Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

أو-تفاعل Slp1 البوليمرات واحد رقائق من Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

نظرا لتزايد استخدام الذهب لعدة تطبيقات مثل الالكترونيات والمواد الحفازة، أجهزة الاستشعار، أو الأدوات الطبية، نما الطلب على هذا المعدن النفيس أكثر من مرة خلال السنوات القليلة الماضية "6-9. يتم الافراج عن الذهب، فضلا عن العديد من المعادن الثمينة والثقيلة الأخرى في البيئة من خلال النفايات الصناعية السائلة في تركيزات المخففة، من خلال أنشطة التعدين، والتخلص من النفايات 7،8،10، على الرغم من أن معظم التلوث البيئي بالمعادن الثقيلة أو الثمينة هو عملية مستمرة الناجمة أساسا عن الأنشطة التكنولوجية. وهذا يؤدي إلى تدخل كبير من النظم الإيكولوجية الطبيعية، ويمكن أن تهدد صحة الإنسان 9. معرفة هذه النتائج السلبية يشجع على البحث عن تقنيات جديدة لإزالة المعادن من النظم الإيكولوجية والتحسينات الملوثة في إعادة تدوير المعادن من مياه الصرف الصناعي. أساليب الفيزيائية والكيميائية راسخة مثل هطول الأمطار أو التبادل الأيوني ليست فعالة جدا، وخصوصا في عاليةلاي المخفف حلول 7،8،11. Biosorption، إما مع المعيشة أو الكتلة الحيوية الميتة، هو بديلا جذابا لمعالجة مياه الصرف الصحي 10،12. استخدام مثل هذه المواد البيولوجية يمكن أن تقلل من استهلاك المواد الكيميائية السامة. وقد وصفت العديد من الكائنات الحية الدقيقة لتتراكم أو شل المعادن. على سبيل المثال، خلايا Lysinibacillus كروي (L. كروي) JG-A12 أظهرت قدرات عالية ملزمة للمعادن الثمينة، على سبيل المثال، PD (II)، وحزب العمال (II)، والاتحاد الافريقي (III)، والمعادن السامة الأخرى مثل الرصاص (II) أو U (VI) 4،13، خلايا العصوية الضارية لالكروم (VI) 14، خلايا خميرة الخباز لحزب العمال (II) والمشتريات (II) 15، وشلوريلا المبتذلة ل Au (III) وU (VI) 16 17. الربط المعادن السابقة مثل الاتحاد الافريقي (III)، PD (II)، وحزب العمال (II) كما تم الإبلاغ عن منتزعة الكبريت desulfuricans 18 وL. كروي JG-B53 19،20. ومع ذلك، لا آلالميكروبات ل ربط كميات عالية من المعادن وتطبيقها كمادة sorptive محدودة 12،21. وعلاوة على ذلك، معدنية سعة ملزم يعتمد على معايير مختلفة، مثل تكوين الخلية، وتستخدم المكون الحيوي، أو البيئية والظروف التجريبية (درجة الحموضة، والقوة الأيونية، ودرجة الحرارة وما إلى ذلك). دراسة معزولة شظايا جدار الخلية 22،23، مثل الدهون غشاء، ببتيدوغليكان، البروتينات، أو غيرها من المكونات، ويساعد على فهم المعدن عمليات الخلايا الكاملة المعقدة التي شيدت 8،21 ملزمة.

مكونات الخلية التي تركز على هذه الدراسة هي بروتينات S-طبقة. البروتينات S-طبقة هي جزء من المغلف الخلية الخارجي من العديد من أنواع البكتيريا والعتيقة، والتي تشكل حوالي 15-20٪ من مجموع كتلة البروتين من هذه الكائنات. واجهة الأولى للبيئة، فإن هذه المركبات الخلية يؤثر بقوة على خصائص الامتصاص البكتيرية 3. البروتينات S-طبقة مع الأوزان الجزيئية تتراوح بين أربعينلتنتج مئات من كيلو دالتون داخل الخلية، ولكن يتم تجميعها خارج حيث أنها قادرة على تشكيل طبقات على الأغشية الدهنية أو البوليمر مكونات جدار الخلية. مرة واحدة معزولة، ما يقرب من جميع S-طبقة بروتينات لها خاصية ذاتية للعفويا التجمع الذاتي في التعليق، في واجهات، أو على الأسطح المستوية أو تشكيل أنبوب يشبه الهياكل 3. سمك أحادي الطبقة البروتين يعتمد على البكتيريا وضمن مجموعة من 5-25 نانومتر 24. بشكل عام، يمكن الهياكل بروتين S-طبقة تشكلت لديهم المائل (P1 أو P2)، مربع (P4)، أو سداسية (P3 أو P6) التماثل مع ثوابت شعرية من 2،5 حتي 35 نانومتر 3،24. يبدو أن تشكيل شعرية ليكون في كثير من الحالات تعتمد على الكاتيونات ثنائي التكافؤ وبشكل رئيسي على الكالسيوم 2+ 25،26، راف، J. آخرون. S-طبقة nanocomposites استنادا للتطبيقات الصناعية في القائمة على البروتين المهندسة النانو. (محرران Tijana Z. غروف وAitziber L. Cortajarena) (الوثاب، 2016 (المقدمة)). ومع ذلك، فإن سلسلة التفاعل الكامل للطي مونومر، التفاعل مونومر-مونومر، تشكيل شعرية، ودور المعادن المختلفة، وخاصة من الكاتيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+، لا تزال غير مفهومة تماما.

سلالة إيجابية الجرام L. تم عزل كروي JG-B53 (التي أعيدت تسميتها من عصيات كروي بعد تصنيف النشوء والتطور الجديد) 27 من كومة من النفايات تعدين اليورانيوم "Haberland" (Johanngeorgenstadt، ساكسونيا، ألمانيا) 4،28،29. في ظيفية البروتين S-طبقة (Slp1) يمتلك شعرية مربع، الوزن الجزيئي من 116 كيلو دالتون 30، وسمك ≈ 10 نانومتر في العيش البكتيريا الخلايا 31. في دراسات سابقة، وقد تحقق تشكيل في المختبر من طبقة البروتين المغلقة ومستقرة مع سمك حوالي 10 نانومتر في أقل من 10 دقيقة 19. سلالة ذات الصلة L. كروي JG-A12، أيضا عزل من "Haberland" كومة، يمتلك قدرات معدنية عالية ملزمة وأظهرت معزول بروتين S-طبقته على معدلات الامتصاص الجيدة الكيميائية عالية والاستقرار الميكانيكية والمعادن الثمينة مثل الاتحاد الافريقي (III)، وحزب العمال (II)، وبالشلل الرعاش (II) 4،32،33. هذا الربط من المعادن الثمينة هو أكثر أو أقل محددة لبعض المعادن ويعتمد على توفر مجموعة وظيفية على سطح البروتين الخارجي والداخلي من البوليمر والمسام، والقوة الأيونية، وقيمة الرقم الهيدروجيني. المجموعات الوظيفية ذات الصلة للتفاعل المعدن من البروتينات COOH-، NH 2 - OH-، PO 4 -، SO 4 - وستتناول ما. من حيث المبدأ، والقدرات المعادن ملزم فتح مجموعة واسعة من التطبيقات، راف، J. آخرون. S-طبقة nanocomposites استنادا للتطبيقات الصناعية في القائمة على البروتين المهندسة النانو. (محرران Tijana Z. غروف وAitziber L. Cortajarena) (الوثاب، 2016 (مقدم)). على سبيل المثال، كمكونات biosorptive لإزالة أو الانتعاشمن المعادن السامة أو قيمة المنحل، قوالب لتخليق أو ترسب محددة من الجسيمات النانوية منظم بانتظام المعدنية (NPS) لالحفز، وغيرها من المواد الهندسة الحيوية مثل طبقات الحيوية الحسية 3،5،18،33. ترتيب بانتظام صفائف NP مثل الاتحاد الافريقي (0) يمكن استخدام -NPs لتطبيقات رئيسية تتراوح بين الإلكترونيات الجزيئية وأجهزة الاستشعار، أجهزة التخزين كثافة عالية جدا، والمحفزات لCO للأكسدة 34-37. تطوير مثل هذه التطبيقات والتصميم الذكي لهذه المواد تستدعي فهما أعمق لآليات ملزمة المعادن الأساسية.

ومن الشروط الأساسية لتطوير مثل هذه المواد الحيوي القائم هو تنفيذ موثوق من طبقة واجهة بين جزيء حيوي وسطح الفني 38،39. على سبيل المثال، polyelectrolytes تجميعها مع طبقة من قبل طبقة (LBL) تقنية 40،41 استخدمت بوصفها طبقة واجهة لالتبلور من البروتينات S-طبقة 39 19،42، راف، J. آخرون. S-طبقة nanocomposites استنادا للتطبيقات الصناعية في القائمة على البروتين المهندسة النانو. (محرران Tijana Z. غروف وAitziber L. Cortajarena) (الوثاب، 2016 (مقدم)). ومع ذلك، ليست مفهومة تماما الآلية المعقدة لامتصاص البروتين والتفاعل بروتين السطح. وبخاصة تكنولوجيا المعلومات على التشكل، والتوجه نمط، وكثافة الطلاء ما زال مفقودا.

وقد اجتذب الكوارتز الكريستال توازن دقيق مع مراقبة تبديد (QCM-D) تقنية الاهتمام في السنوات الأخيرة كأداة لدراسة امتصاص البروتين، حركية طلاء، والتفاعل المواليةسيرورات على مقياس النانومتر 19،43-45. هذا الأسلوب يسمح للكشف تفصيلي لامتصاص الكتلة في الوقت الحقيقي، ويمكن استخدامها كمؤشر لعملية الذاتي تجميع البروتين واقتران الجزيئات وظيفية على الشبكات البروتين 19،20،42،46-48. وبالإضافة إلى ذلك، والقياسات QCM-D تفتح إمكانية دراسة عمليات التفاعل معدنية مع طبقة البروتينية في ظل الظروف البيولوجية الطبيعية. في دراسة حديثة، والتفاعل من البروتين S-طبقة بالمعادن المختارة مثل الاتحاد الأوروبي (III)، والاتحاد الافريقي (III)، PD (II)، وحزب العمال (II) وقد درس مع QCM-D 19،20. طبقة البروتين كثف يمكن أن تكون بمثابة نموذج مبسط لجدار الخلية البكتيريا إيجابية الجرام. دراسة هذا المكون واحد يمكن أن تسهم في فهم أعمق للتفاعل المعدن. ومع ذلك، فقط التجارب QCM-D لا تسمح بيانات بخصوص الهياكل السطح والتأثيرات من المعادن إلى البروتين. تقنيات أخرى ضرورية للحصول على هذه المعلومات. أحد نقاط البيعsibility عن التصوير الحيوي النانو والحصول على معلومات عن الخصائص الهيكلية هي القوة المجهر الذري (AFM).

وكان الهدف من الدراسة التي قدمت للتحقيق في الامتصاص من الذهب (الاتحاد الافريقي (III) والاتحاد الافريقي (0) -NPs) للبروتينات S-طبقة، ولا سيما Slp1 من L. كروي JG-B53. وقد أجريت تجارب على البروتينات مع وقف التنفيذ على نطاق ودفعة في مجموعة ودرجة الحموضة 2،0-5،0 باستخدام ICP-MS ومع يجمد S-طبقات باستخدام QCM-D. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقيق تأثير محلول الملح المعدنية على استقرار شعرية مع دراسات AFM اللاحقة. الجمع بين هذه التقنيات يساهم في التوصل إلى فهم أفضل للفي المختبر عمليات التفاعل المعدن كأداة لتعلم المزيد حول الأحداث على الخلايا البكتيرية كاملة بشأن الصلات المعادن محددة ملزمة. هذه المعرفة أمر بالغ الأهمية لتطوير مواد التصفية المطبقة لاستخلاص المعادن من أجل حماية البيئة والحفاظ على إعادة ليس فقطمصادر 49، ولكن أيضا لتطوير صفائف تلك المصادر المعدنية أمر غاية في التطبيقات التقنية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الكائنات الدقيقة وزراعة الأحكام

ملاحظة: تم إجراء كافة التجارب تحت ظروف معقمة L. تم الحصول كروي JG-B53 من ثقافة الحفاظ البرد 29،30.

  1. نقل البرد الحفاظ على ثقافة (1.5 مل) تحت مقاعد البدلاء النظيفة إلى 300 مل العقيمة مرق مغذي (NB) وسائل الاعلام (3 ز / L استخراج اللحوم، 5 ز / L ببتون، 10 غرام / لتر كلوريد الصوديوم). بعد ذلك يحرك الحل لا يقل عن 6 ساعة عند 30 ° C للحصول على ما قبل الثقافة للزراعة.
  2. زراعة البكتيريا في الظروف الهوائية في NB وسائل الإعلام في الرقم الهيدروجيني = 7.0، 30 ° C في 70 L تحجيم مفاعل حيوي البخار في المكان. لذلك، وملء المفاعل ≈ 57 لتر ماء منزوع الأيونات. إضافة وحل سائل الإعلام NB الصلبة مباشرة في مفاعل حيوي (تركيزات انظر أعلاه).
    1. بالإضافة إلى إضافة عامل مضاد الرغوة (30 ميكرولتر / L NB-وسائل الاعلام) إلى وسائل الإعلام لقمع تشكيل رغوة خلال زراعة، ثم الأوتوكلاف (122 درجة مئوية، ودرجة الحرارة عقد من الزمن 30 دقيقة) وسائل الإعلامداخل منشأة المفاعل.
  3. تهدئة الإعلامية وتنفيذ كامل تشبع الأكسجين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 (باستخدام 1 MH 2 SO 4 و 2 M هيدروكسيد الصوديوم) وبدء التلقيح الآلي ل300 مل قبل الثقافة. بدء تسجيل بيانات المعلمات زراعة عند نقطة التلقيح. تسجيل المعلمات على الانترنت على سبيل المثال، مستوى الأكسجين الذائب (DO 2)، وحمض وقاعدة بالإضافة إلى ذلك، وقيم درجة الحموضة داخل زراعة.
    1. مراقبة نمو البكتيريا عبر الإنترنت من خلال القياسات التعكر غير الغازية.
  4. أداء عينات إضافية بعد كل ساعة من زراعة وتحديد مزيد من المعلمة مثل الوزن الحيوي الجافة (BDW) وحاليا الضوئية الكثافة (OD). لذلك، وجمع 20 مل زراعة مرق في كل نقطة أخذ العينات تحت ظروف معقمة.
    1. تحديد متواجد حاليا OD بواسطة القياسات الضوئية للامتزاز في 600 نانومتر. استخدام معقم مرشح NB-المتوسطة كقيمة فارغة. الخلفإيه الوصول الامتزاز> 0.4 تمييع تعليق الخلية التالية الخطي للقانون لامبرت-البيرة.
    2. لتحديد BDW الطرد المركزي 1-5 مل من تعليق البكتيرية (اعتمادا على كثافة الخلية) في 5000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجفيف بيليه الخلية التي تم الحصول عليها في 105 درجة مئوية في تسخين الفرن حتى الاستقرار الشامل وقياس كتلة بيليه.
  5. التقاط صور مجهرية مع المرحلة البصرية المجهر البحوث التباين في 400 و 1000 التكبير أضعاف (الطوري المكثف 2 و 3 على التوالي) للتحقق من نمو البكتيريا وكوسيلة لمراقبة التلوث المتبادل.
  6. بعد الوصول إلى مرحلة النمو الأسي الكشف عنها بواسطة الانترنت تفعل 2 وتعكر على الانترنت، حصاد الكتلة الحيوية من خلال التدفق من خلال الطرد المركزي في 15000 x ج، 4 ° C، ويغسل الكتلة الحيوية مرتين مع العازلة القياسي (50 ملي تريس، 10 ملي MgCl 2، 3 ملم نان 3، ودرجة الحموضة = 7.5).
    ملاحظة: يمكن تخزين بيليه الكتلة الحيوية التي تم الحصول عليها في -18 & #176؛ C حتى مزيد من الاستخدام لعزل.

2. S-طبقة عزل البروتين وتنقية

ملاحظة: تنقية البوليمرات Slp1 وفقا لطريقة تكييفها كما هو موضح سابقا 2،19،30،32،50،51.

  1. تجانس الكتلة الحيوية الخام غسلها وديفروستيد تم الحصول عليها من زراعة في المخزن القياسي (1: 1 (ث / ت)) لإزالة الآفة باستخدام المفرق (المستوى 3، 10 دقيقة) تحت حمام الثلج التبريد عند 4 درجات مئوية.
  2. الطرد المركزي تعليق (8000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة)، ويغسل بيليه الحصول عليها مرتين مع العازلة القياسي (1: 1 (ث / ت)). بعد غسل والطرد المركزي (8000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة)، resuspend الكرية في المخزن القياسي (1: 1 (ث / ت))، إضافة الدناز الثاني وريبونوكلياز (0.4 وحدة / ز الكتلة الحيوية) إلى تعليق وتتفكك الخلايا في 1000 شريط مع الخالط الضغط العالي. بعد ذلك الطرد المركزي تعليق في 27500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: تعليق خلية مراقبة مع ميل البحوثcroscope. اكتمال تمزق عندما يكون أقل من 2-3 خلايا سليمة واضحة في هذا المجال نظرا لالمجهر في التكبير 400 أضعاف.
  3. يغسل بيليه مرتين مع العازلة القياسي (1: 1 (ث / ت)) وإجراء الطرد المركزي مرة أخرى. بعد ذلك resuspend الكرية في المخزن القياسي (2: 1 (ث / ت)) مختلطة مع 1٪ تريتون X-100 واحتضان لمدة 20 دقيقة تحت المتتالية تهز (100 دورة في الدقيقة) لإذابة الدهون الودائع.
  4. الطرد المركزي الحل (27500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة)، ويغسل الحصول بيليه ثلاث مرات مع العازلة القياسي (1: 1 (ث / ت)).
  5. احتضان بيليه الحصول عليها بعد الطرد المركزي الإضافية (27500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة) لمدة 6 ساعة في المخزن القياسي (1: 1 (ث / ت)) مختلطة مع 0.2 جم / L الليزوزيم، ليتحلل الروابط في ببتيدوغليكان 50. بالإضافة إلى ذلك إضافة الدناز الثاني وريبونوكلياز (كل 0.4 وحدة / ز الكتلة الحيوية) إلى تعليق.
  6. بعد الطرد المركزي (45500 x ج، 4 ° C، 1 ساعة)، resuspend والمرحلة بروتين البيض العليا مع انخفاض حجم رانه الطرد المركزي طاف (<30 مل) التي تحتوي على وحدات بروتين.
  7. إذابة تعليق البيضاء عن طريق خلط 1: 1 مع 6 M غوانيدين هيدروكلوريد (6 M GuHCl، 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة = 7.2). الحل يصبح مشرق.
  8. أداء الترشيح العقيمة (0.2 ميكرون) من حل معاملة GuHCl تليها إضافي الطرد المركزي عالية السرعة (45500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة).
  9. طاف لنقل أنابيب غشاء غسيل الكلى (MWCO 50،000 دالتون) ومدال ضد عازلة التبلور (1.5 ملي تريس، 10 ملي CaCl 2، ودرجة الحموضة = 8.0) لمدة 48 ساعة.
  10. نقل بيضاء اعادة بلورة حل البروتين البوليمر في الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 45500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. resuspend الكرية في انخفاض حجم عالى النقاء المياه (<30 مل).
  11. بعد ذلك، نقل تعليق في أنابيب غشاء غسيل الكلى وإجراء غسيل الكلى ضد الماء عالى النقاء لمدة 24 ساعة لإزالة محتوى العازلة.
    ملاحظة: عدة تغييرات عازلة أو الماء عالى النقاء دخلال شهر غسيل الكلى لا غنى عنها.
  12. يجفد وSlp1 تنقيته في مجفف التجميد.

3. توصيف والكمي لSlp1 للتجارب

ملاحظة: تم كميا تركيز Slp1 لالامتصاص وطلاء التجارب التي كتبها UV-VIS الطيفي.

  1. ماصة 2 ميكرولتر من عينة Slp1 المنحل مباشرة على أقل رمى قياس مضواء. تحديد تركيز البروتين في امتصاص أقصى عند طول موجي 280 نانومتر ل، سمة للبروتينات. استخدام معامل انقراض 0.61 لتحديد تركيز Slp1. استخدام Slp1 حل مجانية لقياس مرجعية.
  2. تمييع البروتين مع العازلة (للتجارب الامتصاص في دفعة واسطة استخدام كلوريد الصوديوم 0.9٪، ودرجة الحموضة = 6.0 وللتجارب QCM-D تستخدم عازلة التبلور، ودرجة الحموضة = 8.0) إلى التركيز المطلوب لإجراء التجارب (1 جم / لتر و 0.2 غرام / L على التوالي).
  3. تحليل Slp1 الجودة والوزن الجزيئي من قبل bioanal القياسيةytical طريقة الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) التي وصفها Laemmli، UK 52.
    1. أداء SDS-PAGE قبل استخدام Slp1 ضمن التجارب وعلى سبيل المثال، بعد الاتحاد الافريقي (0) -NP حضانة باستخدام 10٪ والمواد الهلامية الفصل بولي أكريلاميد.
    2. مقابل عينات SDS مزيج ≈10 ميكرولتر من زراعة أو البروتين العينة مع عينة العازلة (1.97 ز تريس، 5 ملغ برموفينول الأزرق، 5.8 مل الجلسرين، 1 غرام SDS، 2.5 مل β المركابتويثانول، وملء مع الماء عالى النقاء إلى 50 مل) في نسبة 1: 1 (ت / ت) وماصة الخليط بعد 4 دقائق الحضانة عند 95 درجة مئوية في جيوب هلام.
    3. تشغيل SDS-PAGE 30 دقيقة عند جهد 60 V حتى العينات تمرير هلام جمع وتغيير الجهد إلى 120 فولت مرة واحدة اجتياز جل الانفصال.
    4. إزالة المواد الهلامية من نظام هلام، وشطف مع الماء عالى النقاء ومكان لمدة 1 ساعة إلى حل التثبيت (حمض الحمضية 10٪ والايثانول المطلق 50٪). بعد ذلك، وشطف المواد الهلامية مع الماء عالى النقاء.
    5. المواد الهلامية وصمة عارباستخدام الغروية غير محددة تكييفها Coomassie الرائعة طريقة الأزرق 53،54. بعد destaining 72،73، التقاط صور SDS-PAGE من قبل نظام توثيق جل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

4. التجارب الامتصاص في دفعة واسطة والكمي المعادن

  1. لدفعة التجارب الامتصاص الاستعداد الاتحاد الافريقي (III) حل سهم من HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O، ويخفف من الملح والمعادن ومزجها مع الحل Slp1 / كلوريد الصوديوم إلى تركيز المعادن الأولي من 1 ملم والتركيز Slp1 النهائي من 1 غرام / L . إجراء تجارب في ثلاثة توائم مع سيطرة سلبية إضافية دون Slp1. استخدام إجمالي حجم 5 مل للتجارب الامتصاص.
  2. يهز تعليق مستمر في RT على قيم مختلفة درجة الحموضة تعديلها قبل بين 2،0-5،0 لمدة 24 ساعة (ضبط درجة الحموضة مع انخفاض حمض الهيدروكلوريك المركز ومحلول هيدروكسيد الصوديوم).
  3. بعد الامتصاص، الطرد المركزي العينات في 15000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) لseparأكل Slp1 من طاف.
  4. نقل طاف في أنابيب الترشيح الفائق (MWCO 50،000 دا) وأجهزة الطرد المركزي هذه في 15000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة أحادية البروتين المذاب.
  5. تحديد تركيز المعادن في الترشيح الناجم عن ICP-MS 19،20 واستخدام النتائج لظهر حساب الممتص منها المعادن من قبل الكتلة الجافة Slp1. مبادئ القياس، وصفت الفرص للأسلوب ومكونات تستخدم ICP-MS في الأدب 55.
    1. إعداد العينات والمراجع لقياس ICP-MS باستخدام 1٪ HNO 3 مثل المصفوفة والروديوم كمعيار داخلي (1 ملغ / مل).

5. توليف الاتحاد الافريقي-NP وتحديد حجم الجسيمات

ملاحظة: سترات استقرت الاتحاد الافريقي (0) تم تصنيعه -NP وفقا لطريقة تكييفها وصفها من قبل Mühlpfordt، H. وآخرون. (1982) للحصول على جسيمات كروية يبلغ قطرها 10-15 نانومتر 56،57

  1. إعداد استقرت 25 ملي HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O الأسهم لتشكيل NP.
  2. تمييع 250 ميكرولتر من هذا الحل الأسهم في 19.75 مل عالى النقاء المياه واحتضان هذه في 61 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تحت الهز على التوالي.
  3. إعداد 5 مل من محلول المخزون الثاني (12 ملم حمض التانيك، 7 ملي سيترات الصوديوم ثنائي الهيدرات، 0.05 ملي K 2 3 CO)، واحتضان الحل 2 الثاني بشكل منفصل في 61 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة إطار ثابت تحريك المحلول 2 إلى حل واحد. يحرك خليط التفاعل لمدة 10 دقيقة على الأقل في 61 ° C. تبرد بعد ذلك إلى أسفل الحل واستخدامه لNP الطلاء على Slp1 شعرية ضمن التجارب QCM-D.
    ملاحظة: الناتج الاتحاد الافريقي (0) تميزت -NP مع UV-VIS الطيفي في الامتصاصية كحد أقصى من 520 نانومتر، التي تستخدم عادة للكشف عن تشكيل الاتحاد الافريقي (0) -NPs 58. ويمكن تخزين الحل في 4 درجات مئوية.
  5. تحليل حجم المشكلةالاتحاد الافريقي (0) -NP بواسطة الفوتون ارتباط التحليل الطيفي (PCS) والذي يعرف أيضا باسم تشتت الضوء الحيوي.
    1. لتحديد حجم NP، ونقل 1.5 مل من توليفها الاتحاد الافريقي (0) -NP الحل في cuvettes في ظل ظروف خالية من الغبار في مربع تدفق الصفحي وتحليلها مع حجم وزيتا المحتملة بحجم الجسيمات. ويرد وصف تفصيلي لPCS وإعداد العينات في Schurtenberger، P. وآخرون. (1993) 59 وجاين، R. وآخرون. (2015) 60.

6. التجارب QCM-D - Slp1 طلاء على السطوح والاتحاد الافريقي-NP الامتزاز على Slp1 شعرية

تم إجراء قياسات مع QCM-D مجهزة مع ما يصل إلى أربع وحدات تدفق: مذكرة. أجريت جميع التجارب QCM-D مع معدل تدفق ثابت من 125 ميكرولتر / دقيقة عند 25 درجة مئوية. وقد أجريت Slp1 الطلاء والمعادن / NP الحضانة على شافي 2 كهرضغطية أجهزة الاستشعار AT-قطع الكوارتز (Ø 14 ملم) مع تردد الأساسي لل≈ 5 ميغاهرتز. الشطف الخطوات وإضافةيتم وضع علامة ition من الحل في أرقام النتائج جزء تمثيلي. يمكن وصف التجارب QCM-D باعتباره خطوة بخطوة طريقة التي تبدأ مع تنظيف وتعديل السطح من أجهزة الاستشعار المستخدمة تليها Slp1 التبلور في وقت لاحق على معادن والتفاعل NP.

  1. تنظيف الإجراءات:
    1. تجهيز خلايا السائل مع الدمى الاستشعار. مضخة لا يقل عن 20 مل (كل لكل وحدة) من القلوية وكيل التطهير السائل (2٪ المطهر في الماء عالى النقاء (ت / ت)) من خلال نظام QCM-D وأنبوب. ضخ بعد ذلك حجم خمسة أضعاف (كل لكل وحدة) من الماء عالى النقاء من خلال نظام (معدل تدفق تصل إلى 300 ميكرولتر / دقيقة). أداء التنظيف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. تنظيف أجهزة الاستشعار شافي 2 خارج وحدات التدفق عن طريق الحضانة (20 دقيقة على الأقل) في 2٪ SDS الحل وشطف أجهزة الاستشعار بعد ذلك عدة مرات مع الماء عالى النقاء 61،62.
    3. تجفيف بلورات مع شركات تصفيتهاressed الهواء ووضعها في غرفة التنظيف الأوزون لمدة 20 دقيقة 63،64.
    4. كرر الإجراء التنظيف مرتين لإزالة كافة محتويات العضوية.
    5. لإزالة المعادن المربوطة من سطح جهاز الاستشعار شطف أجهزة الاستشعار مع 1 M HNO 3. بعد ذلك، نفذ كل الخطوات الشطف بالماء عالى النقاء.
  2. استشعار تعديل السطحية التي Polyelectrolytes:
    ملاحظة: يمكن أن يتم تعديل سطح إما داخل (تتدفق من خلال الداخلي) أو خارج وحدة التدفق (تقنية LBL). ضمن هذه التجارب تم استخدام الطريقة التالية لتعديل السطوح.
    1. تعديل أجهزة الاستشعار مع 3 غرام / لتر من طبقات متبادلة من البولي ايثلين PE إمين (PEI، MW 25000) والبوليسترين سلفونات (PSS، MW 70000) عن طريق تراجع الطلاء باستخدام تقنية LBL 40،41 الموصوفة سابقا لنظام خاص المستخدمة في المقالة التي كتبها سور، M. وآخرون. (2014) 19.
    2. وضع أجهزة الاستشعار داخل PE-الحل المناسب في ث عميقلوحات الذراع واحتضان هذه لمدة 10 دقيقة في RT.
    3. خذ أجهزة الاستشعار من PE-حل وشطف أجهزة الاستشعار بين كل طلاء خطوة تراجع بشكل مكثف مع الماء عالى النقاء.
      ملاحظة: يتكون تعديل السطح الجديد لا يقل عن ثلاثة PE طبقة تنتهي مع موجبة الشحنة PEI.
    4. بعد هذا التعديل الخارجي وضع أجهزة الاستشعار داخل وحدة التدفق وتتوازن أجهزة الاستشعار من قبل الشطف بالماء عالى النقاء قبل بدء التجارب.
  3. Slp1 أحادي الطبقة التبلور:
    1. حل Slp1 في 4 M اليوريا لتحويل البوليمرات في مونومرات.
    2. الطرد المركزي البروتينات monomerized في 15000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإزالة تكتلات أكبر من البروتين.
    3. مزيج طاف Slp1 solubilized وطرد مع العازلة التبلور إلى تركيز البروتين النهائي من 0.2 جم / L.
      ملاحظة: الكالسيوم اعتمادا التبلور من Slp1 (تجميع الذات) يبدأ من خلال إضافة تفصيلrystallization العازلة. لذلك، ضخ حل مختلطة مع معدل تدفق 125 ميكرولتر / دقيقة لأجهزة الاستشعار (وضعت داخل وحدات تدفق) على الفور. ويتم التبلور بعد القيم المستقرة للتحولات التردد وتبديد تم الكشف عنه خلال التجارب QCM-D.
    4. بعد نجاح التبلور البروتين على رأس أجهزة الاستشعار تعديل PE داخل وحدات تدفق شطف أجهزة الاستشعار المغلفة مع العازلة التبلور أو عالى النقاء waterintensively مع معدل تدفق 125 ميكرولتر / دقيقة حتى القيم المستقرة للتحولات التردد وتبديد تم الكشف عنها.
      ملاحظة: يتم تصور تعديل سطح شافي 2 مع PE للتجارب الامتصاص في وقت لاحق على Slp1 أحادي الطبقة وAFM دراسات في الشكل 1.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي تصميم PE تعديل السطحية وSlp1 أحادي الطبقةالطلاء؛ تم تعديل هذا الرقم من سور، M. وآخرون. (2015) 19 بإذن من سبرينغر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. المعادن والمعادن NP التفاعل:
    ملاحظة: الامتصاص مع الاتحاد الافريقي محلول الملح المعدنية (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) أجريت في تركيزات 1 ملم أو 5 ملم في الرقم الهيدروجيني = 6.0 في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحلول. وقد تم أو-NP الامتزاز مع مخفف أو-المصادر في 1.6 ملي العازلة ثلاثي الصوديوم سترات في الرقم الهيدروجيني ≈ 5.0.
    1. بعد نجاح Slp1 الطلاء في وحدات تدفق، وشطف طبقة Slp1 التي تم الحصول عليها بشكل مكثف مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل حتى تم الكشف عن القيم المستقرة للتحولات التردد وتبديد.
    2. ضخ حل استعداد المعادن (1 ملم) وحل NP إلى وحدات تدفق بمعدل تدفق 125 ميكرولتر / دقيقة وتتبع امتصاص الكتلة إلى المدعوهطبقة P1. ويمكن الكشف عن الامتزاز الشامل مباشرة عن طريق تتبع التحولات تردد اشارة الى المعادلة ساوربري (المعادلة 1).
    3. بعد الانتهاء من التفاعل المعادن وNP المعادن، وشطف مع طبقة معدنية / NP عازلة خالية لإزالة ضعيفة أو المعادن النانوية المرفقة المربوطة أو ضعيفة.
      ملاحظة: يتم عرض مثال على الإعداد التجريبي في الشكل 2.

الرقم 2
الشكل 2. التصميم التخطيطي من الإعداد QCM-D باستخدام وحدة تدفق قطر للطحين 401 * 66. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تسجيل البيانات والتقييم:
    1. تسجيل التغيرات في التردد في هرتز (Δf ن) وتبديد (ΔD ن) ضمن التجارب QCM-D باستخدام QCM-D برامج معينة.
    2. استخدام لتقييم حساسية جماعية كثف (Δm) وساوربري المعادلة / نموذج (المعادلة 1) 65 66 صالحة للأفلام رقيقة وصلبة إلى جانب دون احتكاك على سطح مستشعر تطبيقها على ال ن يغلب. على المدى C (سوربري ثابت) لاستخدامها 5 ميغاهيرتز AT قطع استشعار الكوارتز هو 17.7 نانوغرام ∙ هرتز -1 ∙ سم -2 68. لجامدة، موزعة بالتساوي، وطبقات رقيقة بما فيه الكفاية كثف استخدام المعادلة 1 كما تقريب جيد.
      المعادلة 1
    3. أداء نماذج إضافية وفقا للنموذج كلفن فويت صالحة لجزيئات اللزجة 68-71 مع برنامج تصنيع محددة، ومقارنة النتائج مع هذا النموذج سوربري.
    4. لحساب من سمك طبقة واستخدام الامتزاز الشاملكما الهامة المعلمة النمذجة كثافة طبقة طبقة كثف من 1.35 غرام ∙ سم -3 المقابلة لقيم المذكورة سابقا للبروتينات S-طبقة 72-75. استخدام نفس القيمة لحساب تفاعل المعدن مع الطبقة البروتينية.

7. AFM القياسات

  1. إجراء دراسات وقادرة تماما على AFM المجهر الضوئي المقلوب.
    1. تسجيل صور AFM في السائل باستخدام المخزن المؤقت التبلور أو الماء عالى النقاء مباشرة على أجهزة استشعار المغلفة QCM-D.
    2. شطف أجهزة الاستشعار مع الماء عالى النقاء بعد عدة تجارب QCM-D ووضعها داخل الخلية السوائل AFM. ولذلك، استخدم خلية السوائل مغلقة مع الحجم الإجمالي حوالي 1.5 مل. الحفاظ على درجة حرارة ثابت خلية السائل عند 30 درجة مئوية.
    3. استخدام ناتئ مع تردد صدى ≈ 25 كيلو هرتز في الماء وتصلب <0.1 N / م. ضبط سرعة المسح الضوئي بين 2.5 و 10 ميكرون / ثانية.
      4. 76.
      ملاحظة: يتم عرض الصور الارتفاع مع ض النطاق بينما قيم Z تمثل تضاريس الدقيق للسطح. يتم عرض السعة (الزائفة 3D) الصور دون ض النطاق لقيم Z السعة تعتمد على المعلمات المسح الضوئي وتحمل معلومات محدودة. وقد تم تحليل الصور باستخدام ثلاثة برامج التقييم مختلفة في 77.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

زراعة الكائنات الدقيقة وSlp1 توصيف

البيانات المسجلة للنمو البكتيري يشير إلى نهاية مرحلة النمو الأسي في حوالي 5 ساعة. وقد أظهرت التحقيقات السابقة التي Slp1 يمكن عزله عن هذه النقطة من الحصاد (4.36 جم / L الكتلة الحيوية الرطب ≈ (1.45 جم / L (BDW)) مع أقصى عائد 19. ومع ذلك، والتحسين من زراعة باستخدام مكونات وسائل الاعلام محددة أو fed- ومن شأن اعتماد استراتيجيات زراعة دفعة يؤدي إلى ارتفاع عوائد الكتلة الحيوية، وهذا غير قابل للتصرف لاستخدام كمية كبيرة من الكتلة الحيوية للتطبيقات الصناعية. وتتلخص القيم من الانترنت والمعلمات زراعة متواجد حاليا المسجلة في الشكل 3A. مراقبة مجهرية (الشكل 3B) في ذلك الوقت وتظهر حصاد الخلايا غير sporulated من L. كروي JG-B53.

المحافظة على together.within صفحة = "1"> الشكل (3)
الشكل (3): (A) على الانترنت وغير متصل قياس المعلمات زراعة L. كروي JG-B53 و (B) صورة مجهرية من خلايا البكتيريا الحيوية L. كروي JG-B53 في وقت الحصاد في 400 التكبير أضعاف. تم تعديل هذا الرقم من سور، M. وآخرون. (2014) 19 بإذن من سبرينغر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أيضا، وهي مصنوعة بالإضافة إلى الملف الشخصي البروتين SDS-PAGE (الشكل 4A) إلى أكبر قدر ممكن من Slp1 وقت 5 ساعة من زراعة. الفرقة البروتين الموافق Slp1 ≈ (150 كيلو دالتون) هو أكثر سمكا، ولكن من الآن فصاعدا خسارة في كثافة وحظ accompanالعبوات الناسفة زيادة في البروتينات مع انخفاض الوزن الجزيئي الناجمة عن تجزئة البروتين ممكنا أو فصل البروتينات الأخرى. عصابات البروتينات المعزولة والنقاء التي حصل عليها طريقة المذكورة أعلاه (الشكل 4B) تتوافق مع الوزن الجزيئي لحوالي 150 كيلو دالتون، الذي هو أثقل من الوزن محسوبة على أساس بيانات تسلسل Slp1 (116 كيلو دالتون) 30. هذا ومن المقرر أن التعديلات posttranslational على الأرجح. أسباب أخرى لعدم تطابق بين الكتلة الجزيئية النظرية والكتلة الجزيئية لوحظ في المواد الهلامية SDS وربما تهمة المصنوعات اليدوية التي تعتمد في جل SDS 30.

الرقم 4
الرقم 4. الملامح البروتين الذي أدلى به SDS-PAGE من (A) تفككت خلايا البكتيريا التي تم الحصول عليها من عينات زراعة و (B) تنقيته Slp1 بعد العزلة الناجحة؛ هذه فايتم تعديل جوري من سور، M. وآخرون. (2014) 19 بإذن من سبرينغر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تجارب دفعة الامتصاص وتحديد الاتحاد الافريقي مع ICP-MS

وأظهرت قدرات ملزمة الأقصى المعدنية (س كحد أقصى) من الاتحاد الافريقي (III) التي علقت Slp1 في الشكل (5). وتظهر النتائج أن الاتحاد الافريقي (III) وثابت ملزمة Slp1 خلال حضانة 24 ساعة في نطاق درجة الحموضة التحقيق. وتشير النتائج س كحد أقصى في مجموعة من حوالي 80-100 ملغ الاتحاد الافريقي (III) / ز Slp1. وتمت مقارنة القيم تلخيص (الجدول 1) مع قدرة الامتصاص من حوالي 75 ملغ الاتحاد الافريقي (III) / ز Slp1 ذكرت سابقا من قبل سور، M. وآخرون. (2014) تم الحصول عليها من التجارب مع ضبط النفسدرجة الحموضة القيم عن طريق إضافة محلول الملح المعدني (الرقم الهيدروجيني ≈ 4.3) 19. لتلخيص، وقد أظهرت Slp1 القدرة على ربط كميات عالية من البداية وأضاف الاتحاد الافريقي (III) إثبات القدرات العالية ملزمة لهذا العنصر.

الرقم 5
الشكل 5. رسم تخطيطي لأقصى المعادن ملزم القدرات (س كحد أقصى) من الاتحاد الافريقي (III) لالبوليمرات Slp1 ضمن تجارب تعديل درجة الحموضة مقارنة النتائج الامتصاص باستخدام قيم الرقم الهيدروجيني المعدلة النفس ≈ (4.3) أفاد به سور، M. وآخرون. (2014) 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كانت محسوبة كفاءات إزالة المعادن (RE) ضمن نطاق درجة الحموضة التحقيق ما بين 50 - 60٪ مما يؤكد على إعادةتشير النتائج التي أدلى بها سور، M. وآخرون. (2014) حيث تم تحقيق قيم حوالي 40٪. في التجارب التي سبق والتفاعلات القوية من الاتحاد الافريقي (III) مع المجموعات الوظيفية على سبيل المثال، carboxylic-، hydroxyl-، والمجموعات الأمينية، وقد لوحظ للبروتينات S-طبقة مثل Slp1 وللبروتين المقارن SlfB من L. كروي JG-A12 1،78. يانكوفسكي، U. وآخرون. (2010) الكشف الطيفي تفاعل قوي من الاتحاد الافريقي (III) بشكل رئيسي مع مجموعات الكربوكسيل من SlfB التي يمكن أيضا أن نستنتج لSlp1 من L. كروي JG-B53 20،79،80. أيضا، خصائص البروتين الجوهرية التي من شأنها أن تقلل الاتحاد الافريقي (III) إلى الاتحاد الافريقي (0) في غياب عوامل الاختزال يمكن أن يكون سببا للتفاعل قوي 79. وعلاوة على ذلك، فإن نتائج هذه الدراسة تظهر الميل ليفضل ربط Slp1 في انخفاض قيم الرقم الهيدروجيني. من ناحية أخرى، وهو ملزم في انخفاض قيم درجة الحموضة يمكن أن يؤدي أيضا إلى تمسخ من Slp1. أثبتت الدراسات إلى Slp1 استقرار البروتين وصولا الى درجة الحموضة =3.0 (نتائج غير منشورة). من التجارب الامتزاز في ظل الظروف الحمضية، وذلك باستخدام مثل حمض النيتريك أو باستخدام وكلاء كومبليكسينج مثل EDTA أو سيترات (لا تظهر البيانات)، يتحقق من أن الذهب كان لا بد مستقر ولا يمكن أن يصدر من البوليمرات Slp1.

الاتحاد الافريقي (III) على Slp1 من L. كروي JG-B53
ج الأولي (ملغم / لتر) 196.97
درجة الحموضة 5 4.5 ≈ 4.3 23 4 3.5 3 2.5 2
القيمة
س كحد أقصى 88.3 85.3 74.7 102.5 94.1 81 101.9 96.9
(ملغ الاتحاد الافريقي (III) / ز Slp1)
RE 47.1 47.8 37.9 57.1 54.1 44.8 58.7 56.5
(٪)

الجدول 1: تجليد الحد الأقصى المعدنية القدرات (س كحد أقصى) وزيادة الكفاءة إزالة المعادن (RE) من التجارب دفعة من الامتصاص مع الاتحاد الافريقي (III) وSlp1 البوليمرات في الحل تحليلها بواسطة ICP-MS. بيانات مقارنة للنتائج التي نشرت في وقت سابق من سور، M. وآخرون. (2014) 19.

Slp1 أحادي الطبقة التبلور تتبعها QCM-D

انخفاض فوري في التردد (Δf 5، 7 Δf، Δf 9، Δf 11) يشير إلى امتصاص السريع وقابلية عالية من البروتينات على سطح PE المعدلة (الشكل 6A). مساوية لتغيير سريع في وتيرة، وتبديد (ΔD 5، ΔD 7، ΔD 9، ΔD 11) يزيد أيضا على الفور. هذا الواقع يشير إلى امتصاص الجزيئات اللزجة إلى السطح بسبب التخميد سريع مما أدى إلى زيادة قيم تبديد. ويتحقق التحول تردد أقصى بعد 5 دقائق بقيمة ≈ 95 هرتز وΔD 4.2. في مرحلة لاحقة تحدث فقط إعادة ترتيب بلورته Slp1. وقد أجريت Slp1 امتصاص أي هكذا بها لأكثر من 60 دقيقة لضمان ركان تشكيل سطح تقريبا مغطاة بالكامل، وأمرت بانتظام البروتين شعرية. وتبين التجربة أن طبقة PE موجبة الشحنة هي غير القابلة للتصرف لتحقيق الطلاء مستقرة، سلبي تعديل النهاية يؤدي إلى امتصاص ضعيف وحركية أطول طلاء (لا تظهر البيانات) 38. ضعيف تعلق البروتينات وأزيلت الكتل قبل الشطف مع خالية من Slp1 عازلة التبلور. التغييرات صغيرة من Δf ن تأكيد منخفض البروتين الامتزاز وامتزاز مستقر من Slp1. على الرغم من هذا يسقط تبديد أسفل إلى ≈ 2.8 تشير إلى أن تتم إزالة جزيئات مرنة أكبر.

الشكل (6)
الرقم 6. التبلور من Slp1 على التعديل شافي 2 مجسات تحليلها من قبل QCM-D. (A) في Δf / قطعة ΔD و (B) سماكة سطح عضويةه؛ تم تعديل هذا الرقم من سور، M. وآخرون. (2014) 19 بإذن من سبرينغر وسور، M. (2015) 20. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف سطح تحسب باستخدام النماذج المذكورة السابقة تظهر سمك أحادي الطبقة Slp1 من ≈ 11.2 نانومتر (نموذج كلفن فويت للأفلام مرنة) وقدرها 10.0 نانومتر (سوربري نموذجا للطبقة جامدة) (الشكل 6B). هذه القيم هي أقل من تلك أفاد به سور، M. وآخرون. (2014). ويمكن تفسير الاختلافات التي كتبها قيمة مستعملة مختلفة من كثافة طبقة البروتين داخل النمذجة. يجب أن تكون القيم الحالية أقرب إلى الواقع من سمك طبقة من البروتينات S-طبقة على سطح الخلية من الخلايا الحية من L. كروي JG-B53 31،42. يوضح هذا النموذج أن العلاقة سوربري طق غير مناسب لالصوتية طبقة رقيقة البروتينية، بسبب انتشار الموجة الصوتية القص في الأفلام السائلة اللزجة 81،82 الذي يؤدي إلى التقليل من كتلة Slp1 كثف وسمك. ويمكن تفسير ذلك من خلال خصائص المرونة من البروتينات S-طبقة واقتران لها من جزيئات الماء أثناء عملية الامتزاز. تفاعل الماء مع البروتينات يمكن وصفها بسهولة عن طريق تشكيل قذائف الماء، والسحب لزج أو انحباس في تجاويف في طبقة كثف 83. هذا يؤثر على سماكة طبقة أعلى يقاس نموذج كلفن فويت ويمكن أيضا توضيح الاختلافات في سمك الطبقة التي تم الحصول عليها من قبل اثنين من نماذج مختلفة. في الدراسات AFM السابقة، تم قياس سمك طبقة من السياج Slp1 حوالي 8-12 نانومتر. عن طريق حساب امتصاص كميات كبيرة من Slp1، بدلا من سمك طبقة، وΔm الكلي لل1506.6 نانوغرام ∙ سم -2 (نموذج كلفن فويت) تم حسابها. بيانات الامتزاز الشامل على الأمواج ولخص ارسالا ساحقا حتى في الجدول 2 وتظهر الامتزاز الشامل عالية باستخدام قيم نموذج كلفن فويت.

م كحد أقصى Δm ماكس سماكة سماكة
(نانوغرام / سم 2) (نانوغرام / سم 2) (نانومتر) (نانومتر)
(كلفن فويت) (سوربري) (كلفن فويت) (سوربري)
Slp1 بعد طلاء والشطف 1،505.6 1،351.6 11.2 10

FO: المحافظة على together.within صفحة = "1"> الجدول 2: وسائل كثف من Slp1 على التعديل متضاعف الكتروليتي شافي 2 بلورات تحليلها من قبل QCM-D بعد الشطف مع التبلور العازلة (الرقم الهيدروجيني = 8.0) وسماكة طبقة محسوبة.

QCM-D كأداة للكشف عن المعادن والمعادن NP التفاعل مع البروتينية Slp1 أحادي الطبقة

تم التحقيق تفاعل بلورته Slp1 أحادي الطبقة مع 1 ملم و 5 ملم المنحل الاتحاد الافريقي (III). وتتلخص نتائج مجموع كتلة كثف تم الحصول عليها من الحسابات ونمذجة البيانات المسجلة للتغيرات في وتيرة وتبديد في الجدول 3. والدراسات QCM-D من الاتحاد الافريقي (III) التفاعل مع الطبقات الوحيدة توفر فهما أعمق للمعادن جزيء حيوي التفاعل. لأول مرة، والقدرة ملزمة، حركية الامتصاص، وكيف الفوقيةل يؤثر تمت دراسة استقرار البروتين في المدى نانو. بعد إضافة محلول الملح المعدني إلى أحادي الطبقة Slp1 انخفضت وتيرة ضمن أول 5 دقائق مما يدل على امتصاص الشامل سريع. ومع ذلك، لم يتم إكمال امتصاص الاتحاد الافريقي بعد 60 دقيقة كما هو موضح للمعادن أخرى مثل المشتريات (II) في الدراسات السابقة 19. الزيادة كتلة يحدث تصل إلى 18 ساعة. بعد هذا الوقت، تم تنفيذ خطوات الشطف مع المعادن عازلة خالية تبين أن المعدن كثف هو ثابت تقريبا منضمة إلى طبقة Slp1 بلورته. وأخيرا، تم الحصول على امتصاص المعادن الكلي لل955.0 ± 2.7 نانوغرام ∙ سم -2 (نموذج كلفن فويت) في حالة 1 ملم الاتحاد الافريقي (III) حل و4،534.4 ± 5.5 نانوغرام ∙ سم -2 (نموذج كلفن فويت) في حالة 5 ملي الاتحاد الافريقي (III). ويمكن تفسير القيم العليا التي حصل عليها 5 ملي الاتحاد الافريقي (III) الحلول من خلال خصائص تخفيض الجوهرية للSlp1 حيث أصغر المعدنية الاتحاد الافريقي (0) تشكلت -NP من هذا الحل. هذه الحد المناسبتم الإبلاغ عن روابط Slp1 بالفعل في دراسات سابقة عن المشتريات (II) والاتحاد الافريقي (III) 32،33،79،84. وأظهرت البيانات أيضا أن التفاعل مع الحل الذهب لا يؤدي إلى زعزعة الاستقرار في طبقات البروتين. وهذا يدل على محددة ومستقرة ملزمة من الاتحاد الافريقي (III) لSlp1، والتي تم أكده أيضا قياسات ICP-MS استخدام البوليمرات البروتين.

يمكن تصور تشكيل الاتحاد الافريقي (0) -NP خلال التوليف التي تغير لونها من الأصفر إلى بدء حل واحد المحمر. ويتسبب هذا التغيير اللون عن طريق الإثارة من التذبذبات مأكل سطح الجسيمات النانوية المعدنية ويثبت تشكيل الاتحاد الافريقي (0) -NPs 1،78. وعلاوة على ذلك مصادر القدرة النووية الصغيرة يمكن أن تصنع عن طريق التغير في تركيز عامل مختزل (أعلى تركيز حمض التانيك) 85 مرئية في التلوين مختلف من الحل والتحقق من نتائج القياسات PCS (لا تظهر البيانات). علىومن ناحية أخرى، وزيادة تركيز حمض التانيك يؤدي إلى فقدان الاستقرار NP ومصادر القدرة النووية تميل إلى التكتل 20. وكدليل على المبدأ، والاتحاد الافريقي (0) (توزيع حجم 10-18 نانومتر تقاس PCS رأينا في الشكل 7A) -NPs تصنيعه قبل حضنت مع وقف التنفيذ Slp1 لمدة 48 ساعة وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. ملف البروتين هو مبين في الشكل 7B بالتحقق من الاستنتاج من البيانات QCM-D، أن الاتحاد الافريقي (0) -NPs لا تزعج هيكل Slp1. العصابات البروتين لوحظ في 150 كيلو دالتون تثبت وجود Slp1 سليمة.

الرقم 7
الرقم 7. (A) الموزون حجم توزيع تصنيعه قبل الاتحاد الافريقي (0) -NPs تقاس PCS و (B) لمحة البروتين SDS-PAGE من Slp1. حارة 1: 2 ميكروغرام Slp1 قبل الاتحاد الافريقي (0) -NPs التفاعل وحارة 2: 1 ميكروغرام البوليمرات Slp1 في تعليق بعد 48 ساعة incuba نشوئها مع توليفها قبل الاتحاد الافريقي (0) -NPs. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد NP-التوليف والتوصيف، وأجريت التجارب QCM-D بها. الامتزاز من تصنيعه قبل المعدنية الاتحاد الافريقي (0) -NPs يظهر exemplarily للتجارب QCM-D في مؤامرات Δf / ΔD (الشكل 8 A)، وكما سمك وملامح الجماعية (الشكل 8B).

الرقم 8
الرقم 8. الامتزاز من قبل تصنيعه-الاتحاد الافريقي (0) -NPs على اعادة بلورة Slp1 شعرية تحليلها من قبل QCM-D، (A) في Δf / قطعة ΔD و (ب) الطبقة السطحية و ملفه الشخصي الشامل.على بياض "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن التأكيد على أن QCM-D يمكن استخدامها للكشف عن الامتزاز من 10-18 نانومتر كروية الاتحاد الافريقي (0) -NPs. بعد إضافة مخفف حل الاتحاد الافريقي-NP (A 520 نانومتر = 1) التي حصلت عليها التوليف وصفها، يقلل من تردد، وهو مؤشر مباشر على امتصاص الشامل التي وصفها التنبؤ المعادلة ساوربري (المعادلة 1). الامتزاز من الاتحاد الافريقي (0) تم الانتهاء -NPs تقريبا خلال أقل من 60 دقيقة. بعد هذا الوقت أودعت لا أكثر مصادر القدرة النووية على رأس شعرية Slp1، لذلك يمكن افتراض أن جميع المواقع التفاعلية أو المسام كانت محتلة من قبل الاتحاد الافريقي (0) -NPs. انخفاض هو مبين في تبديد يمكن أن تكون تابعة لتشنج Slp1 شعرية سبب من التفاعل NP. ولخص القيم من إجمالي امتصاص كتلة تصل في الجدول 3. وحتى الشطف مكثفة مع المخزن المؤقت سترات مجانا NP-يؤدي نيىذر إلى الامتزاز تلك المصادر ولا إلى انفصال أحادي الطبقة Slp1. ولذلك، يمكن توقع التفاعل مستقر وقوي للاتحاد الافريقي (0) التفاعل -NP في نفس الاحترام كما هو الحال مع الاتحاد الافريقي (III).

معدن ج المعادن Δm ماكس Δm ماكس سماكة سماكة
(نانوغرام / سم 2) (نانوغرام / سم 2) (نانومتر) (نانومتر)
(كلفن فويت) (سوربري) (كلفن فويت) (سوربري)
أونج> الاتحاد الافريقي (III) 1 ملم 955 932.6 --- ---
5 مم 4،534.4 4،687.9 --- ---
الاتحاد الافريقي (0) - --- 1،382.9 1،382.7 10.2 10.2
مصادر القدرة النووية

الجدول 3: وسائل كثف على اعادة بلورة Slp1 شعرية بعد الاتحاد الافريقي (III) التفاعل (الرقم الهيدروجيني = 6.0) والاتحاد الافريقي-NP الامتزاز (الرقم الهيدروجيني = 4.7) تحليلها من قبل QCM-D وحساب سمك طبقة بعد الاتحاد الافريقي (0) -NP طلاء. بيانات مقارنة للنتائج التي نشرت في وقت سابق من سور، M. وآخرون. (2014) 19.

AFM لتصور نانومتر الهياكل كومبوزيتس

الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "1"> أجريت دراسات AFM اللاحقة بعد عدة تجارب QCM-D للحصول على معلومات الهيكلية للSlp1 المجالس الذاتي قبل وبعد تفاعلها مع المعادن ومصادر القدرة النووية. وهذا أمر ضروري لربط الامتزاز الشامل الكشف خلال التجارب QCM-D مع اكتمال الطلاء البروتين والهياكل بروتين شعرية السماح التصريحات حول الاستقرار طبقة البروتين. في الشكل 9، شعرية البروتين من Slp1 اعادة بلورة على PE تعديل أجهزة الاستشعار يظهر مع شعرية لها النموذجية مربع (P4) كصور السعة. يمكن تحديد ثابت شعرية كما 13-14 نانومتر، وهو مشابه لنتائج التجارب السابقة 30. سمك طبقة من 10 نانومتر ± 2.0 نانومتر تقاس AFM التحقق من سمك طبقة توقع القياسات QCM-D من ≈ 11.2 نانومتر (كلفن فويت النمذجة). الفرق الصغيرة في ارتفاع سطح يمكن تفسير حقيقة أن CALCUL ATED QCM-D تناسب يعتبر مجال الاستشعار بأكملها في حين يظهر الدراسة AFM عالية الدقة سوى مساحة جزئية. ونظرا لهذا، أدرجت الكتل البروتين الذي كانت تعلق على سطح جهاز الاستشعار في حساب كتلة كثف على التوالي لسمك طبقة وأدى إلى سماكة طبقة أعلى من التي تحددها AFM.

الرقم 9
الرقم 9. AFM صورة اتساع اعادة بلورة Slp1 شعرية من L. كروي JG-B53 على بلورات QCM-D مباشرة بعد طلاء والشطف مع العازلة والتكبير من منطقة تميزت؛ تم تعديل هذا الرقم من سور، M. وآخرون. (2014) 19 بإذن من سبرينغر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المحافظة على together.within صفحة = "1"> وبعد أن زرت Au (III) والاتحاد الافريقي (0) -NP التفاعل مع Slp1 وقياسات أجريت مع QCM-D، وتم التحقيق السطوح الاستشعار التي كتبها AFM الشكل 10 يبين Slp1 سليمة شعرية بعد الحضانة مع الاتحاد الافريقي (III) حل. يمكن إثبات أنه بعد الحضانة ظلت شعرية البروتين سليمة تماما. هذا يؤكد النتائج من التجارب QCM-D الذي توقع استقرار الطلاء. في الشكل 11A وباء كثف قبل تصنيعه الاتحاد الافريقي (0) -NPs (يتفاوت حجم 10-18 نانومتر يحددها PCS) ترد على شعرية Slp1. نظرا لحجم الجسيمات، والاتحاد الافريقي وكثف (0) -NPs في المسام وSlp1 لا تتبع -symmetry P4 من Slp1. الاتحاد الافريقي (0) -NPs هي الإحصائية موزعة على البروتين شعرية. من خلال قياس أحجام الجسيمات في الصور ارتفاع AFM (لا تظهر البيانات) حجم مصادر القدرة النووية هو في حدود 16-23 نانومتر، وحتى أصغر، وبالتحديد في مجموعة من حوالي 10 نانومتر 19،20. هذا الاصدارifies حجم NP تحديد قياسها من قبل PCS (ينظر في الشكل 8).

الرقم 10
الرقم 10. AFM صورة اتساع اعادة بلورة وسليمة Slp1 شعرية على بلورات QCM-D الاستشعار بعد الحضانة من 5 ملي الاتحاد الافريقي (III) الحل والتكبير من منطقة تميزت؛ تم تعديل هذا الرقم من سور، M. وآخرون. (2014) 19 بإذن من سبرينغر وسور، M. (2015) 20. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 11
الرقم 11. (A) AFM السعة صورة كثف الاتحاد الافريقي (0) -NPs على بلورته شعرية Slp1 على بلورات استشعار QCM-D (يسار(و) أعيد بناؤها B) 3D سطح الشخصي (يمين)؛ تم تعديل هذا الرقم من سور، M. (2015) 20 بإذن من سبرينغر وراف، J. آخرون. (2016) راف، J. آخرون. S-طبقة nanocomposites استنادا للتطبيقات الصناعية في القائمة على البروتين المهندسة النانو. (محرران Tijana Z. غروف وAitziber L. Cortajarena) (الوثاب، 2016 (مقدم)). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل دراسة الربط من الاتحاد الافريقي للبروتينات S-طبقة تم التحقيق باستخدام مزيج من الأساليب التحليلية المختلفة. على وجه الخصوص، الربط من الاتحاد الافريقي غير جذابة للغاية ليس فقط لاسترداد الاتحاد الافريقي من المياه التعدين أو حلول عملية، ولكن أيضا لبناء المواد، على سبيل المثال، الأسطح الحسية. للدراسات للتفاعل الاتحاد الافريقي (الاتحاد الافريقي (III) والاتحاد الافريقي (0) -NPs) مع وقف التنفيذ وبلورته أحادي الطبقة من Slp1، كان البروتين لتكون معزولة. ولذلك، فقد أظهرت هذه الدراسة زراعة ناجحة لالسلالة البكتيرية إيجابية الجرام L. كروي JG-B53 وعزل بروتين الطبقة السطحية Slp1. ومع ذلك، فإن زراعة والبروتين العزلة لا تزال صعبة وينبغي أن يكون الأمثل. A الإنتاج على نطاق واسع من الكتلة الحيوية وS-طبقة البروتينات هو شرط مسبق لتطبيق الصناعي على حد سواء، على سبيل المثال، لإنتاج معدن مواد التصفية انتقائية. إمكانية تطبيقها هي undoubtedlذ عالية لإزالة المعادن السامة أو استخلاص المعادن القيمة يذوب في الماء العملية، مياه الصرف الصحي، أو مياه الصرف. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال طلب S-طبقات، بل هو أكبر النظر في إمكانية إضافية في مواد أخرى مستوحاة من الحيوية، مثل أجهزة الاستشعار والمواد الحفازة.

وأشارت التجارب دفعة الامتصاص من البوليمرات Slp1 علقت عالية ومستقرة ملزمة من الاتحاد الافريقي (III) في التحقيق درجة الحموضة المدى 2،0-5،0. وبالتالي، يمكن التوصل كفاءات إزالة المعادن تصل إلى 60٪. ويمكن تفسير هذا السلوك ملزم الرائع الذي تفاعل قوي من الاتحاد الافريقي (III) مع Slp1 ربما يسببها من خلال التفاعل بين مجموعات الكربوكسيل النيتروجين ومجموعات تحمل موجودة على سطح البروتين. هذه الحجج يمكن أن تعزز من قبل FTIR وEXAFS التحقيق من سلالة مماثلة L. كروي JG-A12 32،79. أيضا، يمكن الحد من الخصائص الجوهرية للSlp1 شرح RE عال من الاتحاد الافريقي (III) من خلال reduالوراثة لnanoparticular الاتحاد الافريقي (0). ويمكن الافتراض أن S-طبقة، واجهة الأول من البكتيريا على البيئة، يجب أن تشارك أساسا في المعادن ملزمة. في نطاق درجة الحموضة التحقيق، وهو أعلى معدنية سعة مع 102.5 ملغ الاتحاد الافريقي (III) ملزمة ز / تم تحقيقه Slp1 في درجة الحموضة 4.0. هذه القدرة ملزم هو أعلى مما ذكر عن غيرها من المكونات الحيوية، على سبيل المثال، على جدار الخلية معزولة من العصوية الرقيقة (71.5 ملغ الاتحاد الافريقي (III) / ز) 86 أو الكتلة الحيوية من الشائع شلوريلا (98.5 ملغ الاتحاد الافريقي (III) / ز) 8 .

ICP-MS تستخدم لتحديد المعدن ملزمة البوليمرات Slp1 هو طريقة حساسة جدا ويمكن من اكتشاف أصغر كميات من الذهب في هذه الدراسة. ICP-MS يقدم فوائد كثيرة لأداء قرارات المعادن النزرة، على سبيل المثال، النظام سهولة التعامل وحدود الكشف منخفضة؛ في حالة الذهب وصولا الى 0،1-1 PPT. وهذا ما يجعل هذه الطريقة أداة مرنة للتحقيق في عمليات biosorptive في نطاق منخفض التركيزالصورة. ومع ذلك، فقد حصل على نتائج في هذا التحقيق مع وقف التنفيذ البوليمرات S-طبقة ولا يمكن نقلها بسهولة إلى السياج S-طبقة بلورته على الأسطح، وبالتالي إظهار الحد من ICP-MS. على سبيل المثال، يمكن أن يكون هناك أي علاقة مباشرة البوليمرات البروتين معزولة لتلك الهياكل S-طبقة على خلايا البكتيريا الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القياسات ICP-MS لا تسمح بتحديد الحركية للالامتصاص المعدنية. ولذلك، فمن الضروري إيجاد طرق أكثر ملاءمة للتحقيق في المعدن ملزمة رقيقة الأفلام البروتين يجمد.

في هذه الدراسة، تم تطبيق التحليلات QCM-D للكشف عن الموقع في تشكيل الشبكات S-طبقة على السطوح وكذلك ترسب الاتحاد الافريقي على البروتينات. ولذلك، QCM-D هو وسيلة قوية وقابلة للتكرار للاعتراف عمليات الامتصاص والتفاعل جزيء. بالإضافة إلى ذلك QCM-D هو بسيط نسبيا، لرصد الصورة فعالة من حيث التكلفة، وطريقة غير الخطرةاوك العمليات على الانترنت. والأسلوب له ميزة للكشف عن كتلة التغيير مع حد أقصى للحساسية جماعية في السوائل من ≈ 0.5 نانوغرام ∙ سم -2. وهذا يتيح إمكانية للكشف حتى التفاعل الضعيف، على سبيل المثال، من البروتين مع المعادن الذائبة أو لقياس adsorptions في نطاقات تركيز منخفضة. ومن سيئات QCM-D هو أن هذه ليست طريقة التصوير الهيكل الذي يسمح للتصور على سبيل المثال، شبكات البروتين. ولذلك، هناك حاجة إلى تقنيات أخرى.

وQCM-D التحليلات تلتها AFM التصوير هذه الدراسة. الجمع بين هذه الأساليب يسمح لدراسة حركية الامتصاص وعواقب الاتحاد الافريقي الامتصاص للطلاء، مما يثبت أنهم أدوات تنوعا للتحقيق التفاعل المعادن من الأفلام البروتينية رقيقة. وعلاوة على ذلك، تبين أن التبلور موثوقة من البروتينات S-طبقة على الدعم الفني أمر ضروري لدراسات تفاعل البروتين لاحقة. هناكالصدارة، إدخال تعديلات على الأسطح باستخدام الدعاة التصاق هي من الفائدة. تنفيذ وصفها من polyelectrolytes (تنتهي مع الكيانات السياسية موجبة الشحنة)، وطبقة وسيطة بين شافي 2 الأسطح وطبقة البروتين يؤدي إلى أسلوب محسن للبروتين طلاء سريع. وقد وصفت الأثر الإيجابي لتوجيه الاتهام بشكل إيجابي طبقة متضاعف الكتروليتي سابقا لمثل تجميد خلايا البكتيريا الحيوية L. كروي JG-B53 31. تنفيذ عرض PE-طبقات هي الخطوة الأكثر أهمية وحيوية لالتبلور ناجحة وقابلة للتكرار في وقت لاحق من البروتينات S-طبقة.

يمكن أن يثبت أنه للتحقيق في طبقات رقيقة من Slp1، QCM-D هي طريقة جيدة لإظهار امتصاص كتلة كل منها إلى التبلور البروتين عن الأفلام أحادي الطبقة في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا أن يلاحظ هذا في السابق لإعادة تجميع البروتين S-طبقة SbpA من L. كروي </ م> CCM2177 47. باستخدام لاحق عالية الدقة AFM تحليل التغيرات في بنية شعرية من البروتين المجالس الذاتي يمكن تصور. كشفت قياسات AFM التماثل P4 من Slp1 وتؤكد سمك طبقة المنمذجة من Slp1 من حوالي 10 نانومتر. أيضا، والتفاعل المباشر للايونات المعادن الذائبة مع طبقة البروتين يمكن مراقبتها من قبل QCM-D تثبت ملزمة جيدة من الاتحاد الافريقي (III) من قبل طبقة البروتين الأساسية. تشكيل المحتمل من أصغر الاتحاد الافريقي (0) -NPs من لم تم الكشف الاتحاد الافريقي (III) حل داخل المسام البروتين الناجم عن الخصائص الجوهرية للتقليل شعرية Slp1 ضمن قياسات QCM-D عن طريق قياسات AFM اللاحقة. وهذا يمكن أن تكون ذات صلة إلى حد حل AFM والتجريبية التي أنشئت في هذه الدراسة. وهذا يدل على الحد من هذه التقنية وضرورة ارتفاع القرار التصوير لالجزيئات الحيوية في مقياس النانومتر الفرعي. ومع ذلك، فإن ارتفاع الاستقرار طبقة Slp1 بلورته يمكن استخلاصه من عشرالبريد التي تم الحصول عليها QCM-النتائج وما أكده التحقيق AFM.

في الختام، يمكن أن يتبين أن البوليمرات Slp1 تملك قدرات معدنية عالية ملزمة للذهب في التحقيق درجة الحموضة المدى. وعلاوة على ذلك، اتضح من التحقيق أن شعرية Slp1 هو معدن أيون مصفوفة جيدة الملزمة واللازمة لتجميد الجسيمات النانوية المعدنية. ويمكن أن يتبين أن كل الطريقة المستخدمة في هذه المقالة لديه إمكانية للكشف حتى التفاعلات معدنية صغيرة، أو في حالة AFM يمكن تصور الهياكل في نطاق النانو. وعلى الرغم من أنها ليست سوى عن طريق الجمع بين هذه الأساليب هو مبين، الأمر الذي سمح لتحسين المعرفة والفهم من البروتينات التحقيق على المستوى الجزيئي.

أساسا، QCM-D وAFM هي الأساليب المفضلة بالنسبة للخيار لتحقيق المستقبل من البروتين أحادي الطبقة الامتزاز وتفاعلها مع المعادن والجزيئات وظيفية. من خلال الجمع بين هاتين الطريقتين، والكشف عن S-طبقة البروتين الإعلانيةيوفر عمليات الامتصاص والتصوير سطح نظرة ثاقبة العمليات الجزيئية التي قد تكون قادرة على أن يتم تحويلها إلى تعزيز المعرفة من البكتيريا الحية والتفاعل مع بيئتهم. وأظهرت هذه الدراسة مقتطفات من الطرق الممكنة مفيدة للبروتين التفاهم والتفاعل المعدنية. وينبغي إدراج تقنيات مفيدة أخرى يمكن أن تعزز معرفة مثل هذه العمليات بالتفصيل تتراوح بين الطيفي الكروماتوغرافي وأساليب متنوعة لطيفية التحقيق في الجزيئات الحيوية والدراسات المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المشروع IGF "S-المنخل" (490 ZBG / 1) بتمويل من BMWi وBMBF المشروع "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). شكر خاص لتوبياس J. غونتر لمساعدته القيمة خلال الدراسات AFM وإريك جونستون V. لقراءة المخطوطة كما يتحدث اللغة الإنجليزية. وعلاوة على ذلك، فإن مؤلف هذه الورقة أود أن أشكر ألين ريتر وسابرينا Gurlit (من معهد البيئة الموارد من أجل المساعدة في القياسات ICP-MS)، مانجا فوغل، نانسي أنجر، كارين E. Viacava والتكنولوجيا الحيوية مجموعة للمعهد هيلمهولتز فرايبرغ للتكنولوجيا الموارد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

الكيمياء، العدد 107، Biosorption، المعادن، S-طبقة والبكتيريا والجسيمات النانوية، QCM-D، AFM، ICP-MS، الذهب
أو-تفاعل Slp1 البوليمرات واحد رقائق من<em&gt; Lysinibacillus كروي</em&gt; JG-B53 - QCM-D، ICP-MS وAFM كأدوات للدراسات جزيء حيوي المعادن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter