Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Slp1 पॉलिमर और monolayer के Au-सहभागिता से Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

कारण इलेक्ट्रॉनिक्स, उत्प्रेरक, biosensors, या चिकित्सा उपकरणों की तरह कई अनुप्रयोगों के लिए सोने के बढ़ते उपयोग करने के लिए, इस कीमती धातु की मांग में पिछले कुछ साल के समय 6-9 से अधिक हो गया। भारी या कीमती धातुओं के द्वारा सबसे अधिक पर्यावरण प्रदूषण एक पर जा प्रक्रिया है, हालांकि सोने के साथ ही कई अन्य कीमती और भारी धातु, खनन गतिविधियों के माध्यम से, पतला सांद्रता में औद्योगिक अपशिष्ट के माध्यम से वातावरण में जारी है, और अपशिष्ट निपटान 7,8,10 रहे हैं मुख्य रूप से तकनीकी गतिविधियों की वजह से। यह प्राकृतिक पारिस्थितिक तंत्र का एक महत्वपूर्ण हस्तक्षेप की ओर जाता है और संभावित मानव स्वास्थ्य के 9 धमकी सकता है। इन नकारात्मक परिणामों को जानने नई तकनीकों औद्योगिक अपशिष्ट से धातु रीसाइक्लिंग में दूषित पारिस्थितिक तंत्र और सुधार से धातुओं को दूर करने के लिए खोज को बढ़ावा देता है। वर्षा या आयन एक्सचेंज की तरह अच्छी तरह से स्थापित भौतिक-रासायनिक विधियों विशेष रूप से उच्च में, इतना प्रभावी नहीं हैंLy समाधान 7,8,11 पतला। Biosorption, या तो जीवित या मृत बायोमास के साथ, अपशिष्ट उपचार 10,12 के लिए एक आकर्षक विकल्प है। इस तरह के जैविक सामग्री के उपयोग के जहरीले रसायनों की खपत को कम कर सकते हैं। कई सूक्ष्मजीवों जमा या धातुओं स्थिर करने के लिए वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, Lysinibacillus sphaericus की कोशिकाओं (एल sphaericus) जेजी-A12 कीमती धातुओं के लिए उच्च बाध्यकारी क्षमता से पता चला है जैसे, पीडी (द्वितीय), पंडित (द्वितीय), Au (तृतीय), और पंजाब जैसे अन्य विषाक्त धातुओं (द्वितीय) या यू (छठे) 4,13, सीआर (VI) के लिए 14 बेसिलस megaterium की कोशिकाओं, ए.यू. के लिए पंडित (द्वितीय) और पी.डी. (द्वितीय) 15, और Chlorella अभद्र लिए Saccharomyces cerevisiae की कोशिकाओं (तृतीय) और यू (छठे) 16 17। Au तरह पिछले धातुओं के बंधन (तृतीय), (द्वितीय) ने भी Desulfovibrio के लिए सूचित किया गया है पीडी (द्वितीय), और पं 18 और एल के लिए desulfuricans sphaericus जेजी-B53 19,20। फिर भी, न अलएल रोगाणुओं धातुओं की उच्च मात्रा में बाँध और sorptive सामग्री के रूप में उनके आवेदन सीमित 12,21 है। इसके अलावा, बाध्यकारी क्षमता धातु जैसे विभिन्न मापदंडों, सेल रचना, इस्तेमाल जैव घटक, या पर्यावरण और प्रयोगात्मक शर्तों (पीएच, आयनिक शक्ति, तापमान आदि) पर निर्भर करता है। पृथक सेल की दीवार के टुकड़े 22,23 के अध्ययन, झिल्ली लिपिड, पेप्टीडोग्लायकन, प्रोटीन, या अन्य घटकों की तरह, परिसर का निर्माण पूरे कोशिकाओं 8,21 की प्रक्रियाओं को बाध्यकारी धातु को समझने के लिए मदद करता है।

इस अध्ययन में पर ध्यान केंद्रित सेल घटकों एस-परत प्रोटीन होते हैं। एस-परत प्रोटीन कई बैक्टीरिया और आर्किया के बाहरी सेल लिफाफा के हिस्से हैं, और वे के बारे में 15 का गठन - इन जीवों की कुल प्रोटीन द्रव्यमान का 20%। पर्यावरण के लिए पहला इंटरफेस के रूप में, इन सेल यौगिकों दृढ़ता से बैक्टीरियल sorption गुण 3 प्रभावित करते हैं। आणविक भार चालीस से लेकर के साथ एस-परत प्रोटीनकेडीए के सैकड़ों कोशिका के भीतर उत्पादन कर रहे हैं, लेकिन बाहर इकट्ठा कर रहे हैं करने के लिए वे लिपिड झिल्ली या polymeric सेल दीवार घटकों पर परतों के रूप में सक्षम रहे हैं। पृथक करने के बाद, लगभग सभी एस-परत प्रोटीन अनायास इंटरफेस में, या तलीय या ट्यूब संरचनाओं की तरह 3 बनाने सतहों पर निलंबन में स्वयं को इकट्ठा करने के लिए आंतरिक संपत्ति है। प्रोटीन monolayer की मोटाई बैक्टीरिया पर निर्भर करता है और 5 की एक सीमा के भीतर है - 25 एनएम 24। सामान्य में, का गठन एस-परत प्रोटीन संरचनाओं 35 एनएम 3,24 करने के लिए एक परोक्ष (P1 या p2), वर्ग (पी 4), या हेक्सागोनल (पी 3 या पी 6) 2.5 की जाली स्थिरांक के साथ समरूपता हो सकता है। जाली गठन द्विसंयोजक फैटायनों पर निर्भर है और मुख्य रूप से सीए 2 25,26, बदचलन, जे एट अल पर कई मामलों में हो रहा है। एस-परत प्रोटीन आधारित इंजीनियर Nanostructures में औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए nanocomposites आधारित। (एड्स Tijana जेड ग्रोव और Aitziber एल Cortajarena) (स्प्रिंगर, 2016 (प्रस्तुत))। फिर भी, विशेष रूप से इस तरह के सीए 2 और 2 मिलीग्राम + के रूप में द्विसंयोजक फैटायनों मोनोमर तह, मोनोमर-मोनोमर बातचीत, एक जाली के गठन, और विभिन्न धातुओं की भूमिका की पूरी प्रतिक्रिया झरना, अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं।

ग्राम पॉजिटिव तनाव एल 27 (नए वंशावली वर्गीकरण के बाद बेसिलस sphaericus से नाम) sphaericus जेजी-B53 यूरेनियम खनन अपशिष्ट ढेर "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Saxony, जर्मनी) 4,28,29 से अलग किया गया था। अपने कार्य एस-परत प्रोटीन (Slp1) एक वर्ग जाली, 116 केडीए 30 के एक आणविक वजन, और बैक्टीरिया कोशिकाओं 31 रहने पर ≈ 10 एनएम की मोटाई के पास। पिछले अध्ययनों में, लगभग 10 एनएम की मोटाई के साथ एक बंद और स्थिर प्रोटीन की परत की इन विट्रो गठन कम से कम 10 मिनट 19 में हासिल की थी। संबंधित तनाव एल sphaericus JG-A12 भी "Haberland" ढेर से एक को अलग, उच्च धातु बाध्यकारी क्षमता के पास है और इसकी पृथक एस-परत प्रोटीन Au जैसे कीमती धातुओं के लिए एक उच्च रासायनिक और यांत्रिक स्थिरता और अच्छा sorption दरों दिखाया गया है (तृतीय), पंडित (द्वितीय), और पी.डी. (द्वितीय) 4,32,33। कीमती धातुओं के बंधन यह कम या ज्यादा विशिष्ट कुछ धातुओं के लिए है और बहुलक के बाहरी और भीतरी प्रोटीन की सतह पर और अपने pores में कार्य समूहों, आयनिक शक्ति की उपलब्धता, और पीएच मूल्य पर निर्भर करता है। , OH-, पीओ 4 - -, अतः 4 - और तो- प्रोटीन द्वारा धातु बातचीत के लिए प्रासंगिक कार्य समूहों COOH-, राष्ट्रीय राजमार्ग 2 हैं। सिद्धांत रूप में, धातु बाध्यकारी क्षमता अनुप्रयोगों, बदचलन, जे एट अल की एक व्यापक स्पेक्ट्रम खुला। एस-परत प्रोटीन आधारित इंजीनियर Nanostructures में औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए nanocomposites आधारित। (एड्स Tijana जेड ग्रोव और Aitziber एल Cortajarena) (स्प्रिंगर, 2016 (प्रस्तुत))। उदाहरण के लिए, के रूप में हटाने या वसूली के लिए biosorptive घटकोंभंग विषाक्त या बहुमूल्य धातुओं की, संश्लेषण या नियमित रूप से संरचित धातु नैनोकणों (एनपीएस) कटैलिसीस के लिए, और जैव-संवेदी परतों 3,5,18,33 जैसे अन्य जैव इंजीनियर सामग्री का परिभाषित बयान के लिए टेम्पलेट्स। Au की तरह नियमित रूप से व्यवस्थित एनपी सरणियों (0) -NPs सीओ ऑक्सीकरण 34-37 के लिए आणविक इलेक्ट्रॉनिक्स और biosensors, अति उच्च घनत्व भंडारण उपकरणों, और उत्प्रेरक से लेकर प्रमुख अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऐसे आवेदनों और इन सामग्रियों के स्मार्ट डिजाइन के विकास अंतर्निहित धातु बाध्यकारी तंत्र की एक गहरी समझ जरूरी है।

इस तरह के जैव आधारित सामग्री के विकास के लिए एक शर्त बायोमोलिक्यूल और तकनीकी सतह 38,39 के बीच एक अंतरफलक परत के विश्वसनीय कार्यान्वयन है। उदाहरण के लिए, polyelectrolytes एस-परत प्रोटीन 39 की recrystallization के लिए एक इंटरफेस परत के रूप में इस्तेमाल किया गया है परत-दर-परत (LbL) तकनीक 40,41 के साथ इकट्ठे 19,42, बदचलन, जे एट अल के साथ धातुओं की बातचीत के बारे में बयान करना संभव है। एस-परत प्रोटीन आधारित इंजीनियर Nanostructures में औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए nanocomposites आधारित। (एड्स Tijana जेड ग्रोव और Aitziber एल Cortajarena) (स्प्रिंगर, 2016 (प्रस्तुत))। हालांकि, प्रोटीन सोखना और प्रोटीन सतह बातचीत के जटिल तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं है। खास तौर पर रचना, पैटर्न अभिविन्यास, और कोटिंग घनत्व के बारे में जानकारी अभी भी लापता है।

अपव्यय निगरानी (QCM-डी) तकनीक के साथ क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance एक प्रोटीन सोखना, कोटिंग कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए उपकरण, और बातचीत के समर्थक के रूप में हाल के वर्षों में ध्यान आकर्षित किया हैनैनोमीटर स्तर 19,43-45 पर उपकर। इस तकनीक को वास्तविक समय में बड़े पैमाने पर सोखना की विस्तृत पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और प्रोटीन lattices 19,20,42,46-48 पर प्रोटीन स्वयं कोडांतरण की प्रक्रिया और कार्यात्मक अणुओं के युग्मन के लिए एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, QCM-डी माप प्राकृतिक जैविक शर्तों के तहत प्रोटीन की परत के साथ धातु बातचीत प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए संभावना खुला। हाल के एक अध्ययन में, यूरोपीय संघ की तरह चयनित धातुओं के साथ एस-परत प्रोटीन की बातचीत (तृतीय), Au (तृतीय), पीडी (द्वितीय), और पंडित (द्वितीय) QCM-डी 19,20 के साथ अध्ययन किया गया है। adsorbed प्रोटीन की परत ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की कोशिका दीवार का एक सरल मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं। इस एकल घटक के अध्ययन धातु बातचीत का एक गहरी समझ के लिए योगदान कर सकते हैं। हालांकि, पूरी तरह QCM-डी प्रयोगों सतह संरचनाओं और प्रोटीन करने के लिए धातु के प्रभाव के बारे में बयान की अनुमति नहीं है। अन्य तकनीक इस तरह की जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। एक पीओएससंरचनात्मक गुणों पर इमेजिंग जैव nanostructures के लिए sibility और प्राप्त जानकारी के परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) है।

प्रस्तुत अध्ययन का उद्देश्य एल की विशेष Slp1 में, ((0) -NPs एयू (तृतीय) और एयू) एस-परत प्रोटीन के लिए सोने की sorption जांच करने के लिए था sphaericus जेजी-B53। आईसीपी एमएस का उपयोग कर 5.0 और QCM-डी का उपयोग कर स्थिर एस परतों के साथ - प्रयोगों 2.0 की एक पीएच रेंज में बैच पैमाने पर निलंबित प्रोटीन के साथ किया गया। इसके अतिरिक्त, जाली स्थिरता पर धातु नमक के घोल के प्रभाव के बाद के AFM के अध्ययन के साथ जांच की गई। इन तकनीकों के संयोजन विशिष्ट धातु समानताएं के बारे में पूरी बैक्टीरियल कोशिकाओं पर घटनाओं बाइंडिंग के बारे में और अधिक सीखने के लिए एक उपकरण के रूप में इन विट्रो धातु बातचीत की प्रक्रिया का एक बेहतर समझ के लिए योगदान देता है। यह ज्ञान न केवल पर्यावरण संरक्षण के लिए धातुओं की वसूली के लिए लागू फिल्टर सामग्री के विकास और पुनः के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है49, बल्कि विभिन्न तकनीकी अनुप्रयोगों के लिए उच्च आदेश दिया धातु एनपीएस के सरणियों के विकास के लिए सूत्रों का कहना है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सूक्ष्मजीव और खेती की स्थिति

नोट:। सभी प्रयोगों बाँझ शर्तों के तहत किया गया था एल sphaericus जेजी-B53 एक क्रायो संरक्षित संस्कृति 29,30 से प्राप्त हुई थी।

  1. स्थानांतरण 300 मिलीलीटर बाँझ पोषक तत्व शोरबा (नो बॉल) मीडिया (3 जी / एल मांस निकालने, 5 ग्राम / एल peptone, 10 ग्राम / एल NaCl) को साफ बेंच के तहत संस्कृति (1.5 एमएल) क्रायो संरक्षित। बाद में खेती के लिए पूर्व संस्कृति प्राप्त करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 6 घंटे के लिए समाधान हलचल।
  2. एक 70 एल में, पीएच = 7.0 में 30 डिग्री सेल्सियस एनबी मीडिया में एरोबिक परिस्थितियों में बैक्टीरिया पैदा करो भाप में जगह बायोरिएक्टर पहुंचा। इसलिए, ≈ 57 एल विआयनीकृत पानी के साथ रिएक्टर भरें। बायोरिएक्टर में सीधे ठोस एनबी मीडिया जोड़ें और भंग (सांद्रता ऊपर देखें)।
    1. इसके अतिरिक्त खेती के दौरान फोम गठन को दबाने के लिए मीडिया के लिए Antifoam एजेंट (30 μl / एल नायब मीडिया) जोड़ने, तो आटोक्लेव मीडिया (122 डिग्री सेल्सियस, तापमान समय 30 मिनट पकड़)रिएक्टर सुविधा अंदर।
  3. मीडिया शांत हो जाओ और पूरा ऑक्सीजन संतृप्ति प्रदर्शन करते हैं। (1 महाराष्ट्र 2 अतः 4 और 2 एम NaOH का उपयोग) 7.0 पीएच को समायोजित करें और 300 मिलीलीटर पूर्व संस्कृति का स्वत: टीका शुरू करते हैं। टीका बिंदु पर खेती मापदंडों के डेटा रिकॉर्डिंग शुरू। खेती के भीतर जैसे ऑनलाइन मापदंडों, भंग ऑक्सीजन का स्तर (2) करते हैं, एसिड और आधार के अलावा, और पीएच मान लॉग ऑन करें।
    1. गैर इनवेसिव मैलापन मापन द्वारा ऑनलाइन बैक्टीरिया विकास की निगरानी करें।
  4. खेती के हर घंटे के बाद अतिरिक्त नमूना प्रदर्शन और इस तरह के जैव सूखी वजन (BDW) और ऑफ़लाइन ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) के रूप में आगे पैरामीटर निर्धारित करते हैं। इसलिए, बाँझ शर्तों के तहत प्रत्येक नमूने बिंदु पर 20 मिलीलीटर की खेती शोरबा इकट्ठा।
    1. 600 एनएम सोखना के भामिति मापन द्वारा ऑफ़लाइन आयुध डिपो का निर्धारण करते हैं। एक खाली मूल्य के रूप में बाँझ filtrated नायब मध्यम का प्रयोग करें। पिछाड़ीएर सोखना> 0.4 पतला लैम्बर्ट बीयर कानून के linearity के बाद सेल निलंबन तक पहुंच गया।
    2. जीवाणु निलंबन के 5 मिलीलीटर BDW सेंट्रीफ्यूज 1 के निर्धारण के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 5000 XG पर (सेल घनत्व पर निर्भर करता है)। ओवन बड़े पैमाने पर स्थिरता के लिए एक हीटिंग में 105 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त सेल गोली सूखी और गोली बड़े पैमाने पर मापने।
  5. बैक्टीरिया विकास की जाँच के लिए और एक पार संक्रमण नियंत्रण के रूप में 400 और 1,000 गुना बढ़ाई (क्रमशः चरण विपरीत कंडेनसर 2 और 3) में ऑप्टिकल चरण विपरीत अनुसंधान माइक्रोस्कोप के साथ सूक्ष्म चित्र ले लो।
  6. ऑनलाइन द्वारा पता लगाया तेजी से विकास के चरण तक पहुंचने के बाद 2 और ऑनलाइन में गंदगी करते हैं, 15,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रवाह के माध्यम से centrifugation द्वारा बायोमास फसल और मानक बफर (50 मिमी Tris के साथ दो बार बायोमास धोने, 10 मिमी 2 MgCl, 3 मिमी नेन 3, पीएच = 7.5)।
    नोट: प्राप्त बायोमास गोली -18 & # पर संग्रहित किया जा सकता176; अलगाव के लिए आगे उपयोग के लिए जब तक सी।

2. एस-परत प्रोटीन अलगाव और शुद्धीकरण

नोट: पहले 2,19,30,32,50,51 वर्णित के रूप में एक अनुकूलित विधि के अनुसार Slp1 पॉलिमर शुद्ध।

  1. मानक बफर में खेती से प्राप्त धोया और डीफ़्रॉस्ट कच्चे बायोमास Homogenize (1: 1 (w / v)) 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा बर्फ स्नान के तहत एक disperser (स्तर 3, 10 मिनट) का उपयोग करके कशाभिका हटाने के लिए।
  2. निलंबन (8000 XG, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) अपकेंद्रित्र और मानक बफर के साथ दो बार प्राप्त गोली धोने (1: 1 (w / v))। कपड़े धोने और centrifugation (8000 XG, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) के बाद, मानक बफर में गोली resuspend (1: 1 (w / v)), निलंबन के लिए DNase द्वितीय और RNase (0.4 इकाइयों / जी बायोमास) जोड़ सकते हैं और बिखर एक उच्च दबाव homogenizer के साथ 1,000 बार में कोशिकाओं। बाद में 27,500 XG, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
    नोट: अनुसंधान मील के साथ नियंत्रण कक्ष निलंबनcroscope। 3 बरकरार कोशिकाओं 400 गुना बढ़ाई में माइक्रोस्कोप के मद्देनजर क्षेत्र में दिखाई दे रहे हैं - कम से कम 2 जब टूटना पूरा हो गया है।
  3. मानक बफर के साथ दो बार गोली धो (1: 1 (w / v)) और फिर centrifugation प्रदर्शन करते हैं। बाद में मानक बफर में गोली resuspend (2: 1 (w / v)) 1% ट्राइटन X-100 के साथ मिलाया जाता है और लिपिड जमा solubilize के लिए लगातार झटकों (100 आरपीएम) के तहत 20 मिनट के लिए यह सेते हैं।
  4. अपकेंद्रित्र समाधान (27,500 XG, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) और मानक बफर के साथ प्राप्त की गोली तीन बार धोने (1: 1 (w / v))।
  5. मानक बफर में 6 घंटे के लिए अतिरिक्त centrifugation (27,500 XG, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) के बाद प्राप्त गोली सेते हैं (1: 1 (w / v)) पेप्टीडोग्लायकन 50 में लिंकेज hydrolyze के लिए 0.2 ग्राम / एल लाइसोज़ाइम, साथ मिलाया। इसके अतिरिक्त निलंबन के लिए DNase द्वितीय और RNase (प्रत्येक 0.4 इकाइयों / जी बायोमास) जोड़ें।
  6. Centrifugation (45,500 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटा) के बाद, टी के एक कम मात्रा के साथ ऊपरी सफेद प्रोटीन चरण resuspendवह centrifugation सतह पर तैरनेवाला (<30 मिलीलीटर) युक्त प्रोटीन।
  7. 6 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड (6 एम GuHCl, 50 मिमी Tris, पीएच = 7.2) के साथ 1: 1 के मिश्रण से सफेद निलंबन solubilize। समाधान उज्ज्वल हो जाता है।
  8. एक अतिरिक्त उच्च गति centrifugation (45,500 XG, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) के द्वारा पीछा GuHCl इलाज समाधान की बाँझ निस्पंदन (0.2 माइक्रोन) निष्पादित करें।
  9. डायलिसिस झिल्ली ट्यूबों के लिए सतह पर तैरनेवाला (MWCO 50,000 डाल्टन) स्थानांतरण और 48 घंटे के लिए recrystallization के बफर (1.5 मिमी Tris, 10 मिमी 2 CaCl, पीएच = 8.0) के खिलाफ यह dialyzed।
  10. 45,500 XG, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सफेद recrystallized प्रोटीन बहुलक समाधान स्थानांतरण। Ultrapure पानी (<30 एमएल) के एक कम मात्रा में गोली Resuspend।
  11. बाद में, डायलिसिस झिल्ली ट्यूबों में निलंबन हस्तांतरण और बफर सामग्री को हटाने के लिए 24 घंटे के लिए ultrapure पानी के खिलाफ एक डायलिसिस प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: बफर या ultrapure पानी डी की कई बदलावuring डायलिसिस अपरिहार्य हैं।
  12. एक फ्रीज ड्रायर में शुद्ध Slp1 Lyophilize।

प्रयोगों के लिए Slp1 3. विशेषता और मात्रा का ठहराव

नोट: sorption और कोटिंग प्रयोगों के लिए Slp1 एकाग्रता यूवी तुलना स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया।

  1. सीधे दीप्तिमापी के निचले माप कुरसी पर भंग Slp1 नमूना पिपेट 2 μl। प्रोटीन के लिए विशेषता, 280 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर सोखना अधिकतम पर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण। Slp1 एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए 0.61 के विलुप्त होने के गुणांक का प्रयोग करें। संदर्भ मापन के लिए Slp1 मुक्त समाधान का प्रयोग करें।
  2. प्रयोगों (1 जी / एल और 0.2 ग्राम / एल के लिए वांछित एकाग्रता के लिए (0.9% सोडियम क्लोराइड का उपयोग बैच मोड में sorption प्रयोगों, पीएच = 6.0 और QCM-डी प्रयोगों recrystallization के बफर का उपयोग करने के लिए, पीएच = 8.0) बफर के साथ प्रोटीन पतला क्रमशः)।
  3. मानक bioanal द्वारा Slp1 गुणवत्ता और आणविक वजन का विश्लेषण करेंLaemmli, ब्रिटेन 52 से वर्णित विश्लेषणात्मक विधि सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ)।
    1. Au (0) -NP ऊष्मायन 10% polyacrylamide जुदाई जैल उपयोग करने के बाद, प्रयोगों और जैसे भीतर Slp1 उपयोग करने से पहले एसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन करते हैं।
    2. एसडीएस नमूने मिश्रण के लिए नमूना बफर के साथ खेती या प्रोटीन के नमूने के ≈10 μl में (1.97 छ Tris, नीले रंग की 5 मिलीग्राम bromophenol, 5.8 मिलीलीटर ग्लिसरीन, 1 ग्राम एसडीएस, 2.5 मिलीलीटर β-mercaptoethanol, 50 मिलीलीटर ultrapure पानी के साथ भरने के लिए) जेल जेब में 95 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट ऊष्मायन के बाद 1 (वी / वी) और पिपेट मिश्रण: 1 के अनुपात।
    3. नमूने तक 60 वी के एक वोल्टेज पर भागो एसडीएस पृष्ठ 30 मिनट में एक बार जुदाई जेल गुजर 120 वी करने के लिए संग्रह जेल और परिवर्तन वोल्टेज से गुजरती हैं।
    4. जेल प्रणाली से जैल हटाये निर्धारण समाधान (10% अम्लीय एसिड, 50% पूर्ण इथेनॉल) में 1 घंटे के लिए ultrapure पानी और जगह के साथ कुल्ला। बाद में, ultrapure पानी के साथ जैल कुल्ला।
    5. दाग जैलएक अनुकूलित unspecific कोलाइडयन Coomassie खूब ब्लू विधि 53,54 का उपयोग करके। 72,73 destaining के बाद, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार जेल प्रलेखन प्रणाली द्वारा एसडीएस पृष्ठ के चित्र ले।

बैच मोड और धातु मात्रा में 4. Sorption प्रयोगों

  1. बैच के लिए sorption प्रयोगों 4 HAuCl से एयू (तृतीय) शेयर समाधान ∙ 3 एच 2 ओ तैयार, धातु नमक पतला और 1 ग्राम / एल की एक 1 मिमी की प्रारंभिक धातु एकाग्रता और अंतिम Slp1 एकाग्रता के लिए Slp1 / NaCl समाधान के साथ मिश्रण । Slp1 बिना एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के साथ तीन में प्रयोगों का प्रदर्शन। Sorption प्रयोगों के लिए 5 मिलीलीटर की कुल मात्रा का प्रयोग करें।
  2. 24 घंटा (कम केंद्रित एचसीएल और NaOH समाधान के साथ पीएच को समायोजित) के लिए 2.0-5.0 के बीच अलग-पूर्व समायोजित पीएच मान पर आरटी पर लगातार निलंबन हिला।
  3. Sorption के बाद, 15,000 XG, 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) SEPAR करने पर नमूने अपकेंद्रित्रसतह पर तैरनेवाला से Slp1 खा लिया।
  4. भंग प्रोटीन मोनोमर्स दूर करने के लिए 20 मिनट के लिए 15,000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस ultrafiltration ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला (MWCO 50,000 दा) और सेंट्रीफ्यूज इस हस्तांतरण।
  5. आईसीपी एमएस 19,20 द्वारा परिणामस्वरूप छानना में धातु एकाग्रता का निर्धारण और Slp1 शुष्क जन द्वारा sorbed धातु के पीछे-गणना के लिए परिणाम का उपयोग करें। सिद्धांतों मापने, विधि और इस्तेमाल आईसीपी एमएस के घटकों के अवसरों के साहित्य 55 में वर्णित किया गया।
    1. एक आंतरिक मानक (1 मिलीग्राम / एमएल) के रूप में मैट्रिक्स और रोडियाम के रूप में 1% HNO 3 का उपयोग आईसीपी एमएस मापन के लिए नमूने और संदर्भ तैयार करें।

5. Au-एनपी के संश्लेषण और कण आकार का निर्धारण

नोट: साइट्रेट एयू (0) -NP Mühlpfordt, एच एट अल द्वारा पहले से वर्णित एक अनुकूलित विधि के अनुसार संश्लेषित किया गया स्थिर हो। (1982) की एक व्यास के साथ गोलाकार कणों को प्राप्त करने के लिए 10 - 15 एनएम 56,57

  1. एनपी गठन के लिए एक स्थिर 25 मिमी 4 HAuCl ∙ 3 एच 2 ओ स्टॉक तैयार।
  2. 19.75 मिलीलीटर ultrapure पानी में इस शेयर के समाधान के 250 μl पतला और लगातार झटकों के तहत 15 मिनट के लिए 61 डिग्री सेल्सियस पर इन सेते हैं।
  3. एक दूसरे शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर (12 मिमी tannic एसिड, 7 मिमी सोडियम साइट्रेट DI-हाइड्रेट, 3 0.05 मिमी कश्मीर 2 सीओ) तैयार करें और 15 मिनट के लिए 61 डिग्री सेल्सियस पर अलग से 2 एन डी समाधान सेते हैं।
  4. लगातार समाधान एक करने के लिए 2 एन डी शेयर समाधान सरगर्मी के तहत जोड़ें। 61 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ। बाद में समाधान शांत और QCM-डी प्रयोगों के भीतर Slp1 जाली पर एनपी कोटिंग के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप एयू (0) -NP आम तौर पर (0) 58 -NPs का गठन Au का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया 520 एनएम, के absorbance अधिकतम पर यूवी तुलना स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ विशेषता थे। समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  5. गठन के आकार का विश्लेषण करेंयह भी गतिशील प्रकाश बिखरने के रूप में जाना जाता है जो फोटॉन सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (पीसीएस) द्वारा Au (0) -NP।
    1. एनपी आकार के निर्धारण के लिए, एक लामिना का प्रवाह बॉक्स में धूल मुक्त परिस्थितियों में cuvettes में संश्लेषित एयू (0) -NP समाधान के 1.5 मिलीलीटर हस्तांतरण और एक आकार और जीटा संभावित कण आकार मापक के साथ यह विश्लेषण। पीसीएस और नमूना तैयार करने का एक विस्तृत विवरण Schurtenberger, पी एट अल में दी गई है। (1993) 59 और जैन, आर एट अल। (2015) 60।

6. QCM-डी के प्रयोगों - Slp1 जाली पर सतहों पर Slp1 कोटिंग और Au एनपी सोखना

नोट: माप अप करने के लिए चार प्रवाह मॉड्यूल के साथ सुसज्जित एक QCM-डी के साथ किए गए। सभी QCM-डी प्रयोगों 25 डिग्री सेल्सियस पर 125 μl / मिनट की एक निरंतर प्रवाह की दर के साथ प्रदर्शन किया गया। Slp1 कोटिंग और धातु / एनपी ऊष्मायन ≈ 5 मेगाहर्ट्ज के एक मौलिक आवृत्ति के साथ 2 Sio पीजोइलेक्ट्रिक एटी-कट क्वार्ट्ज सेंसर (ओ 14 मिमी) पर किया गया था। कदम rinsing और जोड़नेसमाधान की ition प्रतिनिधि परिणाम भाग के आंकड़ों में चिह्नित कर रहे हैं। QCM-डी प्रयोगों कदम तरह से एक कदम Slp1 recrystallization के द्वारा और बाद में धातु और धातु एनपी बातचीत पर पीछा इस्तेमाल किया सेंसर की सफाई और सतह संशोधन के साथ शुरुआत के रूप में वर्णित किया जा सकता है।

  1. सफाई प्रक्रियाओं:
    1. सेंसर dummies के साथ तरल पदार्थ कोशिकाओं से लैस। पंप पर कम से कम 20 मिलीलीटर के माध्यम से QCM-डी और ट्यूब प्रणाली (ultrapure पानी (वी / वी) में 2% cleanser) एक क्षारीय तरल सफाई एजेंट की (मॉड्यूल प्रति प्रत्येक)। बाद में इस प्रणाली के माध्यम से ultrapure पानी की पांचगुना मात्रा (प्रत्येक मॉड्यूल के प्रति) पंप (300 μl / मिनट के लिए दर प्रवाह)। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार सफाई कार्य करें।
    2. 2% एसडीएस समाधान में ऊष्मायन (कम से कम 20 मिनट) द्वारा प्रवाह मॉड्यूल के बाहर 2 Sio सेंसर साफ और ultrapure पानी 61,62 के साथ बाद में कई बार सेंसर कुल्ला।
    3. फ़िल्टर किए गए कंप्यूटर अनुप्रयोग के साथ क्रिस्टल सूखीहवा ressed और 20 मिनट 63,64 के लिए एक ओजोन सफाई कक्ष में उन्हें जगह है।
    4. सभी कार्बनिक सामग्री को हटाने के लिए दो बार सफाई की प्रक्रिया को दोहराएं।
    5. सेंसर सतह से बाध्य धातुओं को दूर करने के लिए 1 एम HNO 3 के साथ सेंसर कुल्ला। बाद में, ultrapure पानी के साथ सभी rinsing चरणों का प्रदर्शन।
  2. Polyelectrolytes द्वारा सेंसर भूतल संशोधन:
    भूतल संशोधन या तो अंदर किया जा सकता है (प्रक्रिया के माध्यम से प्रवाह) या प्रवाह मॉड्यूल के बाहर (LbL तकनीक): ध्यान दें। इन प्रयोगों के भीतर सतहों को संशोधित करने के लिए निम्नलिखित तरीके से इस्तेमाल किया गया था।
    1. 3 जी द्वारा लेख में विशेष प्रयोग किया प्रणाली के लिए पहले से वर्णित LbL तकनीक 40,41 का उपयोग कर डुबकी कोटिंग के माध्यम से पॉलीथीन imine (पी, मेगावाट 25,000) और polystyrene सल्फ़ोनेट (पीएसएस, मेगावाट 70,000) की बारी पीई परतों के / एल के साथ सेंसर संशोधित Suhr, एम एट अल। (2014) 19।
    2. गहरी w में उचित पीई समाधान के अंदर सेंसर की जगहपक्ष प्लेटें और आरटी पर 10 मिनट के लिए इन सेते हैं।
    3. पीई-समाधान से बाहर सेंसर ले लो और ultrapure पानी के साथ अधिकता हर डुबकी कोटिंग कदम के बीच सेंसर कुल्ला।
      नोट: नई सतह संशोधन सकारात्मक आरोप लगाया पी के साथ कम से कम तीन पीई परत समाप्त होते हैं।
    4. इस बाहरी संशोधन के बाद प्रवाह मॉड्यूल के अंदर सेंसर जगह है और प्रयोगों के शुरू करने से पहले ultrapure पानी के साथ rinsing द्वारा सेंसर संतुलित करना।
  3. Slp1 Monolayer Recrystallization:
    1. मोनोमर्स में पॉलिमर परिवर्तित करने के लिए 4 एम यूरिया में Slp1 भंग।
    2. Monomerized प्रोटीन 15,000 XG, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र बड़ा प्रोटीन agglomerates हटाने के लिए।
    3. 0.2 ग्राम / एल के अंतिम प्रोटीन एकाग्रता के लिए recrystallization के बफर के साथ solubilized और centrifuged Slp1 सतह पर तैरनेवाला मिलाएं।
      नोट: Slp1 (स्वयं कोडांतरण) की recrystallization के आधार पर कैल्शियम आरईसी के अलावा द्वारा शुरू होता हैrystallization बफर। इसलिए, तुरंत (प्रवाह मॉड्यूल के अंदर रखा गया) सेंसर करने के लिए 125 μl / मिनट के प्रवाह की दर के साथ मिश्रित समाधान पंप। recrystallization QCM-डी प्रयोगों के भीतर पाया गया आवृत्ति और अपव्यय पारियों के स्थिर मूल्यों के बाद किया जाता है।
    4. प्रवाह मॉड्यूल के अंदर पीई संशोधित सेंसर के शीर्ष पर सफल प्रोटीन recrystallization के बाद आवृत्ति और अपव्यय पारियों के स्थिर मूल्यों तक 125 μl / मिनट के प्रवाह की दर के साथ waterintensively recrystallization के बफर या ultrapure साथ लेपित सेंसर कुल्ला पाया गया।
      नोट: Slp1 monolayer और AFM के अध्ययन पर बाद में sorption प्रयोगों के लिए पीई के साथ 2 Sio सतह संशोधन चित्र 1 में कल्पना की है।

आकृति 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध डिजाइन पीई सतह संशोधन और Slp1 monolayer केकोटिंग; यह आंकड़ा Suhr, एम एट अल से संशोधित किया गया है। स्प्रिंगर से अनुमति के साथ (2015) 19। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. धातु और धातु एनपी बातचीत:
    नोट: Au धातु नमक के घोल के साथ sorption (4 HAuCl ∙ 3 एच 2 ओ) 1 मिमी या 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में पीएच पर 5 मिमी = 6.0 की सांद्रता में बाहर किया गया था। Au-एनपी सोखना पीएच ≈ 5.0 में 1.6 मिमी त्रिकोणीय सोडियम साइट्रेट बफर में undiluted Au-एनपीएस के साथ किया गया था।
    1. आवृत्ति और अपव्यय पारियों के स्थिर मूल्यों का पता लगाया गया है, जब तक प्रवाह मॉड्यूल में सफल Slp1 कोटिंग के बाद, 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ अधिकता प्राप्त Slp1 परत कुल्ला।
    2. 125 μl / मिनट के प्रवाह की दर के साथ प्रवाह मॉड्यूल के लिए तैयार धातु समाधान (1 मिमी) और एनपी समाधान पम्प और SL करने के लिए बड़े पैमाने पर सोखना ट्रैकP1 परत। मास सोखना Sauerbrey समीकरण की चर्चा करते हुए आवृत्ति पाली (1 समीकरण) पर नज़र रखने से सीधे पता लगाया जा सकता है।
    3. धातु और धातु एनपी बातचीत पूरी करने के बाद, कमजोर बाध्य या कमजोर जुड़ी धातुओं या नैनोकणों को दूर करने के लिए धातु / एनपी मुक्त बफर के साथ परत कुल्ला।
      नोट: प्रयोगात्मक स्थापना का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है।

चित्र 2
चित्रा 2 * 66 401 प्रवाह मॉड्यूल QFM का उपयोग कर QCM-डी सेटअप के योजनाबद्ध डिजाइन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. डेटा रिकॉर्डिंग और मूल्यांकन:
    1. हर्ट्ज (Δf एन) और अपव्यय (ΔD n में आवृत्ति में बदलाव रिकॉर्ड) QCM-डी विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग करके QCM-डी प्रयोगों के भीतर।
    2. जगा वें n करने के लिए लागू किया सेंसर की सतह के घर्षण के बिना युग्मित पतली और कठोर फिल्मों के लिए मान्य है कि adsorbed के लिए बड़े पैमाने पर संवेदनशीलता (Δm) Sauerbrey समीकरण / मॉडल (समीकरण 1) 65 66 के मूल्यांकन के लिए प्रयोग करें। कटौती क्वार्ट्ज सेंसर में प्रयुक्त किए गए 5 मेगाहर्ट्ज के लिए अवधि सी (Sauerbrey निरंतर) 17.7 एनजी ∙ हर्ट्ज -1 ∙ सेमी -2 68 है। कठोर के लिए, समान रूप से वितरित, और पर्याप्त पतली adsorbed परतें एक अच्छा सन्निकटन के रूप में 1 समीकरण का उपयोग करें।
      1 समीकरण
    3. Viscoelastic अणुओं निर्माता विशेष सॉफ्टवेयर के साथ 68-71 के लिए मान्य केल्विन-वोइट मॉडल के अनुसार अतिरिक्त मॉडलिंग प्रदर्शन और Sauerbrey मॉडल के साथ कि परिणामों की तुलना करें।
    4. परत मोटाई की गणना और जन सोखना उपयोग के लिएमहत्वपूर्ण मॉडलिंग पैरामीटर के रूप में 1.35 की adsorbed परत की एक परत घनत्व छ ∙ सेमी -3 एस-परत प्रोटीन 72-75 के लिए पहले से वर्णित मूल्यों के लिए इसी। प्रोटीन की परत के साथ धातु बातचीत की गणना के लिए एक ही मूल्य का प्रयोग करें।

7. AFM माप

  1. एक औंधा ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर पूरी तरह से सक्षम AFM से अध्ययन करते हैं।
    1. सीधे लेपित QCM-डी सेंसर पर recrystallization के बफर या ultrapure पानी का उपयोग कर तरल में रिकार्ड AFM छवियों।
    2. QCM-डी प्रयोगों के बाद ultrapure पानी के साथ सेंसर कुल्ला और AFM द्रव सेल के अंदर उन्हें जगह है। इसलिए, के बारे में 1.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ एक बंद द्रव सेल का उपयोग करें। 30 डिग्री सेल्सियस पर तरल पदार्थ सेल निरंतर का तापमान रखें।
    3. पानी में ≈ 25 kHz के एक अनुनाद आवृत्ति और <0.1 एन / मीटर की कठोरता के साथ एक ब्रैकट का प्रयोग करें। 2.5 और 10 माइक्रोन / सेकंड के बीच स्कैनिंग गति को समायोजित करें।
      4. 76 भिगोना दोलन द्वारा सतह के लिए ब्रैकट की दूरी तय।
      नोट: Z-मूल्यों सतह की सटीक स्थलाकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि ऊंचाई छवियों Z-पैमाने के साथ दिखाया गया है। आयाम Z-मूल्यों स्कैनिंग मापदंडों पर निर्भर करते हैं और सीमित जानकारी सहन क्योंकि आयाम (छद्म 3 डी) चित्र Z पैमाने पर बिना दिखाए जाते हैं। छवियों के विश्लेषण से तीन अलग-अलग मूल्यांकन सॉफ्टवेयर के 77 उपयोग किया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सूक्ष्मजीवों और Slp1 विशेषता की खेती

बैक्टीरिया विकास का दर्ज आंकड़ों के आसपास 5 घंटा में तेजी से विकास के चरण के अंत का संकेत है। पिछला जांच Slp1 फसल के इस बिंदु (4.36 छ / एल गीला बायोमास (≈ 1.45 छ / एल (BDW)) अधिकतम उपज के साथ 19 से अलग किया जा सकता है कि पता चला है। फिर भी, परिभाषित मीडिया घटकों या उपयोग करके खेती के अनुकूलन fed- बैच खेती रणनीतियों। यह औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए बायोमास की उच्च मात्रा के उपयोग के लिए अपरिहार्य है उच्च बायोमास पैदावार के लिए नेतृत्व करेंगे। ऑनलाइन से मूल्यों और ऑफ़लाइन दर्ज की खेती के मापदंडों चित्रा 3 ए में संक्षेप हैं। सूक्ष्म नियंत्रण (चित्रा 3 बी) समय पर एल sphaericus जेजी-B53 की फसल शो गैर sporulated कोशिकाओं की।


चित्रा 3: एल (ए) ऑनलाइन और ऑफलाइन मापा खेती के मापदंडों एल के महत्वपूर्ण बैक्टीरिया कोशिकाओं के sphaericus जेजी-B53 और (बी) सूक्ष्म छवि sphaericus जेजी-B53 400 गुना बढ़ाई में फसल के समय; यह आंकड़ा Suhr, एम एट अल से संशोधित किया गया है। स्प्रिंगर से अनुमति के साथ (2014) 19। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसके अलावा, एक अतिरिक्त बनाया एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन प्रोफ़ाइल (चित्रा -4 ए) खेती के 5 घंटे का समय Slp1 की अधिकतम राशि को इंगित करता है। (150 केडीए ≈) गहरा हो जाता है, लेकिन Slp1 करने के लिए इसी प्रोटीन बैंड यहाँ से तीव्रता में कमी पर accompan मनाया गयासंभव प्रोटीन विखंडन या अन्य प्रोटीन के अलगाव की वजह से कम आणविक वजन के साथ प्रोटीन में वृद्धि के द्वारा आइईडी। (चित्रा 4 बी) उपर्युक्त विधि द्वारा प्राप्त पृथक और शुद्ध प्रोटीन के बैंड (116 केडीए) 30 Slp1 का अनुक्रमण डेटा के आधार पर गणना की वजन से भारी है, जो लगभग 150 केडीए की एक आणविक भार के अनुरूप हैं। यह शायद posttranslational संशोधनों की वजह से है। एसडीएस जैल में सैद्धांतिक आणविक द्रव्यमान और मनाया आणविक जन के बीच बेमेल के लिए अन्य कारणों संभवतः एसडीएस जेल 30 में निर्भर कलाकृतियों को चार्ज कर रहे हैं।

चित्रा 4
(ए) के एसडीएस पृष्ठ द्वारा बनाया गया चित्रा 4. प्रोटीन प्रोफाइल खेती के नमूने और सफल अलगाव के बाद Slp1 शुद्ध (बी) से प्राप्त बैक्टीरिया की कोशिकाओं को विघटित; इस फाईGure Suhr, एम एट अल से संशोधित किया गया है। स्प्रिंगर से अनुमति के साथ (2014) 19। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बैच sorption प्रयोगों और आईसीपी एमएस के साथ Au के निर्धारण

अधिकतम धातु बाध्यकारी क्षमता निलंबित Slp1 द्वारा एयू (तृतीय) की क्यू (अधिकतम) चित्रा 5 में दिखाया जाता है। परिणाम एयू (तृतीय) स्थिरतापूर्वक जांच की पीएच सीमा के भीतर 24 घंटा ऊष्मायन के दौरान Slp1 से ही था कि पता चलता है। 100 मिलीग्राम एयू (तृतीय) / जी Slp1 - परिणाम लगभग 80 की रेंज में क्यू अधिकतम संकेत मिलता है। संक्षेप मूल्यों (तालिका 1) / जी Slp1 Suhr, एम एट अल द्वारा पहले की रिपोर्ट (तृतीय) के चारों ओर 75 मिलीग्राम Au के sorption क्षमता के साथ तुलना की गई। खुद को समायोजित करने के साथ प्रयोगों से प्राप्त (2014)धातु नमक के घोल (पीएच ≈ 4.3) 19 के अलावा द्वारा पीएच मान। संक्षेप में, Slp1 इस तत्व के लिए अपने उच्च बाध्यकारी क्षमता साबित करने शुरू में जोड़ा एयू (तृतीय) की उच्च मात्रा के लिए बाध्य करने की क्षमता दिखाई है।

चित्रा 5
पीएच-समायोजित प्रयोगों के भीतर Slp1 पॉलिमर के लिए क्षमता एयू (तृतीय) की क्यू (अधिकतम) बंधन अधिकतम धातु की चित्रा 5. आरेख Suhr, एम एट अल द्वारा सूचना दी स्व समायोजित पीएच मान (≈ 4.3) का उपयोग कर sorption परिणामों की तुलना में। (2014) 19। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

60% इस प्रकार फिर से इस बात की पुष्टि - जांच की पीएच सीमा के भीतर गणना की धातु हटाने क्षमता (आरई) के बीच 50 थेSuhr, एम एट अल द्वारा किए गए sults। 40% के आसपास के मूल्यों को प्राप्त किया गया जहां (2014)। पहले किए गए प्रयोगों में, कार्य समूहों जैसे, carboxylic-, hydroxyl-, और एमिनो समूहों के साथ Au (तृतीय) की मजबूत बातचीत, एल के SlfB Slp1 तरह एस-परत प्रोटीन के लिए और तुलनात्मक प्रोटीन के लिए देखा गया है sphaericus जेजी-A12 1,78। Jankowski, यू एट अल। (2010) में मुख्य रूप से भी एल के Slp1 के लिए deduced किया जा सकता है कि SlfB की कार्बोक्जिलिक समूहों के साथ स्पैक्ट्रोस्कोप एयू (तृतीय) के एक मजबूत बातचीत का पता चला sphaericus जेजी-B53 20,79,80। इसके अलावा, Au को एयू (तृतीय) को कम करेगा कि आंतरिक प्रोटीन गुण (0) को कम करने के एजेंटों के अभाव में मजबूत बातचीत 79 के लिए एक कारण हो सकता है। इसके अलावा, इस अध्ययन के परिणामों के एक वरीय कम पीएच-मूल्यों पर Slp1 के बंधन की प्रवृत्ति दिखाई। दूसरी ओर, एक भी Slp1 का विकृतीकरण करने के लिए ले जा सकता है कम पीएच-मूल्यों पर बाध्यकारी। Slp1 करने के लिए अध्ययन पीएच करने के लिए नीचे एक प्रोटीन स्थिरता साबित कर दिया =3.0 (अप्रकाशित परिणाम)। अम्लीय परिस्थितियों में desorption प्रयोगों, जैसे, नाइट्रिक एसिड का उपयोग या EDTA या साइट्रेट (नहीं दिखाया डेटा) की तरह मिश्रता एजेंटों का उपयोग करने से, सोने स्थिरतापूर्वक बाध्य किया गया था और Slp1 पॉलिमर से रिहा नहीं किया जा सकता है कि सत्यापन करे।

एल sphaericus जेजी-B53 के Slp1 पर Au (तृतीय)
ग प्रारंभिक (मिलीग्राम / एल) 196.97
पीएच 5 4.5 ≈ 4.3 23 4 3.5 3 2.5 2
मूल्य
क्यू अधिकतम 88.3 85.3 74.7 102.5 94.1 81 101.9 96.9
(एमजी एयू (तृतीय) / जी Slp1)
आरई 47.1 47.8 37.9 57.1 54.1 44.8 58.7 56.5
(%)

तालिका 1: अधिकतम धातु क्षमता (क्यू अधिकतम) और Au साथ बैच sorption प्रयोगों की धातु हटाने क्षमता (आरई) बंधन (तृतीय) और आईसीपी एमएस द्वारा विश्लेषण समाधान में Slp1 पॉलिमर। डेटा Suhr, एम एट अल से पहले प्रकाशित परिणामों की तुलना में। (2014) 19।

QCM-डी द्वारा ट्रैक Slp1 Monolayer Recrystallization

आवृत्ति में तत्काल कमी (Δf 5, Δf 7, Δf 9, Δf 11) एक तेजी से सोखना और पीई संशोधित सतह (चित्रा 6A) के लिए प्रोटीन की एक उच्च आत्मीयता इंगित करता है। आवृत्ति में तेजी से परिवर्तन, अपव्यय (ΔD 5, ΔD 7, ΔD 9, ΔD 11) के बराबर भी तुरंत बढ़ जाती है। इस तथ्य को अपव्यय मूल्यों में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप, क्योंकि तेजी से भिगोना की सतह के लिए viscoelastic अणुओं के एक सोखना इंगित करता है। अधिकतम आवृत्ति पारी ≈ 95 हर्ट्ज और 4.2 की ΔD का एक मूल्य के साथ 5 मिनट के बाद हासिल की है। बाद में recrystallized Slp1 का केवल rearrangements होते हैं। Slp1 सोखना thusly टी सुनिश्चित करने के लिए 60 से अधिक मिनट के लिए बाहर किया गया थावह एक लगभग पूरी तरह से कवर सतह के गठन और नियमित रूप से आदेश दिया प्रोटीन जाली। प्रयोग सकारात्मक आरोप लगाया पीई परत स्थिर कोटिंग्स को प्राप्त करने के लिए अपरिहार्य है कि पता चलता है, नकारात्मक समाप्त संशोधन एक कमजोर सोखना और अब कोटिंग कैनेटीक्स की ओर जाता है 38 (डेटा) नहीं दिखाया। कमजोर प्रोटीन जुड़ी और agglomerates Slp1 मुक्त recrystallization के बफर के साथ rinsing द्वारा हटा दिया गया। Δf के छोटे परिवर्तन एन कम प्रोटीन desorption और Slp1 के स्थिर सोखना की पुष्टि करें। इस के बावजूद अपव्यय बड़ा लोचदार अणुओं को हटा रहे हैं यह दर्शाता है कि ≈ 2.8 तक नीचे चला जाता है।

चित्रा 6
चित्रा QCM-डी द्वारा विश्लेषण संशोधित Sio 2 सेंसर पर Slp1 6. Recrystallization; Δf / ΔD साजिश और (बी) सतह मोटाई प्रोफाइल में (ए)ई; यह आंकड़ा Suhr, एम एट अल से संशोधित किया गया है। स्प्रिंगर और Suhr, एम से अनुमति के साथ (2014) 19 (2015) 20। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पिछले उल्लेख मॉडल का उपयोग करके गणना की सतह प्रोफ़ाइल (केल्विन-वोइट लोचदार फिल्मों के लिए मॉडल) और 10.0 एनएम (कठोर परत के लिए Sauerbrey मॉडल) (चित्रा 6B) की ≈ 11.2 एनएम के एक Slp1 monolayer मोटाई दिखा। इन मूल्यों को उन लोगों की तुलना में कम कर रहे हैं Suhr, एम एट अल द्वारा की सूचना दी। (2014)। मतभेद मॉडलिंग के भीतर प्रोटीन की परत घनत्व का एक अलग खेतों में मूल्य से समझाया जा सकता है। वर्तमान मूल्यों एल के जीवित कोशिकाओं की कोशिका की सतह पर एस-परत प्रोटीन की परत मोटाई की वास्तविकताओं के करीब होना चाहिए sphaericus जेजी-B53 31,42। इस मॉडलिंग दर्शाता है कि Sauerbrey संबंध मैंक्योंकि adsorbed Slp1 द्रव्यमान और मोटाई का एक मूल्यवान समझना में यह परिणाम है कि viscoelastic तरल फिल्मों 81,82 में कतरनी ध्वनिक लहर के प्रचार की, ध्वनिक पतली प्रोटीन की परत के लिए अनुपयुक्त है। इस लोचदार एस-परत प्रोटीन के गुणों और सोखना प्रक्रिया के दौरान पानी के अणुओं की अपनी युग्मन के द्वारा समझाया जा सकता है। प्रोटीन के साथ पानी की बातचीत आसानी से adsorbed परत 83 में गुहाओं में हाइड्रेशन के गोले, चिपचिपा खींचें या फंसाने के गठन से वर्णित किया जा सकता है। इस केल्विन-वोइट मॉडल के आधार पर मापा जाता है एक उच्च परत मोटाई प्रभाव और भी दो अलग अलग मॉडल के द्वारा प्राप्त की परत की मोटाई में मतभेद स्पष्ट कर सकते हैं। पिछले AFM के अध्ययन में, चारों ओर 8-12 एनएम के Slp1 lattices की परत मोटाई मापा गया। बड़े पैमाने पर Slp1 की सोखना, बजाय परत मोटाई, 1506.6 एनजी ∙ सेमी -2 (केल्विन-वोइट मॉडल) की कुल Δm की गणना द्वारा गणना की गई। सर्फ पर जन सोखना के डेटाइक्के 2 टेबल में अभिव्यक्त किया और केल्विन-वोइट मॉडल के मूल्यों का उपयोग करके एक उच्च जन सोखना दिखा रहे हैं।

मीटर अधिकतम Δm अधिकतम मोटाई मोटाई
(एनजी / 2 सेमी) (एनजी / 2 सेमी) (एनएम) (एनएम)
(केल्विन-वोइट) (Sauerbrey) (केल्विन-वोइट) (Sauerbrey)
कोटिंग और rinsing के बाद Slp1 1,505.6 1,351.6 11.2 10

तालिका 2: Recrystallization बफर के साथ rinsing के बाद QCM-डी द्वारा विश्लेषण संशोधित Polyelectrolyte 2 Sio का कण Slp1 की Adsorbed मास (पीएच = 8.0) और गणना परत मोटाई।

प्रोटीन Slp1 monolayer साथ धातु और धातु एनपी इंटरेक्शन की जांच के लिए उपकरण के रूप में QCM-डी

1 मिमी और 5 मिमी भंग एयू (तृतीय) के साथ recrystallized Slp1 monolayer की बातचीत की जांच की थी। आवृत्ति और अपव्यय में परिवर्तन का दर्ज आंकड़ों की गणना और मॉडलिंग से प्राप्त कुल adsorbed के द्रव्यमान का परिणाम 3 टेबल में संक्षेप हैं। Au (तृतीय) बातचीत के QCM-डी अध्ययन monolayers धातु बायोमोलिक्यूल की एक गहरी समझ प्रदान के साथ बातचीत। पहली बार, बाध्यकारी क्षमता, sorption कैनेटीक्स, और कैसे के लिए मेटाएल प्रोटीन स्थिरता एक नैनो रेंज में अध्ययन किया गया प्रभावित करती है। एक तेजी से बड़े पैमाने पर सोखना का संकेत आवृत्ति पहले 5 मिनट के भीतर में कमी आई Slp1 monolayer करने के लिए धातु नमक के घोल के अलावा के बाद। पिछले अध्ययनों 19 में पीडी (द्वितीय) की तरह अन्य धातुओं के लिए वर्णित के रूप में फिर भी, Au के सोखना 60 मिनट के बाद पूरा नहीं किया गया। बड़े पैमाने पर वृद्धि 18 घंटा तक का होता है। इस समय के बाद, rinsing कदम adsorbed धातु लगभग स्थिरतापूर्वक recrystallized Slp1 परत करने के लिए बाध्य है, दिखा रहा है कि धातु मुक्त बफर के साथ प्रदर्शन किया गया। अंत में, 955.0 ± 2.7 एनजी ∙ सेमी -2 (केल्विन-वोइट मॉडल) की कुल धातु अवशोषण 1 मिमी एयू (तृतीय) के समाधान के मामले और 4,534.4 ± 5.5 एनजी ∙ सेमी -2 (केल्विन-वोइट मॉडल) में में प्राप्त हुई थी 5 मिमी Au के मामले (तृतीय)। 5 मिमी एयू (तृतीय) के समाधान के द्वारा प्राप्त उच्च मूल्यों सबसे छोटी धातु Au (0) -NP इस समाधान से गठन किया गया है, जहां Slp1 के आंतरिक कमी गुण से समझाया जा सकता है। ये उचित कम करनेSlp1 के संबंधों में पहले से ही पीडी (द्वितीय) और Au के लिए पिछले अध्ययनों में बताया गया है (तृतीय) 32,33,79,84। आंकड़े यह भी सोने के समाधान के साथ बातचीत प्रोटीन परतों की अस्थिरता के लिए नेतृत्व नहीं करता है कि पता चला है। इस Au भी प्रोटीन पॉलिमर का उपयोग आईसीपी एमएस मापन द्वारा पुष्टि की गई है जो Slp1, (iii) के विशिष्ट और स्थिर बाध्यकारी इंगित करता है।

संश्लेषण के दौरान एयू (0) -NP के गठन के एक लाल एक के लिए शुरू पीला समाधान से रंग बदलने के द्वारा देखे जा सकते थे। यह रंग बदलने नैनोकणों धातु की सतह plasmon दोलनों की उत्तेजना की वजह से और (0) 1,78 -NPs Au के गठन को साबित करता है। इसके अलावा छोटे एनपीएस समाधान का एक अलग रंग में दिखाई दे रहा है और पीसीएस मापन के परिणामों द्वारा सत्यापित एजेंट को कम करने की एकाग्रता (उच्च tannic एसिड एकाग्रता) 85 के बदलाव से संश्लेषित किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। परदूसरी ओर, tannic एसिड एकाग्रता बढ़ती एनपी स्थिरता का एक नुकसान होता है और एनपीएस 20 ढेरी के लिए करते हैं। सिद्धांत के सबूत के रूप में, पूर्व संश्लेषित एयू (0) -NPs (10 के आकार के वितरण - चित्रा 7A में देखा पीसीएस द्वारा मापा 18 एनएम) 48 घंटे के लिए निलंबित कर दिया Slp1 साथ incubated रहे थे और एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया। चित्रा 7 बी में दिखाया गया है प्रोटीन प्रोफ़ाइल एयू (0) -NPs Slp1 संरचना को परेशान नहीं करते कि, QCM-डी डेटा से तैयार निष्कर्ष की पुष्टि करता है। 150 केडीए पर मनाया प्रोटीन बैंड बरकरार Slp1 की उपस्थिति साबित होते हैं।

चित्रा 7
पूर्व संश्लेषित Au के चित्रा 7. (क) संख्या भारित आकार के वितरण (0) पीसीएस और (बी) Slp1 की एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन प्रोफ़ाइल से मापा -NPs; लेन 1: 2 माइक्रोग्राम Slp1 एयू (0) -NPs संपर्क और 2 लेन से पहले: निलंबन में 1 ग्राम Slp1 पॉलिमर के बाद 48 घंटे के incuba पूर्व संश्लेषित एयू (0) के साथ tion। -NPs यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एनपी संश्लेषण और लक्षण के बाद, QCM-डी प्रयोगों किए गए। पूर्व संश्लेषित धातु की सोखना एयू (0) exemplarily Δf / ΔD भूखंडों (चित्रा 8 ए) में और मोटाई और जन प्रोफाइल (चित्रा 8B) के रूप में QCM-डी प्रयोगों के लिए दिखाया गया है -NPs।

आंकड़ा 8
प्री-संश्लेषित Au के 8 चित्रा सोखना (0) Δf / ΔD साजिश और (बी) परत सतह और जन प्रोफ़ाइल में QCM-डी, (ए) द्वारा विश्लेषण recrystallized Slp1 जाली पर -NPs।"खाली> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

18 एनएम गोलाकार एयू (0) -NPs - यह QCM-डी 10 की सोखना पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस बात की पुष्टि की जा सकती है। Undiluted Au-एनपी समाधान के अलावा के बाद (ए 520 एनएम = 1) में वर्णित संश्लेषण के द्वारा प्राप्त की, आवृत्ति Sauerbrey समीकरण (1 समीकरण) की भविष्यवाणी से वर्णित जन सोखना का एक सीधा संकेत है, जो कम हो जाती है। Au के सोखना (0) -NPs लगभग कम से कम 60 मिनट के भीतर पूरा कर लिया गया। यह सब प्रतिक्रियाशील साइटों या pores एयू (0) -NPs द्वारा कब्जा कर लिया गया है कि माना जा सकता है तो इस समय के बाद कोई और अधिक एनपीएस Slp1 जाली के शीर्ष पर जमा थे। लंपटता में दिखाया कमी एनपी बातचीत के द्वारा Slp1 जाली कारण के stiffening से संबद्ध किया जा सकता है। कुल द्रव्यमान सोखना के मूल्यों तालिका 3 में अभिव्यक्त किया जाता है। एनपी मुक्त साइट्रेट बफर के साथ भी गहन rinsing नै ले जाता हैएनपीएस के एक desorption करने के लिए और न ही Slp1 monolayer की एक टुकड़ी को वहाँ। इसलिए, एक स्थिर और मजबूत बातचीत एयू (तृतीय) के साथ के रूप में एक ही सम्मान में एयू (0) -NP बातचीत के लिए भविष्यवाणी की जा सकती है।

धातु सी धातु Δm अधिकतम Δm अधिकतम मोटाई मोटाई
(एनजी / 2 सेमी) (एनजी / 2 सेमी) (एनएम) (एनएम)
(केल्विन-वोइट) (Sauerbrey) (केल्विन-वोइट) (Sauerbrey)
1 मिमी 955 932.6 --- ---
5 मिमी 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
एनपीएस

तालिका 3: recrystallized Slp1 जाली एयू (तृतीय) बातचीत के बाद (पीएच = 6.0) और Au एनपी सोखना QCM-डी और Au (0) -NP कोटिंग के बाद परत मोटाई की गणना से विश्लेषण (पीएच = 4.7) पर adsorbed जन। डेटा Suhr, एम एट अल से पहले प्रकाशित परिणामों की तुलना में। (2014) 19।

Nanometer स्केल्ड संरचनाओं के दृश्य के लिए AFM

9 चित्रा में, Slp1 के प्रोटीन जाली आयाम छवियों के रूप में अपनी विशिष्ट वर्ग जाली (पी 4) के साथ दिखाया गया है पीई संशोधित सेंसर पर recrystallized। पिछले प्रयोगों 30 के परिणामों के बराबर है जो 14 एनएम, - जाली लगातार 13 के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। AFM द्वारा मापा 2.0 एनएम ± 10 एनएम की परत मोटाई ≈ 11.2 एनएम (केल्विन-वोइट मॉडलिंग) की QCM-डी माप की भविष्यवाणी की परत मोटाई सत्यापित। सतह ऊंचाई में छोटा सा फर्क calcul कि इस तथ्य से समझाया जा सकता हैउच्च संकल्प AFM अध्ययन केवल एक आंशिक क्षेत्र से पता चलता है, जबकि पैदा QCM-डी फिट पूरे सेंसर क्षेत्र मानता है। यह देखते हुए, सेंसर सतह से जुड़े थे कि प्रोटीन agglomerates परत मोटाई के लिए क्रमश: adsorbed के द्रव्यमान की गणना में शामिल है और AFM द्वारा निर्धारित की तुलना में उच्च परत मोटाई के नेतृत्व में किया गया।

9 चित्रा
9 चित्रा AFM एल के recrystallized Slp1 जाली के आयाम छवि sphaericus जेजी-B53 QCM-डी क्रिस्टल पर सीधे कोटिंग के बाद और बफर और चिह्नित क्षेत्र के आवर्धन के साथ rinsing; यह आंकड़ा Suhr, एम एट अल से संशोधित किया गया है। स्प्रिंगर से अनुमति के साथ (2014) 19। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

10 चित्रा बरकरार Slp1 से पता चलता है Au (तृतीय) के समाधान के साथ ऊष्मायन के बाद जाली। यह ऊष्मायन के बाद प्रोटीन जाली पूरी तरह से बरकरार रह गए कि दिखाया जा सकता है। इस कोटिंग की स्थिरता की भविष्यवाणी की है कि QCM-डी प्रयोगों से परिणाम की पुष्टि करता है। Slp1 जाली पर दिखाए जाते हैं - चित्रा 11A और बी में adsorbed -NPs (पीसीएस द्वारा निर्धारित 18 एनएम आकार 10 से भिन्न होता है) (0) Au पूर्व संश्लेषित। कारण कण आकार के लिए, Au (0) -NPs Slp1 pores में adsorbed रहे हैं और Slp1 के पी 4 -symmetry का पालन नहीं करते। Au (0) -NPs प्रोटीन जाली पर वितरित सांख्यिकीय हैं। अर्थात् लगभग 10 एनएम 19,20 की रेंज में, यहां तक कि छोटे 23 एनएम और - AFM ऊंचाई छवियों में कण आकार को मापने के द्वारा एनपीएस के आकार 16 की रेंज में है (डेटा) नहीं दिखाया। यह देखेंपीसीएस से पहले मापा चुना गया एनपी आकार (8 चित्रा में देखा) ifies।

चित्रा 10
चित्रा 10 AFM QCM-डी सेंसर का कण recrystallized और बरकरार Slp1 जाली के आयाम छवि के बाद ऊष्मायन 5 मिमी एयू (तृतीय) समाधान और चिह्नित क्षेत्र की बढ़ाई; यह आंकड़ा Suhr, एम एट अल से संशोधित किया गया है। स्प्रिंगर और Suhr, एम से अनुमति के साथ (2014) 19 (2015) 20। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 11
Adsorbed एयू (0) -NPs QCM-डी सेंसर क्रिस्टल पर recrystallized Slp1 जाली पर (बाएं चित्रा 11. (ए) AFM के आयाम की छवि) और (बी) 3 डी सतह प्रोफ़ाइल (दाएं) को खंगाला; यह आंकड़ा स्प्रिंगर और बदचलन, जे एट अल से अनुमति के साथ Suhr, एम (2015) 20 से संशोधित किया गया है। (2016) बदचलन, जे एट अल। एस-परत प्रोटीन आधारित इंजीनियर Nanostructures में औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए nanocomposites आधारित। (एड्स Tijana जेड ग्रोव और Aitziber एल Cortajarena) (स्प्रिंगर, 2016 (प्रस्तुत))। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस काम में विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों का एक संयोजन का उपयोग कर जांच की गई एस-परत प्रोटीन के लिए एयू के बंधन का अध्ययन किया। विशेष रूप से, एयू के बंधन खनन पानी या प्रक्रिया के समाधान से एयू की वसूली के लिए, लेकिन यह भी सामग्री, जैसे, संवेदी सतहों के निर्माण के लिए न केवल बहुत आकर्षक है। Au बातचीत के अध्ययन के लिए (एयू (तृतीय) और Au (0) -NPs) को निलंबित कर दिया और Slp1 की monolayer recrystallized के साथ, प्रोटीन था पृथक होना। इसलिए, इस अध्ययन ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के तनाव एल की सफल खेती को दिखाया गया है sphaericus जेजी-B53 और सतह परत प्रोटीन Slp1 के अलगाव। फिर भी, खेती और प्रोटीन अलगाव चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं और अनुकूलित किया जाना चाहिए। बायोमास और एस-परत प्रोटीन के एक बड़े पैमाने पर उत्पादन धातु चयनात्मक फिल्टर सामग्री के उत्पादन के लिए दोनों के एक औद्योगिक आवेदन, जैसे, के लिए एक पूर्व शर्त है। उनके आवेदन संभावित undoubtedl हैविषाक्त धातुओं के हटाने या प्रक्रिया पानी में भंग बहुमूल्य धातुओं की वसूली, अपशिष्ट जल, या जल निकासी पानी के लिए उच्च वाई। इसके अलावा, एस-परतों के लिए आवेदन संभावित ऐसे biosensors और उत्प्रेरक के रूप में अन्य जैव प्रेरित सामग्री, में उनके अतिरिक्त क्षमता पर विचार भी बड़ा है।

निलंबित Slp1 पॉलिमर के बैच-sorption प्रयोगों 2.0-5.0 जांच की पीएच-सीमा के भीतर एयू (तृतीय) के एक उच्च और स्थिर बाध्यकारी संकेत दिया। इस प्रकार, 60% तक की धातु हटाने क्षमता पहुँचा जा सकता है। यह उल्लेखनीय बाध्यकारी व्यवहार शायद प्रोटीन की सतह पर मौजूद कार्बोक्जिलिक समूहों और नाइट्रोजन असर समूहों की बातचीत के माध्यम से प्रेरित Slp1 साथ Au (तृतीय) के एक मजबूत बातचीत के द्वारा समझाया जा सकता है। इस तर्क के इसी तरह के तनाव एल के एफटीआईआर और EXAFS जांच से मजबूत बनाने जा सकता है sphaericus जेजी-A12 32,79। इसके अलावा, Slp1 के आंतरिक को कम करने के गुण Redu द्वारा एयू (तृतीय) के उच्च आरई व्याख्या कर सकते हैंयह cing Au nanoparticular करने के लिए (0)। यह एस-परत, पर्यावरण के लिए बैक्टीरिया का पहला इंटरफेस के रूप में, बंधन धातु में मुख्य रूप से शामिल किया जाना चाहिए कि माना जा सकता है। जांच की पीएच सीमा के भीतर, 102.5 मिलीग्राम एयू (तृतीय) के साथ बाध्यकारी क्षमता उच्चतम धातु / जी Slp1 पीएच 4.0 से हासिल की थी। यह बाध्यकारी क्षमता बेसिलस subtilis के अलग सेल दीवार (71.5 मिलीग्राम एयू (तृतीय) / छ) के लिए अन्य जैव घटकों, जैसे, के लिए सूचना की तुलना में अधिक है 86 या Chlorella vulgaris (98.5 मिलीग्राम एयू (तृतीय) / छ) 8 की बायोमास के लिए ।

आईसीपी एमएस Slp1 पॉलिमर से बंधे धातु के निर्धारण के लिए इस्तेमाल बहुत संवेदनशील तरीका है और इस अध्ययन में सोने की छोटी से छोटी मात्रा का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है। आईसीपी एमएस जैसे धातु का पता लगाने निर्धारण, आसान हैंडलिंग सिस्टम और कम का पता लगाने सीमा के प्रदर्शन के लिए कई लाभ प्रदान करता है; 1 पीपीटी - 0.1 करने के लिए नीचे सोने के मामले में। यह कम एकाग्रता रेंज में biosorptive प्रक्रियाओं की जांच के लिए इस पद्धति का एक बहुमुखी उपकरण बना देता हैएस। हालांकि, इस जांच में परिणाम निलंबित एस-परत पॉलिमर के साथ प्राप्त कर रहे थे और आसानी से सतहों पर recrystallized एस-परत lattices को हस्तांतरित नहीं किया जा सकता है, और इसलिए आईसीपी एमएस की सीमा को दिखाते हैं। उदाहरण के लिए, अलग-थलग प्रोटीन पॉलिमर का कोई सीधा संबंध महत्वपूर्ण बैक्टीरिया की कोशिकाओं पर उन S-परत संरचनाओं के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, आईसीपी एमएस माप धातु sorption की गतिज के निर्धारण की अनुमति नहीं है। इसलिए, यह पतली स्थिर प्रोटीन फिल्मों से बाध्यकारी धातु की जांच के लिए तरीकों अधिक उपयुक्त खोजने के लिए आवश्यक है।

वर्तमान अध्ययन में, QCM-डी विश्लेषण सतहों पर एस-परत lattices के बगल में गठन के साथ ही प्रोटीन पर Au के बयान का पता लगाने के लिए लागू किया गया था। इसलिए, QCM-डी अणु सोखना और बातचीत की प्रक्रिया की पहचान के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है। इसके अतिरिक्त QCM-डी एस पर नजर रखने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल, लागत प्रभावी, और nonhazardous विधि हैuch ऑनलाइन प्रक्रियाओं। विधि एनजी ∙ सेमी -2 ≈ 0.5 के तरल पदार्थ में एक अधिकतम बड़े पैमाने पर संवेदनशीलता के साथ बड़े पैमाने पर परिवर्तन का पता लगाने में फायदा है। इस संभावना को भंग धातुओं के साथ प्रोटीन की, जैसे भी कमजोर बातचीत, पता लगाने के लिए या कम एकाग्रता पर्वतमाला में adsorptions को मापने के लिए सक्षम बनाता है। QCM-डी का नुकसान इस जैसे, प्रोटीन lattices के दृश्य की अनुमति देता है कि एक संरचना इमेजिंग विधि नहीं है। इसलिए, अन्य तकनीकों की जरूरत है।

QCM-डी AFM इमेजिंग द्वारा पीछा किया गया इस अध्ययन में विश्लेषण करती है। इन तरीकों का संयोजन इस प्रकार वे पतली प्रोटीन फिल्मों की धातु बातचीत की जांच के लिए बहुमुखी उपकरण हैं साबित करना है कि, sorption कैनेटीक्स और कोटिंग के लिए Au sorption के परिणामों के अध्ययन की अनुमति दी। इसके अलावा, यह तकनीकी समर्थन करता है पर एस-परत प्रोटीन की एक विश्वसनीय recrystallization के बाद के प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए आवश्यक है कि दिखाया गया था। क्या आप वहां मौजूद हैंसामने, आसंजन प्रवर्तक का उपयोग कर सतहों के संशोधनों रुचि के हैं। एक तेजी से प्रोटीन कोटिंग के लिए एक बेहतर तरीका करने के लिए 2 Sio सतहों और प्रोटीन की परत नेतृत्व के बीच मध्यवर्ती परत के रूप में (सकारात्मक आरोप लगाया पीई के साथ समाप्त) polyelectrolytes की वर्णित कार्यान्वयन। एक सकारात्मक चार्ज polyelectrolyte परत के सकारात्मक प्रभाव एल के महत्वपूर्ण बैक्टीरिया कोशिकाओं के जैसे, स्थिरीकरण के लिए पहले से वर्णित किया गया है sphaericus जेजी-B53 31। प्रस्तुत पीई परतों के कार्यान्वयन के एस-परत प्रोटीन के बाद में सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत recrystallization के लिए सबसे महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण कदम है।

यह Slp1 की पतली परत की जांच के लिए, QCM-डी वास्तविक समय में monolayer फिल्मों के रूप में प्रोटीन recrystallization के लिए संबंधित बड़े पैमाने पर सोखना को दिखाने के लिए एक अच्छा तरीका है कि प्रदर्शन किया जा सकता है। यह भी एस-परत प्रोटीन एल के SbpA की दुबारा के लिए पहले से मनाया जा सकता है sphaericus </ Em> CCM2177 47। बाद में उच्च संकल्प AFM का उपयोग करके प्रोटीन आत्म विधानसभाओं के जाली संरचना के परिवर्तन देखे जा सकते हैं विश्लेषण करती है। AFM माप Slp1 के पी 4 समरूपता का पता चला है और लगभग 10 एनएम के Slp1 की मॉडलिंग परत मोटाई की पुष्टि करें। इसके अलावा, प्रोटीन की परत के साथ भंग धातु आयनों की सीधी बातचीत (तृतीय) अंतर्निहित प्रोटीन की परत द्वारा Au के अच्छा बाध्यकारी साबित हो QCM-डी द्वारा नजर रखी जा सकती है। छोटी से छोटी Au के संभावित गठन (0) -NPs QCM-डी माप भीतर Slp1 जाली के आंतरिक को कम करने के गुण की वजह से प्रोटीन अंदर pores एयू (तृतीय) समाधान बाद में AFM के माप से पता लगाया गया नहीं कर सका है। इस AFM का संकल्प सीमा और इस अध्ययन में स्थापित प्रयोगात्मक से संबंधित हो सकता है। यह इस तकनीक और उप नैनोमीटर पैमाने में biomolecules के लिए उच्च संकल्प इमेजिंग की आवश्यकता की सीमा से पता चलता है। हालांकि, recrystallized Slp1 परत के एक उच्च स्थिरता वें से deduced किया जा सकता हैई QCM-परिणाम प्राप्त किया और AFM जांच से इस बात की पुष्टि की गई थी।

अंत में, यह Slp1 पॉलिमर की जांच की पीएच-सीमा के भीतर सोने के लिए उच्च धातु बाध्यकारी क्षमता है कि दिखाया जा सकता है। इसके अलावा, जांच Slp1 जाली एक अच्छा मैट्रिक्स धातु आयन बाध्यकारी और धातु नैनोकणों के स्थिरीकरण के लिए है कि पता चलता है। यह इस लेख में प्रयुक्त प्रत्येक विधि के nanoscale रेंज में संरचनाओं कल्पना कर सकते हैं, यहां तक ​​कि छोटे धातु बातचीत, या AFM के मामले में पता लगाने के लिए संभावना है कि दिखाया जा सकता है। हालांकि, यह केवल एक आणविक स्तर पर जांच की प्रोटीन के ज्ञान और समझ में सुधार करने के लिए अनुमति दी गई है कि इन दिखाया विधियों के संयोजन से है।

मुख्य रूप से, QCM-डी और AFM भविष्य प्रोटीन monolayer सोखना की जांच और धातुओं और कार्यात्मक अणुओं के साथ उनकी बातचीत के लिए चुनाव के पसंदीदा तरीके हैं। इन दो विधियों, एस-परत प्रोटीन विज्ञापन का पता लगाने के संयोजन सेsorption प्रक्रियाओं और सतह इमेजिंग रहने वाले बैक्टीरिया का ज्ञान और अपने वातावरण के साथ संपर्क बढ़ाने के लिए हस्तांतरित किया जा करने में सक्षम हो सकता है कि आणविक प्रक्रियाओं में एक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इस अध्ययन में यह समझ प्रोटीन और धातु बातचीत के लिए मददगार संभव तरीकों में से एक अंश दिखाया। Biomolecules के जांच स्पेक्ट्रोस्कोपी और करने के लिए विविध spectrometric और क्रोमेटोग्राफिक तरीकों से लेकर विस्तार से ऐसी प्रक्रियाओं के ज्ञान में वृद्धि कर सकता है कि अन्य उपयोगी तकनीक भविष्य के अध्ययनों में शामिल किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

वर्तमान कार्य आंशिक रूप से BMWi और BMBF-परियोजना "Aptasens" (BMBF / डीएलआर 01RB0805A) द्वारा वित्त पोषित IGF-परियोजना "एस चलनी" (490 ZBG / 1) द्वारा वित्त पोषित किया गया। AFM के अध्ययन के दौरान और एक देशी अंग्रेजी वक्ता के रूप में पांडुलिपि पढ़ने के लिए एरिक वी जॉनस्टोन के लिए अपने बहुमूल्य मदद के लिए टोबियास जे गुंठर के लिए विशेष धन्यवाद। इसके अलावा, इस पत्र के लेखक (आईसीपी एमएस माप में सहायता के लिए संसाधन पारिस्थितिकीय के लिए संस्थान से) Aline रिटर और सबरीना Gurlit को धन्यवाद देना चाहूंगा, Manja वोगेल, नैन्सी उंगेर, करेन ई Viacava और Helmholtz-संस्थान के समूह जैव प्रौद्योगिकी संसाधन प्रौद्योगिकी के लिए Freiberg।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 107 biosorption धातु एस-परत बैक्टीरिया नैनोकणों QCM-डी AFM आईसीपी एमएस सोना
Slp1 पॉलिमर और monolayer के Au-सहभागिता से<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; जेजी-B53 - QCM-डी, बायोमोलिक्यूल धातु अध्ययन के लिए उपकरण के रूप में आईसीपी एमएस और AFM
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter