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Chemistry

Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

A causa della crescente uso di oro per diverse applicazioni come l'elettronica, catalizzatori, biosensori o strumenti medici, la domanda di questo metallo prezioso è cresciuta nel tempo degli ultimi anni 6-9. L'oro così come molti altri metalli preziosi e pesanti vengono rilasciati nell'ambiente tramite scarichi industriali in concentrazioni diluite, attraverso attività minerarie, e lo smaltimento dei rifiuti 7,8,10, anche se la maggior contaminazione ambientale da metalli pesanti o preziosi è un processo in corso principalmente causato da attività tecnologiche. Questo porta ad una interferenza significativa di ecosistemi naturali e potrebbe minacciare la salute umana 9. La conoscenza di questi risultati negativi promuove la ricerca di nuove tecniche per rimuovere i metalli da ecosistemi e miglioramenti contaminati nel riciclaggio dei metalli dalle acque di scarico industriali. Metodi fisico-chimici ben affermati come precipitazione o scambio ionico non sono così efficaci, specialmente in altaly diluito soluzioni 7,8,11. Bioassorbimento, sia con la vita o la biomassa morti, è un'alternativa interessante per trattamento delle acque reflue 10,12. L'uso di tali materiali biologici può ridurre il consumo di prodotti chimici tossici. Molti microrganismi sono stati descritti per la costituzione o immobilizzare metalli. Per esempio, le cellule di Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 hanno dimostrato elevate capacità di legame per i metalli preziosi, per esempio, Pd (II), Pt (II), Au (III), e altri metalli tossici come Pb (II) o U (VI) 4,13, cellule di Bacillus megaterium per Cr (VI) 14, le cellule di Saccharomyces cerevisiae per Pt (II) e Pd (II) 15, e Chlorella volgare Au (III) e U (VI) 16 , 17. Il legame di metalli precedenti, come Au (III), Pd (II), e Pt (II) è stato riportato anche per Desulfovibrio desulfuricans 18 e per L. sphaericus JG-B53 19,20. Tuttavia, non all microbi legano elevate quantità di metalli e la loro applicazione come materiale sorbitive è limitato 12,21. Inoltre, la capacità di legame del metallo dipende da diversi parametri, ad esempio, la composizione delle cellule, il bio-componente utilizzato, o ambientali e condizioni sperimentali (pH, forza ionica, temperatura etc.). Lo studio di frammenti di parete cellulare isolati 22,23, come lipidi di membrana, peptidoglicano, proteine ​​o altri componenti, aiuta a comprendere il processo di complessi costruiti cellule intere 8,21 vincolante metallo.

I componenti cellulari focalizzati su in questo studio sono proteine ​​S-layer. Proteine ​​S-strato sono parti della busta esterna delle cellule di molti batteri e di archeobatteri, e costituiscono circa il 15 - 20% della massa di proteine ​​totali di questi organismi. Come la prima interfaccia per l'ambiente, questi composti cellulari influenzano fortemente le proprietà di assorbimento batteriche 3. Proteine ​​S-strato con peso molecolare compreso tra quarantaa centinaia di kDa sono prodotti all'interno della cellula, ma sono montati all'esterno dove sono in grado di formare strati sulle membrane lipidiche o componenti della parete cellulare polimerici. Una volta isolato, quasi tutti S-layer proteine ​​hanno la proprietà intrinseca di auto-assemblarsi spontaneamente in sospensione, alle interfacce, o su superfici che formano strutture planari o tube-like 3. Lo spessore del monostrato proteine ​​dipende batteri ed è in un intervallo di 5 - 25 nm 24. In generale, le strutture proteiche S-strato formato può avere un obliquo (P1 o P2), quadrato (P4), o esagonale (p3 o p6) simmetria con costanti reticolari 2,5 a 35 nm 3,24. La formazione reticolare sembra essere in molti casi dipendono cationi bivalenti e principalmente su Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)). Tuttavia, la cascata reazione piena di monomero piegatura, interazione monomero-monomero, la formazione di un reticolo, e il ruolo dei diversi metalli, in particolare di cationi bivalenti come Ca 2+ e Mg 2+, non sono ancora del tutto chiaro.

Il ceppo gram-positivi L. sphaericus JG-B53 (rinominato da Bacillus sphaericus dopo nuova classificazione filogenetica) 27 è stato isolato dalla miniera di uranio rifiuti mucchio "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sassonia, Germania) 4,28,29. La sua funzionale proteina S-layer (SLP1) possiede un reticolo quadrato, un peso molecolare di 116 kDa 30, e uno spessore di ≈ 10 nm a vivere cellule batteriche 31. In studi precedenti, la formazione in vitro di uno strato proteico chiuso e stabile con uno spessore di circa 10 nm è stato raggiunto in meno di 10 min 19. Il ceppo correlate L. sphaericus JG-A12, anche un isolato dal mucchio "Haberland", possiede alta metallo capacità di legame e il suo isolato proteina S-layer ha mostrato un buon tasso di assorbimento chimica e stabilità meccanica e per i metalli preziosi come Au (III), Pt (II), e Pd (II) 4,32,33. Questo legame di metalli preziosi è più o meno specifici per alcuni metalli e dipende dalla disponibilità di gruppi funzionali sulla superficie esterna della proteina e interna del polimero e nei suoi pori, forza ionica, e il valore del pH. Gruppi funzionali rilevanti per l'interazione metallo da parte delle proteine ​​sono COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - e SO-. In linea di principio, capacità di legame metallo aprono un ampio spettro di applicazioni, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)). ad esempio, come componenti biosorptive per la rimozione o recuperodi metalli tossici o pregiati disciolti, i modelli per sintesi o la deposizione di nanoparticelle definito regolarmente strutturati metalliche (NP) per la catalisi, e altri materiali bio-ingegneria, come bio-sensoriali strati 3,5,18,33. Array NP regolarmente organizzati come Au (0) -NPs potrebbero essere utilizzati per le principali applicazioni che spaziano dall'elettronica molecolare e biosensori, dispositivi di storage ad altissima densità, e catalizzatori per CO-ossidazione 34-37. Lo sviluppo di tali applicazioni e design intelligente di questi materiali richiede una comprensione più profonda dei meccanismi vincolanti metallo sottostante.

Un prerequisito per lo sviluppo di tali materiali bio-based è l'implementazione affidabile di un livello di interfaccia tra la biomolecola e la superficie tecnica 38,39. Ad esempio, polielettroliti assemblati con il layer-by-layer (LBL) 40,41 tecnica sono stati utilizzati come strato di interfaccia per ricristallizzazione proteine ​​S-strato 39 19,42, Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)). Tuttavia, il complesso meccanismo di adsorbimento di proteine ​​e interazione proteina-superficie non è completamente noto. Soprattutto informazioni sulla conformazione, l'orientamento del modello, e la densità di rivestimento è ancora mancante.

Cristallo di quarzo microbilancia con il monitoraggio di dissipazione (QCM-D) la tecnica ha attirato l'attenzione negli ultimi anni come uno strumento per lo studio delle proteine, la cinetica di rivestimento, e l'interazione proprocessi su scala nanometrica 19,43-45. Questa tecnica permette di rilevare dettagliata di adsorbimento di massa in tempo reale, e può essere utilizzato come indicatore per il processo di auto-assemblaggio di proteine ​​e di accoppiamento molecole funzionali su reticoli proteine ​​19,20,42,46-48. Inoltre, le misure QCM-D aperta la possibilità di studiare processi di interazione del metallo con lo strato proteico in condizioni biologiche naturali. In un recente studio, l'interazione della proteina S-strato con metalli scelti come Eu (III), Au (III), Pd (II) e Pt (II) è stato studiato con QCM-D 19,20. Lo strato proteina adsorbita può servire come un modello semplificato di una parete cellulare di batteri gram-positivi. Lo studio di questo singolo componente può contribuire a una più profonda comprensione delle interazioni metallo. Tuttavia, esclusivamente QCM-D esperimenti non consentono dichiarazioni riguardanti strutture superficiali e le influenze dei metalli alle proteine. Altre tecniche sono necessarie per ottenere tali informazioni. Una posbilità per immagini bio-nanostrutture e informazioni sulle proprietà strutturali ottenere è la microscopia a forza atomica (AFM).

L'obiettivo dello studio presentato era studiare l'assorbimento di oro (Au (III) e Au (0) -NPs) alle proteine ​​S-strato, in particolare SLP1 di L. sphaericus JG-B53. Gli esperimenti sono stati fatti con proteine ​​sospesi su scala batch in un intervallo di pH di 2,0 - 5,0 mediante ICP-MS e con immobilizzati S livelli utilizzando QCM-D. Inoltre, l'influenza della soluzione di sale di metallo sulla stabilità lattice è stata studiata con successivi studi AFM. La combinazione di queste tecniche contribuisce a una migliore comprensione dei processi di interazione in vitro in metallo come strumento per saperne di più su eventi in cellule batteriche intere riguardanti affinità metalliche specifiche vincolanti. Questa conoscenza non è solo cruciale per lo sviluppo di materiali filtranti applicabili per il recupero di metalli per la tutela dell'ambiente e la conservazione del reFonti 49, ma anche per lo sviluppo di array di NP metalliche altamente ordinati per varie applicazioni tecniche.

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Protocol

1. di microrganismi e di coltivazione Condizioni

Nota:. Tutti gli esperimenti sono stati fatti in condizioni di sterilità L. sphaericus JG-B53 è stato ottenuto da una cultura crio-conservati 29,30.

  1. La cultura (1,5 ml) sotto il banco pulito trasferimento crio-conservati per 300 ml di brodo nutriente sterile (NB) media (3 g / L di estratto di carne, 5 g / l di peptone, 10 g / L di NaCl). Successivamente agitare la soluzione per almeno 6 ore a 30 ° C per ottenere la pre-coltura per la coltivazione.
  2. Coltivare i batteri in condizioni aerobiche in NB mezzi a pH = 7,0, 30 ° C in 70 L scalata a vapore in-place bioreattore. Pertanto, riempire il reattore con ≈ 57 l di acqua deionizzata. Aggiungere e sciogliere i media NB solido direttamente a bioreattore (concentrazioni vedi sopra).
    1. Inoltre aggiungere agente antischiuma (30 ml / L NB-media) per i media a sopprimere la formazione di schiuma durante la coltivazione, poi in autoclave (122 ° C, temperatura di mantenimento di 30 min) i mediaall'interno della struttura del reattore.
  3. Raffreddare i mezzi di comunicazione ed eseguire completa saturazione di ossigeno. Aggiustare il pH a 7,0 (1 utilizzando MH 2 SO 4 e 2 M NaOH) e avviare l'inoculazione automatica del 300 ml precoltura. Avviare la registrazione dei dati dei parametri di coltivazione nel punto di inoculazione. Log parametri online per esempio, il livello di ossigeno disciolto (DO 2), aggiunta di acido e di base, e del valore pH all'interno della coltivazione.
    1. Monitorare la crescita batterica in linea dalle misure di torbidità non invasive.
  4. Eseguire campionamento supplementare dopo ogni ora di coltivazione e determinare ulteriore parametro come il peso bio secco (BDW) e la densità ottica offline (OD). Pertanto, raccogliere 20 ml di brodo coltura in ciascun punto di campionamento in condizioni sterili.
    1. Determinare offline OD da misurazioni fotometriche di adsorbimento a 600 nm. Utilizzare sterile filtrata NB-mezzo come un valore vuoto. A poppaer raggiungendo adsorbimento> 0,4 ​​diluire la sospensione cellulare segue la linearità della legge di Lambert-Beer.
    2. Per la determinazione del BDW centrifuga 1 a 5 ml di sospensione batterica (seconda densità delle cellule) a 5.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Essiccare il pellet cellulare ottenuta a 105 ° C in un forno di riscaldamento fino alla stabilità di massa e misurare la massa pellet.
  5. Prendere immagini microscopiche con ottica di fase microscopio di ricerca contrasto 400 e 1000 ingrandimenti volte (contrasto di fase condensatore 2 e 3, rispettivamente) per il controllo della crescita batterica e come controllo contaminazione incrociata.
  6. Dopo aver raggiunto la fase di crescita esponenziale rilevata dalla linea dO 2 e torbidità online, raccogliere la biomassa mediante centrifugazione flow-through a 15.000 xg, a 4 ° C e lavare la biomassa due volte con tampone standard (50 mM Tris, 10 mM MgCl 2, 3 mM NaN 3, pH = 7,5).
    Nota: Il pellet biomassa ottenuta può essere conservato a -18 & #176; C sino al successivo utilizzo per l'isolamento.

2. S-layer Protein isolamento e purificazione

Nota: Purificare polimeri SLP1 secondo un metodo adatto come descritto in precedenza 2,19,30,32,50,51.

  1. Omogeneizzare la biomassa grezzo lavato e scongelato ottenuto dalla coltivazione in tampone standard (1: 1 (w / v)) per rimuovere flagelli usando un dispersore (livello 3, 10 min) sotto raffreddamento bagno di ghiaccio a 4 ° C.
  2. Centrifugare la sospensione (8.000 xg, a 4 ° C per 20 min) e lavare il pellet ottenuto due volte con tampone standard (1: 1 (w / v)). Dopo il lavaggio e la centrifugazione (8000 xg, a 4 ° C per 20 min), risospendere il pellet nel tampone standard (1: 1 (w / v)), aggiungere DNasi II e RNasi (0,4 unità / g biomassa) alla sospensione e disintegrano le cellule a 1.000 bar con un omogeneizzatore ad alta pressione. Successivamente centrifugare la sospensione a 27.500 xg, a 4 ° C per 1 ora.
    Nota: sospensione cellulare di controllo con i mi di ricercacroscope. Rottura è completato quando meno di 2 - 3 cellule intatte sono visibili nel campo Vista del microscopio in 400 ingrandimenti piega.
  3. Lavare due volte il pellet con tampone standard (1: 1 (w / v)) e ripetere la centrifugazione. Successivamente risospendere il pellet nel tampone standard (2: 1 (w / v)) mescolato con 1% Triton X-100 e incubare per 20 min sotto successive scuotimento (100 rpm) per solubilizzare depositi lipidici.
  4. Centrifugare la soluzione (27.500 xg, a 4 ° C per 1 ora) e lavare i pellet ottenuti tre volte con tampone standard (1: 1 (w / v)).
  5. Incubare il pellet ottenuto dopo centrifugazione supplementare (27.500 xg, a 4 ° C per 1 ora) per 6 ore in tampone standard (1: 1 (w / v)) miscelato con 0,2 g / L lisozima, per idrolizzare legami di peptidoglicano 50. Inoltre aggiungere DNasi II e RNasi (ogni 0,4 unità / g biomassa) alla sospensione.
  6. Dopo centrifugazione (45.500 xg, a 4 ° C, 1 ora), risospendere il fase proteica bianco superiore con un basso volume di tlui centrifugazione surnatante (<30 ml) contenenti subunità proteiche.
  7. Solubilizzare la sospensione bianca mescolando 1: 1 con 6 M guanidina cloridrato (6 M GuHCl, 50 mM Tris, pH = 7,2). La soluzione diventa luminoso.
  8. Eseguire filtrazione sterile (0,2 micron) della soluzione trattata GuHCl seguita da una centrifugazione ad alta velocità supplementare (45.500 xg, a 4 ° C per 1 ora).
  9. Trasferire il surnatante in provette di membrana di dialisi (MWCO 50.000 Dalton) e dializzato contro tampone ricristallizzazione (TRIS 1,5 mm, 10 mM CaCl 2, pH = 8.0) per 48 ore.
  10. Trasferire la soluzione di bianco polimero proteico ricristallizzato in provette e centrifugare a 45.500 xg, 4 ° C per 1 ora. Risospendere il pellet in un basso volume di acqua ultrapura (<30 ml).
  11. Successivamente, trasferire la sospensione in tubi di membrana di dialisi e di eseguire una dialisi contro acqua ultrapura per 24 ore per rimuovere i contenuti del buffer.
    Nota: Diversi cambiamenti di tampone o acqua ultrapura durante la dialisi sono indispensabili.
  12. Lyophilize il SLP1 purificato in un liofilizzatore.

3. Caratterizzazione e quantificazione di SLP1 per gli esperimenti

Nota: la concentrazione SLP1 per assorbimento e rivestimento esperimenti sono stati quantificati mediante spettrofotometria UV-VIS.

  1. Pipettare 2 ml di campione SLP1 disciolto direttamente sul piedistallo di misura inferiore del fotometro. Determinare la concentrazione di proteine ​​di adsorbimento massima alla lunghezza d'onda di 280 nm, caratteristico per le proteine. Utilizzare il coefficiente di estinzione di 0.61 per determinare la concentrazione SLP1. Utilizzare soluzione gratuita SLP1 per misurazioni di riferimento.
  2. Diluire la proteina con il tampone (per esperimenti di adsorbimento in modalità batch utilizzano 0,9% NaCl, pH = 6,0 e per esperimenti QCM-D utilizzano buffer di ricristallizzazione, pH = 8,0) alla concentrazione desiderata per esperimenti (1 g / L e 0,2 g / L rispettivamente).
  3. Analizzare la qualità SLP1 e peso molecolare dal bioanal normaelettroforesi ytical metodo di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) descritta da Laemmli, Regno Unito 52.
    1. Eseguire SDS-PAGE prima di utilizzare SLP1 entro esperimenti e ad esempio, dopo Au (0) -NP incubazione utilizzando 10% gel di separazione poliacrilammide.
    2. Per SDS-campioni mix ≈10 ml di campione coltivazione o di proteine ​​con il tampone (1.97 g TRIS, 5 mg di bromofenolo blu, 5,8 ml di glicerina, 1 g di SDS, 2,5 ml di β-mercaptoetanolo, si riempiono di acqua ultrapura a 50 ml) in un rapporto di 1: 1 (v / v) e pipetta la miscela dopo 4 min di incubazione a 95 ° C nelle tasche gel.
    3. Run SDS-PAGE 30 min ad una tensione di 60 V finché i campioni passano la raccolta gel e variazione di tensione di 120 V, una volta superato il gel di separazione.
    4. Rimuovere il gel dal sistema di gel, sciacquare con acqua ultrapura e luogo per 1 ora in una soluzione di fissaggio (acido acido 10%, il 50% di etanolo assoluto). In seguito, lavare il gel con acqua ultrapura.
    5. Gel Stainutilizzando un colloidale non specifica adapted Coomassie brillante metodo blu 53,54. Dopo la decolorazione 72,73, scattare immagini SDS-PAGE da parte del sistema di documentazione gel secondo il protocollo del produttore.

4. Gli esperimenti di adsorbimento in batch mode e quantificazione metallo

  1. Per lotto esperimenti di assorbimento preparano Au (III) soluzione madre da HAuCl4 ∙ 3 H 2 O, diluire il sale metallico e mescolare con la soluzione SLP1 / NaCl ad una concentrazione di metallo iniziale di 1 mm e concentrazione finale SLP1 di 1 g / l . Effettuare esperimenti in terzine con un controllo negativo supplementare senza SLP1. Utilizzare un volume totale di 5 ml per esperimenti di assorbimento.
  2. Agitare la sospensione continuamente a RT a diversi valori di pH preregolate tra 2,0-5,0 per 24 ore (regolare il pH con una soluzione di HCl e NaOH bassa concentrazione).
  3. Dopo assorbimento, centrifugare i campioni a 15.000 xg, 4 ° C per 20 min) a Separmangiato SLP1 da surnatante.
  4. Trasferire il surnatante in provette di ultrafiltrazione (MWCO 50.000 Da) e centrifugare a 15.000 xg questo, 4 ° C per 20 minuti per rimuovere i monomeri disciolti proteine.
  5. Determinare la concentrazione di metalli nel filtrato risultante da ICP-MS 19,20 e utilizzare i risultati per il back-calcolo sorbito metallo dalla massa secca SLP1. Misurare i principi, le opportunità del metodo e dei componenti dei macchinari usati per ICP-MS sono stati descritti in letteratura 55.
    1. Preparare i campioni e riferimenti per le misure ICP-MS con 1% HNO 3 come matrice e rodio come standard interno (1 mg / ml).

5. Sintesi di Au-NP e Determinazione della dimensione delle particelle

Nota: citrato stabilizzato Au (0) -NP sono stati sintetizzati secondo un metodo descritto in precedenza adattato da Mühlpfordt, H. et al. (1982) per ottenere particelle sferiche con un diametro di 10 - 15 nm 56,57

  1. Preparare una stabilizzato 25 HAuCl mm 4 ∙ 3 H 2 O stock per la formazione NP.
  2. Diluire 250 ml di questa soluzione in 19,75 ml di acqua ultrapura e incubare questi a 61 ° C per 15 minuti sotto i successivi agitazione.
  3. Preparare 5 ml di una seconda soluzione madre (12 mm di acido tannico, di 7 mm di citrato di sodio-idrato, 0.05 K mM 2 3 CO) e incubare la soluzione 2 ° separatamente a 61 ° C per 15 minuti.
  4. Aggiungere sotto costante agitazione la soluzione di riserva 2 al soluzione one. Mescolare la miscela di reazione per almeno 10 min a 61 ° C. Successivamente raffreddare la soluzione ed utilizzarla per il rivestimento NP su SLP1 reticolo all'interno QCM-D esperimenti.
    Nota: Il Au risultante (0) -NP stati caratterizzati mediante spettroscopia UV-VIS al massimo assorbimento di 520 nm, tipicamente utilizzati per la rilevazione di formato Au (0) -NPs 58. La soluzione può essere conservato a 4 ° C.
  5. Analizzare le dimensioni del formatoAu (0) -NP mediante spettroscopia di correlazione fotonica (PCS) che è anche conosciuto come dispersione dinamica della luce.
    1. Per la determinazione delle dimensioni NP, trasferire 1,5 ml di Au sintetizzato (0) -NP soluzione nella cuvette in condizioni privo di polvere in una scatola flusso laminare e analizzare con una dimensione e potenziale zeta sizer particella. Una descrizione dettagliata di PCS e preparazione del campione è dato in Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 e Jain, R. et al. (2015) 60.

6. QCM-D Esperimenti - SLP1 rivestimento sulle superfici e Au-NP adsorbimento su SLP1 Lattice

Nota: Le misurazioni sono state effettuate con una QCM-D dotato di un massimo di quattro moduli di flusso. Tutti gli esperimenti QCM-D sono stati eseguiti con una portata costante di 125 microlitri / min a 25 ° C. Rivestimento SLP1 e metallo / NP incubazione sono stati fatti su SiO 2 sensori piezoelettrici di quarzo AT-cut (Ø 14 mm) con una frequenza fondamentale di ≈ 5 MHz. Risciacquo passi e aggiungereition di soluzione sono contrassegnati nelle figure dei risultati parte rappresentativa. Gli esperimenti QCM-D potrebbe essere descritto come un passo per passo modo che inizia con la pulizia e la modificazione superficiale dei sensori utilizzati seguita da ricristallizzazione SLP1 e successivamente sull'interazione NP metallo e metallo.

  1. Procedure di pulizia:
    1. Dotare le cellule del liquido con manichini del sensore. Pompa almeno 20 ml (ciascuno per modulo) di un agente detergente liquido alcalino (2% detergente in acqua ultrapura (v / v)) attraverso il sistema QCM-D e tubo. Successivamente pompare il volume di cinque volte (ciascuna per modulo) di acqua ultrapura attraverso il sistema (portata fino a 300 ml / min). Eseguire la pulizia secondo il protocollo del produttore.
    2. Pulire i SiO 2 sensori di fuori dei moduli di flusso mediante incubazione (almeno 20 min) a 2% soluzione di SDS e sciacquare i sensori in seguito più volte con acqua ultrapura 61,62.
    3. Asciugare i cristalli con comp filtrataressed aria e metterli in una camera di pulizia di ozono per 20 min 63,64.
    4. Ripetere la procedura di pulizia due volte per rimuovere tutti i contenuti organici.
    5. Per rimuovere i metalli legati dalla superficie del sensore sciacquare i sensori con 1 M HNO 3. Successivamente, eseguire tutte le operazioni di risciacquo con acqua ultrapura.
  2. Sensore modifica della superficie per polielettroliti:
    Nota: modifica di superficie può essere effettuato sia all'interno (fluire attraverso procedura) o all'esterno del modulo di flusso (tecnica LBL). All'interno di questi esperimenti è stata utilizzata la seguente modo per modificare le superfici.
    1. Modificare i sensori con 3 g / L di strati alternati di PE di polietilenimminico (PEI, MW 25.000) e polistirene sulfonato (PSS, MW 70.000) tramite dip coating utilizzando LBL tecnica 40,41 descritto in precedenza per il sistema utilizzato speciale nell'articolo di Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Posizionare i sensori all'interno del PE-soluzione appropriata in profonda well piastre e incubare questi per 10 minuti a RT.
    3. Prendete i sensori di PE-soluzione e sciacquare i sensori tra ogni tuffo rivestimento passo intensamente con acqua ultrapura.
      Nota: La nuova modifica superficie è costituita da almeno tre strati PE terminante con carica positiva PEI.
    4. Dopo questa modifica esterna posizionare i sensori all'interno del modulo di flusso ed equilibrare i sensori risciacquando con acqua ultrapura prima di iniziare gli esperimenti.
  3. SLP1 monostrato Ricristallizzazione:
    1. Sciogliere SLP1 a 4 M di urea per convertire i polimeri in monomeri.
    2. Centrifugare le proteine ​​a 15.000 xg monomerized, 4 ° C per 1 ora per rimuovere agglomerati di proteine ​​più grandi.
    3. Mescolare il surnatante SLP1 solubilizzato e centrifugato con tampone ricristallizzazione ad una concentrazione proteica finale di 0,2 g / L.
      Nota: Il calcio seconda ricristallizzazione SLP1 (auto-assemblaggio) inizia con l'aggiunta del recBuffer rystallization. Pertanto, la soluzione mista pompa con una portata di 125 ml / min per i sensori (posto all'interno moduli di flusso) immediatamente. La ricristallizzazione avviene dopo che i valori stabili di frequenza e di dissipazione turni sono stati individuati all'interno QCM-D esperimenti.
    4. Dopo successo ricristallizzazione proteina sulla cima dei sensori PE-modificato all'interno dei moduli di flusso sciacquare i sensori rivestiti con tampone ricristallizzazione o ultrapura waterintensively con una portata di 125 ml / minuto fino a valori stabili di spostamenti di frequenza e di dissipazione sono stati rilevati.
      Nota: La modifica SiO 2 superficie con PE per esperimenti di assorbimento successive Onto SLP1 monostrato e AFM studi viene visualizzato nella figura 1.

Figura 1
Figura 1. Schema di disegno di PE modifica della superficie e SLP1 monostratoPaint; Questa cifra è stata modificata da Suhr, M. et al. (2015) 19 con il permesso di Springer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Metallo e metallo NP Interazione:
    Nota: L'assorbimento con soluzione di sale di metallo Au (HAuCl4 ∙ 3 H 2 O) è stata effettuata in concentrazione 1 mM o 5 mM a pH = 6.0 in soluzioni di NaCl 0,9%. Au-NP assorbimento è stato fatto con puro Au-NP in 1,6 mm di buffer tri-sodio-citrato a pH ≈ 5.0.
    1. Dopo il rivestimento SLP1 successo nei moduli di flusso, sciacquare lo strato SLP1 ottenuto intensamente con 0,9% NaCl finché sono stati rilevati valori stabili di spostamenti di frequenza e di dissipazione.
    2. Pompa la soluzione preparata in metallo (1 mM) e la soluzione NP ai moduli di flusso con una portata di 125 ml / min e monitorare l'adsorbimento di massa alla Sllivello p1. Adsorbimento di massa può essere rilevato direttamente tracciando i turni di frequenza che si riferiscono alla equazione Sauerbrey (equazione 1).
    3. Dopo aver completato l'interazione metallo e NP metallo, lavare lo strato di metallo / NP buffer libero per rimuovere deboli metalli o nanoparticelle collegate rilegati o deboli.
      Nota: Un'illustrazione del setup sperimentale è mostrato in Figura 2.

Figura 2
Figura 2. Schema di disegno di Setup QCM-D utilizzando il modulo di flusso QFM 401 * 66. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Registrazione dei dati e valutazione:
    1. Registrare i cambiamenti di frequenza in Hz (Af n) e la dissipazione (ΔD n) Entro gli esperimenti QCM-D utilizzando QCM-D software specifico.
    2. Utilizzare per la valutazione della sensibilità di massa adsorbita (Δm) l'equazione / modello di Sauerbrey (Equazione 1) 65 66 valido per film sottili e rigidi accoppiati senza attrito sulla superficie del sensore applicato al n ° armonico. Il termine C (costante Sauerbrey) per l'usato 5 MHz a sensore di quarzo taglio è del 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. Per rigida, distribuiti in modo uniforme, e gli strati adsorbiti sufficientemente sottili utilizzano Equazione 1 come una buona approssimazione.
      Equazione 1
    3. Eseguire ulteriore modellazione secondo il modello di Kelvin-Voigt valido per molecole viscoelastici 68-71 con il software specifico produttore e confrontare i risultati con quella del modello Sauerbrey.
    4. Per il calcolo dello spessore dello strato e l'uso di adsorbimento di massaimportante parametro modellazione una densità strato dello strato adsorbito di 1,35 g ∙ cm -3 corrispondente ai valori descritti in precedenza per le proteine ​​S-strato 72-75. Utilizzare lo stesso valore per il calcolo di interazione metallo con lo strato proteinico.

7. Misure AFM

  1. Effettuare studi con pienamente in grado AFM su un microscopio ottico invertito.
    1. Registra immagini AFM in liquido usando il tampone ricristallizzazione o acqua ultrapura direttamente sui sensori QCM-D rivestiti.
    2. Sciacquare i sensori con acqua ultrapura dopo gli esperimenti QCM-D e metterli all'interno della cellula fluido AFM. Pertanto, utilizzare una cella chiusa di fluido con un volume totale di circa 1,5 ml. Mantenere la temperatura del fluido costante di cella a 30 ° C.
    3. Utilizzare un cantilever con una frequenza di risonanza di ≈ 25 kHz in acqua e una rigidità di <0,1 N / m. Regolare la velocità di scansione tra 2,5 e 10 micron / sec.
      4. 76.
      Nota: Le immagini vengono visualizzate con altezza z scala mentre valori z rappresentano la topografia esatta della superficie. Amplitude immagini (pseudo 3D) sono indicati senza z scala perché z valori di ampiezza dipendono i parametri di scansione e portano informazioni limitate. L'analisi delle immagini è stata effettuata utilizzando tre software di valutazione diverso di 77.

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Representative Results

Coltivazione di microrganismi e SLP1 Caratterizzazione

I dati registrati di crescita batterica indica la fine della fase di crescita esponenziale a circa 5 ore. Studi precedenti hanno dimostrato che SLP1 può essere isolato da questo punto di raccolta (4,36 g / L biomassa umida (≈ 1,45 g / L (BDW)) con una resa massima 19. Tuttavia, l'ottimizzazione della coltivazione utilizzando componenti o supporto definiti federalismo strategie di coltivazione lotto comporterebbero rese di biomassa superiori. Questo è irrinunciabile per l'uso di alte quantità di biomassa per applicazioni industriali. I valori della linea e parametri colturali offline registrati sono riassunti nella Figura 3A. controllo microscopica (Figura 3B) al momento di raccolta mostrano cellule non sporigeni di L. sphaericus JG-B53.


Figura 3: (A) online e offline misurato i parametri di coltivazione di L. sphaericus JG-B53 e (B) immagine microscopica di batteri vitali cellule di L. sphaericus JG-B53, al momento della raccolta in 400 ingrandimenti volte; Questa cifra è stata modificata da Suhr, M. et al. (2014) 19 con il permesso di Springer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Inoltre, un profilo proteico SDS-PAGE inoltre realizzato (Figura 4A) indica la quantità massima di SLP1 al momento di 5 ore di coltivazione. La band proteina corrispondente al SLP1 (≈ 150 kDa) è più spesso, ma da qui in una perdita di intensità è stata osservata Prelibicato da un aumento di proteine ​​con peso molecolare inferiore a causa di possibili frammentazione della proteina o segregazione di altre proteine. Le bande di proteine ​​isolati e purificati ottenuti con il metodo di cui sopra (Figura 4B) corrisponde ad un peso molecolare di circa 150 kDa, che è più pesante del peso calcolato sulla base dei dati di sequenziamento SLP1 (116 kDa) 30. Ciò è probabilmente dovuto a modifiche post-traduzionali. Altri motivi per la mancata corrispondenza tra massa molecolare teorica e la massa molecolare osservata in gel SDS sono eventualmente caricano artefatti dipendenti nel gel SDS 30.

Figura 4
Figura 4. Profili proteina prodotta mediante SDS-PAGE di (A) disintegrati cellule di batteri ottenuti da campioni di coltivazione e (B) purificato SLP1 dopo l'isolamento di successo; Questo figura è stato modificato da Suhr, M. et al. (2014) 19 con il permesso di Springer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Esperimenti Batch-assorbimento e la determinazione di ragazza con ICP-MS

Le capacità massima metallici vincolanti (q max) di Au (III) di sospensione SLP1 sono mostrati in Figura 5. I risultati mostrano che Au (III) è stato stabilmente vincolata da SLP1 durante l'incubazione 24 hr nell'intervallo pH investigato. I risultati indicano q max nell'intervallo di circa 80 - 100 mg Au (III) / g SLP1. I valori di riepilogo (Tabella 1) sono stati confrontati con la capacità di assorbimento di circa 75 mg di Au (III) / g SLP1 registrati precedentemente da Suhr, M. et al. (2014) ottenuti da esperimenti con l'auto-regolazionevalori di pH per aggiunta della soluzione di sale di metallo (pH ≈ 4,3) 19. In sintesi, SLP1 ha dimostrato la capacità di legare elevate quantità di inizialmente aggiunto Au (III) dimostrando le sue elevate capacità di legame per questo elemento.

Figura 5
Figura 5. Schema di massima del metallo Binding Capacità (q max) di Au (III) per polimeri SLP1 entro esperimenti pH regolato rispetto ai risultati di adsorbimento con valori di pH auto-regolato (≈ 4,3) riportati da Suhr, M. et al. (2014) 19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Le efficienze di rimozione metallo calcolati (RE) nel range di pH indagati sono stati tra i 50 - 60% confermando così la risultati fatte da Suhr, M. et al. (2014), dove sono stati raggiunti valori di circa il 40%. Negli esperimenti precedentemente formulate, forti interazioni di Au (III) con i gruppi funzionali ad esempio, carboxylic-, hydroxyl- e gruppi amino, è stata osservata per le proteine ​​S-layer come SLP1 e per la proteina comparativa SlfB di L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) rivelò spettroscopica una forte interazione di Au (III), principalmente con gruppi carbossilici di SlfB che potrebbe anche essere dedotti per SLP1 di L. sphaericus JG-B53 20,79,80. Inoltre, le proprietà intrinseche della proteina che ridurrebbero Au (III) a Au (0) in assenza di agenti riducenti possono essere un motivo per la forte interazione 79. Inoltre, i risultati di questo studio mostrano la tendenza di una preferita vincolante SLP1 a valori di pH inferiori. D'altra parte, un legante a valori di pH inferiori potrebbe anche portare ad una denaturazione di SLP1. Gli studi al SLP1 dimostrato una stabilità di proteine ​​fino a pH =3.0 (risultati non pubblicati). Da esperimenti desorbimento in condizioni acide, utilizzando ad esempio, l'acido nitrico o tramite agenti complessanti come EDTA o citrato (dati non mostrati), verifica che l'oro è stato stabilmente legato e non poteva essere rilasciato da polimeri SLP1.

Au (III) su SLP1 di L. sphaericus JG-B53
c iniziale (mg / L) 196,97
pH 5 4.5 ≈ 4.3 23 4 3.5 3 2.5 2
valore
q max 88.3 85.3 74,7 102.5 94.1 81 101.9 96.9
(mg Au (III) / g SLP1)
RI 47.1 47,8 37.9 57.1 54.1 44.8 58,7 56.5
(%)

Tabella 1: Massimo metallo Binding Capacità (q max) e incrementi di efficienza di rimozione del metallo (RE) di esperimenti Batch-sull'assorbimento di Au (III) e SLP1 Polimeri in soluzione analizzata per ICP-MS. I dati confrontati con i risultati precedentemente pubblicati da Suhr, M. et al. (2014) 19.

SLP1 monostrato Ricristallizzazione cingolati da QCM-D

La diminuzione immediata della frequenza (Af 5, Af 7, 9 Af, Af 11) indica un assorbimento rapido ed un'elevata affinità delle proteine ​​alla superficie modificata PE (Figura 6A). Uguale alla variazione veloce di frequenza, la dissipazione (ΔD 5, ΔD 7, ΔD 9, ΔD 11) aumenta anche immediatamente. Questo fatto indica un adsorbimento di molecole viscoelastiche alla superficie a causa di smorzamento veloce con conseguente aumento dei valori di dissipazione. Lo spostamento di frequenza massima viene raggiunta dopo 5 min con un valore di ≈ 95 Hz e ΔD di 4,2. In una fase successiva si verificano solo riarrangiamenti di ricristallizzato SLP1. SLP1 adsorbimento è stata questa convenzione è effettuata per più di 60 minuti per garantire tha formazione di una superficie quasi completamente coperto e regolarmente ordinato lattice proteine. L'esperimento dimostra che lo strato PE carica positiva è irrinunciabile per realizzare rivestimenti stabili, modifica negativa finale porta ad un assorbimento debole e cinetiche di rivestimento più lunghi (dati non mostrati) 38. Debolmente attaccato proteine ​​e agglomerati sono stati rimossi risciacquando con SLP1 privo di buffer ricristallizzazione. I piccoli cambiamenti di Af n confermano la bassa desorbimento proteine ​​e assorbimento stabile di SLP1. Nonostante ciò la dissipazione scende a ≈ 2,8 indica che le molecole più grandi elastici vengono rimossi.

Figura 6
Figura 6. ricristallizzazione di SLP1 su modificati SiO 2 sensori analizzati da QCM-D; (A) in Af / ΔD trama e (B) Spessore superficie profiloe; Questa cifra è stata modificata da Suhr, M. et al. (2014) 19 con il permesso di Springer e Suhr, M. (2015) 20. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Il profilo di superficie calcolato utilizzando i modelli di cui precedenti mostrano uno spessore monostrato SLP1 di ≈ 11,2 nm (modello di Kelvin-Voigt per film elastici) e di 10,0 Nm (modello Sauerbrey per strato rigido) (Figura 6B). Questi valori sono inferiori a quelli riportato da Suhr, M. et al. (2014). Le differenze possono essere spiegate da un diverso valore utilizzato della densità strato di proteine ​​all'interno della modellazione. I valori di corrente devono essere più vicino alla realtà di spessore dello strato di proteine ​​S-strato sulla superficie cellulare di cellule vive di L. sphaericus JG-B53 31,42. Questo modello dimostra che la relazione Sauerbrey is inadeguato per acustica sottile strato proteico, a causa di una propagazione dell'onda acustica di taglio in film liquidi viscoelastici 81,82 che si traduce in una sottostima della massa SLP1 adsorbita e spessore. Questo può essere spiegato con le proprietà elastiche delle proteine ​​S-strato e il suo accoppiamento delle molecole di acqua durante il processo di adsorbimento. L'interazione di acqua con proteine ​​può essere facilmente descritto dalla formazione di gusci di idratazione, resistenza viscosa o intrappolamento nella cavità nello strato adsorbito 83. Ciò effettua uno spessore superiore misurata dal modello di Kelvin-Voigt e può chiarire le differenze di spessore strato ottenuto dai due modelli differenti. In studi precedenti AFM, gli spessori di SLP1 reticoli di circa 8-12 nm sono stati misurati. Calcolando l'assorbimento di massa di SLP1, invece di spessore, un totale di 1.506,6 Δm ng ∙ cm -2 (modello di Kelvin-Voigt) è stata calcolata. I dati di assorbimento di massa su Surfassi sono riassunte in Tabella 2 e mostrano un elevato assorbimento di massa utilizzando i valori del modello di Kelvin-Voigt.

m max Δm max spessore spessore
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
SLP1 dopo il rivestimento e risciacquo 1,505.6 1,351.6 11.2 10

Tabella 2: Adsorbed Messa di SLP1 su modificati Polielettrolita SiO 2 Cristalli analizzati da QCM-D dopo il risciacquo con Ricristallizzazione Buffer (pH = 8,0) e calcolato Spessore di stesa.

QCM-D come strumento per il rilevamento di metallo e metallo NP interazione con proteinico SLP1 monostrato

L'interazione di ricristallizzato monostrato SLP1 con 1 e 5 mm sciolto Au (III) è stato indagato. I risultati di massa adsorbita totale ottenuto dai calcoli e modellazione dei dati registrati di cambiamenti nella frequenza e dissipazione sono riassunti nella tabella 3. Gli studi QCM-D di Au (III) interazione con i monostrati fornire una comprensione più profonda del metallo-biomolecole interazione. Per la prima volta, la capacità di legame, la cinetica di assorbimento, e come la metal influenza la stabilità della proteina sono stati studiati in un nano-gamma. Dopo l'aggiunta della soluzione di sale di metallo per il monostrato SLP1 frequenza ridotta entro i primi 5 minuti indica un veloce adsorbimento di massa. Tuttavia, l'assorbimento di Au non è stata completata dopo 60 min come descritto per altri metalli quali Pd (II) in studi precedenti 19. L'aumento di massa si verifica fino a 18 ore. Trascorso questo tempo, fase di lavaggio sono state eseguite con tampone privo di metallo che mostra che il metallo adsorbito è quasi stabilmente legato allo strato SLP1 ricristallizzato. Infine, un assorbimento totale di metallo di 955.0 ± 2.7 ng ∙ cm -2 (modello di Kelvin-Voigt) è stato ottenuto in caso di (III) Soluzione 1 Au mM e 4,534.4 ± 5.5 ng ∙ cm -2 (modello di Kelvin-Voigt) in caso di 5 mM Au (III). I valori più alti ottenuti da 5 soluzioni Au mm (III) possono essere spiegati dalle proprietà intrinseche della riduzione SLP1 dove più piccolo metallico Au (0) -NP sono formate da questa soluzione. Questi riducendo correttolegami di SLP1 sono stati già riportati in studi precedenti per Pd (II) e Au (III) 32,33,79,84. I dati hanno anche mostrato che l'interazione con la soluzione di oro non porta ad una destabilizzazione degli strati proteiche. Questo indica la specifica e stabile legame di Au (III) a SLP1, che è stato anche confermato da misurazioni ICP-MS utilizzando polimeri di proteine.

La formazione di Au (0) -NP durante la sintesi può essere visualizzato dal cambiamento di colore da soluzione gialla iniziando ad un rossastro. Questo cambiamento di colore è causato dalla eccitazione delle oscillazioni plasmonica superficiale di nanoparticelle metalliche e dimostra la formazione di Au (0) -NPs 1,78. Inoltre NP piccole potrebbero essere sintetizzati dalla variazione della concentrazione dell'agente riducente (concentrazione più elevata di acido tannico) 85 visibile in una diversa colorazione della soluzione e verificato da risultati delle misurazioni PCS (dati non mostrati). SulD'altra parte, l'aumento della concentrazione di acido tannico porta ad una perdita di stabilità NP e NP tendono ad agglomerarsi 20. Come prova di principio, pre-sintetizzati Au (0) (distribuzione delle dimensioni di 10 - 18 nm misurata con PCS visto in Figura 7A) sono state incubate con -NPs sospesa SLP1 per 48 ore ed analizzata mediante SDS-PAGE. Il profilo proteico mostrato in Figura 7B verifica la conclusione tratta dai dati QCM-D, che Au (0) -NPs non disturbare la struttura SLP1. Le bande proteiche osservate a 150 kDa dimostrano la presenza di SLP1 intatta.

Figura 7
Figura 7. (A) Numero ponderato distribuzione delle dimensioni di ragazza pre-sintetizzato (0) -NPs misurata da PCS e (B) profilo proteico SDS-PAGE di SLP1; corsia 1: 2 mg SLP1 prima Au (0) -NPs interazione e corsia 2: 1 mg polimeri SLP1 in sospensione dopo 48 ore incuba zione con pre-sintetizzato Au (0) -NPs. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo l'NP-sintesi e caratterizzazione, QCM-D sono stati effettuati esperimenti. L'assorbimento di pre-sintetizzato metallico Au (0) -NPs è esemplarmente mostrato per esperimenti QCM-D Terreni Af / ΔD (Figura 8 A) e lo spessore e profili di massa (Figura 8B).

Figura 8
Figura 8. adsorbimento di pre-sintetizzato Au (0) -NPs su ricristallizzato SLP1 Lattice Analizzata da QCM-D, (A) in Af / ΔD trama e (B) Superficie livello e profilo di massa.blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Potrebbe essere confermato che QCM-D può essere utilizzato per rilevare l'adsorbimento del 10 - 18 nm Au sferica (0) -NPs. Dopo l'aggiunta della soluzione Au-NP non diluito (A 520 nm = 1) ottenuta dalla sintesi descritta, la frequenza diminuisce, che è un indicatore diretto di adsorbimento massa descritta dalla previsione dell'equazione Sauerbrey (Equazione 1). L'adsorbimento di Au (0) -NPs era quasi completato entro meno di 60 min. Trascorso questo tempo non più NP sono stati depositati sulla parte superiore del reticolo SLP1, così si può presumere che tutti i siti reattivi o pori sono occupati da Au (0) -NPs. La riduzione registrata nella dissipazione può essere affiliato al irrigidimento delle SLP1 reticolo causa dall'interazione NP. I valori di assorbimento totale di massa sono riassunte nella tabella 3. Anche intensiva risciacquo con il tampone citrato NP-gratis conduce niaTher a un desorbimento di NP, né a un distaccamento del monostrato SLP1. Pertanto, un'interazione stabile e forte può essere prevista a Au (0) interazione -NP nello stesso rispetto con Au (III).

Metallo c metallo Δm max Δm max spessore spessore
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mM 955 932,6 --- ---
5 mM 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
NP

Tabella 3: Adsorbed Santa Messa ricristallizzato SLP1 Lattice dopo Au (III) Interaction (pH = 6,0) e Au-NP adsorbimento (pH = 4,7) Analizzata da QCM-D e Calcolo di Spessore di dopo Au (0) -NP Coating. I dati confrontati con i risultati precedentemente pubblicati da Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM per la visualizzazione di strutture nanometriche Scaled

Nella figura 9, il reticolo di proteine ​​di SLP1 ricristallizzato sui sensori PE modificato è mostrato con il suo tipico reticolo quadrato (p4) come immagini di ampiezza. La costante reticolare potrebbe essere determinato come 13 - 14 nm, che è paragonabile a risultati di esperimenti precedenti 30. Lo spessore dello strato di 10 nm ± 2,0 nm misurato dal AFM verificato lo spessore dello strato previsto delle misure QCM-D di ≈ 11.2 nm (Kelvin-Voigt modellazione). La piccola differenza di altezza della superficie può essere spiegata dal fatto che il calculated QCM-D fit considera l'intera area del sensore mentre lo studio AFM alta risoluzione mostra solo una zona parziale. Dato questo, agglomerati di proteine ​​che sono stati attaccati alla superficie del sensore sono stati inclusi nel calcolo della massa adsorbita rispettivamente lo spessore dello strato e portato ad uno spessore superiore a quello determinato mediante AFM.

Figura 9
Figura 9. AFM Ampiezza Immagine di ricristallizzata SLP1 Lattice di L. sphaericus JG-B53 on QCM-D cristalli Subito dopo Rivestimento e risciacquo con tampone e ingrandimento di regione segnata; Questa cifra è stata modificata da Suhr, M. et al. (2014) 19 con il permesso di Springer. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La figura 10 mostra il SLP1 intatto reticolo dopo incubazione con la soluzione di Au (III). Si può dimostrare che, dopo l'incubazione reticolo proteina rimasto intatto. Ciò conferma i risultati degli esperimenti QCM-D premonitori stabilità del rivestimento. Nella Figura 11A e B il adsorbito pre-sintetizzato Au (0) -NPs (dimensioni variano 10-18 nm determinato dal PCS) sui reticolo SLP1 sono mostrati. A causa delle dimensioni delle particelle, l'Au (0) -NPs sono assorbiti nei pori SLP1 e non seguono la -symmetry p4 di SLP1. Au (0) -NPs sono statistico distribuito sulla proteina reticolo. Misurando le dimensioni delle particelle di immagini altezza AFM (dati non mostrati) le dimensioni delle nanoparticelle è nella gamma di 16 - 23 nm e ancora più piccolo, cioè nell'intervallo di circa 10 nm 19,20. Questo verasserisce di essere coperto la dimensione determinata NP precedentemente misurato da PCS (visto nella figura 8).

Figura 10
Figura 10. AFM Ampiezza Immagine di ricristallizzato e intatto SLP1 Lattice sui Cristalli QCM-D sensore dopo incubazione di 5 mM Au (III) Soluzione e ingrandimento di regione segnata; Questa cifra è stata modificata da Suhr, M. et al. (2014) 19 con il permesso di Springer e Suhr, M. (2015) 20. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 11
Figura 11. (A) AFM ampiezza immagine di adsorbito Au (0) -NPs su ricristallizzato reticolo SLP1 su QCM-D cristalli sensori (a sinistra) E (B) 3D ricostruito profilo di superficie (a destra); Questa cifra è stata modificata da Suhr, M. (2015) 20 con il permesso di Springer e Raff, J. et al. (2016) Raff, J. et al. S-layer a base di nanocompositi per applicazioni industriali a base di proteine ​​Engineered Nanostructures. (a cura di Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentato)). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo lavoro ha studiato il legame di Au alle proteine ​​S-layer è stata studiata utilizzando una combinazione di diversi metodi di analisi. In particolare, il legame di Au è molto interessante non solo per il recupero di Au da acque minerarie o soluzioni di processo, ma anche per la costruzione di materiali, ad esempio, superfici sensoriali. Per gli studi di interazione Au (Au (III) e Au (0) -NPs) con sospensione e ricristallizzata monostrato di SLP1, la proteina doveva essere isolato. Pertanto, questo studio ha dimostrato la coltivazione di successo del ceppo batterico gram-positivi L. sphaericus JG-B53 e l'isolamento della proteina strato superficiale SLP1. Tuttavia, la coltivazione e l'isolamento delle proteine ​​rimangono impegnativo e dovrebbero essere ottimizzati. Una produzione su larga scala di proteine ​​biomassa e S-strato è un prerequisito per una applicazione industriale di entrambi, ad esempio, per la produzione di materiali metallici filtro selettivo. Il loro potenziale applicazione è undoubtedly elevato per la rimozione di metalli tossici o il recupero dei metalli preziosi disciolti in acque di processo, acque di scarico o di drenaggio dell'acqua. Inoltre, il potenziale domanda di S-layer è ancora più grande considerando il loro potenziale addizionale in altri materiali bio-ispirati, come biosensori e catalizzatori.

Gli esperimenti batch di assorbimento di polimeri SLP1 sospesi hanno indicato un elevato e stabile di legame di Au (III) all'interno del pH-range investigato 2,0-5,0. In tal modo, l'efficienza di rimozione del metallo fino al 60% potrebbe essere raggiunto. Questa notevole vincolo comportamentale può essere spiegato da una forte interazione di Au (III) con SLP1 probabilmente indotta attraverso l'interazione di gruppi carbossilici e gruppi azotati cuscinetto presenti sulla superficie della proteina. Questo argomento potrebbe essere rafforzare da FTIR e EXAFS ricerca del ceppo simile L. sphaericus JG-A12 32,79. Inoltre, intrinseche proprietà riducenti di SLP1 possono spiegare l'alto RE di Au (III) di Reducing a nanoparticular Au (0). Si può presumere che S-layer, come prima interfaccia di batteri per l'ambiente, dovrebbe essere principalmente coinvolti in metallo vincolante. All'interno della gamma di pH indagato, la capacità con 102,5 mg di Au (III) legame più alto metallo / g SLP1 è stato raggiunto a pH 4.0. Questa capacità legante è superiore noto anche per altri bio-componenti, ad esempio, per la parete cellulare isolati di Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) 86 o biomassa di Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS utilizzato per la determinazione del metallo legato da polimeri SLP1 è metodo molto sensibile e permette la rilevazione di piccole quantità di oro in questo studio. ICP-MS offre molti vantaggi per l'esecuzione di determinazioni di metalli in tracce, ad esempio, il sistema di maneggevolezza e limiti di rilevabilità bassi; nel caso dell'oro fino a 0,1 - 1 ppt. Questo rende questo metodo uno strumento versatile per studiare i processi biosorptive in bassa gamma di concentrazioneS. Tuttavia, i risultati di questa indagine sono stati ottenuti con polimeri in sospensione S-strato e non possono essere facilmente trasferiti reticoli S-strato ricristallizzato sulle superfici, e quindi mostrano la limitazione di ICP-MS. Ad esempio, alcuna relazione diretta di isolati polimeri proteici potrebbe essere fatto per quelle strutture S-strato su cellule batteriche vitali. Inoltre, le misure ICP-MS non consentono la determinazione della cinetica di assorbimento di metallo. Pertanto, è necessario trovare metodi più adatti per la ricerca di legare con film sottili di metallo proteina immobilizzata.

Nel presente studio, analisi QCM-D sono stati applicati per rilevare la formazione in situ di reticoli S-strato su superfici così come la deposizione di Au sulle proteine. Pertanto, QCM-D è un metodo robusto e riproducibile per il riconoscimento dei processi di adsorbimento e di interazione molecola. Inoltre QCM-D è relativamente semplice, conveniente, e il metodo non pericolosi per monitorare such processi on-line. Il metodo ha il vantaggio di rilevare variazioni di massa con una sensibilità massima di massa in liquidi di ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Ciò consente la possibilità di rilevare anche interazione debole, ad esempio, di proteina con metalli disciolti o per misurare adsorptions nelle gamme bassa concentrazione. Lo svantaggio di QCM-D è che questo non è un metodo di imaging struttura che permette la visualizzazione di esempio, reticoli proteiche. Pertanto, sono necessarie altre tecniche.

La QCM-D analizza in questo studio sono stati seguiti da immagini AFM. La combinazione di questi metodi ha permesso lo studio della cinetica di assorbimento e le conseguenze di Au assorbimento per il rivestimento, dimostrando in tal modo che essi sono strumenti versatili per investigare l'interazione metallo di film sottili proteici. Inoltre, è stato dimostrato che una ricristallizzazione affidabile delle proteine ​​S-strato su supporti tecnici è essenziale per successivi studi di interazione proteina. Làribalta, modifiche delle superfici con promotori di adesione sono di interesse. La realizzazione descritta di polielettroliti (terminano con PE caricati positivamente) come strato intermedio tra SiO 2 superfici e lo strato proteico portare ad un procedimento perfezionato per un rivestimento proteico veloce. L'effetto positivo di uno strato carica positivamente polielettrolita è stato descritto in precedenza per esempio, immobilizzazione di batteri vitali cellule di L. sphaericus JG-B53 31. L'attuazione delle PE-layer presentati sono il passo più importante e fondamentale per la successiva ricristallizzazione successo e riproducibile di proteine ​​S-layer.

Si potesse dimostrare che per la ricerca di sottili strati di SLP1, QCM-D è un buon metodo per mostrare l'assorbimento di massa rispettivo alla ricristallizzazione proteina come film monostrato in tempo reale. Ciò può anche essere osservato in precedenza per il riassemblaggio della proteina S-layer SBPA di L. sphaericus </ em> CCM2177 47. Utilizzando successiva alta risoluzione AFM analizza le modifiche della struttura reticolare della proteina auto-assiemi possono essere visualizzati. Misure AFM hanno rivelato la simmetria p4 di SLP1 e confermano lo spessore dello strato modellato di SLP1 di circa 10 nm. Inoltre, l'interazione diretta di ioni metallici disciolti con lo strato di proteina potrebbe essere monitorato da QCM-D dimostrando buon legame di Au (III) dallo strato proteico sottostante. La probabile formazione dei più piccoli Au (0) -NPs dalla soluzione Au (III) all'interno dei pori proteine ​​causate da intrinseche proprietà riducenti del reticolo SLP1 entro misure QCM-D non poteva stato rilevato da successive misurazioni AFM. Questo potrebbe essere correlato al limite di risoluzione di AFM e il set up sperimentale in questo studio. Questo mostra il limite di questa tecnica e la necessità di imaging ad alta risoluzione per biomolecole nella scala nanometrica sub. Tuttavia, una elevata stabilità dello strato SLP1 ricristallizzato potrebbe essere dedotta da the ha ottenuto QCM-risultati ed è stato confermato dall'indagine di AFM.

In conclusione, si potrebbe dimostrare che i polimeri SLP1 hanno un'elevata capacità di metallo vincolanti per l'oro all'interno del pH-range investigato. Inoltre, l'indagine rivela che il reticolo SLP1 è vincolante uno ione metallico buon matrice e per l'immobilizzazione di nanoparticelle metalliche. Potrebbe essere dimostrato che ogni metodo utilizzato in questo articolo ha la possibilità di rilevare anche piccoli interazioni metallo, o in caso di AFM possono visualizzare le strutture nella gamma nanoscala. Anche se, è solo dalla combinazione di questi metodi illustrati, che ha permesso di migliorare la conoscenza e la comprensione delle proteine ​​esaminati a livello molecolare.

Principalmente, QCM-D e AFM sono i metodi preferiti di scelta per la futura ricerca di proteine ​​monostrato adsorbimento e la loro interazione con i metalli e molecole funzionali. Grazie alla combinazione di questi due metodi, il rilevamento di S-layer proteina annuncioprocessi di assorbimento e di immagini di superficie fornisce una panoramica dei processi molecolari che possono essere in grado di essere trasferito per migliorare la conoscenza di batteri viventi e l'interazione con l'ambiente. Questo studio ha mostrato un estratto di possibili metodi utili per la comprensione e l'interazione delle proteine ​​metallo. Altre tecniche utili che potrebbero migliorare la conoscenza di questi processi in dettaglio che vanno da diversi spettrometriche e cromatografiche metodi per spettroscopiche ricerca di biomolecole e dovrebbero essere inclusi negli studi futuri.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il presente lavoro è stato parzialmente finanziato dal IGF-progetto "S-Sieve" (490 ZBG / 1), finanziato dal BMWi e BMBF-progetto "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Un ringraziamento speciale a Tobias J. Günther per il suo prezioso aiuto durante gli studi AFM e di Erik V. Johnstone per aver letto il manoscritto come un madrelingua inglese. Inoltre, l'autore di questo articolo ringrazia Aline Ritter e Sabrina Gurlit (da Istituto di ecologia delle risorse per l'assistenza nelle misurazioni ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava e la biotecnologia del gruppo del Helmholtz-Institut Freiberg per Technology Resource.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

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Chimica bioassorbimento metalli S-layer batteri nanoparticelle QCM-D AFM ICP-MS oro
Au-Interazione di SLP1 Polimeri e monostrato da<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS e AFM come strumenti di studi Biomolecule metallo
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