Summary
Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) malformasyonu kortikal gelişim (MCD) en sık görülen yetişkinlikte ama genetik temeli en dağınık durumda bilinmeyen kalır. Biz son zamanlarda roman aday genler MCD'ler için tanımlamak için ve doğrudan kendi etken rol içinde vivoonaylamak için bir strateji geliştirdik.
Abstract
Serebral korteks dahil doğum kusurları — kortikal geliştirme (MCD) olarak da bilinen Ekstremite Malformasyonlari — önemli Fikri Engellilik ve ilaca dirençli epilepsi % 20-40 için Çocukluk nedenleri. Yüksek çözünürlüklü beyin görüntüleme MCD fenotipleri büyük bir grup tanımlaması içinde vivo kolaylaştırdı. Beyin görüntüleme, genomik analiz ve hayvan modellerin üretimi gelişmeler rağmen sistematik olarak aday genler öncelik ve sözde mutasyonlar fonksiyonel etkilerini sınamak için basit bir iş akışı yok. Bu sorunu çözmek için kimliği roman sorumlu genlerin MCD etkinleştirme deneysel bir strateji geliştirdi doğrulanmış ve. Bu strateji tanımlayıcı aday genomik bölgeler veya genlerin yolu ile dizi-CGH ya da bütün exome sıralama ve onların inactivation veya overexpression içinde utero üzerinden kemirgen beyin geliştirme belirli mutasyonların etkileri karakterize dayanır elektroporasyon. Bu yaklaşım bir sözde veziküler protein, periventriküler Nodüler Heterotopya, arızalı nöronal göç neden bir MCD patogenezinde için kodlama C6orf70 gen tanımlaması yol açtı.
Introduction
Serebral korteks bilişsel ve entelektüel işlemlerinde önemli bir rol oynar ve duygusal kontrolü yanı sıra öğrenme ve hafıza ilgilenmektedir. Bu nedenle birçok nörolojik ve psikiyatrik hastalıklar kortikal geliştirme (MCD) Ekstremite Malformasyonlari neden şaşırtıcı değil. MCD etyolojisinde alınan her ikisi de beri karmaşıktır ve genetik faktörler söz konusu. MCD genetik olarak belirlenen oranda toplu yaygınlığı yaklaşık % 2 ve çoğu durumda tek tük. Örneğin, konjenital beyin dysgenesis insidansı insan nüfusunun % 1 daha yüksek olarak tahmin edildi ve bazı türlerinin MCD epilepsi olan tüm hastalarda % 14'den fazla ve ciddi veya dirençli epilepsi1, % 40 oranında gözlenir 2.
Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) en yaygın MCD'ler biridir ve sinir hücreleri anormal geçiş tarafından gelişmekte olan serebral korteks ventrikül bölgesinden (VZ) neden olur. Kümeleri sonuçlarında heterotopik nöronların genellikle manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanarak görüntülenir lateral ventriküllerin duvarları boyunca göç nöronların hatası. Klinik, anatomik ve görüntüleme PNH heterojen bulunuyor. Nodüller küçük ve tek taraflı bilateral ve simetrik aralığı. Ortak klinik sekeller epilepsi ve fikri Engelli3içerir. Xq28 haritalar, Filamin A (veya FLNA) gen mutasyonlar ikili PNH X'e aileleriyle % 100 ve % 26 sporadik hastalar3,4bulundu. 20q13 haritalar, ARFGEF2 gen mutasyonlar neden PNH nadir, resesif şeklinde iki düşündürmekteyse aileler5' te bildirilmiştir. Son zamanlarda, biallelic Reseptör-ligand cadherin çift DCHS1 ve FAT4 kodlama genlerdeki mutasyonlar PNH6içerir bir multisystemic bozukluğu tarafından etkilenen dokuz hastalarda tespit edilmiştir. PNH Ayrıca ile ilişkili kırılgan X Sendromu7, Williams Sendromu8, 22q11 microdeletion Sendromu9, 5 p 1510mükerrer, 1 p 3611, 5q14.3-S1512, 6 p 2513 silme ve ek sorumlu genlerin dağılmış düşündüren 6q terminal silme Sendromu14,15,16,17,18,19, genom. Ancak, sporadik PNH hastaların yaklaşık % 74'genetik temeli aydınlatılmamıştır17gerekmektedir.
Dizi Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (dizi-CGH) kanıtlanmış gibi Ancak, alt mikroskobik kromozom anormallikleri, bu yaklaşımı kullanarak tanımlanan genomik bölgelerin tespiti için güçlü araçlardır olmak klasik gen eşleme yaklaşımlar genellikle büyük ve çok sayıda gen içerir.
Büyük paralel sıralama teknikleri (Yani bütün Exome sıralama (WES) ve bütün-genom sıralama (WGS)) gelişiyle maliyeti ve tüm insan exome veya genom sıralamak için gereken süreyi önemli ölçüde azalttı. Yine de, WES ve WGS veri yorumlanması için veri süzme gelen her hastaya onlarca, yüzlerce (veya hatta binlerce çözümleme türüne bağlı olarak,) türevleri ortaya beri çoğu durumda, zorlu kalır.
Roman MCD sorumlu genlerin, dizi-CGH birleştiren bir roman sistematik Strateji belirleme işlemini hızlandırmak için aday genler WES ve rahim içinde elektroporasyon (orijinal) tarama tasarlanmıştır. EKOSEM seçime bağlı olarak devre dışı bırakın (veya overexpress) belirli genler veya mutasyonlar kemirgen beynindeki corticogenesis18,19onların katılımı hızlı değerlendirilmesi etkinleştirme sağlar. RNAi aracılı nakavt veya overexpression bir veya daha fazla aday gen gen hastalığı geliştirme, nöronal göç ve/veya olgunlaşma yerelleştirilmiş kusurları ile ilişkili olduğunda neden beklenir. Kimin inactivation (veya overexpression) Rodents hastalarda gözlenen fenotip üretir bir gen kimlik, bu MCD sporadik hastalarda tarama için olağanüstü bir aday haline gelir. Bu yaklaşımı kullanarak, biz son zamanlarda C6orf70 gen (olarak da bilinen ERMARD) çok önemli katkı 6q27 kromozom silme işlemleri16barındırmaktan hastalarda PNH patogenezinde ortaya koydu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik beyanı: Wistar fareler çiftleş, muhafaza ve Fransızca ve Avrupa Birliği mevzuatı ile anlaşma INMED hayvan tesislerinde kullanılan.
1. DNA ekstraksiyon ve miktar dizi-CGH ve WES için
- Genomik DNA (gDNA) insan kanı lökosit otomatik bir DNA izolasyon robot veya üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan el ile DNA ekstraksiyon Kitleri kullanarak hastaların ayıklamak. Tüm örnekleri bir Spektrofotometre kullanarak ölçmek.
2. dizi-CGH Protokolü
-
GDNA kısıtlama hazım
- Bir hasta ve 37 ° C'de 2 h için ticari olarak mevcut insan kontrolü DNA RsaI ve AluI ile saf gDNA çift ng Özet 500 10 U/μL enzim 0.5 μl her reaksiyon için kullanın. 20 dk 65 ° c enzimler devre dışı bırakın ve buz için örnek tüpler taşımak için kuluçkaya.
-
Örnek etiketleme
- Random primerler Mikroarray biçiminde her tepki tüp (örneğin 5 µl 1-pack, 2 paket ve 4-pack microarrays için) kullanmak için gerekli uygun hacmi ekleyin. De yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından karıştırın.
- Örnek tüpler için termal cycler aktarın. 95 ° C 3 dakika ve daha sonra 4 ° C 5 min için kuluçkaya.
- Bir siyanür 3 ve bir siyanür 5 hazırlamak aşağıdaki birimler karıştırma tarafından buz üzerinde etiketleme Master Mix: 10,0 µl 5 X reaksiyon arabellek, 5.0 µl 10 x dNTPs, 3.0 µl siyanür 3-dUTP veya siyanür 5-dUTP ve 1.0 µl Exo (-) Klenow enzim, 2.0 µl nükleaz ücretsiz su. Mikrodizi biçimine göre her reaktif hacmi kullanımda seçin.
- Etiketleme Master Mix gDNA içeren her tepki tüp ekleyin. De hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
- Örnek tüpler için termal cycler aktarmak ve 37 ° c 2 h, 10 dk 65 ° C için kuluçkaya ve örnekleri 4 ° C'de korumak
-
Etiketli gDNA arıtma
- 1 x TE (pH 8.0) 430 µl her tepki tüp ekleyin.
- Arıtma sütun 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin ve sütunları uygun şekilde etiketleyin. Yük her bir arıtma sütuna gDNA etiketli.
- 14.000 x g oda sıcaklığında bir microcentrifuge içinde vasıl 10 dk santrifüj. Akışı aracılığıyla atın ve sütun 2 ml koleksiyonu tüpe geri yerleştirin.
- 1 x TE (pH 8.0) 480 µL her bir sütun ekleyin. 14.000 x g oda sıcaklığında bir microcentrifuge içinde vasıl 10 dk santrifüj. Akışı aracılığıyla atın.
- Sütun bir taze 2 mL toplama tüp ve bir microcentrifuge saf örnek toplamak için oda sıcaklığında 1000 x g, 1 dk santrifüj tersine çevirin.
- Numune hacmi 1 x TE (pH 8.0) ekleme veya yoğunlaştırıcı kullanarak kullanım Mikroarray biçiminde için istenen getirmek. Örneğin, 1-pack Mikroarray getirmek için birimin 80,5 µL. için örnek 5 min için buz üzerinde kuluçkaya ve sonra yukarı ve aşağı 10 kez çözüm pipette.
-
Hibridizasyon için etiketli gDNA hazırlanması
- Test ve referans örnekleri uygun siyanür 5 etiketli sample ve siyanür 3 etiketli bir taze 1,5 mL RNase free tüpü kullanarak birleştirin. 1-pack Mikroarray emin olmak için son hacim Örneğin, 158 µL. Mikroarray biçimine göre her örnek hacmi kullanımda seçmektir.
- Bir Spektrofotometre verim, A260 nm (DNA), A550 nm (siyanür 3) ve A650 nm (siyanür 5) Absorbans ölçme tarafından etiketleme veya belirli etkinlik derecesini ölçmek için kullanın.
- Verim formülü kullanarak hesaplar: [DNA concentration(ng/µl) numune hacmi (µl) x] / 1000 (ng/µg). Özel faaliyet formülü kullanarak hesaplar: boya/µg gDNA µl başına µl başına pmol.
Not: Örneğin, için 0,5 µg giriş DNA verimi 8-11 µg olmalıdır ve siyanür-3 örnek ve 20-35 siyanür-5 etiketli örnek için etiketli için belirli aktivite (pmol/µg) 25-40 olmalıdır.
- Verim formülü kullanarak hesaplar: [DNA concentration(ng/µl) numune hacmi (µl) x] / 1000 (ng/µg). Özel faaliyet formülü kullanarak hesaplar: boya/µg gDNA µl başına µl başına pmol.
- Hibridizasyon Master Mix Mikroarray biçimi kullanmak için gerekli miktarda hazırlamak için aşağıdaki reaktifler mix: 50 µL karyolası-1 DNA (1,0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH engelleme aracı ve 260 µl 2 x HI-RPM hibridizasyon arabellek.
- Hibridizasyon Master Mix uygun hacmi Mikroarray biçimi kullanmak için gerekli toplam hacmi elde etmek için etiketli gDNA içeren 1,5 ml RNase free tube ekleyin. Örneğin, 1 paket Mikroarray için her reaksiyon için son hacim 362 µl olduğundan emin olun.
- Yukarı ve aşağı, pipetting tarafından örnek mix sonra hızlı bir şekilde de 14,000 x g santrifüj kapasitesi ve 3 min 95 ° c ve 30 dk 37 ° C'de için kuluçkaya.
-
Chambers'ı derleme ve hibridizasyon
- Temiz conta slayt odası üsse doğru yukarı bakacak şekilde ve odası Bankası dikdörtgen bölümünü ile uyumlu conta etiketini yükleyin. Conta slayt odası tabanı ile aynı hizada ve açık olmadığından emin olun.
- Hibridizasyon örnek karışımı örnek eşit şekilde dağıtılır emin conta iyi dağıtmak.
- Mikrodizi slayt conta slayt yerine sandviç çifti düzgün uyumlu değerlendirilmesi üzerine koy. Ardından, kapak gözükeceksin slaytlar koyarak ve el sıkma pensi tepki odası bir araya getirin.
- Dikey olarak birleştirilmiş odası döndürerek ıslatma slaytlar olun. Kabarcıklar odasında mevcut olmadığından emin olun. Gerekirse, derleme sert bir yüzey üzerinde sabit kabarcıklar taşımak için dokunun.
- 20 devir / dakikada döndürmek için kurulmuş bir rotator rafa monte slayt odaları koymak. Hibridizasyon odası fırına koyar ve hibridizasyon 65 ° C'de 24-40 h kullanımda Mikroarray biçimine göre gerçekleştirmek.
-
Mikrodizi çamaşır ve tarama
- Hibridizasyon odası fırından alın ve 1 yıkama arabellekte daldırın. Onun demontaj için devam edin.
- Mikrodizi slayt kaldırın ve hızlı yıkama arabellek 1 oda sıcaklığında bir slayt rafa içine koymak.
- Dizi slayt ile (kullanım bir bit ve bir manyetik karıştırıcı) karıştırarak 5 dakika yıkayın. Çok güçlü karıştırma ama iyiye gitmeye karıştırıcı hızı 4 (Orta hızda), ayarı için ayarlayın.
- 90 s karıştırma için yıkama tampon 2 dizi slayt yıkayın. Yavaşça (o ortaya kuru) arabelleğinden slaydı yeniden elde etmek ve bir slayt tutucu bir slayt koruyucusu yardımıyla içine yükleyin.
- Slayt dizi tarayıcıya yüklemek ve dizi üretici yönergelerine göre tarama gerçekleştirin.
- Ayıklama yazılım üreticisinin yönergeleri (V.9.1.3.1) doğrultusunda kullanılan tarayıcı ile sağlanan kullanarak sonuçları çözümleyebilirsiniz.
3. WES Protokolü
- Hedef zenginleştirme
- DsDNA BR tahlil gDNA örnek enstrüman protokolüne göre konsantrasyonu belirlemek için kullanın.
- Kaliteli Çift Kişilik iplikçik DNA 5 µg 1 x 50 µL toplam hacmi 1.5 mL düşük bağlama tüpte arabellekte düşük TE sulandırmak.
- Bir sonicator kadar ayarlayın ve bir microtube üreticinin yönerge göre yükleme ve boşaltma istasyonu içine koymak. Kap tüp üzerinde tutun.
- Yavaş yavaş 50 µl DNA örneği üzerinden önceden bölünmüş septa kabarcıklar tanıtımı olmadan aktarın.
- Sonicator'ın üretici tarafından önerilen ayarlara göre DNA kesme ve üreticinin yönerge göre bir Bioanalyzer kullanarak kalitesini değerlendirmek. DNA parçası boyutu 150 ila 200 hedeftir bp.
- DNA tamiri biter
- Son onarım tepki Mix son onarım Oligo Mix 10 µL ile 40 µL son onarım enzim karışımı karıştırarak hazırlayın. Bir girdap karıştırıcı iyi karıştırın.
- 30 dk içinde termal cycler için 20 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve sonra onları 4 ° C'de Isıtmalı bir kapak kullanmayın.
- Son onarım tepki her 50 µL 3.2.1. adımda hazırlanan Mix 50 µL DNA örneği de güdülmesini ekleyin. De yukarı ve aşağı pipetting veya hafif vortexing karıştırın.
- Örnek üretici protokolüne göre göre boncuk arıtma kiti ile arındırmak.
- Poliadenilasyon 3' biter.
- DA-takip Master Mix 20 µl her sonunda tamir, saf DNA örneği için (yaklaşık 20 µL) ekleyin.
- De yukarı ve aşağı pipetting veya hafif vortexing karıştırın.
- Termal cycler 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve sonra 4 ° C'de tutun Isıtmalı bir kapak kullanmayın.
- Tüp ligasyonu yakalama öncesi dizin oluşturma bağdaştırıcısının.
- Tüp ligasyonu Master Mix 5 µL her A kuyruklu DNA örneği ekleyin.
- 5 µL uygun yakalama öncesi dizin çözüm her örnek için ekleyin.
- Kuyuları mühür ve 5 kısaca santrifüj örnekleri s.. için vortexing tarafından iyice karıştırın.
- 15 dakika içinde bir termal cycler 20 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve 4 ° C'de basılı tutun Isıtmalı bir kapak kullanmayın.
- Üretici protokolüne göre göre boncuk arıtma kiti ile örnekleri arındırmak.
- Dizin oluşturulmuş Kütüphane amplifikasyon.
- Yakalama öncesi PCR reaksiyon mix uygun hacmi 1 µL astar mix ve 25 µL PCR Master Mix karıştırarak hazırlayın. Bir girdap karıştırıcı iyi karıştırın.
- 26 µL PCR plaka ayrı Wells amplifikasyon karışımı ve her dizin oluşturulmuş gDNA Kütüphane örneğinin 24 µL birleştirir.
- PCR programı çalıştırmak ile ertesi gün merdiven: 98 ° C için 2 dk 5 döngüleri için 30 98 ° C'de s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 1 min ve 10 dakika süreyle 72 ° C'de son bir uzantısı için tutun örnekleri 4 ° C'de
- Örnek üretici protokolüne göre göre boncuk arıtma kiti ile arındırmak.
- Üretici protokolüne göre bir Bioanalyzer kalitesiyle değerlendirmek.
- Hibridizasyon için dizin oluşturulmuş DNA örneklerinin havuzu oluşturma
- Her yakalama tepki havuzu için her dizin oluşturulmuş gDNA Kütüphane örnek bir iyi bir PCR plaka uygun hacmi birleştirin. Örneğin, insan veya fare All-Exon kitaplıklar yakalamak için 187.5 kullanarak havuzu başına 8 kitaplıkları birleştirmek ng dizin oluşturulmuş her Kütüphane. Her final yakalama tepki havuzu 1500 içerdiğinden emin olun dizin oluşturulmuş gDNA ng.
- Her birim için azaltmak < 7 µL vakum yoğunlaştırıcı kullanarak. Tamamen örnek kurutma önlemek.
- Yeterli su nükleaz ücretsiz son iyi hacim 7 µL ve girdap sonra gDNA şiddetle için sıvı kuyu dibinde toplamak için bir santrifüj veya mini plaka spinner 30 s. santrifüje içeren plaka getirmek için her konsantre gDNA havuzu ekleyin.
- GDNA Kütüphane havuzları yakalama kitaplığına hibridizasyon
- Her 7 µL dizine gDNA havuzu Mix engelleme 9 µl ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet karıştırmak için.
- Kuyuları kap, gDNA termal cycler için içeren mühürlü plaka ve 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya, daha sonra 65 ° C'de tutun Plaka için en az 5 dk 65 ° C'de tutulur emin olun.
- Yakalama Kütüphane boyutu temelinde RNase blok, seyreltme uygun hazırlamak (%10 seyreltme kitaplıkları < 3.0 Mb ve %25 seyreltme için kitaplıklarına > için 3,0 Mb).
- Yakalama Kütüphane büyüklüğüne göre yakalama Kütüphane uygun miktarda birleştirin ve RNase blok çözüm buz tuttu bir PCR plaka oranında seyreltin. De pipetting tarafından karıştırın. Yakalama kitaplıkları için < 3,0 Mb, kullanım 2 µl Kütüphanesi ve RNase blok 5 µL % 10 seyreltme. Yakalama kitaplıkları > 3,0 Mb, kullanım 5 µl Kütüphanesi ve RNase blok 2 µl %25 seyreltme olarak.
- Hibridizasyon arabelleği 37 µL Kütüphane/RNase blok yakalamak Mix 7 µL içeren her şey ekleyin. De pipetting tarafından mix ve kısaca karışımı içeren plaka santrifüj kapasitesi.
- GDNA havuzu plaka 65 ° c adımında de gDNA havuzu plaka 3.7.5 her örnek için tüm 44 µL Kütüphane yakalama karışımı aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanırken korumak. De yavaş yavaş aşağı yukarı 8-10 kez pipetting tarafından karıştırın.
- Kuyu kubbeli şerit Kapakları kapatın. Bütün wells tamamen mühürlü emin olun. Bir sıkıştırma mat termal cycler PCR plaka üzerine getirin.
- Hibridizasyon karışımı için 65 ° C'de 24 saat kuluçkaya Not: Örnekleri en fazla 72 saat için melezleşmiştir, ancak genişletilmiş hibridizasyon geniş buharlaşma örnek wells neden olmaz doğrulamanız gerekir.
- Manyetik boncuklar streptavidin kaplı hazırlanması
- Bir su banyosu veya sıcak bir blok içinde 65 ° C'de yıkama arabellek 2 prewarm.
- Şiddetle Streptavidin manyetik boncuklar bir girdap Mikser resuspend. Manyetik boncuklar depolama sırasında yerleşmek.
- Hibridizasyon örnekleri için resuspended boncuk 50 µL PCR plaka wells için ekleyin.
- Boncuk yıkama ve onları bağlayıcı arabelleğe 200 µL içinde resuspend.
- Streptavidin boncuk kullanarak melezleşmiştir DNA'sı yakalamak.
- Tahmin ve kayıt sonra 24 saat kuluçka kalır hibridizasyon çözüm hacmi.
- Hibridizasyon plaka 65 ° C'de korumak ve yıkanmış streptavidin boncuk 200 µL içeren plaka wells için her hibridizasyon karışımı tüm birimi (yaklaşık 60 µL) aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın. De yavaş yavaş aşağı yukarı 3-5 kere pipetting tarafından karıştırın.
- Kuyuları kap ve yakalama plaka Nutator Mikser veya oda sıcaklığında 30 dk için eşdeğer üzerinde kuluçkaya. Örnekleri düzgün wells karıştırma emin olun.
- Kısaca bir santrifüj veya mini plaka spinner yakalama plaka santrifüj kapasitesi.
- Boncuk süspansiyon toplamak için bir manyetik Separator yakalama plaka koymak. Kaldırmak ve süpernatant atın.
- Boncuk yıkama arabellek 1 200 µL içinde resuspend. Boncuk tamamen resuspended kadar yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
- Kısaca santrifüje santrifüj veya mini plaka getiriyor.
- Plaka manyetik ayırıcısı olarak koymak.
- Temizleyin, sonra kaldırmak ve süpernatant atmak çözüm için bekleyin.
- Sonrası için çoğaltılmış sıralama işleme örnek yakalama
- Aşağıdaki karıştırılarak PCR reaksiyon karışım uygun hacmi hazırlamak: 9 µL nükleaz ücretsiz su, 25 µL astar Arttırımlar sayısına göre Mix Master Mix ve 1 µL. İyi bir girdap Mikser kullanarak mix ve buz üzerinde tutun.
- Her amplifikasyon tepki için adım 3.10.1 PCR reaksiyon karışımı 35 µL PCR plaka wells yerleştirin.
- Pipet her yukarı ve aşağı boncuk süspansiyon homojen olduğundan emin olmak için boncuk bağlı yakalanan Kütüphane havuzu örnekleri.
- Her yakalanan Kütüphane havuzu boncuk süspansiyon, 15 µL de uygun PCR reaksiyon karışıma ekleyin. Boncuk süspansiyon homojen olana pipetting tarafından iyice karıştırın.
- Point 3.10.2 termal cycler içinde hazırlanan tabak yerleştirin ve aşağıdaki PCR güçlendirme programı çalıştırın: 98 ° C için 2 dk, 8-11 devredir 98 ° C'de 30 s, 60 ° C 30 s ve 72 ° C için 1 dakika takip 10 dk 72 ° C'de son bir uzantısı tarafından. Örnekleri 4 ° C'de tutun
- Örnek bir boncuk dayalı saflaştırma üretici protokolüne göre ile arındırmak.
- Üretici protokolüne göre bir Bioanalyzer kalitesiyle değerlendirmek.
- Örnekleri sıralama multiplexed için hazırlayın
Not: Havuzları kütüphanelerin Kütüphane yakalama boyutunu esas alarak ve strateji havuzu yakalama öncesi çıkan 8 veya 16 dizin oluşturulmuş, son zenginleştirilmiş örnekleri içerir. Bir tek sıralama şeritte multiplexed dizin oluşturulmuş kitaplıklar toplam sayısı platformu, sıralama veri yakalama Library için gerekli miktarı ile birlikte kullanılan ve çıkış özellikleri tarafından belirlenir.- Lane birleştirilebilir dizin sayısı platform kapasiteye göre hesaplar. Bir tek sıralama şeritte multiplexed dizin oluşturulmuş kitaplıklar toplam sayısı platformu, sıralama veri yakalama Library için gerekli miktarı ile birlikte kullanılan ve çıkış özellikleri tarafından belirlenir. Örneğin, insan bütün Exon v5 kitaplığı için önerilen sıralama veri dizini Kütüphane başına 4 Gb ve önerilen sıralama veri yakalama öncesi havuzu başına 32 Gb (8-dizin havuzları).
- Kütüphaneler sıra.
- Seçim sonraki nesil sıralama platformda kitaplık yükleme ve enstrüman özelliklerine göre çalıştırmak sıralama gerçekleştirin.
- Exome sıralama veri analiz.
- Boru hattı ve temel arama için yazılım çalıştırın. Örneğin, silindir okunma20harita, Picard ile (http://broadinstitute.github.io/picard/) Yinelenenleri kaldırmak ve tek nükleotid polimorfizmleri ve ekleme veya silme (indels) üslerinin Platypus21ile tanımlamak için kullanın. Eşanlamlı türevleri ve bu bir gen frekansta gözlenen filtre < %5 ve de novo türevlerini tanımlamak için ebeveyn exomes gelen verilerle karşılaştırın.
4. plazmid DNA hazırlık rahim içinde adım için
- Tasarım kodlama dizisi veya 3' UTR22daha önce açıklandığı gibi aday gen hedefleyen birkaç kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs).
- Hedeften uzak önlemek için etkileri shRNAs özgüllük patlama arama standart yöntemlerle veritabanları karşı sınayın. Diğer fare genler ile tamamlayıcılık fazla % 50 görüntüleme shRNAs hariç.
- Tavlanmış klon oligonucleotides mU6-pro vektör olarak içine daha önce23açıklanan.
- Plazmid DNA ile üreticinin yönergelerine uygun bir Maxi-prep arındırmak ve 3 µg/µL son bir konsantrasyon olun.
- Aliquot 20 µl DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-ya tek başına veya 1.5 mg/ml shRNA ile inşa GFP) ve hızlı 2 µL eklemek yeşil görsel enjeksiyon izleme izin vermek için boya (2 mg/mL).
5. rahim içinde elektroporasyon
-
Cerrahi müdahale
- Ketamin/xylazine karışımı ile bir arada kullanarak (e0'ın onay sperm pozitif vajinal fiş gün tanımlanmış) E15.5 hamile dişi rats, anestezi (0.1 ve 0.01 mg-vücut ağırlığı, sırasıyla), hangi bir mayi yolu ile verilir anestezik indüksiyon için enjeksiyon.
- Hayvan tam ayak çimdik refleks kaybolması gözlemleyerek anestezi emin olun.
- Hayvanın alt karin kürk kaldırmak için bir kesme makinesi kullanarak tıraş. Deri önlük povidone-iyot ve % 70 alkol kullanarak dezenfekte. Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.
- Hayvan bir ısı kaynağı yerleştirin ve steril örtü (ile açık bir pencere ortasında 4-5 cm) kesi sitesi üzerinden koymak. Facemasks, laboratuvar önlüğü, kapaklar ve steril cerrahi eldiven giymek. Kısırlık ameliyatı sonuna kadar korumak.
- Kaudal karın orta çizgi boyunca cilt dikey kesi (2-2,5 cm) yapmak ve deri altındaki kas duvarının bir kesi yapmak keskin makas kullanarak — Ayrıca 2,5 cm, — orta çizgi boyunca.
- Dikkatle karın boşluğu üzerinden bir rahim boynuz ortaya çıkarmak. Embriyo nemlendirmek 37 ° C Önceden ısıtılmış normal tuzlu eriyik-e doğru damla. Rahim sürekli nemli tutmak.
-
DNA ve elektroporasyon enjeksiyon
- Yavaşça rahim boynuzları biri halkalı Forseps ile tutun ve bir embriyo rahim duvarına dikkatle itin. Embriyo bir yandan ve diğer el eklemek ile dikkatli bir şekilde cam kılcal orta hat üzerinden 1 mm sol lateral ventrikül (2-3 mm derin) tutun ve yaklaşık 1 µL enjeksiyon kullanarak görsel izleme izin vermek için hızlı yeşil ile DNA enjekte bir microinjector.
- Normal tuzlu çözüm 3 x 7 mm2 elektrotlar yüzey üzerinde bırak. (Sol lateral ventrikül) enjekte tarafında olumlu steril elektrot ve negatif steril elektrot üzerinde sağ ventrikül yerleştirin. 5 elektrik darbeleri 950 ms aralıklarla bir ayak kontrollü pedallı (40 V bir electroporator ile tahsil 4000 mF kondansatör) teslim etmek.
-
Elektroporasyon yordamları deftere
- Rahim boynuzları için karın boşluğu koy, boşluğuna embriyolar daha doğal olarak konumlandırılmış izin vermek için ve intraoperatif sıvı kaybı için hesabınıza normal tuzlu çözüm damla ekleyin.
- Absorbe cerrahi dikişler, karın kas duvarla sonra deri basit kesintiye dikiş kullanarak kapatın.
- Sıçanı kafese geri koymak ve anestezi çıkar kadar hayvan izlemek.
- Ağrı yönetimi için buprenorfin (0.03 mg/kg) en fazla 48 saat için her 8-12 h bir subkutan enjeksiyon tarafından hayvan için yönetmek.
6. beyin numune hazırlama
-
Fiksasyon yöntemi
- Gebe iri fare 5 gün sonra hızlı servikal yerindençıkmasına tarafından takip gaz anestezi (isoflurane) kullanarak cerrahi işlem kurban.
- Karın boşluğu yeniden açmak için bir dikey kesi yapmak.
- Rahim boynuzları ortaya çıkarmak, embriyoların rahim kaldırmak ve onları başını kesmek keskin makas kullanarak.
- Beyin doku için en az hasarla çıkarmak: keskin makas kullanırken, arka (beyincik) boyunca küçük bir kesi yapmak / deri ve forseps bir çift kullanarak kafatasını delip başın ön (olfactive ampuller) eksen kabuğu uzakta ortaya çıkarmak için kafatası beyin ve küçük bir spatula kullanarak kaldırın.
- Beyin gecede 4 ° C'de % 4 olarak bırakın 1 fosfat Buffered Saline (PBS) x Paraformaldehyde.
-
Beyin kesit
- 1 x PBS için 10 dk beyinlerinde yıkayın.
- Beyin %4 agar plastik kalıpları katıştırma katıştırın.
- 50 mL 1 x PBS %4 agar 5 embriyonik beyin gömmek için hazırlayın. En fazla 50 ° C'de çözünmüş o özel olduğundan emin olun
- Beyin için en az 1 h 4 ° C'de polimerize özel tutmak Beyin çevresinde aşırı özel kaldırın.
- Yani beynin ön/arka eksen için blade dikey odaklı vibratome taban plakası beyne tutkal. Kuru ve yapıştırılmış beyin ile plaka vibratome odanın içine yerleştirmek tutkal için birkaç dakika bekleyin.
- Vibratome 1 x PBS ile doldurun. 100 µm kalınlığında kesitler dilim.
- Beyin dilimleri slaytlarda aktarmak, aşırı sıvı kaldırmak, montaj orta birkaç damla ekleyin ve bir coverslip beyin üzerine yerleştirin
7. confocal görüntüleme ve kantitatif analiz
- Gecede daha önce Imaging montaj orta kuru izin. 10 X lazer tarama confocal mikroskop olarak görüntü bölümler.
- Yazılım için nicel görüntü analizi kullanarak, görüntüyü 8 bitlik, select bir hücredeki temsilcisi GFP olumlu floresan dönüştürün ve el ile şeklini tanımlayın. Bunu yapmak için üzerinde "tahmin"'ı tıklatın ve serbest seçim aracını kullanarak hücrenin kenarlığını çizin. Bu şekilde çapı ve yoğunluk eşik hücrenin otomatik olarak yazılım tarafından korunur.
- Tıkırtı üstünde "Bul hücreleri" korteks boyunca transfected hücreleri yerelleştirmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı sağlamak için. Daha sonra gerekirse el ile yanlış pozitif kaldırın.
- Korteksin bütün kalınlığı 8 araştırma alanları tek tek bölümlerde normalleştirilmiş bölün. Bunu başarmak için "Bölge araç" tıklatın, nerede 8 "bölge Stripes" seçin (1) ilk ve son (8) çizgili VZ ve CP üst sırasıyla karşılık gelir. "Uygula" tüm korteks transfected GFP hücreleri göreli konumunu saymak yazılım izin vermek için tıklatın. Son olarak "Miktar analizi için Excel dosyasındaki verileri vermek için Kaydet" tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Roman MCD sorumlu genlerin tanımlamak için tasarlanmış deneysel strateji şekil 1' de recapitulated.
Degisken PNH (şekil 2A), corpus callosum dysgenesis, colpocephaly, serebellar hipoplazi ve epilepsi ile ilişkili polymicrogyria birleştirerek gelişimsel beyin anomalileri ile 155 hastalar kohort içinde dizi-CGH gerçekleştirerek ataksi ve kognitif bozukluk, 1.2 Mb en az kritik silme 12 hastalar (şekil 2B)21tarafından paylaşılan 6q27 olarak tespit edilmiştir. Genomik bölge dört bilinen genlerin (THBS2, PHF10, TCTE3 ve DLL1) içerir ve iki genler (WDR27 ve C6orf70) tahmin (şekil 2B).
Dizi-CGH paralel olarak, WES analizi 14 hasta izole ikili PNH ile ve hiçbir kopya numarası varyasyon analizi, bir hasta ile de novo mutasyon tespit yapılmıştır (c.752T > c: pIle250Asn) öngörülen C6orf70 gen (içinde GenBank katılım numarası NM_018341.1) (şekil 3).
C6orf70 içinde tanımlanan mutasyon PNH içinde etken bir rol olduğunu onaylamak ve haploinsufficiency 6q27 içinde eşleme diğer genlerin fenotip etkileyebilir olup olmadığını araştırmak için nöronal göç onların rol içinde vivo araştırılmıştır sıçan kortikal sinir ataları kendi ifadesinde susturmaya rahim içinde devirme yaklaşım RNAi aracılı23,24 kullanarak. Sadece genler gelişmekte olan fare korteks, PHF10, C6orf70 ve DLL1, içinde ifade test edildi (şekil 4A). Farklı kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs) bu üç genlerin kodlama dizisi hedefleme üretildi. Üst kortikal katmanlara taahhüt nöronlar oluşturulduğunda ShRNAs sonra neuroprogenitors sıçan yeni korteksimiz içinde içine rahim içinde elektroporasyon tarafından embriyonik gün 15 (E15), kullanılmaya başlanmıştır. Yeşil flüoresan protein transfection muhabir olarak kullanıldı. GFP pozitif hücrelerinin göreli dağıtım 5 gün sonra elektroporasyon incelenmiştir. Nakavt Dll1 ve Phf10 sonuçlandı gecikme Radyal nöronal göç (veri) gösterilmez, oysa C6orf70 nakavt nöronal göç engelliler ve heterotopik nodüller gelişimi için son derece doğuran Bu Flna devirme modeli (şekil 4B)24saat içinde gözlenen anımsatan. Tersine, transfections etkisiz C6orf70 uyuşmazlığı shRNA ile nöronal göç (şekil 4B) bariz etkisi vardı.
Şekil 1: Roman MCD sorumlu genlerin Kimlik tanımlaması için iş akışı. Roman hastalık genler neden tanımlamak için kullanılan farklı yaklaşımlar şematik gösterimi. Kutuları mevcut kağıt açıklanan yaklaşımlar içinde sarı temsil renkli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: 6q27 silme neden anormal beyin gelişimi ile PNH. (A) hastanın 2. T2 tartılır koronal (sol paneli) ve gelişeceğini bir ada korteks aşağıda Sol temporal lob (siyah ve beyaz ok ucu) duvar astar PNH gösterilen T1 tartılır Aksiyel (doğru kapı aynası) bölümleri. (B) hasta 11. İkili heterotopik nodüller temporal boynuz (beyaz ok uçları) duvarlar boyunca gösterilen T1 ağırlıklı koronal bölümünde. (C) hasta 12. Koronal bölüm T2 ağırlığını koydu. Solda, PNH hala görünür (siyah ok ucu) olduğunu ve ventrikül genişlemiş. (D) silme dizi-CGH (üst kısım) kullanarak PNH hastalarda tespit 6q27 bölgesinin şematik gösterimi. Yatay, kesikli çizgiler hastalarda tespit silme gösterir. Silinmiş boyutunu asgari kritik bölge ayrıca belirtilir ve dört bilinen gen içermektedir: THBS2, PHF10, TCTE3 ve DLL1 ve iki tahmin edilen gen: WDR27 ve C6orf70 (üst kısım). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Sonuçları sıralama. ( ) T2 - ağırlıklı Aksiyel bölüm ön boynuzları (beyaz ok uçları) ikili PNH c.752T taşıyan hastada gösterilen > C6orf70 bir mutasyon. Bu gösterilen sıralama (B) Sanger WES tarafından tanımlanan mutasyon de novooluştu. Mutasyon konumunu tarafından siyah ok uçları belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: 6q27 en az kritik bölge ve C6orf70-nakavt lokalize genlerin ifade analizi kortikal nöronların Radyal geçiş değiştirir. (A)kantitatif RT-sıçan beyin korteksi 6q27 kritik bölgede bulunan genlerin ifade gösterilen PCR. Cyclophilin A normalleştirme için kullanılan. (B) temsilcisi neocortical koronal bölümleri E20 sıçan beyin 5 gün sonra elektroporasyon ya yeşil flüoresan Protein ile yalnız (kontrol) oluşturmak veya sıra (C6orf70-shCDS) kodlama C6orf70 hedefleme shRNA ile kombine ya da (C6orf70-shCDSmm) göreli etkisiz uyumsuzluğu ile inşa. Flna -nakavt (FLNA-shCDS) Engelli nöronal göçün denetimi olarak kullanıldı. C6orf70-shCDS ya da FLNA-shCDS ile rahimde elektroporasyon GFP pozitif hücreler (VZ) (beyaz ok) ventrikül bölgedeki tutuklanması indüklenen, tek başına veya birlikte uyumsuzluğu ile GFP ifade hücreleri oluşturmak, ancak değiştirmemesi nöronal göç. Ölçek çubukları 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCD'ler Fikri Engellilik ve ilaca dirençli çocukluk epilepsi1,%220-40 oranında hesaba önemli nedenleri. MCD'ler ilgi önemli ölçüde iki önemli faktörler sonucunda son on yıl içinde artmıştır. İlk gelişmedir (özellikle MRG) görüntüleme beyinde sağlayan doktorlar ve bilim adamları daha önce tanınmayan birçok beyin malformasyonlar görselleştirmek. Diğer birçok roman MCD sorumlu genlerin tanımlaması sağladı genetik araçları evrimidir. Bu büyük ölçüde bizim bilgi beyin gelişimi ve işlev altında yatan ve daha doğru genetik danışmanlık için izin mekanizmalardan birini geliştirdi.
Geçmişte, araştırmacılar beyin gelişimi daha sonraki aşamaları için rolünü netleştirmek için fonksiyonel deneyleri tasarımını bırakarak öncelikle sorumlu gen hattın numarasını gösterme, onların çabaları yoğunlaşmıştır. Bu nadir, tekrarlayan genetik bozukluklar daha yaygın sporadik bozukluklar hangi geleneksel gen bulma yöntemleri mükellef değildir için çalışma ilerleme nedeniyle daha zor olmuştur. Sorumlu genlerin kez tanımlamak için geçerli yaklaşımlar nispeten geniş bölgelerinde çok sayıda gen (dizi-CGH) veya çeşitli türevleri (WES yada WGS) doğrulamak zor olan aday genler, bir dizi içeren genom tanımlaması izin.
Dizi-CGH ve WES (veya WGS) yaklaşımlar birçok genetik bozukluklar mutasyon spektrum genişletti. Yine de, kritik bazı sınırlamalar hala devam etmektedir. Örneğin, dizi-CGH yüksek kaliteli DNA ihtiyacı ve dengeli translokasyonlar veya küçük silme/mükerrer tek bir genin bir veya birkaç ekzonlar ilgili olanlar da dahil tanımlamak başarısız olur. Bu sorunu çözmek için dizi-CGH geleneksel yoklama aralığı (1 M dizi-CGH seti kullanarakörneğin ) daha yüksek çözünürlükte gerçekleştirilen veya SNP-dizi analizi ile yerine. WES kez büyük intragenic bölgeler kapsamaz ve derin intronic mutasyonlar tanımlamak başarısız olur. Buna ek olarak, bazen kapsama (özellikle halinde mozaizm düşük oranı olan mutasyonlar) etken mutasyonlar tanımlamak için çok düşük olabilir. Başka bir kritik WES için veri analizi ve filtreleme hala önemli bir çaba gerektiren bir adımdır. WES kapsamını artırmak için tek bir denemede hasta sayısı azaltılabilir veya farklı yakalama kitleri aynı anda kullanılabilir.
EKOSEM genler nakavt nöronal göç etkisini analiz etmek için en uygun yaklaşımdır. Ancak, diğer adımları kortikal gelişimsel, neurogenesis ve nöronal olgunlaşma gibi üzerine araştırmalar bazı teknik sınırlamalar tarafından engel. Oysa araştırmalar daha sonraki aşamalarında, bu yordam için ilişkili doğum sonrası ölümcül yüksek orandaki tarafından kısıtlanır E13 kez başarısız olmadan gerçekten de, orijinal gerçekleştirilen. Buna ek olarak, gen-nakavt verimliliği önemli fenotipik heterojenite için önde gelen electroporated embriyo arasında farklı olabilir.
Genel olarak, mevcut Protokolü dört büyük kritik adımı vardır. O mevcut kağıt açıklanan protokolün bir parçası olmasa da, dikkate alınması gereken ilk temel adım bu tür çalışmalarda kayıtlı hastaların seçim olduğuna işaret etmeliyiz. Gerçekten de, roman MCD genler tanımlama işlemi bir kohort klinik ve görüntüleme araştırmalarda hastaların kimin için fenotip olarak homojen olmalıdır gerektirir. Hasta son derece homojen fenotip ile toplama belirli bir gen sorumlu mutasyonların belirlenmesi olasılığını artırır. Ancak, başarı elde etmek için bu tür çalışmalarda kayıtlı hastaların en az sayı büyük ölçüde farklı gen mutasyon oranı üzerinde bağlıdır beri tahmin etmek zordur. Örneğin, hangi ikili PNH X'e ailesel vakalarının % 100 ve sporadik hastaların % 26 mutasyona uğramış, FLNAgibi genler için gen içinde birden fazla isabet tanımlamak için gereken hasta sayısı nispeten düşük olabilir. Bunun tersi olarak, düşük mutasyon oranı ile gen için taranması için hasta sayısı yüksektir. Örneğin, C6orf70, söz konusu olduğunda biz sadece 64 hasta eleme üzerine tek bir etken mutasyon tespit edebilmek (14 WES ve geleneksel Sanger üzerinden 50 üzerinden sıralama)16bir mutasyon oranı yaklaşık % 1.5 bu gen için tahmin etme,. İkinci önemli adım roman sorumlu genlerin tanımlamak için tüm bilinen MCD genlerdeki mutasyonlar dışlanması var. Roman sonraki nesil sıralama teknolojileri gelişiyle sayesinde bilinen ile aday gen mutasyonu tarama Şimdi tek bir deneyde gerçekleştirilebilir. Ancak, uygun çeşitleri filtreleme yanlış pozitif deneysel olarak onaylanması için ve potansiyel etken mutasyonlar filtre uygulamak için fazla sayıda varlığı önlemek için kullanılmalıdır. Gerçekten de, aday genler/türevleri sayısı WES deneylerde özellikle yüksektir. Belirli bir gen katılımı şüphesi varsa, mutasyon tarama MLPA analiz mikrodelesyonu veya microduplications dışlamak için aynı zamanda tamamlanmalıdır. Üçüncü kritik nokta kromozomal düzenlemeler güçlü kesme noktası noktası konumunu tarafından etkilenmiştir olmasıdır. Bu bağlamda, en olası geniş, kesintiye uğraması veya CIS düzenleyici elemanlarının silme/çoğaltma dahil değildir genlerle distal çıkarılması hariç tutmak için değer. Son olarak, in vivo RNAi deneyleri sorumlu genlerin nöronal geçiş sırasında embriyonik aşamaları doğrudan bir rol oynamak varsayıyorum. Ancak, MCD PNH, dahil olmak üzere, etyolojisinde türdeş olmayan ve rahim içinde yaklaşım gelişimsel adımları nöronal hücre veya nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma da dahil olmak üzere ilgili genlerin etkileri algılamak başarısız olabilir. Buna ek olarak, kemirgen beyin düşük karmaşıklık nakavt etkisini veya insan beyninde daha belirgin olabilir verilen aday gen overexpression maskesi.
İşlevsel genomik ve in vivo çalışmalar entegrasyonu yeni MCD sorumlu genlerin tanımlaması için yeni tanı araçları geliştirmek için yardımcı olacaktır inanıyorum. Bu strateji aynı zamanda defa deneysel modeller ve sınırlı erişim eksikliği nedeniyle beyin dokusu ile etkilenen hastaların sınırlı tedavi hedefleri sınamak ve MCD, Patofizyoloji anlamak için yeni hayvan modelleri sağlayabilir. MCD ile ilişkili moleküler yolları deşifre bozuklukları da fizyolojik beyin gelişimi hakkında değerli yeni bilgiler genel olarak sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dr. G. McGillivray, teşekkür ederim PR J. Clayton-Smith, halkla ilişkiler dahil Dobyns, halkla ilişkiler P. STRIANO, yani PR Scheffer, halkla ilişkiler S.P. Roberston ve PR S.F. MCD hastalar sağlamak için Berkovic. Biz Dr F. Michel ve ö. Mei teknik tavsiye ve yardım için teşekkür ederiz. Bu eser yedi Çerçeve Programı AB, fon tarafından desteklenmiştir arzu projesi, sözleşme numarası: Sağlık-F2-602531-2013, (için V.C., RG, A.R., AF ve C.C.), (için A.R. ve C.C.) INSERM, Fondation Jérôme Lejeune (A.F, E.P.P ve C.C R13083AA) ve Région Provence Alpes Côte d'Azur (APO2014 - CC ve A.A.D yazısı). D.A.K bir EMBO genç araştırmacı ve tarafından desteklenen FWF verir (I914 ve P24367).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
- Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
- Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
- Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
- Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
- Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
- Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
- Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
- Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
- van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
- Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
- Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
- Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
- Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
- Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
- Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
- Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
- Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
- Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
- Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
- Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
- Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).
