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Chemistry

SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

原因エレクトロニクス、触媒、バイオセンサ、または医療機器のようないくつかのアプリケーションのための金の使用の増加に、この貴金属の需要はここ数年の時間6-9かけて成長してきました。重鎖または貴金属、最も環境汚染は継続的なプロセスであるが、金だけでなく、他の多くの貴重な重金属は、鉱業活動を通じて、希薄濃度の工業排水を経て環境中に放出され、廃棄物処理7,8,10されています主に技術的な活動によって引き起こされます。これは、自然の生態系の重要な干渉につながり、潜在的に人間の健康9を脅かします。これらの負の結果を知ることは、工業廃水からの金属のリサイクルに汚染された生態系や改善点から金属を除去するための新しい技術の探索を推進しています。沈殿又はイオン交換のような十分に確立された物理化学的方法には、特に高で、それほど効果的ではありませんLYは、溶液7,8,11に希釈しました。バイオソープションは、いずれかの生きているか死んバイオマスで、廃水処理10,12のための魅力的な代替です。そのような生物学的材料の使用は、毒性化学物質の消費量を低減することができます。多くの微生物は、蓄積又は金属を固定するために記載されています。例えば、Lysinibacillusのスフェリカスの細胞が（L.スファエリカス ）JG-A12は、貴金属のための高い結合能力を示している、例えば、パラジウム（II）、白金（II）、金（III）、及びPbのような他の有毒金属（II）またはU（VI）4,13、クロム（VI）14のためのバチルス・メガテリウムの細胞、金のために白金（II）およびPd（II）15、及びクロレラ下品ためのサッカロマイセス・セレビシエの細胞（III）とU（VI）16 、17。金（III）、パラジウム（II）、およびPt（II）のような前の金属の結合はまた、 デスルホビブリオ18およびL.ためのdesulfuricansについて報告されていますスフェリカス JG-B53 19,20。それにもかかわらず、ではないアルリットルの微生物は、金属を大量に結合して、収着材料としての用途は限ら12,21です。また、容量の金属結合は、異なるパラメータ、 例えば、細胞組成物、使用されるバイオコンポーネント、または環境や実験条件（pH、イオン強度、温度など）に依存します。単離された細胞壁断片22,23の研究は、膜脂質、ペプチドグリカン、タンパク質、または他の構成要素と同様に、複雑な構築全細胞8,21のプロセスを結合金属を理解するのに役立ちます。

この研究に着目セル構成要素は、S層タンパク質です。 S層タンパク質は、多くの細菌及び古細菌の外側細胞エンベロープの一部であり、それらは、約15を構成する - これらの生物の全タンパク質質量の20％。環境への最初のインターフェイスとして、これらの細胞の化合物は、強く、細菌の吸着特性3に影響を与えます 。 40の範囲の分子量を有するS層タンパク質kDaでの数百の細胞内で生産され、それらは脂質膜または高分子の細胞壁成分に層を形成することができる場合に外部組み立てられます。一旦単離されると、ほぼ全てのS層タンパク質は自発的に界面で、または平面または管状の構造体3を形成する面に、懸濁液中で自己集合する固有の特性を有しています。タンパク質の単分子層の厚さは、細菌に依存し5の範囲内である- 25nmで24。一般に、形成されたS層タンパク質の構造は、35ナノメートル3,24に対して斜め（P1またはP2）、正方形（P4）、または六角形（P3またはP6）2.5の格子定数との対称性を有することができます。格子形成は、二価の陽イオンに依存して、主のCa 2+ 25,26、ラフ、Jらに多くのケースであるように思われます。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016（提出））。それにもかかわらず、特に例えば、Ca 2+およびMg 2+などの二価カチオンのモノマーの折り畳み、モノマー-モノマー相互作用、格子を形成し、異なる金属の役割の完全な反応カスケードは、まだ完全には理解されていません。

グラム陽性菌株L. 27（新系統発生的分類した後、バチルス・スファエリカスから改称） スフェリカス JG-B53はウラン鉱山廃棄物の山「ハーバーランド」（Johanngeorgenstadt、ザクセン、ドイツ）4,28,29から単離しました。その機能S層タンパク質（SLP1）は正方格子、116 kDaで30の分子量、および細菌細胞31生きに ​​≈10nmの厚さを有しています。以前の研究では、約10nmの厚さで閉じ、安定したタンパク質層のインビトロでの形成は10分未満19で達成されました。関連菌株L.スフェリカス JG-A12は、また「ハーバーランド "パイルからの分離株は、高い金属結合能力を有し、その単離されたS層タンパク質は、Auのような貴金属のための高い化学的および機械的安定性と優れた吸着率を示した（III）、白金（II）、およびPd（II）4,32,33。貴金属のこの結合は、いくつかの金属について多かれ少なかれ特異的であり、ポリマーの外側及び内側タンパク質表面上及び細孔内の官能基、イオン強度、およびpH値の利用可能性に依存します。 、OH - 、PO 4 - - 、SO 4 - 、およびSO-タンパク質による金属相互作用に関連する官能基は、COOH-、NH 2です。原理的には、金属結合能力は、アプリケーション、 ラフ、Jらの広いスペクトルを開きます。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016年（提出））。 例えば、除去又は回復のためbiosorptiveコンポーネントとして溶解毒性または有価金属の、合成または触媒反応、およびバイオ感覚層3,5,18,33のような他の生体工学材料のため、定期的に構造化金属ナノ粒子（NPS）の定義された堆積のためのテンプレート。 Auのような規則的に配置されたNPアレイ（0）-NPsはCO酸化34-37ための分子エレクトロニクスやバイオセンサー、超高密度記憶装置、および触媒に至るまでの主要な用途のために使用することができます。このようなアプリケーションや、これらの材料のスマートなデザインの開発は、基礎となる金属結合メカニズムのより深い理解を必要とします。

このようなバイオベース材料の開発のための前提条件は、生体分子と技術面38,39との間の界面層の信頼できる実装です。例えば、高分子電解質は、S層タンパク質39の再結晶化のための界面層として使用されているレイヤー・バイ・レイヤー（のLbL）技術40,41に組み付け19,42、ラフ、J.らと金属との相互作用に関する記述することが可能です。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016年（提出））。しかし、タンパク質吸着およびタンパク質 - 表面相互作用の複雑なメカニズムは完全に理解されていません。特に立体構造、パターンの向き、コーティング密度の情報がまだ不足しています。

消費モニタリング（QCM-D）技術で水晶マイクロバランスは、タンパク質吸着、コーティング速度を研究するためのツール、および対話プロとして近年注目を集めていますナノメートルスケール19,43-45上セス。この技術は、リアルタイムで大量の吸着の詳細な検出を可能にし、タンパク質格子19,20,42,46-48に機能性分子のタンパク質自己集合プロセスと結合するための指標として用いることができます。また、QCM-Dの測定は、天然の生物学的条件下でのタンパク質性の層と金属の相互作用の過程を研究する可能性を開きます。最近の研究において、Euのような選択された金属とS層タンパク質の相互作用（III）、金（III）、パラジウム（II）、およびPtは（II）QCM-D 19,20で検討されています。吸着したタンパク質層は、グラム陽性細菌の細胞壁の単純化モデルとしての役割を果たすことができます。この単一の成分の研究では、金属相互作用のより深い理解に寄与することができます。しかし、単にQCM-D実験は、タンパク質に金属の表面構造と影響に関する記述を許可していません。他の技術は、そのような情報を得るために必要です。 One POSイメージングバイオナノ構造のための任及び構造特性情報を取得するには、原子間力顕微鏡（AFM）です。

提示研究の目的は、特にL. SLP1に、S層タンパク質に金（Au（III）とAu（0）-NPs）の収着を調査することでしたスフェリカス JG-B53。 ICP-MSを使用して5.0とQCM-Dを使用して固定化されたS-層と - 実験は、2.0のpH範囲内のバッチスケールで懸濁タンパク質を用いて行きました。さらに、格子の安定性に対する金属塩溶液の影響は、その後のAFM研究で調査しました。これらの技術の組み合わせは、特定の金属親和性について細菌細胞全体のイベントを結合についての詳細を学ぶためのツールとして、in vitroでの金属相互作用プロセスのより良い理解に貢献しています。この知識だけでなく、環境保護のための金属の回収のために適用可能なフィルター材料の開発と再の保全のために重要です49だけでなく、様々な技術的なアプリケーションのための高度に秩序化された金属NPのアレイの開発のためのソース。

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Protocol

1.微生物および栽培条件

注：すべての実験は、無菌条件下で行われたL.。スフェリカス JG-B53は、凍結保存培地29,30から得られました。

  1. 300ミリリットルのクリーンベンチの下に転送凍結保存培養物（1.5ミリリットル）の滅菌栄養ブロス（NB）メディア（3グラム/ Lの肉エキス、5グラム/ Lペプトン、10グラム/ LのNaCl）。その後、培養のために前培養物を得るために、30℃で少なくとも6時間溶液を攪拌します。
  2. 70 Lに、pH値= 7.0で、30℃をNB培地で好気的条件下で細菌を育てるには、蒸気インプレースバイオリアクターをスケールされました。したがって、≈57 L脱イオン水で原子炉を埋めます。バイオリアクターに直接固体NBメディアを追加し、溶解（濃度は、上記参照）。
    1. さらにメディアをオートクレーブ（122°C、温度保持時間30分）、培養中の泡の形成を抑制するために培地に消泡剤（30μL/ LのNB-メディア）を追加原子炉施設の内部。
  3. メディアをクールダウンし、完全な酸素飽和度を実行します。 （1 MH 2 SO 4と2 M NaOHを用いて）pHを7.0に調整し、300ミリリットル前培養の自動接種を開始します。接種ポイントで栽培パラメータのデータの記録を開始します。栽培中の例えば オンラインパラメータ、溶存酸素レベル（2 DO）、酸及び塩基付加、およびpH値を記録します。
    1. 非侵襲的な濁度測定によりオンライン細菌の増殖を監視します。
  4. 栽培の毎時間後に追加のサンプリングを行い、そのようなバイオ乾燥重量（BDW） とオフラインの光学密度（OD）としてさらにパラメータを決定。したがって、無菌条件下で各サンプリング点で20ミリリットルの培養ブロスを収集します。
    1. 600nmでの吸収の光度測定によってオフラインでODを決定します。ブランク値として無菌ろ過NB培地を使用してください。船尾にER吸着に到達することは> 0.4は、ランベルト・ベールの法則の直線以下の細胞懸濁液を希釈します。
    2. 細菌懸濁液を5mlのBDW遠心分離機1の決意を室温で5分間、5,000×gで（細胞密度に応じて）。質量安定性までの加熱炉で105℃で得られた細胞ペレットを乾燥させ、ペレットの質量を測定します。
  5. 細菌の増殖を確認するため、クロスコンタミネーションコントロールとして400〜1000倍の倍率（それぞれ位相差コンデンサー2および3）に光位相コントラスト研究顕微鏡で顕微鏡画像を取ります。
  6. オンラインで検出された指数増殖期に達した後、2、オンライン濁度を行う15,000×gでフロースルー遠心分離によりバイオマスを収穫、4℃、標準緩衝液（50 mMトリス、10mMのMgCl 2を、3 mMので二回バイオマスを洗いますNaN 3、pH値= 7.5）。
    注：得られたバイオマスのペレットを-18＆＃で保存することができます176; C分離のためのさらなる使用まで。

2. S層タンパク質の単離および精製

注意：以前に2,19,30,32,50,51説明したように適応した方法に従ってSLP1ポリマーを精製します。

  1. 4℃で冷却氷浴下分散機（レベル3、10分）を使用して、鞭毛を削除するには：（1（）w / vの1）標準緩衝液で栽培から得られる洗浄し、解凍し、粗バイオマスを均質化します。
  2. 懸濁液（8,000×gで、20分間、4°C）を遠心分離し、標準的な緩衝液で2回得られたペレットを洗浄し（1：1（W / V））。洗浄、遠心分離（8,000×gで、20分間、4℃）した後、標準的なバッファーを用いてペレットを再懸濁（1：1（W / V））、懸濁液にDNアーゼIIおよびRNase（0.4単位/ gのバイオマス）を追加し、崩壊します高圧ホモジナイザー1,000バーで細胞。その後、27,500×gで1時間4℃のサスペンションを遠心します。
    注：研究MIとコントロール細胞懸濁液をcroscope。 3無傷の細胞400倍の倍率で顕微鏡の視野に表示されている - 2未満のときに破裂が完了します。
  3. 標準緩衝液で2回ペレットを洗浄（1：1（w / vで））し、再び遠心分離を行います。その後、標準的な緩衝液中にペレットを再懸濁し（2：1（W / V））、1％トリトンX-100と混合し、脂質沈着物を可溶化するために連続振盪（100 rpm）で下に20分間それをインキュベートします。
  4. 遠心分離機溶液（27,500×gで、1時間、4℃）、標準緩衝液で得られたペレットを3回洗浄し（1：1（W / V））。
  5. 標準緩衝液中で6時間、追加の遠心分離（27,500×gで、1時間、4℃）後に得られたペレットをインキュベートし（1：1（W / V））ペプチドグリカン50で結合を加水分解するためには0.2g / Lのリゾチームと混合。さらに懸濁液にDNアーゼIIおよびRNase（各0.4単位/ gのバイオマス）を追加します。
  6. 遠心分離後（45,500×gで、4℃、1時間）は、Tの低容量と上部白タンパク質相を再懸濁彼は、タンパク質サブユニットを含有する上清（<30 ml）を遠心分離します。
  7. 6 M塩酸グアニジン（6 MのGuHCl、50mMのトリス、pH値= 7.2）で1：1に混合することにより、白色の懸濁液を可溶化します。解決策は明るくなります。
  8. 追加の高速遠心分離（45,500×gで、1時間、4℃）に続いてのGuHCl処理液の滅菌濾過（0.2μm）を実行します。
  9. 透析膜チューブ（MWCO 50,000ダルトン）に上清を移し、48時間再結晶化バッファー（1.5 mMトリス、10mMのCaCl 2を、pH値= 8.0）に対してそれを透析しました。
  10. 45,500×gで、1時間4℃でチューブと遠心分離機に白の再結晶タンパク質ポリマー溶液を移します。超純水（<30ミリリットル）の低容量でペレットを再懸濁。
  11. その後、透析膜チューブに懸濁液を移し、バッファーの内容を削除するために24時間超純水に対して透析を行います。
    注：いくつかのバッファの変更や超純水During透析が不可欠です。
  12. 凍結乾燥機で精製SLP1を凍結乾燥。

実験3.特性とSLP1の定量

注：収着およびコーティング実験のためSLP1濃度は、UV-VIS分光光度法により定量しました。

  1. 直接光度計の低い測定台座の上に溶解SLP1サンプルのピペット2μL。タンパク質についての特性、波長280 nmの吸着最大でタンパク質濃度を決定します。 SLP1濃度を決定するために、0.61の吸光係数を使用してください。基準測定用SLP1無料のソリューションを使用してください。
  2. 実験（1 G / L及び0.2グラム/ Lのために所望の濃度に（0.9％のNaClを使用してバッチモードで吸着実験はpH = 6.0およびQCM-D実験は、再結晶化バッファを使用するため、でpH = 8.0）緩衝液でタンパク質を希釈それぞれ）。
  3. 標準bioanalによってSLP1品質および分子量を分析Laemmli、UK 52記載ytical方法ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）。
    1. 10％ポリアクリルアミド分離ゲルを用いたAu（0）-NPのインキュベーション後に、実験および例えば内SLP1を使用する前に、SDS-PAGEを行います。
    2. サンプルバッファーで栽培またはタンパク質サンプルの≈10μlのSDS-サンプルミックスの場合（1.97グラムTRISは、5 mgのブロモフェノールブルー、5.8ミリリットルグリセリン、1グラムのSDS、βメルカプトエタノール2.5ミリリットルを、50ミリリットルの超純水で満たす）で比1：1（v / v）のゲルポケットに95℃で4分間のインキュベーションの後、混合物をピペット。
    3. 60 Vの電圧で動作し、SDS-PAGE 30分のサンプルは、分離ゲルを通過したら、120 Vに収集ゲルと変化電圧を渡すまで。
    4. ゲル系からゲルを外し、固定液（10％酸性酸、50％無水エタノール）に1時間超純水と場所で洗い流し。その後、超純水でゲルをすすぎます。
    5. ステインゲル適応非特異コロイドクマシーブリリアントブルー法53,54を使用します。 72,73を脱色した後、製造業者のプロトコルに従って、ゲルドキュメンテーションシステムによって、SDS-PAGEの画像を撮影します。

バッチモードおよび金属定量4.収着実験

  1. バッチ吸着実験のために金属塩を希釈および1mMの初期金属濃度とは1g / Lの最終SLP1濃度にSLP1 / NaCl溶液と混合、H 2 O 3∙のHAuCl 4の金（III）ストック溶液を調製。 SLP1のない追加の陰性対照とトリプレットで実験を行います。吸着実験のために5ミリリットルの全容量を使用してください。
  2. （低濃HClおよびNaOH溶液でpHを調整）24時間2.0〜5.0の間で異なる事前調整されたpH値で、室温で連続的にサスペンションを振ります。
  3. 吸着した後、20分間の遠心15,000×gで、4℃でのサンプル）SEPARへ上澄み液からSLP1を食べました。
  4. 溶解したタンパク質の単量体を除去するために、20分間、15,000×gで4℃での限外濾過チューブに上清（MWCO 50,000 Da）で遠心これを転送します。
  5. ICP-MS 19,20によって得られたろ液中の金属濃度を決定し、SLP1乾燥質量によって収着金属のバック計算の結果を使用しています。原理を測定する方法及び使用済みICP-MSの構成要素の機会が、文献55に記載されました。
    1. 内部標準（1 mg / mlの）とマトリックスとロジウムとして1％のHNO 3を用いて、ICP-MS測定用の試料と参照を準備します。

5.金-NPの合成と粒子サイズの決意

注：クエン酸は、Au（0）-NPはMühlpfordt、H.らの前述の適合方法に従って合成した安定しました。 （1982）の直径を有する球状粒子を得た10 - 15ナノメートル56,57

  1. NPの形成のために、安定化の25mMのHAuCl 4∙3 H 2 Oの在庫を準備します。
  2. 19.75ミリリットル超純水に、このストック溶液の250μLを希釈し、連続振とう下で15分間、61℃でこれらをインキュベートします。
  3. 第二ストック溶液5ml（12mMのタンニン酸、7 mMのクエン酸ナトリウム二水和物、0.05 mMのK 2 CO 3）を用意し、15分間61℃で別々に2 番目のソリューションをインキュベートします。
  4. 定数は、溶液1に2 番目の原液を攪拌下に追加します。 61℃で少なくとも10分間、反応混合物を撹拌しました。その後、溶液を冷却し、QCM-D実験内SLP1格子上のNPコーティングのためにそれを使用します。
    注：得られたAu（0）-NPは、典型的に形成されたAu（0）58 -NPsの検出のために使用される520nmでの吸光度の最大でUV-VIS分光法で特徴づけました。溶液を4℃で保存することができます。
  5. 形成の大きさを分析また、動的光散乱として知られて光子相関分光法（PCS）によって金（0）-NP。
    1. NPサイズの決意について、層流ボックス内で無塵の条件でキュベットに合成金（0）-NP溶液1.5mlを転送し、サイズおよびゼータ電位、粒子寸法測定器でそれを分析します。 PCSおよび試料調製の詳細な説明はSchurtenberger、P.らに記載されています。 （1993）59、ジャイナ、R。ら。 （2015）60。

6. QCM-Dの実験 - SLP1格子の上表面上SLP1コーティングとAu-NP吸着

注：測定は、最大4つの流れモジュールを搭載したQCM-Dを用いて行きました。すべてQCM-D実験は、25℃で125μL/分の一定の流速で行いました。 SLP1コーティングおよび金属/ NPのインキュベーションは≈5 MHzでの基本周波数とSiO 2の圧電ATカット水晶センサ（Ø14ミリメートル）で行いました。すすぎ工程およびアドオンソリューションのitionは、代表的な結果の一部を図にマークされています。 QCM-D実験はSLP1の再結晶化により、後に金属と金属のNPの相互作用に続いて使用されるセンサーのクリーニングや表面改質で始まるステップの方法によりステップとして記述することができます。

  1. 清掃手順：
    1. センサーダミーと流体セルを装備。ポンプ少なくとも20 mlのスルーQCM-D及びチューブシステム（超純水（v / v）の2％の洗浄剤）、アルカリ性液体洗浄剤の（モジュールごとにそれぞれ）。その後システムを介して超純水の五倍の体積を（各モジュールあたり）ポンプ（300μL/ minに速度をアップフロー）。製造業者のプロトコルに従って、クリーニングを行ってください。
    2. 2％SDS溶液中でのインキュベーション（少なくとも20分）により、フローモジュール外のSiO 2のセンサーを清掃し、超純水61,62と、その後数回のセンサーをすすぎます。
    3. フィルタリングコンプの結晶を乾燥させ空気をressedと20分63,64のためのオゾン洗浄室に配置します。
    4. すべての有機内容を削除するために二回の洗浄手順を繰り返します。
    5. センサ表面から結合金属を除去するには、1 M HNO 3でセンサーをすすぎます。その後、超純水ですすぎ、すべての手順を実行します。
  2. 高分子電解質によってセンサ表面改質：
    注意：表面改質はいずれかの内部（手順を流れる）またはフローモジュール（のLbL技術）の外に行うことができます。これらの実験の範囲内の表面を変更するには、以下の方法を使用しました。
    1. 3グラムによって記事に特別に使用されるシステムについて前述のLbL技術40,41を用いて、ディップコーティングを介したポリエチレンイミン（PEI、MW 25,000）とポリスチレンスルホン酸（PSS、MW7万）の交互のPE層の/ Lのセンサーを変更Suhrの、M。ら。 （2014年）19。
    2. 深いワットで適切なPE-ソリューション内部のセンサーを配置エルプレートし、室温で10分間これらをインキュベートします。
    3. PE-溶液からセンサーを取り出し、超純水で集中的にすべてのディップコーティング工程の間にセンサーをすすぎます。
      注意：新たな表面改質は、正に荷電したPEIで少なくとも三つのPE層の終端から成ります。
    4. この外部変更後の流れモジュール内のセンサーを配置し、実験を開始する前に、超純水でリンスすることによってセンサーを平衡化。
  3. SLP1単層の再結晶：
    1. モノマーのポリマーへの変換のための4 M尿素SLP1を溶解します。
    2. 単量タンパク質15,000×gで1時間4℃で遠心分離し、より大きなタンパク質凝集物を除去します。
    3. 0.2g / Lの最終タンパク質濃度に再結晶化緩衝液で可溶化し、遠心分離SLP1上清を混合します。
      注：SLP1（自己組織化）のカルシウムによって再結晶化は、RECの添加により開始しますrystallizationバッファ。したがって、すぐに（流れモジュールの内部に配置）センサ125μL/ minの流量で混合した溶液をポンプ。再結晶は、QCM-D実験内で検出された周波数と消費シフトの安定した値の後に行われます。
    4. 周波数と消費シフトの安定した値が検出されるまでの流れモジュール内部のPE-修正センサの上部に成功したタンパク質の再結晶後125μL/ minの流量でwaterintensively再結晶バッファまたは超純でコーティングされたセンサーをすすぎます。
      注：SLP1単層およびAFMの研究への吸着後の実験のためにPEのSiO 2表面改質は 、図1に可視化されます。

図1
図1.回路図デザインのPE表面改質とSLP1単層のコーティング;この図はSuhrの、M。らから変更されています。 （2015年）19スプリンガーから許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 金属および金属NP相互作用：
    注：Au金属塩溶液（のHAuCl 4∙3 H 2 O）との吸着は、pH = 6.0で0.9％NaCl溶液で1 mMのまたは5mMの濃度で行いました。金-NP吸着は、pH≈5.0で1.6 mMの三ナトリウム - クエン酸緩衝液中で希釈されていない金-NPを用いて行きました。
    1. 周波数及び散逸シフトの安定した値が検出されるまでのフローモジュールに成功SLP1コーティングした後、0.9％NaCl溶液で激しく得SLP1層をリンス。
    2. 125μL/ minの流量でフローモジュールに準備された金属溶液（1ミリモル）及びNP溶液をポンプおよびSLに大量の吸着を追跡P1層。質量吸着のSauerbrey式（ 式1）を参照して周波数シフトを追跡することにより直接検出することができます。
    3. 金属および金属NPの相互作用を完了した後、弱い結合又は弱い添付金属またはナノ粒子を除去するために、金属/ NP空きバッファを持つ層をすすぎます。
      注：実験の図を図2に示されています。

図2
図2 * 66 401フロー・モジュールQFMを使用して、QCM-Dのセットアップの概略設計 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. データの記録と評価 ：
    1. ヘルツ（たΔfn）と損失（ΔDnは周波数の変化を記録します）QCM-D固有のソフトウェアを使用して、QCM-D実験内。
    2. 倍音n番目に適用されるセンサ表面に摩擦なし接続された薄くて硬質フィルムに対して有効である吸着質量感度（量Δm）のSauerbrey方程式/モデル（ 式1）65 66の評価のために使用します。カット水晶センサーで使用する5 MHzのための項C（のSauerbrey定数）は17.7 ngの∙ヘルツ-1∙cm -2で68です。剛性のために、均等に分布しており、十分に薄い吸着層は、良好な近似として式（1）を使用しています。
      式（1）
    3. メーカー固有のソフトウェアとの粘弾性分子68〜71の有効なケルビン・フォークトモデルに応じて追加のモデリングを行い、のSauerbreyモデルのそれと結果を比較します。
    4. 層の厚さの計算および質量吸着用重要なモデルパラメータとして1.35の吸着層の密度G∙cm -3のS層タンパク質72〜75について前述した値に相当します。タンパク質性の層と金属の相互作用の計算のために同じ値を使用します。

7. AFM測定

  1. 倒立光学顕微鏡で完全に行うことができ、AFMを用いた研究を行います。
    1. コー​​ティングされたQCM-Dセンサに直接再結晶化緩衝液または超純水を用いた液体のレコードAFM像。
    2. QCM-D実験後に超純水でセンサを洗浄し、AFM流体セルの内部に配置します。したがって、約1.5ミリリットルの総容量で、閉じた流体セルを使用しています。 30℃での流体セルの温度を一定に保ちます。
    3. 水に≈25 kHzでの共振周波数と<0.1 ​​N / Mの剛性とカンチレバーを使用してください。 2.5から10μm/秒の間のスキャン速度を調整します。
      4. 76減衰振動によって表面にカンチレバーの距離を決定します。
      注：Z値は、表面の正確な形状を表している高さの画像は、zスケールで示しています。振幅Z値は、走査パラメータに依存し、限られた情報を負担するため、振幅（擬似3D）画像は、zスケールなしで示​​されています。画像の解析は、3つの異なる評価ソフトウェアの77を用いて行きました 。

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Representative Results

微生物およびSLP1キャラの育成

細菌増殖の記録されたデータは、約5時間で指数増殖期の終わりを示します。以前の研究は、それにもかかわらず、定義されたメディアコンポーネントを使用して、培養の最適化またはfed-。最大収率19 4.36グラム/ L（SLP1は収穫のこの時点から単離することができることを湿潤バイオマス（≈1.45グラム/ L（BDW））を示していますバッチ培養戦略これは産業用アプリケーションのためのバイオマスの大量の使用を不可分である。高いバイオマス収量につながる。 オンラインとオフラインの記録栽培パラメータは、図3（a）に要約されてからの値。顕微鏡制御（ 図3B）時L.スフェリカス JG-B53の収穫ショー非胞子形成細胞の。


図3（A）は、オンラインとオフラインL.の栽培パラメータを測定Lの重要な細菌細胞のスフェリカス JG-B53および（B）顕微鏡画像スフェリカス JG-B53 400倍の倍率での収穫の時。この図はSuhrの、M。らから変更されています。 （2014年）19スプリンガーから許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

また、付加的に行わSDS-PAGEタンパク質プロフィール（図4A）は 、培養の5時間の時点でSLP1の最大量を示しています。 SLP1（≈150キロダルトン）に対応するタンパク質バンドが厚いですが、強度の損失に、ここからはaccompan観察されました可能なタンパク質の断片又は他のタンパク質の分離に起因する低分子量を有するタンパク質の増加によってIED。 （ 図4B）上記の方法で得られた単離および精製されたタンパク質のバンドが（116 kDaの）30 SLP1の配列決定データに基づいて算出した重量より重く、約150キロダルトンの分子量に相当します。これは、おそらく翻訳後修飾によるものです。 SDSゲルでの理論分子量と観察された分子質量との不一致のための他の理由は、おそらく、SDSゲル30に依存アーティファクトを充電しています。

図4
（A）のSDS-PAGEによって作られた図4のタンパク質プロファイルは、栽培サンプルと成功分離後SLP1を精製し、（B）から得られた細菌細胞を崩壊しました。このFiのグレはSuhrの、M。らから変更されています。 （2014年）19スプリンガーから許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

バッチ収着実験とICP-MSのAuの決意

最大の金属結合能力懸濁SLP1によって金（III）の（Q max）は、図5に示されている。結果は、金（III）は、安定調査したpH範囲内で24時間のインキュベーションの間にSLP1によって拘束されたことを示します。 100mgの金（III）/ gのSLP1 -結果は、約80の範囲内のQ maxを示します。要約値（ 表1）/グラムSLP1はサー、M.らによって以前に報告された（III）約75ミリグラムのAuの収着容量と比較しました。自己調整と実験から得られた（2014）金属塩溶液（pHは≈4.3）19を添加することによりpH値。要約すると、SLP1は、この要素のための高い結合能力を証明する最初に加えたAu（III）の高い量を結合する能力を示しています。

図5
Suhrの、M。らによって報告された自己調整pH値（≈4.3）を使用して吸着結果と比較して、pH調整実験内SLP1ポリマーに金（III）の容量（Q max）を最大結合金属の図5.図 。 （2014年）19。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

調査したpH範囲内で算出した金属除去効率（RE）は、50の間であった - このようにして再確認した60％Suhrの、M。らによって行われたsults。 40％程度の値が達成された（2014）。以前に行われた実験では、官能基、例えば、carboxylic-、ヒドロキシル、およびアミノ基のAu（III）の強力な相互作用が、L.のSLFB SLP1ようなS層タンパク質のために、比較タンパク質について観察されましたスフェリカス JG-A12 1,78。 Jankowski、U。ら。 （2010）主にもLの SLP1のために推定することができるSLFBのカルボキシル基と分光金（III）の強力な相互作用を検出スフェリカス JG-B53 20,79,80。また、還元剤の不存在下でのAu（0）に金（III）を低下させる固有のタンパク質特性は強い相互作用79の理由であり得ます。さらに、この研究の結果は、好適な低いpH値でSLP1の結合の傾向を示します。一方、また、SLP1の変性につながる可能性がより低いpH値での結合。 SLP1の研究は、pHにダウンタンパク質の安定性を証明しました=3.0（未発表の結果）。脱着酸性条件下での実験などを用いて、硝酸またはEDTAまたはクエン酸のような錯化剤を使用することから（データは示さず）、金が安定結合させたとSLP1ポリマーから放出されなかったことを検証します。

L.スフェリカスJG-B53のSLP1上のAu（III）
C 初期 （mg / Lで） 196.97
pH値 5 4.5 ≈4.3 23 4 3.5 3 2.5 2
値
Q 最大 88.3 85.3 74.7 102.5 94.1 81 101.9 96.9
（MGのAu（III）/ G SLP1）
RE 47.1 47.8 37.9 57.1 54.1 44.8 58.7 56.5
（％）

表1：最大の金属は 、ICP-MSで分析ソリューションにおけるAu（III）およびSLP1ポリマーとバッチ収着実験の 容量（Q max）が 金属除去効率（RE）を 結合。 Suhrの、M。らから、以前に公開された結果と比較したデータ。 （2014）19。

QCM-DによってトラッキングSLP1単層の再結晶化

周波数の即時の減少（Δfを5、Δfの7、Δfの9、Δfの11）は 、迅速な吸着とPE表面改質された（図6A）へのタンパク質の高い親和性を示しています。周波数の高速変更、損失（ΔD5、ΔD7、ΔD9、ΔD11）に等しいもすぐに増加します。この事実は、散逸値の増加をもたらすために速い減衰の表面に粘弾性分子の吸着を示します。最大周波数偏移は≈95 Hzから4.2のΔDの値で5分後に達成されます。後の段階で再結晶SLP1の唯一の再配列が起こります。 SLP1吸着は、次いで、こうしてTを確実にするために、60分かけて行きました彼はほとんど完全に覆われた表面を形成し、定期的に注文したタンパク質格子。実験は、正に帯電したPE層が安定したコーティングを達成するために不可分であることを示し、負の終了変更が弱く吸着し、より長いコーティング速度をもたらす38（データは示さず）。弱く付着したタンパク質および凝集物SLP1フリー再結晶化緩衝液で洗浄することにより除去しました。 Δfのの小さな変化は 、n低タンパク質脱離とSLP1の安定した吸着を確認します。これにもかかわらず、消費電力が大きく、弾性分子が除去されたことを示す≈2.8まで低下。

図6
QCM-Dで分析 修正SiO 2の センサー 上のSLP1の図6の再結晶化 。 （A）量Δf/ΔDプロットで、（B）の表面の厚さプロフィールE;この図はSuhrの、M。らから変更されています。スプリンガーとSuhrの、Mからの許可を得て（2014）19（2015）20。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

前の上記モデルを用いて算出した表面プロファイルは（ケルビン-フォークト弾性フィルムのモデル）および10.0 nmの（剛性層用のSauerbreyモデル）（図6B）の≈11.2ナノメートルのSLP1単層の厚さを示した。これらの値は、それよりも低いですSuhrの、M。らによって報告されました。 （2014年）。差はモデル内のタンパク質層の密度の異なる使用される値によって説明することができます。電流値は 、Lの生細胞の細胞表面上にS層タンパク質の層の厚さの現実に近くあるべきですスフェリカス JG-B53 31,42-。このモデル化は、私はそれのSauerbreyの関係を示していますなぜなら、吸着SLP1質量と厚さの過小評価につながる粘弾性液体フィルム81,82内せん断弾性波の伝播、音響薄いタンパク質性の層には不適切です。これは、S層タンパク質と、吸着工程中の水の分子のその結合の弾性特性によって説明することができます。タンパク質と水の相互作用を容易に吸着層83に空洞内に水和殻、粘性抵抗又は捕捉の形成によって説明することができます。これは、ケルビン - フォークトモデルによって測定上位層の厚さに影響し、また、2つの異なるモデルによって得られた層の厚さの違いを明確にすることができます。以前のAFMの研究では、周り8-12ナノメートルのSLP1格子の層厚を測定しました。質量SLP1の吸着、代わりの層の厚さ、1506.6 ngの∙cm -2の（ケルビン・フォークトモデル）の合計量Δmを計算することにより算出しました。サーフィンの質量の吸着のデータエースを表2にまとめとケルビン・フォークトモデルの値を用いて高質量の吸着を示しています。

m以下 Δmの最大 厚さ 厚さ
（NG / cm 2）を （NG / cm 2）を （nm）と （nm）と
（ケルビン-フォークト） （のSauerbrey） （ケルビン-フォークト） （のSauerbrey）
コーティングおよびすすぎ後SLP1 1,505.6 1,351.6 11.2 10

表2： 再結晶させて緩衝液で洗浄した後、QCM-Dによって分析 修正高分子電解質のSiO 2 結晶 のSLP1の吸着質量 （pH値= 8.0）と計算された層厚さを。

タンパク質性SLP1単分子膜で金属及びNP相互作用の検出のためのツールとしてのQCM-D

1mMから5mMの溶解のAu（III）で再結晶SLP1単層の相互作用を調べました。周波数および散逸の変化の記録されたデータの計算およびモデリングから得られた全吸着量の結果を表3に要約されている。単層のAu（III）の相互作用のQCM-D研究は、金属、生体分子のより深い理解を提供インタラクション。初めて、結合能、吸着速度、およびどのようにメタlは、タンパク質の安定性は、ナノ範囲で検討した影響を与えます。 SLP1単層に金属塩溶液を添加した後、周波数は、高速大量吸着を示す最初の5分以内に減少しました。以前の研究19でのPd（II）のような他の金属のために説明したようにそれにもかかわらず、金の吸着は60分後に完了しませんでした。質量増加は、18時間までに発生します。この時間の後、すすぎ工程では、吸着金属はほぼ安定して再結晶化SLP1層にバインドされていることを示す金属を含まない緩衝液を用いて実施しました。最後に、955.0±2.7 ngの∙cm -2の（ケルビン・フォークトモデル）の全金属吸収は1 mMの金（III）溶液の場合と4,534.4±5.5 ngの∙cm -2の（ケルビン・フォークトモデル）内で得られました5 mMの金（III）の場合。 5mMの金（III）の溶液によって得られたより高い値は、最小の金属はAuを（0）-NPこの溶液から形成されたSLP1の固有の還元特性によって説明することができます。これらの適切な削減SLP1のつながりはすでにパラジウム（II）及びAuのための以前の研究で報告されている（III）32,33,79,84を 。データはまた、金溶液との相互作用は、タンパク質層の不安定化をもたらさないことを示しました。これはまた、タンパク質ポリマーを使用して、ICP-MSの測定により確認されたSLP1に金（III）の特異的結合と安定を示しています。

合成中のAu（0）-NPの形成は、赤みを帯びたものに開始した黄色の溶液から色の変化によって可視化することができました。この色の変化は、金属ナノ粒子の表面プラズモン振動の励起によって引き起こされると（0）1,78 -NPs金の形成を証明しています。さらに小さいのNPは、溶液の異なる着色で可視およびPCS測定の結果によって検証還元剤の濃度（より高いタンニン酸濃度）85の変形によって合成することができた（データは示さず）。上の他方では、タンニン酸の濃度を増加させることNP安定性の喪失をもたらし、NPは20に凝集する傾向があります。原理の証明として、予め合成されたAu（0）-NPs（10のサイズ分布- 図7Aに見られるPCSにより測定し18nmで）を48時間中断しSLP1と共にインキュベートし、SDS-PAGEにより分析しました。 図7（b）に示すタンパク質プロファイルは、Au（0）-NPsはSLP1構造を乱さないことをQCM-Dデータから引き出された結論を、確認します。 150 kDaのタンパク質で観察されたバンドはインタクトSLP1の存在を証明します。

図7
PCSとSLP1の（B）SDS-PAGEタンパク質プロフィールにより測定し、予め合成のAu（0）-NPsの図7（A）の数加重サイズ分布。レーン1：2μgのSLP1のAu（0）-NPs相互作用およびレーン2前：懸濁液中の1μgのSLP1ポリマー48時間後のincuba合成前のAu（0）-NPsでる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

NP合成および特徴付けの後、QCM-Dの実験を行いました。あらかじめ合成金属のAu（0）-NPsの吸着が例示たΔf/ΔDプロット（ 図8 A）で、厚さと質量プロファイル（ 図8B）としてQCM-Dの実験のために示されています。

図8
事前合成金の図8.吸着は（0）Δfを/ΔDプロットと（B）層表面と質量プロファイル内のQCM-D、（A）によって分析し再結晶化SLP1格子上に-NPs。「ブランク>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

18nmの球状のAu（0）-NPs - それは、QCM-Dは、10の吸着を検出するために使用できることが確認できました。未希釈のAu-NP溶液を添加した後（520ナノメートル = 1）に記載の合成によって得られる、周波数のSauerbrey式（ 式1）の予測によって記述質量吸着の直接的な指標である、減少します。金の吸着は（0）-NPsは、ほとんど未満60分以内に完了しました。それは、すべての反応部位または孔は金（0）-NPsによって占有されたと仮定することができるように、この時間の後、それ以上のNPは、SLP1格子の上に堆積させました。消費が示さ減少は、NPの相互作用によってSLP1格子原因の補強に所属することができます。総質量吸着の値を表3に要約されている。NPフリークエン酸緩衝液であっても集中的なすすぎがネイリードNPの脱着にもSLP1単層の剥離にTHER。したがって、安定した強い相互作用は、Au（III）と同じ点でのAu（0）-NP相互作用のために予測することができます。

金属 C 金属 Δmの最大 Δmの最大 厚さ 厚さ
（NG / cm 2）を （NG / cm 2）を （nm）と （nm）と
（ケルビン-フォークト） （のSauerbrey） （ケルビン-フォークト） （のSauerbrey）
1 mMの 955 932.6 --- ---
5 mMの 4,534.4 4,687.9 --- ---
金（0） - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
NP

表3：再結晶SLP1格子のAu（III）の相互作用の後（pH値= 6.0）とAu-NP吸着QCM-DとAu（0）-NPコーティング後の層の厚さの計算によって分析した（pH値= 4.7）に吸着質量 。 Suhrの、M。らから、以前に公開された結果と比較したデータ。 （2014年）19。

ナノスケール構造体の可視化のためのAFM

図9では、SLP1のタンパク質格子は、振幅画像などその典型的正方格子（P4）で示されているPE修正センサーに再結晶しました。以前の実験30の結果に匹敵する14ナノメートル、 -格子定数は、13のように決定することができます。 AFMによって測定さ2.0 nmの±10nmの層厚が≈11.2ナノメートル（ケルビン - フォークトモデル）のQCM-D測定の予測膜厚を確認しました。表面高さの小さな違いは、計算学会事実によって説明することができます高解像度のAFM研究は、一部の領域のみを示しているQCM-Dフィットはセンサ全体の面積を考慮ated。これを考えると、センサ表面に付着したタンパク質凝集体は、層の厚さにそれぞれ吸着質量の計算に含まれ、AFMにより決定より高い層の厚さにつながりました。

図9
図9 AFM Lの 再結晶SLP1格子の振幅像 スフェリカス JG-B53 QCM-Dの結晶の上に直接コーティングした後およびバッファとマークされた地域の倍率ですすぎ 、この図はSuhrの、M。らから変更されています。 （2014年）19スプリンガーから許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10はそのまま SLP1を示し金（III）溶液とのインキュベーション後に格子。これは、インキュベーション後に、タンパク質格子が完全に無傷のままであったことを示すことができます。これは、コーティングの安定性を予測したQCM-Dの実験からの結果を確認します。 図11AおよびBに吸着プリ合成金（0）-NPs（サイズは10で変化- PCSによって決定さ18 nm）のSLP1格子のが示されています。粒子サイズに、Auが（0）-NPsはSLP1の細孔内に吸着され、SLP1のP4の -symmetryに従っていません。 Au（0）-NPsタンパク質格子上に分布統計あります。すなわち、約10ナノメートル19,20の範囲内で、さらに小さい23 nmおよび- AFM高さ画像で粒子サイズを測定することによって、NPのサイズは16の範囲である（データは示さず）。この版（ 図8に示す ）、PCSにより予め測定決定NPサイズはifies。

図10
マーク領域の5 mMの金（III）溶液と倍率のインキュベーション後のQCM-Dセンサー結晶の再結晶化し、無傷SLP1格子の図10のAFM振幅画像 。この図はSuhrの、M。らから変更されています。スプリンガーとSuhrの、Mからの許可を得て（2014）19（2015）20。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図11
吸着したAu（0）-NPs QCM-Dセンサー結晶の再結晶化SLP1格子上（左の図11（A）のAFM振幅画像）及び（B）は、3D（右）の表面形状を再構築。この図は、シュプリンガーとラフ、J.らの許可を得てSuhrの、M。（2015）20から変更されています。 （2016） ラフ、Jら。 S層タンパク質ベースのエンジニアナノ構造における産業用アプリケーションに基づくナノコンポジット。 （編Tijana Z.グローブ＆Aitziber L. Cortajarena）（スプリンガー、2016年（提出））。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

この研究では、異なる分析方法の組み合わせを用いて調べたS層タンパク質の金の結合を研究しました。具体的には、金の結合は、例えば 、感覚面鉱業水またはプロセス溶液から金を回収するだけでなく、材料の建設のためだけでなく、非常に魅力的です。 Auの相互作用の研究のために金（Au（III）及びAu（0）-NPs）に懸濁し、SLP1の単層を再結晶化して、タンパク質が持っていたが単離されます。したがって、本研究では、グラム陽性菌株L.の成功した培養を示していますスフェリカス JG-B53と表層タンパク質SLP1の分離。それにもかかわらず、栽培やタンパク質の分離が困難なままであり、最適化されなければなりません。バイオマスとS層タンパク質の大規模生産は、金属選択フィルタ材料の製造のために、例えば 、両方の工業的応用のための前提条件です。その応用の可能性があるundoubtedl有毒金属の除去または処理水に溶解させた有価金属の回収、排水、または排水のための高Y。さらに、S-層の適用可能性は、このようなバイオセンサーおよび触媒として他の生体触発材料、での追加の可能性を考慮しても大きくなっています。

中断SLP1ポリマーのバッチ吸着実験は、2.0から5.0に調査したpH範囲内のAu（III）の高い、安定した結合を示しました。これにより、最大60％の金属除去効率に達することができました。この顕著な結合挙動は、おそらく、タンパク質の表面に存在するカルボキシル基と窒素基軸受の相互作用を介して誘導さSLP1のAu（III）の強い相互作用によって説明することができます。この引数は、同様の歪みLの FTIRとEXAFS調査によって強化することができスフェリカス JG-A12 32,79。また、SLP1の固有の削減プロパティはのReduによって金（III）の高いREを説明することができます金（0）ナノ粒子にそれをcing。これは、S層は、環境への細菌の最初のインタフェースとして、金属結合で主に関与すべきであると考えることができます。調査したpH範囲内で、102.5 mgの金（III）/グラムSLP1と最も高い金属結合能力は、pH 4.0で達成されました。この結合能は、 枯草菌の単離された細胞壁（71.5 mgの金（III）/ g）のための他の生体成分 、例えば、について報告さよりも高い86またはクロレラ・ブルガリス （98.5 mgの金（III）/ g）の8のバイオマス。

ICP-MSは、SLP1ポリマーによって結合された金属の決意のために使用される非常に感度の高い方法であり、この研究では金の最小量を検出することができます。 ICP-MSは、 例えば、容易なハンドリングシステムと低い検出限界、微量金属の測定を実行するための多くの利点を提供しています。 1 PPT - 0.1までの金の場合にはこれは、この方法で、低濃度範囲でbiosorptiveプロセスを調査するための多彩なツールになります秒。しかし、この研究での結果は、懸濁S層ポリマーで得られ、容易に表面に再結晶S層格子に移すことができないため、ICP-MSの限界を示しています。例えば、単離されたタンパク質ポリマーの直接関係は重要な細菌細胞のそれらS層構造に対して行われませんでした。また、ICP-MS測定は、金属吸着の運動の決意を許可していません。従って、固定化された薄いタンパク質膜で金属結合を調査するための方法は、より適切な見つけることが必要です。

本研究では、QCM-D分析は、表面上にS層格子のその場での形成と同様に、タンパク質上のAuの付着を検出するために適用しました。従って、QCM-Dは、分子の吸着との相互作用のプロセスを認識するための堅牢で再現性のある方法です。さらに、QCM-Dは、比較的単純な、費用対効果の高い、とsを監視するための無害な方法であり、uchがオンラインを処理します。この方法は、≈0.5 ngの∙cm -2での液体の最大質量感度と質量変化を検出するという利点を有しています。これは、溶解した金属とタンパク質の、例えば 、弱い相互作用を検出するために、低濃度範囲で吸着量を測定するための可能性を可能にします。 QCM-Dの欠点は、これが、例えば、タンパク質格子の可視化を可能にする構造のイメージング方法ではないということです。従って、他の技術が必要とされています。

QCM-Dは、AFMイメージングによって追跡したこの研究で分析します。これらの方法の組み合わせは、このように、彼らが薄いタンパク質性フィルムの金属相互作用を研究するための多目的なツールであることを証明し、吸着動態およびコーティング用のAu吸着の影響の研究を可能にしました。また、技術的な支持体上のS層タンパク質の確実な再結晶化は、その後のタンパク質相互作用の研究のために必須であることが示されました。そこ前部、接着促進剤を使用して、表面の修飾は、重要です。高速タンパク質コーティングするための改良された方法に対するSiO 2表面およびタンパク質層のリードとの間に中間層として高分子電解質の説明実装（正に帯電したPEで終了）。積極的に高分子電解質層は、例えばについて以前L.の重要な細菌細胞の固定化を説明してきた電荷の正の効果スフェリカス JG-B53 31。提示PE-層の実装では、S層タンパク質の後に成功しかつ再現可能な再結晶のために最も重要な、重要なステップです。

それはSLP1の薄層の調査のため、QCM-Dはリアルタイムで単層フィルムのようなタンパク質の再結晶にそれぞれの質量の吸着を表示するための良い方法であることを証明することができました。これはまた、Lの S層タンパク質SBPAの再構成のために以前に観察することができスフェリカス</ em>のCCM2177 47。その後の高分解能AFMを用いて、タンパク質の自己集合体の格子構造の変化を可視化することができる分析。 AFM測定はSLP1のP4対称性を明らかにし、約10nmのSLP1のモデル化された層の厚さを確認します。また、タンパク質層を有する溶解した金属イオンの直接的な相互作用は、QCM-Dは、基礎となるタンパク質層により、金（III）の良好な結合を証明することによってモニターすることができます。最も小さい金の予想形成（0）-NPs QCM-D測定内SLP1格子の固有の還元特性に起因するタンパク質の細孔内部に金（III）溶液を、その後のAFM測定によって検出されませんでしたから。これは、AFMの解像限界と本研究で設定した実験に関連している可能性があります。これは、この技術の制限とサブナノメートルスケールでの生体分子のための高分解能イメージングの必要性を示しています。しかし、再結晶SLP1層の高い安定性は、目から推定することができますEは、QCM-結果を得て、AFM調査により確認しました。

結論として、SLP1ポリマーを調べたpH範囲内の金のための高い金属結合能を有することを示すことができました。さらに、調査はSLP1格子は良好なマトリックス金属イオン結合と、金属ナノ粒子の固定化のためのものであることを明らかにする。それは、この記事で使用される各メソッドは小さな金属の相互作用を検出する可能性があることを示すことができ、またはAFMの場合には、ナノスケールの範囲内の構造を視覚化することができます。が、それだけで分子レベルで調べたタンパク質の知識と理解を向上させることを可能にしたこれらの示す方法の組み合わせによるものです。

主に、QCM-DおよびAFMは、タンパク質単分子層吸着し、金属や機能性分子との相互作用の将来の調査のための選択の好ましい方法です。これらの2つの方法、S層タンパク質広告の検出を組み合わせることにより収着プロセスと表面画像は、生菌の知識とその環境との相互作用を強化するために転送することができるかもしれない分子プロセスへの洞察を提供します。本研究では、タンパク質と金属の相互作用を理解するのに役立つ可能な方法の抜粋を示しました。生体分子の調査を分光するために、多様な分析およびクロマトグラフィー法に至るまで詳細にこのようなプロセスの知識を向上させる可能性があり、今後の研究に含まれるべきである。その他の役立つテクニック

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

本研究の一部はBMWiとBMBFプロジェクト」Aptasens」（BMBF / DLR 01RB0805A）が資金を提供し、IGF-プロジェクト「S-ふるい」（490 ZBG / 1）によって資金を供給されました。英語のネイティブスピーカーとして原稿を読み取るためのAFM研究中およびエリックV.ジョンストンへの彼の貴重な助けのためのトビアス・J・ギュンターに感謝します。さらに、この論文の著者は、Manjaフォーゲル、ナンシーアンガー、カレンE. Viacavaとヘルムホルツ研究所のグループバイオテクノロジー（ICP-MS測定における支援のためのリソースエコロジー研究所から）アリーンリッターとサブリナGurlitに感謝したいと思います資源技術のためのフライベルク。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

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SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから<em&gt; Lysinibacillusスフェリカス</em&gt; JG-B53 - 生体分子金属研究のためのツールと​​して、QCM-D、ICP-MSおよびAFM
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