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Chemistry

Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

Devido ao crescente uso de ouro para diversas aplicações como eletrônica, catalisadores, biossensores, ou instrumentos médicos, a procura deste metal precioso tem crescido ao longo dos últimos anos de tempo 6-9. Ouro, bem como muitos outros metais preciosos e pesados ​​são liberados no ambiente através de efluentes industriais em concentrações diluídas, por meio de atividades de mineração, e eliminação de resíduos 7,8,10, embora a maioria contaminação ambiental por metais pesados ​​ou preciosos é um processo em curso causada principalmente por atividades tecnológicas. Isto leva a uma interferência significativa dos ecossistemas naturais e pode potencialmente ameaçar a saúde humana 9. Conhecendo esses resultados negativos promove a busca por novas técnicas para remover metais de ecossistemas e melhorias contaminados na reciclagem de metais de efluentes industriais. Métodos físico-químicos bem estabelecidos como precipitação ou permuta de iões não são tão eficazes, especialmente em altaly diluída soluções 7,8,11. Biossorção, quer com a vida ou biomassa morta, é uma alternativa atraente para o tratamento de águas residuais 10,12. O uso de tais materiais biológicos pode reduzir o consumo de produtos químicos tóxicos. Muitos microrganismos têm sido descritos para acumular ou imobilizar metais. Por exemplo, células de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 mostraram capacidades de ligação elevadas para os metais preciosos, por exemplo, Pd (II), Pt (II), Au (III), e outros metais tóxicos como o Pb (II) ou L (VI) 4,13, células de Bacillus megaterium para o Cr (VI), 14, células de Saccharomyces cerevisiae para Pt (II) e Pd (II) 15, e Chlorella vulgar para Au (III) e U (VI) 16 , 17. A ligação de metais anteriores como Au (III), Pd (II) e Pt (II), também tem sido relatado para Desulfovibrio desulfuricans 18 e para L. sphaericus JG-B53 19,20. No entanto, não all micróbios vincular quantidades elevadas de metais e sua aplicação como material de sorção é limitada 12,21. Além disso, a capacidade de ligação do metal depende de diferentes parâmetros, por exemplo, a composição celular, o bio-componente usado, ou condições ambientais e experimentais (pH, força iónica, temperatura, etc.). O estudo dos fragmentos da parede celular isolado 22,23, como lípidos da membrana, peptidoglycan, proteínas ou outros componentes, ajuda a compreender os processos de células inteiras construídas complexas 8,21 vinculativo metal.

Os componentes celulares com foco em neste estudo são proteínas S-layer. Proteínas S-camada são partes do envelope celular externo de muitas bactérias e archaea, e que constituem cerca de 15 - 20% da massa de proteína total destes organismos. À medida que a primeira interface para o meio ambiente, estes compostos celulares influenciam fortemente as propriedades de sorção bacterianas 3. Proteínas S-layer com pesos moleculares variando de quarentaa centenas de kDa são produzidos dentro da célula, mas são montados no exterior, onde eles são capazes de formar camadas nas membranas lipídicas ou poliméricas componentes da parede celular. Uma vez isolado, quase todos os S-layer proteínas têm a propriedade intrínseca à espontaneamente auto-montar em suspensão, nas interfaces, ou em superfícies planas ou formando tubo-como estruturas 3. A espessura da monocamada de proteína depende das bactérias e está dentro de uma gama de 5 - 24 25 nm. Em geral, as estruturas de proteínas S-camada formada pode ter uma oblíqua (P1 ou P2), quadrada (P4) ou hexagonal (P3 ou P6) simetria com constantes de rede de 2,5 a 35 nm, 3,24. A formação da estrutura parece ser, em muitos casos dependentes de catiões divalentes e principalmente sobre Ca 2+ 25,26, Raff, J. et ai. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). No entanto, a cascata de reacção cheio de dobragem monómero, monómero interação-monómero, a formação de uma estrutura, e o papel dos diferentes metais, especialmente de catiões divalentes, tais como Ca 2+ e Mg 2+, não são ainda totalmente compreendidas.

A estirpe de bactérias gram-positivas L. sphaericus JG-B53 (renomeado de Bacillus sphaericus após nova classificação filogenética) 27 foi isolada dos resíduos pilha mineração de urânio "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saxônia, Alemanha) 4,28,29. Sua funcional da proteína S-camada (Slp1) possui uma rede quadrada, um peso molecular de 116 kDa, 30, e uma espessura de 10 nm ≈ em células de bactérias que vive 31. Em estudos anteriores, a formação in vitro de uma camada de proteína fechado e estável com uma espessura de aproximadamente 10 nm foi alcançada em menos de 10 min 19. A tensão relacionada L. sphaericus JG-A12, também um isolado da pilha "Haberland", possui capacidades de ligação de alta de metal e seu isolado S-camada de proteína tem mostrado uma boa taxas de sorção de alta estabilidade química e mecânica e para os metais preciosos como Au (III), Pt (II), e Pd (II) 4,32,33. Esta ligação de metais preciosos é mais ou menos específicos para alguns metais e depende da disponibilidade de grupos funcionais sobre a superfície da proteína exterior e interior do polímero e nos seus poros, força iónica, e o valor de pH. Grupos funcionais relevantes para a interação do metal por as proteínas são COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, e SO. Em princípio, as capacidades de ligação a metais abrir um amplo espectro de aplicações, Raff, J. et ai. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). por exemplo, como componentes biosorptive para remoção ou recuperaçãode metais tóxicos ou valiosos dissolvidos, modelos para a síntese ou a deposição de nanopartículas definido regularmente estruturados metálicos (PN) para a catálise e outros materiais bio-engenharia, como camadas de bio-sensorial 3,5,18,33. Matrizes NP regularmente organizados como Au (0) -NPs poderia ser usado para grandes aplicações que vão desde a eletrônica molecular e biossensores, dispositivos de armazenamento densidade extremamente altas, e catalisadores para o CO-oxidação 34-37. O desenvolvimento de tais aplicações e design inteligente desses materiais exige uma compreensão mais profunda dos mecanismos de ligação de metal subjacentes.

Um pré-requisito para o desenvolvimento de tais materiais de base biológica é a implantação confiável de uma camada de interface entre a biomolécula ea superfície técnica 38,39. Por exemplo, polielectrólitos montado com a camada-por-camada (LbL) 40,41 técnica têm sido utilizados como uma camada de interface para a recristalização das proteínas S-camada 39 19,42, Raff, J. et al. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). No entanto, o mecanismo complexo da adsorção de proteína e interacção de proteína à superfície não é completamente compreendido. Especialmente informações sobre a conformação, a orientação padrão, e densidades de revestimento ainda está desaparecido.

Quartz microbalança de cristal com monitoramento dissipação (QCM-D) técnica tem atraído atenção nos últimos anos como uma ferramenta para o estudo de adsorção de proteínas, cinética de revestimento, e interação proprocessos em escala nanométrica 19,43-45. Esta técnica permite a detecção detalhada de adsorção em massa em tempo real, e pode ser usado como um indicador para o processo de auto-montagem de proteínas e acoplamento de moléculas funcionais em redes proteicas 19,20,42,46-48. Além disso, as medições QCM-D em aberto a possibilidade de estudar os processos de interação do metal com a camada proteica em condições biológicas naturais. Em um estudo recente, a interacção da proteína S-camada com metais seleccionados tais como Eu (III), Au (III), Pd (II) e Pt (II) foi estudada com QCM-D 19,20. A camada de proteína adsorvida pode servir como um modelo simplificado de uma parede celular de bactérias gram-positivas. O estudo deste componente único pode contribuir para uma compreensão mais profunda da interação metal. No entanto, unicamente experimentos QCM-D não permitem declarações relativas a estruturas de superfície e influências de metais para a proteína. Outras técnicas são necessárias para obter essas informações. Um poslidade de imagem para bio-nano-estruturas e obtenção de informações sobre as propriedades estruturais é a microscopia de força atômica (AFM).

O objectivo do estudo foi investigar apresentada a sorção de ouro (Au (III) e Au (0) -NPs) para proteínas S-camada, em particular Slp1 de L. sphaericus JG-B53. As experiências foram efectuadas com proteínas suspensos na escala em lotes numa gama de pH 2,0 - 5,0 utilizando ICP-MS e imobilizadas com S-camadas usando QCM-D. Além disso, a influência de uma solução de sal de metal sobre a estabilidade da estrutura foi investigada com estudos subsequentes AFM. A combinação destas técnicas contribui para uma melhor compreensão dos processos de interação in vitro de metal como uma ferramenta para aprender mais sobre os eventos em células bacterianas inteiras sobre afinidades de metal específicos de ligação. Este conhecimento é crucial não só para o desenvolvimento de materiais de filtro válidos para a recuperação de metais para a protecção do ambiente ea conservação dos refontes 49, mas também para o desenvolvimento de matrizes de nanopartículas metálicas altamente ordenadas para várias aplicações técnicas.

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Protocol

1. microorganismo e Cultivo Condições

Nota:. Todas as experiências foram realizadas sob condições estéreis L. sphaericus JG-B53 foi obtido a partir de uma cultura criopreservados 29,30.

  1. Transferência de crio-preservado de cultura (1,5 ml), sob a bancada limpa para 300 ml de caldo nutriente estéril (NB) meios (3 g / l de extracto de carne, 5 g / l de peptona, 10 g / L de NaCl). Depois agita-se a solução durante pelo menos 6 horas a 30 ° C para se obter a pré-cultura para o cultivo.
  2. Cultivar a bactéria em condições aeróbias em meio NB a pH = 7,0, 30 ° C num biorreactor de 70 L dimensionado de vapor no local. Portanto, encher o reactor de 57 L com ≈ água desionizada. Adicionar e dissolver mídia NB sólido diretamente em biorreator (concentrações veja acima).
    1. Além disso adicionar agente anti-espuma (30 mL / L NB-media) para a mídia para suprimir a formação de espuma durante a cultura, então autoclave (122 ° C, temperatura de manutenção de tempo de 30 min) os meios de comunicaçãono interior do reactor de instalação.
  3. Esfriar a mídia e executar completa saturação de oxigênio. Ajustar o pH para 7,0 (utilizando 1 H 2 SO 4 e 2 M de NaOH) e começar a inoculação automática do 300 ml de pré-cultura. Iniciar a gravação de dados de parâmetros de cultivo no ponto de inoculação. Log parâmetros on-line por exemplo, o nível de oxigênio dissolvido (OD 2), adição de ácido e base, e os valores do pH no cultivo.
    1. Monitorar o crescimento bacteriano em linha por as medições da turvação não-invasivos.
  4. Operações de amostragem adicional após cada hora de cultivo e ainda determinar parâmetros como o peso bio seco (BDW) e densidade óptica offline (OD). Portanto, recolher 20 ml de caldo de cultivo em cada ponto de amostragem em condições estéreis.
    1. Determinar OD off-line por meio de medições fotométricas da adsorção a 600 nm. Use estéril filtrada NB-meio como um valor em branco. À réer atingindo adsorção> 0,4 ​​diluir a suspensão de células após a linearidade da lei de Lambert-Beer.
    2. Para a determinação da BDW centrífuga de 1 a 5 ml de suspensão bacteriana (dependendo da densidade celular) a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Seca-se a pelete de células obtida a 105 ° C num forno de aquecimento até a estabilidade de massa e medir a massa da pelota.
  5. Tome imagens microscópicas com fase óptica microscópio de pesquisa contraste em 400 e 1.000 ampliação vezes (contraste de fase condensador 2 e 3, respectivamente) para a verificação do crescimento bacteriano e como controle de contaminação cruzada.
  6. Depois de atingir a fase de crescimento exponencial detectado por linha de DO2 e turbidez em linha, a colheita da biomassa por centrifugação de fluxo a 15000 xg, 4 ° C e lava-se a biomassa duas vezes com tampão padrão (50 mM Tris, 10 mM de MgCl 2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Nota: O sedimento biomassa obtida pode ser armazenada a -18 & #176; C até posterior utilização para o isolamento.

2. S-camada de isolamento e purificação de proteínas

Nota: Purifica-se polímeros Slp1 acordo com um método adaptado, tal como descrito anteriormente 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogeneizar a biomassa em bruto e lavou-se obtido a partir de cultura descongelado em tampão padrão (1: 1 (w / v)) para remover flagelos, utilizando um dispersor (nível 3, 10 min), sob arrefecimento em banho de gelo a 4 ° C.
  2. Centrifugar a suspensão (8000 xg, 4 ° C durante 20 min) e lava-se o sedimento, obtido duas vezes com tampão padrão (1: 1 (w / v)). Após a lavagem e centrifugação (8000 xg, 4 ° C durante 20 min), ressuspender o sedimento em tampão padrão (1: 1 (w / v)), adicionar DNase II e RNase (0,4 unidades / g de biomassa) para a suspensão e se desintegram as células a 1.000 bar com um homogeneizador de alta pressão. Depois centrifugar a suspensão a 27.500 xg, a 4 ° C durante 1 h.
    Nota: suspensão de células de Controle com os mi pesquisacroscope. A rotura é concluída quando menos de 2 - 3 células intactas são visíveis no campo de visão do microscópio, em ampliação de 400 vezes.
  3. Lava-se a pelete duas vezes com tampão padrão (1: 1 (w / v)) e realizar a centrifugação novamente. Em seguida ressuspender o sedimento em tampão padrão (2: 1 (w / v)) misturado com 1% de Triton X-100 e incubar durante 20 min sob sucessivas agitação (100 rpm) para solubilizar depósitos lipídicos.
  4. Centrifugar a solução (27.500 xg, a 4 ° C durante 1 hora) e lavar os pellets obtidos três vezes com tampão padrão (1: 1 (w / v)).
  5. Incubar o pellet obtido após centrifugação adicional (27.500 xg, a 4 ° C durante 1 h), durante 6 h em tampão padrão (1: 1 (w / v)) misturado com 0,2 g / l de lisozima, para hidrolisar as ligações em peptidoglicano 50. Adicionalmente adicionar DNase e RNase II (cada 0,4 unidades / g de biomassa) para a suspensão.
  6. Depois de centrifugação (45.500 xg, 4 ° C, 1 hora), ressuspender a fase de proteína branco superior com um baixo volume de tele centrifugação sobrenadante (<30 ml) contendo subunidades de proteínas.
  7. Solubiliza-se a suspensão branca através da mistura 1: 1 com 6 M de cloridrato de guanidina (6 M GuHCl, 50 mM Tris, pH = 7,2). A solução torna-se brilhante.
  8. Efectuar a filtração estéril (0,2 um) da solução tratada GuHCl seguido de uma centrifugação de alta velocidade adicional (45.500 xg, a 4 ° C durante 1 hr).
  9. Transferir o sobrenadante para tubos de membrana de diálise (MWCO 50.000 Dalton) e dialisadas contra tampão de recristalização (TRIS 1,5 mM, CaCl2 10 mM, pH = 8,0) durante 48 horas.
  10. Transferir a solução de polímero branco proteína recristalizado em tubos e centrifugar a 45.500 xg, a 4 ° C durante 1 h. Ressuspender o sedimento num pequeno volume de água ultrapura (<30 ml).
  11. Em seguida, transferir a suspensão para dentro de tubos de diálise de membrana e efectuar uma diálise contra água ultra-pura, durante 24 h para remover o conteúdo de tampão.
    Nota: Várias mudanças de tampão ou água ultrapura durante diálise são indispensáveis.
  12. Liofilizar o Slp1 purificado num secador por congelação.

3. caracterização e quantificação de Slp1 para Experimentos

Nota: concentração Slp1 para sorção e revestimento experiências foram quantificados por espectrofotometria de UV-VIS.

  1. Pipetar 2 ul de amostra dissolvida Slp1 directamente sobre o pedestal de medida menor do fotómetro. Determinar a concentração de proteína a adsorção máxima num comprimento de onda de 280 nm, característicos de proteínas. Utilizar o coeficiente de extinção de 0,61 para determinar a concentração Slp1. Use Slp1 solução gratuita para medições de referência.
  2. Dilui-se a proteína com o tampão (para as experiências de sorção no modo de lote utilizam 0,9% de NaCl, pH = 6,0 e para experiências QCM-D usar tampão de recristalização, pH = 8,0) até à concentração desejada para as experiências (1 g / L e 0,2 g / L respectivamente).
  3. Analisar a qualidade Slp1 e peso molecular pelo Bioanal padrãoytical método de electroforese de sódio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE), descrita por Laemmli, Reino Unido 52.
    1. Execute SDS-PAGE antes de usar Slp1 dentro de experimentos e por exemplo, depois de Au (0) -np incubação utilizando 10% de gel de poliacrilamida de separação.
    2. Por SDS-amostras de mistura = 10 ul da cultura ou a proteína da amostra com tampão de amostra (1,97 g de Tris, 5 mg de azul de bromofenol, 5,8 ml de glicerina, 1 g de SDS, 2,5 ml β-mercaptoetanol, encher com água ultrapura até 50 ml) em uma proporção de 1: 1 (v / v) e pipeta-se a mistura após 4 minutos de incubação a 95 ° C para os bolsos de gel.
    3. Executar SDS-PAGE a 30 min a uma tensão de 60 V até que as amostras passam a tensão de gel e recolha de mudança de 120 V, uma vez que passa do gel de separação.
    4. Remover os geles a partir do sistema de gel, lavar com água ultrapura e lugar durante 1 hora em solução de fixação (ácido acídico 10%, 50% de etanol absoluto). Em seguida, lavar os géis com água ultrapura.
    5. Géis Manchausando uma coloidal inespecífica adaptado Coomassie brilhante método azul 53,54. Após descoloração 72,73, tirar imagens de SDS-PAGE pelo sistema de documentação de gel de acordo com o protocolo do fabricante.

4. Experimentos de sorção em Batch-modo e Metal Quantificação

  1. Por lote experimentos de sorção preparar Au (III), solução de estoque de HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O, dilui-se o sal de metal e misturá-lo com a solução Slp1 / NaCl a uma concentração de metal inicial de 1 mM e concentração final Slp1 de 1 g / L . Realizar experimentos em trigêmeos com um controle negativo adicional sem Slp1. Utilizar um volume total de 5 ml para experiências de sorção.
  2. Agitar a suspensão à TA continuamente a diferentes valores de pH pré-ajustada entre 2,0 a 5,0, durante 24 h (ajustar o pH com solução de HCl a partir de NaOH e concentradas).
  3. Após adsorção, as amostras de centrifugar a 15.000 xg, 4 ° C durante 20 min) para SEPARSlp1 comeu a partir do sobrenadante.
  4. Transferir o sobrenadante para tubos de ultrafiltração (MWCO 50.000 Da) e centrifuga-se a 15.000 xg esta, 4 ° C durante 20 min para remover monómeros de proteína dissolvida.
  5. Determinar a concentração de metal no filtrado resultante por ICP-MS 19,20 e usar os resultados para back-cálculo de metais sorvido pela massa seca Slp1. Medindo princípios, as oportunidades do método e componentes da usados ​​ICP-MS foram descritos na literatura 55.
    1. Preparar as amostras para medições de referência e ICP-MS, utilizando 1% de HNO3 como matriz e ródio como padrão interno (1 mg / mL).

5. Síntese de Au-NP e Determinação do Tamanho de Partículas

Nota: Citrato de Au estabilizadas (0) -np foram sintetizados de acordo com um método adaptado descrito anteriormente por Mühlpfordt, H. et ai. (1982) para se obterem partículas esféricas com um diâmetro de 10 - 15 nm, 56,57

  1. Prepare uma estabilizada HAuCl 25 mM 4 ∙ 3 H 2 O estoque para a formação NP.
  2. Diluir 250 ul desta solução estoque em 19,75 ml de água ultrapura e incubar estes a 61 ° C durante 15 min sob agitação sucessiva.
  3. Prepare 5 ml de uma solução-mãe de segunda (12 mM de ácido tânico, 7 mM de citrato de sódio di-hidratado, 0,05 mM de K 2 CO 3) e incubar a solução 2 nd separadamente a 61 ° C durante 15 min.
  4. Adicionar sob constante agitação da solução estoque 2ª a solução one. Agita-se a mistura reaccional durante pelo menos 10 min a 61 ° C. Depois arrefecer a solução e usá-lo para NP revestimento sobre Slp1 estrutura dentro experimentos QCM-D.
    Nota: O Au resultante (0) -np foram caracterizados por espectroscopia de UV-VIS no máximo de absorvância a 520 nm, normalmente usado para a detecção de formado Au (0) -NPs 58. A solução pode ser armazenada a 4 ° C.
  5. Analisar o tamanho do formadoAu (0) -np por espectroscopia de correlação do fotão (PCS), que é também conhecida como dispersão de luz dinâmica.
    1. Para a determinação do tamanho NP, transferir 1,5 mL da sintetizados Au (0) -np solução em cuvetes sob condições isentas de pó em uma caixa de fluxo laminar e analisá-lo com um tamanho e potencial zeta das partículas Sizer. Uma descrição detalhada do PCS e preparação da amostra é dado em Schurtenberger, P. et ai. (1993) 59 e Jain, R. et ai. (2015) 60.

6. Experiências QCM-D - Slp1 revestimento nas superfícies e Au-NP adsorção Slp1 Malha

Nota: As medições foram realizadas com um QCM-D equipado com até quatro módulos fluxo. Todas as experiências QCM-D foram realizadas com uma taxa de fluxo constante de 125 ul / min a 25 ° C. Revestimento Slp1 e metal / NP incubação foram feitos em SiO2 piezoelétricos sensores de quartzo AT-corte (Ø 14 mm) com uma freqüência fundamental de ≈ 5 MHz. Enxaguar etapas e adicionarition de solução estão marcados nas figuras do resultado parte representativa. As experiências QCM-D poderia ser descrito como uma forma passo a passo começando com a limpeza e a modificação da superfície dos sensores utilizados, seguido por recristalização Slp1 e, mais tarde, a interacção NP de metal e metal.

  1. Procedimentos de limpeza:
    1. Equipar as células do líquido com manequins de sensores. Bomba de pelo menos 20 ml (cada um por módulo) de um agente de limpeza líquido alcalino (2% em purificadores de água ultrapura (/ v) v) através do sistema de QCM-D e tubo. Em seguida bombear o volume de cinco vezes (por cada módulo) de água ultrapura através do sistema (caudal de até 300 ul / min). Realizar a limpeza de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Limpar as SiO 2 sensores de fora dos módulos de fluxo por incubação (pelo menos 20 minutos) na solução de SDS a 2% e enxaguar os sensores depois várias vezes com água ultrapura 61,62.
    3. Secam-se os cristais com amostra filtradaressed ar e colocá-los em uma câmara de limpeza de ozônio durante 20 min 63,64.
    4. Repita o procedimento de limpeza duas vezes para remover todos os conteúdos orgânicos.
    5. Para remover metais ligada da superfície do sensor enxaguar os sensores com 1 M de HNO3. Em seguida, execute todas as etapas de lavagem com água ultrapura.
  2. Sensor de superfície Modificação por polieletrólitos:
    Nota: A modificação da superfície pode ser feito tanto no interior (fluir através de procedimento) ou fora do módulo de fluxo (técnica de automontagem). Dentro destas experiências da seguinte forma para modificar as superfícies foi usada.
    1. Modificar os sensores com 3 g / L de camadas alternadas de PE de imina de polietileno (PEI, MW 25.000) e de sulfonato de poliestireno (PSS, MW 70.000) através de revestimento por imersão utilizando a técnica LbL 40,41 previamente descrito para o sistema utilizado especial no artigo de Suhr, M. et ai. (2014) 19.
    2. Coloque os sensores dentro da solução-PE apropriado em w profundaell placas e incuba-se estes durante 10 min a RT.
    3. Tome os sensores fora da PE-solução e lave os sensores entre cada passo de revestimento por imersão intensamente com água ultrapura.
      Nota: A nova modificação de superfície é constituído por pelo menos três camadas de PE com terminação PEI carregado positivamente.
    4. Após esta modificação externa colocar os sensores no interior do módulo de fluxo e equilibrar os sensores por enxaguamento com água ultrapura antes de começar as experiências.
  3. Slp1 monocamada recristalização:
    1. Dissolver Slp1 em 4 M de ureia para a conversão de polímeros em monómeros.
    2. Centrifugar as proteínas monomerized a 15.000 xg, 4 ° C durante 1 h para remover aglomerados de proteínas maiores.
    3. Misturar-se o sobrenadante e centrifugou-se Slp1 solubilizado com tampão de recristalização a uma concentração final de proteína de 0,2 g / L.
      Nota: O cálcio dependendo da recristalização Slp1 (auto-montagem) é iniciado por adição do rectampão rystallization. Portanto, bombear a solução mista com um caudal de 125 ul / min para os sensores (colocado no interior dos módulos de fluxo) imediatamente. A recristalização é feita após os valores estáveis ​​de frequência e de dissipação de turnos foram detectados dentro experimentos QCM-D.
    4. Após recristalização a partir de proteínas bem sucedido em cima dos sensores-PE modificados no interior dos módulos de fluxo de lavagem os sensores revestidos com tampão de recristalização ou waterintensively ultrapura com uma taxa de fluxo de 125 mL / min até que os valores estáveis ​​de frequência e de dissipação foram detectadas mudanças.
      Nota: O SiO2 modificação da superfície com PE para experimentos de sorção posteriores Onto Slp1 estudos monocamada e AFM é visualizado na Figura 1.

figura 1
Figura 1. Esquema Projeto de PE modificação da superfície e Slp1 MonolayerRevestimento; Este valor foi modificado a partir Suhr, M. et al. (2015) 19 com a permissão da Springer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Metais e NP Interação:
    Nota: A sorção com a solução de sal de metal Au (HAuCl 4 ∙ 3 H2O) foi realizada em concentrações de 1 mM ou 5 mM a pH = 6,0 a 0,9% em soluções de NaCl. Au-NP adsorção foi feito com não diluído Au-NPs em 1,6 mM tampão tri-sódio-citrato em pH ≈ 5.0.
    1. Após o revestimento Slp1 sucesso nos módulos de fluxo, lavar a camada Slp1 obtido intensamente com solução de NaCl 0,9% até foram detectados valores estáveis ​​de frequência e de dissipação de turnos.
    2. Bombear a solução preparada de metal (1 mM) e uma solução de NP para os módulos de fluxo com uma taxa de fluxo de 125 mL / min e controlar a massa de adsorção para o Slcamada p1. Adsorção de massa pode ser detectada diretamente, acompanhando as mudanças de freqüência referentes à equação de Sauerbrey (equação 1).
    3. Depois de completar a interação metal e de metal NP, lavar a camada de metal / NP tampão livre para remover metais ou fracos nanopartículas ligadas ou fracos em anexo.
      Nota: Uma ilustração da configuração experimental é mostrado na Figura 2.

Figura 2
Figura 2. desenho esquemático da instalação QCM-D usando Fluxo Módulo QFM 401 * 66. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Gravação de Dados e Avaliação:
    1. Grave as mudanças na freqüência em Hz (Af n) e dissipação (ΔD n) Dentro dos experimentos QCM-D usando QCM-D de software específico.
    2. Use para avaliação da sensibilidade de massa adsorvida (Dm) do Sauerbrey equação / modelo (Equação 1) 65 66 que é válido para filmes finos e rígidos acoplados sem atrito à superfície do sensor aplicada ao n º harmônico. O termo C (constante Sauerbrey) para o usado 5 MHz AT sensor de quartzo corte é de 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. Para rígida, uniformemente distribuída, e as camadas adsorvidas suficientemente finas usar a Equação 1 como uma boa aproximação.
      Equação 1
    3. Realizar modelagem adicional de acordo com o modelo de Kelvin-Voigt válido para moléculas viscoelásticas 68-71 com a fabricante de software específico e comparar os resultados com o do modelo Sauerbrey.
    4. Para o cálculo da espessura da camada e a utilização de massa de adsorçãomodelagem como parâmetro importante uma densidade de camada da camada adsorvida de 1,35 g cm -3 ∙ correspondente aos valores descritos anteriormente para as proteínas S de camada 72-75. Utilize o mesmo valor para o cálculo da interação do metal com a camada proteica.

7. As medições AFM

  1. Realizar estudos com plenamente capaz AFM em um microscópio óptico invertido.
    1. Gravação de imagens de AFM em líquido usando o buffer de recristalização ou água ultrapura diretamente nos sensores QCM-D revestidos.
    2. Lave os sensores com água ultrapura após experimentos QCM-D e colocá-los dentro da célula fluido AFM. Portanto, utilizar uma célula de fluido em circuito fechado com um volume total de cerca de 1,5 ml. Manter a temperatura do fluido constante da célula a 30 ° C.
    3. Usar um cantilever com uma frequência de ressonância de 25 kHz ≈ em água e uma rigidez de <0,1 N / m. Ajuste a velocidade de digitalização entre 2,5 e 10 m / seg.
      4. 76.
      Nota: as imagens da altura são mostrados com z-escala, enquanto valores z representam a topografia da superfície exacta. Imagens amplitude (Pseudo 3D) são mostrados sem z-escala, porque z-valores de amplitude dependem de parâmetros de digitalização e dar informações limitadas. Análise de imagens foi feita utilizando três softwares de avaliação diferente do 77.

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Representative Results

Cultivo de Microrganismos e Slp1 Caracterização

Os dados gravados do crescimento bacteriano indica o final da fase de crescimento exponencial em cerca de 5 horas. Investigações anteriores demonstraram que Slp1 pode ser isolado a partir deste ponto de colheita (4,36 g / L de biomassa húmida (≈ 1,45 g / L (BDW)) com um rendimento máximo de 19. No entanto, a optimização de cultivo usando componentes de meios definidos ou fe- estratégias cultivo descontínuo iria levar a rendimentos de biomassa mais elevados. Este é inalienável para a utilização de uma quantidade elevada de biomassa para aplicações industriais. Os valores da linha e parâmetros de cultivo desligada gravadas encontram-se resumidos na Figura 3A. controle microscópico (Figura 3B) no momento da colheita mostrar células não esporulados de L. sphaericus JG-B53.


Figura 3: (A) online e offline medidos parâmetros de cultivo de L. sphaericus JG-B53 e (B) imagem microscópica de células de bactérias L. vitais sphaericus JG-B53 no momento da colheita em 400 vezes de ampliação; Este valor foi modificado a partir Suhr, M. et al. (2014) 19 com a permissão da Springer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além disso, um perfil de proteína SDS-PAGE, adicionalmente, feito (Figura 4A) indica a quantidade máxima de Slp1 no momento de 5 h de cultivo. A banda correspondente à proteína Slp1 (≈ 150 kDa) é mais espessa, mas a partir de agora uma perda de intensidade foi observado accompanied por um aumento em proteínas com peso molecular mais baixo possível causada por segregação ou fragmentação de proteínas de outras proteínas. As bandas de proteínas isoladas e purificadas obtidas pelo método acima mencionado (Figura 4B) correspondem a um peso molecular de aproximadamente 150 kDa, que é mais pesado do que o peso calculado com base nos dados de sequenciação de Slp1 (116 kDa) 30. Este é provavelmente devido a modificações pós-translacionais. Outras razões para a discordância entre a massa molecular teórico ea massa molecular observada em geles de SDS são possivelmente cobrar artefatos dependentes no gel SDS 30.

Figura 4
Figura 4. Perfis de proteína produzida por SDS-PAGE de (A) células de bactérias desintegrou obtidos a partir de amostras de cultivo e (B) purificado Slp1 após isolamento com sucesso; Este fifigura foi modificado a partir Suhr, M. et ai. (2014) 19 com a permissão da Springer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Experimentos lote de sorção e Determinação de Au com ICP-MS

As capacidades de ligação máxima de metal (q max) do Au (III) por suspensão Slp1 são mostrados na Figura 5. Os resultados mostram que, Au (III) foi estavelmente ligado por Slp1 durante a incubação de 24 horas dentro do intervalo de pH investigado. Os resultados indicam q máximo na gama de aproximadamente 80 - 100 mg de Au (III) / g Slp1. Os valores resumidos (Tabela 1) foram comparadas com a capacidade de sorção de cerca de 75 mg Au (III) / g Slp1 relatado anteriormente por Suhr, M. et ai. (2014), obtido a partir de experimentos com a auto-regulaçãovalores de pH-por adição da solução de sal de metal (pH ≈ 4.3) 19. Para resumir, Slp1 demonstrou a capacidade de ligar grandes quantidades de Au inicialmente adicionado (III) provando suas elevadas capacidades de ligação para este elemento.

Figura 5
Figura 5. Diagrama do máximo de ligação de metal Capacidades (q no máximo) do Au (III) para os polímeros Slp1 dentro de experiências com o pH ajustado em comparação com os resultados de sorção utilizando valores de pH auto-ajustado (4,3 Å) reportados por Suhr, M. et ai. (2014) 19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As eficiências de remoção de metal calculados (RE) dentro da faixa de pH foram investigados entre 50 - 60% confirmando assim a resultados realizadas por Suhr, M. et ai. (2014), onde foram alcançados valores de cerca de 40%. Em experiências realizadas anteriormente, fortes interacções de Au (III) com os grupos funcionais, por exemplo, hidroxilo, carboxylic- e grupos amino, tem sido observado para as proteínas S-camada como Slp1 e para a proteína comparativa SlfB de L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et ai. (2010) detectada espectroscopicamente uma forte interacção de Au (III), principalmente com grupos carboxílicos de SlfB que também poderiam ser deduzidas para a Slp1 de L. sphaericus JG-B53 20,79,80. Além disso, as propriedades intrínsecas da proteína que reduziria Au (III) em Au (0) na ausência de agentes de redução pode ser uma razão para a forte interacção 79. Além disso, os resultados deste estudo mostram a tendência de uma ligação de Slp1 preferido a valores de pH mais baixos. Por outro lado, uma ligação a valores de pH mais baixos, também pode levar a uma desnaturação da Slp1. Estudos para a Slp1 mostrou uma estabilidade da proteína para baixo para pH =3,0 (resultados não publicados). A partir de experiências de dessorção sob condições ácidas, usando, por exemplo, ácido nítrico ou utilizando agentes complexantes como o EDTA ou o citrato de (dados não mostrados), verifica-se que o ouro foi estavelmente ligado e não podia ser libertado a partir de polímeros Slp1.

Au (III) em Slp1 de L. sphaericus JG-B53
c inicial (mg / L) 196,97
pH 5 4,5 ≈ 4.3 23 4 3,5 3 2.5 2
valor
q max 88,3 85,3 74,7 102.5 94,1 81 101.9 96,9
(mg Au (III) / g Slp1)
RÉ 47,1 47,8 37,9 57,1 54,1 44,8 58,7 56,5
(%)

Tabela 1: Máximo de Metal Encadernação Capacidades (q max) e Eficiências de remoção de metal (RE) de Experimentos Batch-sorção com Au (III) e Slp1 Polímeros em solução, analisada por ICP-MS. Dados comparados com os resultados publicados anteriormente de Suhr, M. et al. (2014) 19.

Slp1 Monolayer recristalização Seguido por QCM-D

A diminuição imediata da frequência (5 Af, Af 7, 9 Af, Af 11) indica uma adsorção rápida e uma elevada afinidade para as proteínas de superfície da PE modificada (Figura 6A). Igual à rápida mudança na freqüência, a dissipação (ΔD 5, ΔD 7, ΔD 9, ΔD 11) também aumenta imediatamente. Este fato indica uma adsorção de moléculas de viscoelástico para a superfície por causa de amortecimento rápido, resultando em aumento dos valores de dissipação. O deslocamento de frequência máxima é alcançada após 5 min com um valor de 95 Hz e ≈ ΔD de 4,2. Numa fase posterior, apenas rearranjos de recristalizado Slp1 ocorrer. Slp1 adsorção foi thusly realizada por mais de 60 min para garantir tele formação de uma superfície quase totalmente coberto e estrutura de proteínas regularmente solicitados. A experiência mostra que a camada de PE está carregado positivamente inalienável para alcançar revestimentos estáveis, modificação final negativa conduz a uma fraca absorção e a cinética de revestimento mais longos (dados não mostrados) 38. Fracamente ligados proteínas e aglomerados foram removidos por lavagem com tampão de recristalização Slp1-free. As pequenas alterações de Af n confirmam a baixa dessorção de proteína e a adsorção de Slp1 estável. Apesar disso, a dissipação cai para ≈ 2,8 indicando que as moléculas maiores são removidos elásticas.

Figura 6
Figura 6. A recristalização de Slp1 em Modificados SiO 2 Sensores analisados ​​por QCM-D; (A) em Af / parcela ΔD e (B) profil espessura superfícieE; Este valor foi modificado a partir Suhr, M. et al. (2014) 19 com a permissão da Springer e Suhr, M. (2015) 20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O perfil da superfície calculada usando os modelos anteriores mencionados mostram uma espessura monocamada Slp1 de ≈ 11,2 nm (modelo Kelvin-Voigt para películas elásticas) e de 10,0 nm (modelo Sauerbrey para a camada rígida) (Figura 6B). Estes valores são inferiores aos relatado por Suhr, M. et ai. (2014). As diferenças podem ser explicadas por um valor usado diferente da densidade da camada de proteína dentro da modelagem. Os valores actuais deve estar mais perto de realidades de espessura da camada de proteínas S-camada sobre a superfície celular de células vivas de L. sphaericus JG-B53 31,42. Essa modelagem demonstra que a relação i Sauerbreyé inadequado para a camada proteica fina acústico, por causa de uma propagação da onda acústica de cisalhamento em filmes líquidos viscoelásticos 81,82, que resulta em uma subestimação da massa adsorvida Slp1 e espessura. Isto pode ser explicado pelas propriedades elásticas das proteínas S de camada e o seu acoplamento de moléculas de água durante o processo de adsorção. A interacção de proteínas com água pode ser facilmente descrito por formação de camadas de hidratação, arrastamento viscoso ou aprisionamento em cavidades na camada adsorvida 83. Isto efetua uma espessura de camada superior medido pelo modelo de Kelvin-Voigt e também pode clarificar as diferenças na espessura da camada obtida por os dois modelos diferentes. Em estudos anteriores AFM, espessura das camadas de reticulados Slp1 de cerca de 8-12 nm foram medidos. Ao calcular a massa de adsorção Slp1, em vez da espessura da camada, um total de 1506,6 Dm ng ∙ cm -2 (modelo Kelvin-Voigt) foi calculada. Os dados de adsorção em massa de surfases são resumidos na Tabela 2 e mostram uma elevada adsorção de massa usando os valores do modelo de Kelvin-Voigt.

m max Dm max espessura espessura
(ng / cm2) (ng / cm2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
Slp1 após revestimento e enxaguamento 1.505,6 1,351.6 11.2 10

"1"> Quadro 2: Adsorbed Missa de Slp1 em Modificados Polyelectrolyte SiO 2 Crystals analisados ​​por QCM-D após a lavagem com recristalização Buffer (pH = 8,0) e calculada a espessura da camada.

QCM-D como Ferramenta para detecção de metais e NP Interação com proteico Slp1 Monolayer

A interacção de monocamada Slp1 recristalizado com 1 mM e 5 mM dissolvido Au (III), foi investigada. Os resultados da massa total adsorvida obtido a partir de cálculos e modelagem dos dados gravados de mudanças na freqüência e dissipação estão resumidos na Tabela 3. Os estudos QCM-D de Au (III) interação com as monocamadas fornecer uma compreensão mais profunda do metal-biomolécula interação. Pela primeira vez, a capacidade de ligação, a cinética de sorção, e como o metaG influencia a estabilidade da proteína foram estudados em nano-escala. Após a adição da solução de sal de metal para a monocamada Slp1 diminuiu a frequência dentro dos primeiros 5 minutos, indicando uma rápida adsorção de massa. No entanto, a adsorção de Au não foi completada depois de 60 minutos, como foi descrito para outros metais, como Pd (II) em estudos anteriores 19. O aumento de massa ocorre até 18 horas. Após este tempo, os passos de lavagem foram realizadas com um tampão de metal livre mostrando que o metal adsorvido é quase estavelmente ligado à camada Slp1 recristalizado. Finalmente, uma absorção total de metal 955.0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (modelo Kelvin-Voigt) foi obtido no caso de a (III) 1 mM, solução de Au e 4,534.4 ± 5,5 ng ∙ cm -2 (modelo Kelvin-Voigt) em caso de mM Au 5 (III). Os valores mais elevados obtidos por 5 mM de Au (III), as soluções podem ser explicados pelas propriedades intrínsecas de redução de Slp1 onde menor Au metálico (0) -np foram formados a partir desta solução. Estas redução adequadalaços de Slp1 já foram relatados em estudos anteriores para Pd (II) e Au (III) 32,33,79,84. Os dados também mostraram que a interacção com a solução de ouro não conduzir a uma desestabilização das camadas de proteína. Isto indica a ligação específica e estável de Au (III) para Slp1, que foi também confirmado por medições por ICP-MS, utilizando polímeros de proteína.

A formação de Au (0) -np durante a síntese pode ser visualizado pela mudança de cor da solução de amarelo para iniciar um avermelhado. Esta mudança de cor causada pela excitação das oscilações de plasmons de superfície de nanopartículas metálicas e demonstra a formação de Au (0) -NPs 1,78. Além disso NPs menores pode ser sintetizado pela variação da concentração do agente de redução (concentração mais elevada de ácido tânico) em 85 visível uma coloração diferente da solução e verificado por resultados das medições PCS (dados não mostrados). NoPor outro lado, o aumento da concentração de ácido tânico conduz a uma perda de estabilidade e NP NPs tendem a aglomerar-20. Como prova do princípio, Au pré-sintetizado (0) (distribuição de tamanhos de 10 - 18 nm medido por PCS visto na Figura 7A) -NPs foram incubadas com Slp1 suspensa durante 48 h e analisadas por SDS-PAGE. O perfil protéico mostrado na Figura 7B verifica a conclusão tirada a partir de dados QCM-D, que Au (0) -NPs não perturbe a estrutura Slp1. As bandas de proteína observadas em 150 kDa provar a presença de Slp1 intacta.

Figura 7
Figura 7. (A) NÚMERO DO ponderada distribuição de tamanho de Au pré-sintetizado (0) -NPs medido por PCS e (B) perfil de proteína SDS-PAGE de Slp1; Pista 1: 2 mg Slp1 antes Au (0) -NPs interação e pista 2: 1 ug polímeros Slp1 em suspensão após 48 horas incuba ção com Au pré-sintetizados (0) -NPs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após o NP-síntese e caracterização, as experiências QCM-D foram realizadas. A adsorção de metálico pré-sintetizado Au (0) -NPs é mostrado exemplarmente para experiências QCM-D em parcelas Af / ΔD (Figura 8 A) e como a espessura e os perfis de massa (Figura 8B).

Figura 8
Figura 8. A adsorção de pré-sintetizado Au (0) -NPs para recristalizado Slp1 Malha Analisado por QCM-D, (A) em Af / trama ΔD e (B) e o perfil de superfie da camada de massa.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pode ser confirmado que a QCM-D pode ser utilizada para detectar a adsorção do 10 - 18 nm, Au esférica (0) -NPs. Após a adição da solução de Au-NP não diluído (A 520 nm = 1) obtido pela síntese descrita, a frequência diminui, o que é um indicador directo da adsorção de massa descrito pela equação de predição da Sauerbrey (Equação 1). A adsorção de Au (0) -NPs estava praticamente concluída em menos de 60 min. Após este tempo não mais NPs foram depositados no topo da estrutura Slp1, de modo que pode ser assumido que todos os locais reactivos ou poros foram ocupadas por Au (0) -NPs. A diminuição mostrado na dissipação pode ser filiado ao enrijecimento das Slp1 treliça causa pela interação NP. Os valores de adsorção massa total são somados na Tabela 3. Mesmo lavagem intensiva com o tampão citrato NP-livre leva neither a uma dessorção de NPs nem a um descolamento da monocamada Slp1. Portanto, uma interacção forte e estável pode ser previsto para o Au (0) -np interacção no mesmo sentido como com Au (III).

Metal c de metal Dm max Dm max espessura espessura
(ng / cm2) (ng / cm2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932,6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
NPs

Tabela 3: Massa adsorvido em Recristalizada Slp1 Malha após Au (III) interação (pH = 6,0) e Au-NP Adsorção (pH = 4,7) Analisando por QCM-D e Cálculo da Espessura da camada após Au (0) -np Coating. Dados comparados com os resultados publicados anteriormente de Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM para visualização de nanômetros Estruturas Scaled

Na Figura 9, a estrutura da proteína de Slp1 recristalizado em sensores de PE modificado é mostrado com a sua rede quadrada típico (P4) como imagens de amplitude. A constante de rede pode ser determinada como 13 - 14 nm, o que é comparável com os resultados de experiências anteriores 30. A espessura da camada de 10 nm ± 2,0 nm medido por AFM verificou-se a espessura da camada previa das medições QCM-D de ≈ 11,2 nm (modelagem Kelvin-Voigt). A pequena diferença na altura da superfície pode ser explicado pelo fato de que o calculated QCM-D ajuste considera toda a área do sensor enquanto o estudo AFM alta resolução mostra apenas uma área parcial. Perante isto, os aglomerados da proteína que foram ligados à superfície do detector foram incluídas no cálculo da massa adsorvida, respectivamente, para a espessura da camada e levou a uma maior espessura da camada do que o determinado por AFM.

Figura 9
Figura 9. AFM Amplitude Imagem do Recristalizada Slp1 Malha de L. sphaericus JG-B53 em Cristais QCM-D Diretamente após revestimento e lavagem com tampão e Ampliação da região marcada; Este valor foi modificado a partir Suhr, M. et al. (2014) 19 com a permissão da Springer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 10 mostra o Slp1 intacta rede cristalina após a incubação com a solução de Au (III). Pode-se mostrar que, após a incubação da proteína estrutura permaneceu completamente intacto. Isto confirma os resultados das experiências de QCM-D preditos que a estabilidade do revestimento. Na Figura 11A e B do adsorvida pré-sintetizados Au (0) -NPs (o tamanho varia 10-18 nm determinado por PCS) sobre a estrutura Slp1 são mostrados. Devido ao tamanho das partículas, o Au (0) -NPs são adsorvidos nos poros Slp1 e não seguem a -symmetry P4 de Slp1. Au (0) -NPs estatística são distribuídos em treliça proteína. Ao medir os tamanhos de partícula em imagens AFM de altura (dados não apresentados) o tamanho das nanopartículas está na gama de 16 - 23 de nm e ainda menor, isto é, na gama de cerca de 10 nm, 19,20. Esta verifies o tamanho determinado NP medido por PCS anteriormente (visto na Figura 8).

Figura 10
Figura 10. AFM Amplitude Imagem do Recristalizada e Intact Slp1 Malha em Cristais QCM-D Sensor após incubação de 5 mM Au (III) Solução e Ampliação da região marcada; Este valor foi modificado a partir Suhr, M. et al. (2014) 19 com a permissão da Springer e Suhr, M. (2015) 20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11
Figura 11. (A) AFM amplitude imagem de adsorvido Au (0) -NPs em recristalizado estrutura Slp1 na QCM-D cristais de sensores (esquerda) E (B) reconstrução 3D perfil de superfície (à direita); Este valor foi modificado a partir Suhr, M. (2015) 20 com a permissão da Springer e Raff, J. et al. (2016) Raff, J. et ai. S-camada de nanocompósitos à base para aplicações industriais em à base de proteínas Engineered Nanoestruturas. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submetido)). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste trabalho foi estudada a ligação às proteínas de Au-S camada foi investigada utilizando uma combinação de diferentes métodos analíticos. Em particular, a ligação de Au é muito atraente, não somente para a recuperação das águas de mineração de Au ou soluções de processo, mas também para a construção de materiais, por exemplo, superfícies sensoriais. Para os estudos da interacção Au (Au (III) e Au (0) -NPs) com suspensão e recristalizou-se em monocamada de Slp1, a proteínas tem de ser isolado. Portanto, o presente estudo demonstrou a cultura bem sucedida da estirpe bacteriana gram-positiva L. sphaericus JG-B53 e o isolamento da proteína de superfície da camada Slp1. No entanto, o cultivo e o isolamento das proteínas permanecem desafiante e deve ser optimizado. Uma produção em larga escala de proteínas de biomassa e S-camada é uma condição prévia para uma aplicação industrial, tanto, por exemplo, para a produção de materiais de metal filtro selectivo. O seu potencial de aplicação é undoubtedly elevado para a remoção de metais tóxicos ou a recuperação de metais valiosos dissolvidos na água de processo, águas residuais ou águas de drenagem. Além disso, o potencial de aplicação para S-camadas é ainda maior considerando o seu potencial adicional em outros materiais bio-inspirados, como biossensores e catalisadores.

As experiências de lote de sorção de polímeros em suspensão Slp1 indicou uma ligação elevada e estável de Au (III) na gama de pH investigada de 2,0 a 5,0. Desse modo, a eficiência de remoção de metal de até 60% pode ser alcançado. Este comportamento de ligação notável pode ser explicada por uma forte interacção de Au (III) com Slp1 provavelmente induzida através da interacção de grupos carboxílicos e grupos de azoto que suporta presentes na superfície da proteína. Este argumentos poderiam ser fortalecer por FTIR e EXAFS investigação da estirpe semelhante L. sphaericus JG-A12 32,79. Além disso, as propriedades intrínsecas de redutores Slp1 pode explicar o elevado RE de Au (III) por reducing para nanoparticular Au (0). Pode-se supor que S-layer, como primeira interface de bactérias para o ambiente, deve ser envolvido principalmente no metal vinculativo. Dentro da gama de pH investigados, a maior capacidade com 102,5 mg de Au (III), de ligação a metais / g Slp1 foi alcançada a um pH de 4.0. Esta capacidade de ligação é maior do que o relatado por outros componentes-bio, por exemplo, para parede celular isolado de Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) 86 ou para a biomassa da Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS utilizado para a determinação do metal ligada por polímeros Slp1 é um método muito sensível e permite a detecção de pequenas quantidades de ouro neste estudo. ICP-MS oferece muitos benefícios para a realização de determinações de metais traço, por exemplo, sistema de fácil manuseio e baixo limite de detecção; no caso do ouro até 0,1 - 1 ppt. Isto torna este método uma ferramenta versátil para a investigação de processos biosorptive na faixa de baixa concentraçãos. No entanto, os resultados desta investigação foram obtidas com polímeros S-camada suspensas e não pode ser facilmente transferido para reticulados S-layer recristalizados em superfícies, e por conseguinte, mostram a limitação de ICP-MS. Por exemplo, nenhuma relação directa de polímeros de proteína isolada pode ser feita para as estruturas S-camadas em células de bactérias vitais. Além disso, as medições por ICP-MS não permitem a determinação da cinética de sorção de metal. Portanto, é necessário encontrar métodos mais apropriada para o estudo da ligação por filmes finos de metal Proteína A imobilizada.

No presente estudo, as análises QCM-D foram aplicadas para detectar a formação in situ de reticulados S-camada em superfícies, bem como a deposição de Au sobre as proteínas. Portanto, QCM-D é um método robusto e reprodutível para o reconhecimento de processos de adsorção e de interacção da molécula. Além disso QCM-D é uma relativamente simples, custo-benefício, e não perigosos método para monitorar such processa online. O método tem a vantagem de detectar a mudança de massa com uma sensibilidade massa máxima em líquidos de ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Isso permite a possibilidade de detectar até mesmo interação fraca, por exemplo, da proteína com metais dissolvidos ou para medir adsorção em faixas de baixa concentração. A desvantagem da QCM-D é que este não é um método de imagiologia estrutura que permite a visualização de, por exemplo, reticulados proteína. Por conseguinte, são necessárias outras técnicas.

As análises de QCM-D neste estudo foram seguidos por AFM imagiologia. A combinação destes métodos permitiu o estudo da cinética de sorção e consequências de Au de sorção para o revestimento, provando assim que eles são ferramentas versáteis para investigar a interacção de metal de filmes finos proteináceos. Além disso, foi demonstrado que uma recristalização fiável das proteínas S-camada em suportes técnicas é essencial para estudos de interacção proteína subsequentes. Láfore, modificações das superfícies usando promotores de adesão são de interesse. A aplicação descrita de polielectrólitos (que termina com PES carregados positivamente) como camada intermédia entre as superfícies de SiO 2 e camada de ligação de proteína a um método melhorado para um revestimento de proteína rápido. O efeito positivo de uma camada carregar positivamente polielectrólito foi descrito anteriormente para, por exemplo, a imobilização de células de bactérias L. vitais sphaericus JG-B53 31. A implementação das PE-camadas apresentados são o passo mais importante e crítico para a recristalização bem sucedido e reprodutível depois de proteínas S-layer.

Pode ser demonstrado que, para a investigação de camadas finas de Slp1, QCM-D é um bom método para mostrar a respectiva massa de adsorção para a recristalização proteína como filmes monocamada em tempo real. Este também pode ser observada anteriormente para a remontagem da proteína S-SBPA camada de L. sphaericus </ em> CCM2177 47. Através da utilização subsequente de alta resolução AFM analisa alterações da estrutura reticular da proteína auto-agrupamentos pode ser visualizado. Medições AFM revelou a simetria p4 de Slp1 e confirmar a espessura da camada modelada de Slp1 de cerca de 10 nm. Além disso, a interacção directa de iões metálicos dissolvidos, com a camada de proteína poderia ser monitorada por QCM-D provando boa ligação de Au (III) por a camada de proteína subjacente. A provável formação do menor Au (0) -NPs de solução Au (III) dentro poros proteínas causadas por propriedades redutoras intrínsecas da estrutura Slp1 dentro medições QCM-D poderia não foram detectados por medições AFM subseqüentes. Isto pode estar relacionado com o limite de resolução da AFM e a montagem experimental deste estudo. Isso mostra a limitação dessa técnica ea necessidade de imagens de alta resolução para biomoléculas na escala sub nanômetros. No entanto, uma elevada estabilidade da camada Slp1 recristalizado poderia ser deduzida a partir the obtido QCM-resultados e foi confirmado pela investigação AFM.

Em conclusão, pode-se mostrar que polímeros Slp1 têm capacidades de ligação de alta de metal para o ouro dentro da gama de pH investigada. Além disso, o inquérito revela que a estrutura Slp1 é obrigatório um íon metálico boa matriz e para a imobilização de nanopartículas metálicas. Pode ser demonstrado que cada método usado neste artigo tem a possibilidade de detectar até mesmo pequenas interações metal, ou em caso de AFM pode visualizar estruturas na escala nanométrica. Embora, é apenas pela combinação desses métodos mostrados, que tem permitido melhorar o conhecimento ea compreensão das proteínas estudadas em um nível molecular.

Principalmente, QCM-D e AFM são os métodos preferenciais de escolha para investigação futura de monocamada de proteína adsorção e sua interação com metais e moléculas funcionais. Ao combinar estes dois métodos, a detecção de anúncio proteína S-layerprocessos de sorção e de imagem em superfície proporciona um insight sobre processos moleculares que podem ser capazes de ser transferidos para aprimorar o conhecimento de bactérias que vivem e interação com o ambiente. Este estudo mostrou um trecho de métodos possíveis votos para a proteína compreensão e interação metal. Outras técnicas de votos que poderiam melhorar o conhecimento de tais processos em detalhes que variam de diversas espectrométricas e cromatográficos métodos para espectroscópicas investigação de biomoléculas e deve ser incluída em estudos futuros.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O presente trabalho foi parcialmente financiado pelo IGF-projeto "S-Peneira" (490 ZBG / 1) financiado pela BMWi eo BMBF-projeto "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Um agradecimento especial a Tobias J. Günther pelo valioso auxílio durante os estudos de AFM e para Erik V. Johnstone para ler o manuscrito como um falante nativo Inglês. Além disso, o autor deste papel gostaria de agradecer Aline Ritter e Sabrina Gurlit (do Instituto de Ecologia de Recursos para assistência em medições por ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava e da biotecnologia grupo do Instituto Helmholtz- Freiberg para a Tecnologia de Recursos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

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Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-
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