figur 4B)24. Transfections med den ineffektive C6orf70 feil shRNA hadde derimot ingen tydelig påvirkning på neuronal overføring (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for identifikasjon av romanen MCD forårsaker gener identifikasjon. Skjematisk fremstilling av de ulike tilnærmingene som kan brukes til å identifisere romanen sykdomsfremkallende gener. Boksene farget i gult representerer tilnærmingene beskrevet i dagens papir. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: 6q27 slettinger forårsake unormal hjernens utvikling med PNH. (A) pasient 2. T2-veide Koronal (venstre panel) og T1-veide aksial (høyre panel) deler viser PNH fôr av den venstre tinninglappen (hvit og svart pilspiss) under en utbrettet isolerte cortex. (B) pasient 11. T1-vektet koronale delen viser bilaterale heterotopic knuter langs veggene av timelige hornene (hvit pilspisser). (C) pasient 12. T2-veide koronale delen. Til venstre, PNH er fremdeles synlig (svart pilspiss) og ventriklene er utvidet. (D) skjematisk fremstilling av slettinger i 6q27 regionen i PNH pasienter med array-CGH (øverst). Vannrett, stiplede linjene representerer slettinger identifisert i pasienter. Størrelsen på den minimal kritiske slettet regionen er også indikert og inneholder fire kjente gener: THBS2, PHF10, TCTE3 og DLL1 og to spådd gener: WDR27 og C6orf70 (øverst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sekvensering resultater. ( ) T2 - vektet aksial delen viser bilaterale PNH i frontal hornene (hvit pilspisser) i pasienten bærer c.752T > en mutasjon i C6orf70. (B) Sanger sekvensering viser at oppstod mutasjon identifisert av WES de novo. Plasseringen av mutasjon angis av svart pilspisser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Uttrykk analyse av gener lokalisert i 6q27 minimal kritiske region og C6orf70-knockdown endrer radial migrering av kortikale nevroner. (A) kvantitative RT PCR viser uttrykket av gener i regionen 6q27 kritisk i hjernebarken rotte. Cyclophilin A ble brukt for normalisering. (B) representant neocortical framskaffet E20 rotte hjerner 5 dager etter electroporation med enten Green fluorescerende Protein lage alene (kontroll), eller kombinert med shRNA målretting C6orf70 koding sekvens (C6orf70-shCDS) eller med relativt ineffektiv misforholdet konstruere (C6orf70-shCDSmm). Flna -knockdown (FLNA-shCDS) ble brukt som kontroll av nedsatt neuronal migrasjon. I livmoren electroporation med C6orf70-shCDS eller FLNA-shCDS indusert arrestasjonen av GFP-positive celler innenfor sonen ventrikkel (VZ) (hvite piler), mens cellene uttrykke GFP alene eller i kombinasjon med misforholdet konstruere forandre ikke neuronal migrasjon. Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MCDs er viktige årsaker til intellektuelle handikap og utgjør 20-40% av stoff-resistent barndommen epilepsi1,2. Interesse i MCDs har økt dramatisk det siste tiåret som følge av to viktige faktorer. Først er forbedring i hjernen imaging (spesielt MRI), som tillater leger og forskere å visualisere mange hjerne misdannelser som tidligere ikke ble gjenkjent. Den andre er utviklingen av genetisk verktøy som har tillatt identifikasjon av mange romanen MCD forårsaker gener. Dette har kraftig forbedret vår kunnskap om mekanismer som ligger til grunn for hjernens utvikling og funksjon, og tillot mer nøyaktig genetisk veiledning.

Tidligere fokusert forskere sin innsats primært på forårsaker genet identifikasjon, slik at utformingen av funksjonelle analyser å avklare deres rolle i hjernens utvikling til senere stadier. Dette har blitt mer vanskelig på grunn av utviklingen fra studien av sjeldne, tilbakevendende genetiske lidelser til mer vanlig sporadiske forstyrrelser for som tradisjonelle genet å finne metoder ikke er mottakelig. Gjeldende tilnærminger til å identifisere forårsaker gener ofte lar identifikasjon av relativt store regioner i genomet som inneholder mange gener (matrise-CGH) eller flere varianter i en rekke kandidat gener som er vanskelig å validere (WES eller WGS).

Matrise-CGH og WES (eller WGS) tilnærminger har utvidet mutasjon spekteret for mange genetiske lidelser. Likevel, noen viktige begrensninger fortsatt. For eksempel matrise-CGH trenger høy kvalitet DNA og klarer ikke å identifisere balansert translocations eller liten slettinger/duplikasjoner inkludert omfatter én eller få exons med et enkelt. Du løser dette problemet, kan matrise-CGH være utført med høyere oppløsning enn konvensjonelle sonde avstand (f.eks bruker 1 M matrise-CGH kit) eller erstattes med SNP-array analysen. WES ofte dekker ikke store intragenic regioner og klarer ikke å identifisere dypt intronic mutasjoner. I tillegg, kan noen ganger dekning være for lav til å identifisere forårsaker mutasjoner (spesielt ved mutasjoner med lav prosentandel av mosaicism). Et annet viktig skritt for WES er at dataanalyse og filtrering krever fortsatt en betydelig innsats. For å øke dekningen av WES, antall pasienter i et enkelt eksperiment kan reduseres eller annen fange kits kan brukes samtidig.

IUE er mest hensiktsmessig tilnærming å analysere virkningen av gener knockdown på neuronal migrasjon. Men er undersøkelser på andre trinn av kortikale utviklingsmessige, som neurogenesis og neuronal modning, hindret av noen tekniske begrensninger. Faktisk utføres IUE før E13 er ofte mislykket mens undersøkelser ved senere stadier er begrenset av høyt antall postnatal dødelighet forbundet denne prosedyren. I tillegg kan gen-knockdown effektivitet variere blant electroporated embryo fører til betydelig fenotypiske heterogenitet.

Samlet har nåværende protokollen fire hovedtrinn for kritisk. Selv om det ikke er en del av protokollen beskrevet i dagens papir, må vi påpeke at første grunnleggende skritt for å bli tatt i betraktning er valg av pasienter å være registrert i slike studier. Prosessen med å identifisere romanen MCD gener krever faktisk klinisk og tenkelig undersøkelser i en kohort av pasienter som fenotypen bør være så homogene som mulig. Samle pasienter med svært homogen fenotypen øker sjansen for å identifisere forårsaker mutasjoner i et gitt gen. Minimum antall pasienter å være registrert i slike studier å oppnå suksess er imidlertid vanskelig å forutsi, siden det er sterkt avhengig av Mutasjonshastigheten av ulike genene. For eksempel for gener som FLNA, som er mutert i 100% av familiær tilfeller av X-tilknyttet bilaterale PNH og 26% av sporadiske pasienter, kan antall pasienter trengte å identifisere flere treff i genet være relativt lav. Derimot for gener med lav Mutasjonshastigheten er antall pasienter å bli vist høyere. For eksempel i C6orf70, vi var i stand til å identifisere en enkelt forårsaker mutasjon kun ved screening 64 pasienter (14 gjennom WES og 50 gjennom konvensjonelle Sanger sekvensering)16, beregne en Mutasjonshastigheten for dette genet på ca 1,5%. Andre kritiske trinn er utelukkelse av mutasjoner i alle kjente MCD gener for å identifisere romanen forårsaker gener. Takket være bruk av romanen neste generasjons sekvensering teknologi, kan mutasjon screening av kjente og kandidat gener nå utføres i et enkelt eksperiment. Imidlertid bør riktig varianter filtrering brukes å unngå tilstedeværelsen av et stort antall falske positiver bekreftes eksperimentelt og filtrerer ut potensielle forårsaker mutasjoner. Faktisk er antall kandidat gener/varianter spesielt høy i WES eksperimenter. Hvis involvering av et bestemt gen er usikker, bør også mutasjon screening suppleres av MLPA analyse, utelate microdeletions eller microduplications. Det tredje kritiske punktet er det faktum at chromosomal rearrangements er sterkt påvirket av plasseringen til stoppunktet. I denne sammenheng er det verdt å utelate, i størst mulig grad, avbrudd eller forskyvning av cis-regulatoriske elementer distale på gener ikke inkludert i sletting/duplisering. Til slutt antar i vivo RNAi eksperimenter at forårsaker genene spiller en direkte rolle i neuronal migrasjon under embryonale stadier. Men etiologien for MCD, inkludert PNH, er heterogene og i utero tilnærming kan mislykkes i å oppdage effekten av gener involvert i utviklingsmessige trinn inkludert neuronal spredning eller cellen overlevelse. I tillegg kan lav kompleksitet gnager hjernen maskere virkningen av knockdown eller overuttrykte med et gitt kandidat, som kan være mer tydelig i den menneskelige hjernen.

Vi tror at integrering av genomics og i vivo funksjonelle studier vil bidra til å utvikle nye diagnostiske verktøy for identifisering av nye MCD forårsaker gener. Denne strategien kan også gi nye dyr modeller for å teste terapeutiske mål og forstå i Patofysiologien ved MCD, som har så langt vært begrenset av mangel på eksperimentelle modeller og begrenset tilgang til hjernevevet fra pasientene påvirkes. Tyde molekylær veiene som er forbundet med MCD vil lidelser også gi verdifull ny informasjon om fysiologiske hjernens utvikling generelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, Pr. dvs Scheffer, Pr. S.P. Roberston og Pr. SF Berkovic for å gi MCD pasienter. Vi takker Dr. F. Michel og D. Mei for tekniske råd og hjelp. Dette arbeidet ble støttet av støtte fra de syv rammeprogram i EU, ønske om prosjektet, kontraktnummeret: helse-F2-602531-2013, (til V.C., R.G., A.R., A.F. og C.C.), INSERM (til A.R. og C.C.), Fondation Jerome Lejeune Institute (R13083AA A.F, E.P.P og C.C) og Région Provence-Alpes-Côte d'Azur (APO2014 - DEMOTIC C.C. og A.A.D). D.A.K er en EMBO ung etterforsker og støttes av FWF gir (I914 og P24367).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Picospritzer III Parker Hannifin Corp P/N 051-0500-900 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0002 The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V Microm 10076838 Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300 Olympus The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software Glance Vision Technologies eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K Agilent Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K Agilent Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless Agilent Agilent p/n G2534A Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays Agilent Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven Agilent Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers Agilent Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid Agilent Agilent p/n G8800A or equivalent Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube Ambion p/n AM12400 or equivalent Microcentrifuge
Magnetic stir bar Corning p/n 401435 or equivalent Instrument for stirring
Qubit Fluorometer Life Technologies p/n Q32857 Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer Invitrogen p/n Q32850 Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes Pipetman or equivalent DNA dispensation
Vacuum Concentrator Thermo Scientific p/n DNA120-115 or
equivalent		 Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit Agilent p/n 5190-4240 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units) Agilent p/n 5190-3391 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates GE Healthcare p/n 25-9005-98 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich p/n NA1020 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA p/n G1521 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays: Promega (female) or p/n G1471 (male) Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays: Coriell p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or Agilent p/n 5188-5226 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and Agilent p/n 5188-5221 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 Agilent p/n 5188-5222 Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution Agilent p/n 5185-5979 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA Agilent p/n 5190-3393 Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner Agilent Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples Agilent p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples Agilent p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples Agilent p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples Agilent p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples Agilent p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples Agilent p/n G9622C
DNA 1000 Kit Agilent p/n 5067-1504 Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit Agilent p/n 5067-4626 Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit Kit for automated PCR purification.
5 mL Agencourt p/n A63880
60 mL Agencourt p/n A63881
450 mL Agencourt p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL Life Technologies Cat #65601
10 mL Life Technologies Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32853
Qubit assay tubes Life Technologies p/n Q32856 DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries Agilent depending on the experiment Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8800A DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8810A DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates Agilent p/n 410088 DNA amplification
Optical strip caps Agilent p/n 401425 DNA amplification
Tube cap strips, domed Agilent p/n 410096 DNA amplification
Compression mats Agilent p/n 410187 DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle Agilent p/n G2943CA DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set Agilent p/n G2947CA DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series Covaris DNA shearing
Covaris sample holders p/n 520078 DNA shearing
Nutator plate mixer BD Diagnostics p/n 421105 or equivalent Plate Mixer
GaIIx Illumina next generation sequencing machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
  2. Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
  3. Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
  4. Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
  5. Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
  6. Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
  7. Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
  8. Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
  9. van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
  10. Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
  11. Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
  12. Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
  13. Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
  14. Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
  15. Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
  16. Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
  17. Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
  18. Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
  19. Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
  20. Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
  21. Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
  22. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
  23. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  24. Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).

Tags

Nevrovitenskap problemet 130 misdannelser i kortikale utvikling matrise-CGH hel-exome sekvensering i utero electroporation dyremodell RNA-interferens
En ny strategi kombinerer matrise-CGH, hel-exome sekvensering og <em>In Utero</em> Electroporation i Red for å identifisere forårsaker gener for hjerne misdannelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conti, V., Carabalona, A.,… More

Conti, V., Carabalona, A., Pallesi-Pocachard, E., Leventer, R. J., Schaller, F., Parrini, E., Deparis, A. A., Watrin, F., Buhler, E., Novara, F., Lise, S., Pagnamenta, A. T., Kini, U., Taylor, J. C., Zuffardi, O., Represa, A., Keays, D. A., Guerrini, R., Falace, A., Cardoso, C. A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations. J. Vis. Exp. (130), e53570, doi:10.3791/53570 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter