Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Au-Samspill Slp1 Polymers og ett lag fra Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

På grunn av den økende bruken av gull i flere applikasjoner som elektronikk, katalysatorer, biosensorer, eller medisinske instrumenter, har etterspørselen av dette edelt metall vokst de siste par års tid 6-9. Gull samt mange andre edle og tungmetaller slippes ut i miljøet via industrielle utslipp i fortynnede konsentrasjoner, gjennom gruvevirksomhet, og avfallshåndtering 7,8,10, selv om de fleste miljøforurensning av tunge eller edle metaller er en pågående prosess hovedsakelig forårsaket av teknologiske aktiviteter. Dette fører til en betydelig innblanding av naturlige økosystemer og potensielt kan true menneskers helse 9. Kjenner disse negative utfall fremmer jakten på nye teknikker for å fjerne metaller fra forurensede økosystemer og forbedringer i resirkulering metaller fra industrielt avløpsvann. Veletablerte fysikalsk-kjemiske metoder som utfelling eller ionebytting ikke er så effektiv, særlig i høyly utvannet løsninger 7,8,11. Biosorption, enten med levende eller død biomasse, er et attraktivt alternativ for rensing av avløpsvann 10,12. Bruken av slike biologiske materialer kan redusere forbruket av giftige kjemikalier. Mange mikroorganismer er blitt beskrevet til å akkumulere eller immobilisere metaller. For eksempel kan celler av Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 er vist en høy bindingskapasitet for edle metaller, for eksempel, Pd (II), Pt (II), Au (III), og andre giftige metaller som Pb (II) eller U (VI) 4,13, celler av Bacillus megaterium for Cr (VI) 14, celler av Saccharomyces cerevisiae på Pt (II) og Pd (II) 15, og Chlorella vulgær for Au (III) og U (VI) 16 , 17. Bindingen av foregående metaller som Au (III), Pd (II), og Pt (II) har også blitt rapportert for Desulfovibrio desulfuricans 18 og for L. sphaericus JG-B53 19,20. Likevel, ikke all mikrober binde store mengder metaller og deres søknad som sorptive materialet er begrenset 12,21. Videre metall bindingsevne avhenger av forskjellige parametre, f.eks celle sammensetning, den brukes bio-komponent, eller miljømessige og eksperimentelle forhold (pH, ionestyrke, temperatur etc.). Studiet av isolerte celleveggfragmenter 22,23, som membranlipider, peptidoglykan, proteiner eller andre komponenter, hjelper til å forstå den metallbindende prosessene komplekse konstruerte hele celler 8,21.

Cellekomponenter fokusert på i denne studien er S-lags proteiner. S-lag protein er en del av den ytre celleveggen av mange bakterier og archaea, og de utgjør ca 15 - 20% av den totale proteinmasse i disse organismer. Som det første grensesnittet til omgivelsene, disse celle forbindelsene en sterk innvirkning på de bakterielle sorpsjons-egenskaper 3. S-lags proteiner med molekylvekter i området fra førtitil hundrevis av kDa produseres inne i cellen, men er montert utenfor der de er i stand til å danne sjikt på lipidmembraner eller polymere celleveggkomponenter. Når isolert, nesten alle S-lags proteiner har den iboende egenskap å spontant selv montere i suspensjon, på grensesnitt, eller på flater som danner plane eller tube-lignende strukturer 3. Tykkelsen av proteinet monolaget avhenger av bakterier, og er innenfor et område på 5 - 25-nm 24. Generelt kan de dannede S-lag protein strukturer har en skrå (p1 og p2), square (p4) eller sekskantet (p3 eller P6) symmetri med gitter-konstanter på 2,5 til 35 nm 3,24. Gitterdannelse synes å være i mange tilfeller avhengig av divalente kationer og hovedsakelig på Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-lag basert nanocomposites for industrielle applikasjoner i Protein-baserte Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (innsendt)). Ikke desto mindre, den fullstendige reaksjonen kaskade av monomer folding, monomer-monomer interaksjon, dannelse av et gitter, og rollen til forskjellige metaller, spesielt divalente kationer så som Ca2 + og Mg2 +, er fortsatt ikke fullstendig forstått.

Den gram-positive belastning L. sphaericus JG-B53 (omdøpt fra Bacillus sphaericus etter ny fylogenetisk klassifikasjon) 27 ble isolert fra uran mining avfallet hoper "Haberland" (Johann, Sachsen, Tyskland) 4,28,29. Dets funksjonelle S-lag protein (Slp1) besitter en kvadratisk gitter, en molekylvekt på 116 kDa 30, og en tykkelse på 10 nm på ≈ levende bakterieceller 31. I tidligere studier, ble den in vitro dannelse av en lukket og stabil protein lag med en tykkelse på omtrent 10 nm oppnås på mindre enn 10 min 19. Den relaterte belastninger L. sphaericus JG-A12, også et isolat fra "Haber" haug, har høy metall-bindingskapasitet og dens isolerte S-lag protein har vist en høy kjemisk og mekanisk stabilitet og god absorpsjon prisene for edelmetaller som Au (III), Pt (II), og Pd (II) 4,32,33. Denne bindingen av edle metaller er mer eller mindre spesifikk for noen metaller, og er avhengig av tilgjengeligheten av funksjonelle grupper på den ytre og indre protein overflaten av polymeren og i dets porer, ionestyrke og pH-verdien. Aktuelle funksjonelle grupper for metall interaksjon med proteiner er COOH, NH2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - og SO. I prinsippet metallbindende kapasitet åpne et bredt spekter av applikasjoner, Raff, J. et al. S-lag basert nanocomposites for industrielle applikasjoner i Protein-baserte Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (innsendt)). f.eks, som biosorptive komponenter for fjerning eller gjenvinningoppløste giftige eller verdifulle metaller, maler for syntese eller definert deponering av regelmessig strukturerte metalliske nanopartikler (NPS) for katalyse og andre bio-konstruerte materialer som bio-sensorisk lag 3,5,18,33. Jevnlig arrangert NP arrays som Au (0) -NPs kunne brukes til større applikasjoner som spenner fra molekylær elektronikk og biosensorer, ultrahøy tetthet lagringsenheter, og katalysatorer for CO-oksidasjon 34-37. Utviklingen av slike programmer og smart design av disse materialene krever en dypere forståelse av de underliggende metall bindende mekanismer.

En forutsetning for utviklingen av slike bio-baserte materialer er pålitelig gjennomføring av et grensesnittsjikt mellom biomolekylet og den tekniske overflaten 38,39. For eksempel, polyelektrolytter montert med lag-på-lag (LbL) 40,41 teknikken har blitt brukt som et grensesnittlag for omkrystallisering av S-lag protein 39 19,42, Raff, J. et al. S-lag basert nanocomposites for industrielle applikasjoner i Protein-baserte Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (innsendt)). Imidlertid er den komplekse mekanismen for protein adsorpsjon og protein-interaksjon overflate ikke er helt forstått. Spesielt informasjon om konformasjon, mønster orientering, og belegg tettheter er fortsatt savnet.

Kvartskrystall mikro med ødsling overvåking (QCM-D) teknikken har tiltrukket seg oppmerksomhet i de siste årene som et verktøy for å studere protein adsorpsjon, belegg kinetikk, og samhandling proprosesser på nanometerskala 19,43-45. Denne teknikken gjør det mulig for den detaljerte påvisning av masse adsorpsjon i sanntid, og kan benyttes som en indikator for proteinet selvsammen prosess og kobling av funksjonelle proteinmolekyler på gittere 19,20,42,46-48. I tillegg QCM-D-målinger åpne muligheten til å studere metall interaksjonsprosesser med det proteinholdige lag under naturlige biologiske forhold. I en fersk undersøkelse, samspillet av S-lag protein med utvalgte metaller som Eu (III), Au (III), Pd (II), og Pt (II) har blitt studert med QCM-D 19,20. Det adsorberte protein Laget kan tjene som en forenklet modell av en cellevegg av gram-positive bakterier. Studiet av denne enkeltkomponent kan bidra til en dypere forståelse av metall interaksjon. Men ikke utelukkende QCM-D eksperimenter ikke tillate uttalelser om overflatestrukturer og påvirkninger av metaller til protein. Andre teknikker er nødvendig for å oppnå slik informasjon. En poslighet for bildebehandling bio-nanostrukturer og innhente informasjon om strukturelle egenskaper er atomkraften mikroskopi (AFM).

Målet med den fremlagte studien var å undersøke sorpsjon av gull (Au (III) og Au (0) -NPs) til S-lag protein, spesielt Slp1 av L. sphaericus JG-B53. Forsøkene ble utført med proteiner suspendert i batch skala i et pH-område på 2,0 - 5,0 ved hjelp av ICP-MS og med immobiliserte S-lag ved hjelp av QCM-D. I tillegg, ble innflytelsen av metallsaltløsning på gitteret stabilitet undersøkt med påfølgende AFM studier. Kombinasjonen av disse teknikkene bidrar til en bedre forståelse av in vitro metall samhandlingsprosesser som et verktøy for å lære mer om forpliktende aktiviteter hele bakterieceller om konkrete metall slektskap. Denne kunnskapen er ikke bare avgjørende for utviklingen av gjeldende filtermaterialer for utvinning av metaller for miljøvern og bevaring av rekilder 49, men også for utvikling av matriser av svært bestilt metalliske NPs for ulike tekniske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikroorganisme og dyrkningsforhold

Merk:. Alle forsøk ble gjort under sterile forhold L. sphaericus JG-B53 anskaffet fra Cryo-bevart kultur 29,30.

  1. Overføring cryo-konservert kultur (1.5 ml) under ren benk til 300 ml steril næringsbuljong (NB) media (3 g / l kjøttekstrakt, 5 g / l pepton, 10 g / l NaCl). Deretter omrøres løsningen i minst 6 timer ved 30 ° C for å oppnå pre-kulturen for dyrking.
  2. Dyrke bakteriene under aerobe forhold i NB medier ved pH = 7,0, 30 ° C i en 70 L skalert steam-in-place bioreaktor. Derfor fylle reaktoren med ≈ 57 L avionisert vann. Legg til og oppløse solid NB media direkte i bioreaktor (konsentrasjoner se ovenfor).
    1. I tillegg legger antiskum middel (30 mL / L NB-media) til media for å undertrykke skumdannelse under dyrking, deretter autoklav (122 ° C, temperatur holdetid 30 min) mediainne i reaktoren innretningen.
  3. Kjøl ned media og utføre komplett oksygenmetning. Juster pH til 7,0 (ved bruk av en MH 2 SO 4 og 2 M NaOH) og starte den automatiske inokulering av 300 ml forkultur. Start data innspillingen av dyrkings parametre på vaksinasjonen punktet. Logg online parametre f.eks oppløst oksygen nivå (DO 2), syre og base tillegg, og pH-verdier innenfor dyrking.
    1. Overvåke bakterievekst på nettet ved de ikke-invasive turbiditetsmålinger.
  4. Utføre ytterligere prøvetaking etter hver time dyrking og avgjøre videre parameter som bio tørrvekt (BDW) og offline optisk tetthet (OD). Derfor samler 20 ml dyrkingsbuljong ved hvert prøvepunkt under sterile betingelser.
    1. Bestem offline OD ved fotometriske målinger av adsorpsjon ved 600 nm. Bruk steril filtrert NB-medium som en tom verdi. After nådd adsorpsjon> 0,4 ​​fortynnet cellesuspensjon følgende lineariteten til Beer-Lambert loven.
    2. For bestemmelse av BDW sentrifuge 1 til 5 ml av bakteriesuspensjonen (avhengig av celletetthet) ved 5000 xg i 5 min ved RT. Tørk det oppnådde cellepellet ved 105 ° C i en varmeovn inntil massen stabilitet og måle pellet masse.
  5. Ta mikroskopiske bilder med optisk fasekontrastmikroskop forskning på 400 og 1000 gangers forstørrelse (fasekontrast kondensator 2 og 3 henholdsvis) for kontroll av bakterievekst og som et kryssforurensningskontroll.
  6. Etter å ha nådd den eksponentielle vekstfasen detektert av nettet gjøre 2 og nettet turbiditet, høste biomassen ved gjennomstrømning sentrifugering ved 15 000 xg, 4 ° C og vaskes biomasse to ganger med standard buffer (50 mM TRIS, 10 mM MgCl2, 3 mM NaN3, pH = 7,5).
    Merk: Det oppnådde biomassen pellet lagres ved -18 & #176; C inntil videre bruk for isolasjon.

2. S-lag protein Isolering og rensing

Merk: Rens Slp1 polymerer ifølge en tilpasset metode som beskrevet tidligere 2,19,30,32,50,51.

  1. Homogenisere vasket og tint urene biomasse oppnådd fra dyrking i standard-buffer (1: 1 (v / v)) for å fjerne flageller ved hjelp av en dispergator (nivå 3, 10 min) under isbad avkjøling ved 4 ° C.
  2. Sentrifuger suspensjonen (8000 xg, 4 ° C i 20 min) og vask den oppnådde pellet to ganger med standard buffer (1: 1 (v / v)). Etter vasking og sentrifugering (8000 xg, 4 ° C i 20 min), resuspender pelleten i standard-buffer (1: 1 (v / v)), tilsett DNase II og RNase (0,4 enheter / g biomasse) til suspensjonen og oppløse cellene ved 1000 bar med en høytrykks-homogenisator. Deretter sentrifugeres suspensjonen ved 27 500 xg, 4 ° C i 1 time.
    Merk: Kontroll cellesuspensjon med forsknings microscope. Brudd er fullført når mindre enn 2 - 3 intakte celler som er synlige i lys innen mikroskopet i 400 gangers forstørrelse.
  3. Vask pelleten to ganger med standard buffer (1: 1 (v / v)) og utfører sentrifugering på nytt. Etterpå resuspender pelleten i standard-buffer (2: 1 (w / v)) blandes med 1% Triton X-100 og det inkuberes i 20 minutter i henhold til etterfølgende rysting (100 rpm) for å oppløse lipidavleiringer.
  4. Sentrifuger oppløsningen (27 500 xg, 4 ° C i 1 time), og vaske de erholdte pellet tre ganger med standard buffer (1: 1 (v / v)).
  5. Inkuber pellet oppnådd etter ytterligere sentrifugering (27 500 xg, 4 ° C i 1 time) i 6 timer i standard-buffer (1: 1 (v / v)) blandes med 0,2 g / l lysozym, for å hydrolysere bindinger i peptidoglykan 50. I tillegg legger DNase og RNase II (hver 0,4 enheter / g biomasse) til suspensjonen.
  6. Etter sentrifugering (45 500 xg, 4 ° C, 1 time), resuspender den øvre hvite protein fase med et lavt volum av than sentrifugering supernatant (<30 ml) inneholdende protein subenheter.
  7. Oppløse den hvite suspensjonen ved å blande 1: 1 med 6 M guanidin hydroklorid (6M GuHCI, 50 mM TRIS, pH = 7,2). Løsningen blir klar.
  8. Utføre sterilfiltrering (0,2 um) av den GuHCI behandlede oppløsning, etterfulgt av en ytterligere høyhastighetssentrifugering (45 500 xg, 4 ° C i 1 time).
  9. Overfør supernatanten til dialysemembranrørene (MWCO 50 000 Dalton), og dialysert mot den omkrystallisering buffer (1,5 mM Tris, 10 mM CaCl2, pH = 8,0) i 48 timer.
  10. Overfør den hvite rekrystallisert proteinpolymeroppløsning i rør og sentrifuger ved 45 500 xg, 4 ° C i 1 time. Resuspender pelleten i et lite volum av ultrarent vann (<30 ml).
  11. Deretter overfører suspensjonen inn i dialysemembranrørene og utføre en dialyse mot ultrarent vann i 24 timer for å fjerne bufferinnhold.
    Merk: Flere endringer av buffer eller ultrarent vann during dialyse er uunnværlig.
  12. Lyofilisere den renset Slp1 i en frysetørker.

3. Karakterisering og Kvantifisering av Slp1 for Experiments

Merk: Slp1 konsentrasjon for absorpsjon og belegg eksperimenter ble kvantifisert ved UV-VIS spektrofotometri.

  1. Pipetter 2 pl av prøve oppløst Slp1 direkte på den nedre sokkel måling av fotometeret. Bestem proteinkonsentrasjonen ved adsorpsjon maksimum ved en bølgelengde på 280 nm, karakteristisk for proteiner. Bruk ekstinksjonskoeffisient på 0,61 for å bestemme Slp1 konsentrasjon. Bruk Slp1 gratis løsning for referansemålinger.
  2. Fortynn proteinet med buffer (for absorpsjon eksperimenter i batch-modus bruker 0,9% NaCl, pH = 6,0 og for QCM-D-eksperimentene bruke omkrystallisering buffer, pH = 8,0) til ønsket konsentrasjon for eksperimenter (1 g / l og 0,2 g / l henholdsvis).
  3. Analyser Slp1 kvalitet og molekylvekt ved standard bioanalytical metode natriumdodecylsulfat polyakrylamid-elektroforese (SDS-PAGE) som beskrevet av Laemmli, UK 52.
    1. Utfør SDS-PAGE før du bruker Slp1 innen eksperimenter og f.eks etter Au (0) np inkubasjon bruker 10% polyakrylamid separasjons geler.
    2. For SDS-samples blanding ≈ 10 ul av dyrkingen eller proteinprøven med prøvebuffer (1,97 g TRIS, 5 mg bromfenolblått, 5,8 ml glyserol, 1 g SDS, 2,5 ml β-merkaptoetanol, fylles med ultrarent vann til 50 ml) i et forhold på 1: 1 (v / v) og pipetter blandingen etter 4 minutters inkubering ved 95 ° C inn i gelen lommene.
    3. Run SDS-PAGE i 30 minutter ved en spenning på 60 V til prøvene passere innsamling gelen og endre spenningen til 120 V når passerer separasjons gel.
    4. Fjern gelene fra gelen system, skyll med ultrarent vann og sted i 1 time inn i fikseringsoppløsning (10% eddiksyre, 50% absolutt etanol). Etterpå skyll geler med ultrarent vann.
    5. Stain gelsved hjelp av en tilpasset uspesifikk kolloidal Coomassie brilliant blue metode 53,54. Etter avfarging 72,73, ta SDS-PAGE-bilder ved gel dokumentasjonssystem i henhold til produsentens protokoll.

4. Sorption Eksperimenter i Batch-modus og Metal Kvantifisering

  1. For satsvis absorpsjon eksperimenter forberede Au (III) forrådsoppløsning fra HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O, fortynne metallsalt og blander den med Slp1 / NaCl-løsning til en initial metall-konsentrasjon på 1 mM og endelig Slp1 konsentrasjon på 1 g / l . Utføre eksperimenter i trill med en ekstra negativ kontroll uten Slp1. Bruke et totalt volum på 5 ml for absorpsjon eksperimenter.
  2. Riste suspensjonen kontinuerlig ved RT i forskjellige forhåndsjustert pH-verdier mellom 2,0 til 5,0 i 24 timer (juster pH med lav konsentrert HCl og NaOH-oppløsning).
  3. Etter sorpsjon, sentrifugere prøvene ved 15 000 xg, 4 ° C i 20 min) for å separspiste Slp1 fra supernatant.
  4. Overfør supernatanten til ultrafiltrerings rør (MWCO 50 000 Da) og sentrifuger ved 15 000 xg dette, 4 ° C i 20 minutter for å fjerne oppløste protein monomerer.
  5. Bestem metallkonsentrasjon i det resulterende filtrat ved ICP-MS 19,20 og bruke resultatene for back-beregning av sorbert metall ved Slp1 tørr masse. Måling prinsipper, ble mulighetene for metode og komponenter av brukte ICP-MS beskrevet i litteraturen 55.
    1. Forbered prøvene og referanser for ICP-MS-målinger ved hjelp av en 3% HNO som matrise, og rhodium som en intern standard (1 mg / ml).

5. Syntese av Au-NP og Bestemmelse av partikkelstørrelse

Merk: sitrat stabilisert Au (0) np ble syntetisert i henhold til en tilpasset metode som er beskrevet tidligere av Mühlpfordt, H. et al. (1982) for å oppnå sfæriske partikler med en diameter på 10 - 15 nm 56,57

  1. Forbered en stabilisert 25 mM HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O lager for NP formasjonen.
  2. Fortynn 250 ul av denne lagerløsning i 19,75 ml ultrarent vann, og inkuber disse ved 61 ° C i 15 minutter under påfølgende risting.
  3. Forbered 5 ml av en andre stamoppløsning (12 mM garvesyre, 7 mM natriumcitrat di-hydrat, 0,05 mM K 2 CO 3) og inkuber 2. løsningen separat ved 61 ° C i 15 min.
  4. Legg under konstant omrøring 2 nd stamløsning til løsning en. Omrør reaksjonsblandingen i minst 10 minutter ved 61 ° C. Etterpå avkjøles løsningen og bruke den for NP belegg på Slp1 gitter innenfor QCM-D eksperimenter.
    Merk: Det resulterende Au (0) np ble karakterisert med UV-VIS-spektroskopi ved absorbansen maksimum på 520 nm, som vanligvis brukes for påvisning av dannede Au (0) -NPs 58. Løsningen kan bli lagret ved 4 ° C.
  5. Analyser av størrelsen av den dannedeAu (0) np ved fotonkorrelasjonsspektroskopi (PCS), som også er kjent som dynamisk lysspredning.
    1. For bestemmelse av NP størrelse, overføres 1,5 ml av syntetisert Au (0) np løsning i kuvettene etter støvfrie betingelser i en laminær strømning boksen og analysere dem med en størrelse og zetapotensial partikkelsorterer. En detaljert beskrivelse av PCS og prøveopparbeidelse er gitt i Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 og Jain, R. et al. (2 015) 60.

6. QCM-D Experiments - Slp1 Belegg på overflater og Au-NP adsorpsjon på Slp1 Lattice

Note: Målingene ble utført med en QCM-D utstyrt med opptil fire strømningsmoduler. Alle QCM-D-forsøk ble utført med en konstant strømningshastighet på 125 ul / min ved 25 ° C. Slp1 belegg og metall / NP inkubasjon ble gjort på SiO 2 piezoelektriske AT snitt kvarts sensorer (Ø 14 mm) med en fundamental frekvens på ≈ 5 MHz. Skylling skritt og leggeition løsning er merket med tallene fra representative resultater delen. De QCM-D-eksperimenter kan beskrives som en trinnvis måte som begynner med rengjøring og overflatemodifisering av de anvendte følere, etterfulgt av omkrystallisering Slp1 og senere på metall og metall NP interaksjon.

  1. Rengjøring Prosedyrer:
    1. Utstyre væske celler med sensor dummies. Pump minst 20 ml (per hver modul) av et alkalisk flytende rensemiddel (2% rensemiddel i ultrarent vann (v / v)) gjennom QCM-D og rørsystem. Etterpå pumpe femdobbelte volum (hver per modul) av ultrarent vann gjennom systemet (strømningshastighet opp til 300 mL / min). Utføre renhold i henhold til produsentens protokoll.
    2. Rens SiO 2 sensorer utenfor strømnings modulene ved inkubering (minst 20 min) i 2% SDS-løsning og skyll sensorene deretter flere ganger med ultrarent vann 61,62.
    3. Tørk krystaller med filtrert kompressed luft og plassere dem i en ozon rensekammer for 20 min 63,64.
    4. Gjenta rengjøringsprosedyren to ganger for å fjerne alle organiske innholdet.
    5. For å fjerne bundne metaller fra sensoren overflaten skyll sensorene med en M HNO 3. Etterpå utføre alle skylle skritt med ultrarent vann.
  2. Sensor Surface Modifisering av polyelektrolytter:
    Merk: Overflatemodifisering kan gjøres enten på innsiden (flyte gjennom prosedyre) eller utenfor strømningsmodulen (LbL-teknikk). Innenfor disse eksperimentene på følgende måte for å modifisere overflatene ble anvendt.
    1. Modifisere sensorene med 3 g / l av vekslende lag av PE polyetylenimin (PEI, MW 25000) og polystyrensulfonat (PSS, MW 70 000) via dip coating ved hjelp LbL teknikk 40,41 tidligere beskrevet for det spesielle system brukt i artikkelen av Suhr, M. et al. (2014) 19.
    2. Plassere sensorene i riktig PE-løsning i dyp well plater og inkuberes dette i 10 minutter ved RT.
    3. Ta sensorene ut av PE-løsning og skyll sensorene mellom hver dip belegningstrinnet intensivt med ultrarent vann.
      Merk: Den nye overflatemodifisering består av minst tre lag terminerings PE med positivt ladet PEI.
    4. Etter denne eksterne modifikasjon plassere sensorene inne i strømningsmodul, og likevekt sensorene ved skylling med ultrarent vann før forsøkene.
  3. Slp1 ett lag Rekrystallisering:
    1. Oppløse Slp1 i 4 M urea for å konvertere polymerer til monomerer.
    2. Sentrifuger monomerized proteiner ved 15 000 xg, 4 ° C i 1 time for å fjerne større protein agglomerater.
    3. Bland det solubiliserte og sentrifugert Slp1 supernatanten med omkrystallisering buffer til en endelig proteinkonsentrasjon på 0,2 g / l.
      Merk: kalsium avhengig rekrystallisering av Slp1 (self-montering) starter ved tilsetting av recrystallization buffer. Derfor, pumpe den blandede løsning med en strømningshastighet på 125 mL / min til sensorene (plassert inne i strømnings modulene) umiddelbart. Omkrystalliseringen utføres etter at stabile verdier av frekvensspredning og skift ble detektert i løpet av QCM-D-eksperimenter.
    4. Etter vellykket protein omkrystallisering på toppen av de modifiserte PE-sensorer inne i strømnings modulene skylle de belagte følerne med omkrystallisering buffer eller ultra waterintensively med en strømningshastighet på 125 mL / min inntil stabile verdier av frekvensspredning og skift ble påvist.
      Merk: SiO 2 overflatemodifisering med PE for senere absorpsjon eksperimenter bort på Slp1 monolags og AFM studier er visualisert i Figur 1.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk Design av PE Surface Modifikasjon og Slp1 med ett lagBelegg; Dette tallet har blitt forandret fra Suhr, M. et al. (2 015) 19 med tillatelse fra Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Metall og metall NP Interaksjon:
    Merk: sorpsjon med Au metallsaltløsning (HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O) ble utført i konsentrasjoner på 1 mM, eller 5 mM ved pH = 6,0 i 0,9% NaCl-oppløsning. Au-NP adsorpsjonen ble utført med ufortynnet Au-NPS i 1,6 mM tri-natrium-citrat-buffer ved pH 5,0 ≈.
    1. Etter vellykket Slp1 belegg i strømningsmoduler, skyll innhentet Slp1 lag intensivt med 0,9% NaCl-løsning til stabile verdier av frekvens og ødsling skift ble oppdaget.
    2. Pump den fremstilte metall-løsning (1 mM), og NP-løsning til flytmoduler med en strømningshastighet på 125 mL / min og spore massen adsorpsjon til Slp1 lag. Mass adsorpsjon kan oppdages direkte ved å spore frekvens skift henviser til Sauerbrey ligning (ligning 1).
    3. Etter endt metall og metall NP samhandling, skyll lag med metall / NP gratis buffer for å fjerne svake innbundne eller svake festet metaller eller nanopartikler.
      Merk: En illustrasjon av den eksperimentelle oppsettet er vist i figur 2.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk Design av QCM-D Oppsett med Flow Module QFM 401 * 66. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Dataregistrering og evaluering:
    1. Spill skiftene i frekvens i Hz (Af n) og ødsling (AD n) Innenfor QCM-D eksperimenter ved hjelp QCM-D spesifikk programvare.
    2. Bruk for evaluering av adsorbert masse følsomhet (Δm) den Sauerbrey ligningen / modell (ligning 1) 65 66 som er gyldig for tynne og stive filmer sammen uten friksjon til sensoren overflaten påføres n th overtone. Betegnelsen C (Sauerbrey konstant) for den brukte 5 MHz AT kutt kvarts sensor er 17,7 ng ∙ Hz -1 ∙ cm -2 68. For stiv, jevnt fordelt, og tilstrekkelig tynne adsorberte lag bruke ligning 1 som en god tilnærming.
      Ligning 1
    3. Utføre ytterligere modellering henhold til Kelvin-Voigt modellen gyldig for viskoelastiske molekyler 68-71 med produsenten spesifikk programvare og sammenligne resultatene med at av Sauerbrey modell.
    4. For beregning av tykkelse og masse adsorpsjon brukenlike viktig parameter modellering et lag tetthet av adsorberte lag av 1,35 g ∙ cm -3 svarende til verdier som tidligere er beskrevet for S-lag protein 72-75. Bruk samme verdi for beregning av metallet interaksjon med proteinholdige lag.

7. AFM Målinger

  1. Utføre studier med fullt kapabel AFM på en invertert optisk mikroskop.
    1. Post AFM bilder i flytende ved hjelp av rekrystallisering buffer eller ultrarent vann direkte på belagte QCM-D sensorer.
    2. Skyll sensorer med ultrarent vann etter QCM-D eksperimenter og plassere dem inne i AFM væske cellen. Bruk derfor en lukket fluidcelle med et totalvolum på ca. 1,5 ml. Hold temperaturen av fluidet cellekonstant ved 30 ° C.
    3. Bruke en utligger med en resonansfrekvens på 25 kHz ≈ i vann og en stivhet på <0,1 N / m. Justere skannehastighet mellom 2,5 og 10 mikrometer / sek.
      4. 76.
      Merk: Høyde bilder er vist med z-skala, mens z-verdiene representerer den nøyaktige topografien av overflaten. Amplitude (Pseudo 3D) Bildene vises uten z-skala fordi amplitude z-verdiene avhenger skanningsparametere og bære begrenset informasjon. Analyse av bilder ble gjort ved hjelp av tre ulike evalueringsprogramvaren er 77.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dyrking av mikroorganismer og Slp1 Karakterisering

De registrerte data for bakterievekst indikerer slutten av den eksponentielle vekstfasen til rundt 5 timer. Tidligere undersøkelser har vist at Slp1 kan isoleres fra dette punktet av innhøstingen (4,36 g / L våt biomasse (≈ 1,45 g / L (BDW)) med en maksimal avkastning 19. Likevel, optimalisering av dyrking ved hjelp av definerte medie komponenter eller Federa- tion batch dyrkingsstrategier vil føre til høyere biomasse avkastning. Dette er umistelige for bruk av høy mengde biomasse for industrielle applikasjoner. Verdiene fra online og offline registrert dyrkings parametere er oppsummert i figur 3A. Mikroskopisk kontroll (figur 3B) på tiden for innhøsting viser non-sporulerte celler av L. sphaericus JG-B53.


Figur 3: (A) online og offline målt dyrking parametere av L. sphaericus JG-B53 og (B) mikroskopisk bilde av vitale bakterieceller av L. sphaericus JG-B53 ved innhøstingen i 400 ganger forstørrelse; Dette tallet har blitt forandret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillatelse fra Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dessuten kan et ytterligere laget SDS-PAGE protein profil (figur 4A) viser den maksimale mengde av Slp1 på tidspunktet for 5 timer av dyrking. Proteinet bånd tilsvarende Slp1 (≈ 150 kDa) er tykkere, men fra her på et tap i intensitet ble observert accompanIED av en økning i proteiner med lavere molekylvekt på grunn av mulig protein fragmentering eller segregering av andre proteiner. Båndene av isolerte og rensede proteiner erholdt ved fremgangsmåten som er nevnt ovenfor (figur 4B) tilsvarer en molekylvekt på omtrent 150 kDa, som er tyngre enn den beregnede vektprosent basert på sekvenseringsdata for Slp1 (116 kDa) 30. Dette skyldes sannsynligvis posttranslational modifikasjoner. Andre årsaker til misforholdet mellom teoretiske molekylmasse og den observerte molekylmasse i SDS-geler er muligens belaste avhengige gjenstander i SDS-gel 30.

Figur 4
Figur 4. Protein Profiler av SDS-PAGE av (A) oppløst bakterieceller hentet fra dyrking av prøver og (B) renset Slp1 etter vellykket isolasjon; Dette figure har blitt forandret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillatelse fra Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Batch-absorpsjon Eksperimenter og Fastsettelse av Au med ICP-MS

Den maksimale bindingskapasitet av metall (q max) av Au (III) ved å suspen Slp1 er vist i figur 5. Resultatene viser at Au (III) ble stabilt bundet ved Slp1 i løpet av 24 timers inkubering innenfor det undersøkte pH-område. Resultatene indikerer q max i området på ca. 80 - 100 mg Au (III) / g Slp1. De summerte verdiene (tabell 1) ble sammenlignet med den sorpsjonskapasitet på rundt 75 mg Au (III) / g Slp1 rapportert tidligere av Suhr, M. et al. (2014) hentet fra eksperimenter med selvjusterpH-verdier ved tilsetning av metallsaltløsning (pH 4,3 ≈) 19. For å oppsummere, er Slp1 vist evne til å binde store mengder av opprinnelig tilsatt Au (III) beviser den høye bindingskapasiteter for dette elementet.

Figur 5
Figur 5. Diagram av Maximum Metal Binding Kapasiteter (q max) av Au (III) til Slp1 polymerer innen pH-justerte eksperimenter i forhold til absorpsjon resultater ved hjelp av selvjustert pH-verdier (≈ 4,3) rapportert av Suhr, M. et al. (2014) 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De beregnede metall fjerning effektivitet (RE) innenfor det undersøkte pH-området var mellom 50 - 60% og dermed bekrefter retater laget av Suhr, M. et al. (2014) hvor verdiene på rundt 40% ble oppnådd. I tidligere gjort forsøk sterke interaksjoner av Au (III) med de funksjonelle grupper, f.eks carboxylic-, hydroxylderivatert og aminogrupper, er blitt observert for S-lags proteiner som Slp1 og for sammenlignende protein SlfB av L. sphaericus JG-A12 1,78. Jankowski, U. et al. (2010) påvist spektroskopisk en sterk interaksjon mellom Au (III), hovedsakelig med karboksylsyregrupper SlfB som også kan utledes for Slp1 av L. sphaericus JG-B53 20,79,80. Også iboende protein egenskaper som vil redusere Au (III) til Au (0) i fravær av reduksjonsmidler kan være en årsak til den sterke samspillet 79. Videre viser resultatene av denne undersøkelse viser tendens til en foretrukket binding av Slp1 ved lavere pH-verdier. På den annen side, en binding ved lavere pH-verdier kan også føre til denaturering av Slp1. Studier til Slp1 viste et protein stabilitet ned til pH =3,0 (upubliserte resultater). Fra desorpsjon eksperimenter under sure betingelser, ved hjelp av for eksempel salpetersyre eller bruke kompleksdannere som EDTA eller citrat (data ikke vist), bekrefter at gullet var stabilt bundet og kunne ikke bli frigitt fra Slp1 polymerer.

Au (III) på Slp1 av L. sphaericus JG-B53
c initial (mg / L) 196,97
pH 5 4.5 ≈ 4.3 23 4 3.5 3 2.5 2
verdi
q max 88.3 85.3 74.7 102,5 94.1 81 101,9 96,9
(mg Au (III) / g Slp1)
RE 47.1 47.8 37.9 57.1 54.1 44.8 58.7 56.5
(%)

Tabell 1: Maksimal Metal Binding Kapasiteter (q max) og metall fjerning Effektivitet (RE) av Batch-absorpsjon Eksperimenter med Au (III) og Slp1 Polymers i Solution analysert ved ICP-MS. Data forandret i forhold til tidligere publiserte resultater fra Suhr, M. et al. (2014) 19.

Slp1 ett lag Rekrystallisering sporet av QCM-D

Den umiddelbare frekvensen avtar (5 Af, Af 7, 9 Af, Af 11) indikerer en hurtig adsorpsjon og en høy affinitet av proteinene til PE-modifiserte overflaten (figur 6A). Lik den raske endringen i frekvens, spredning (AD 5, AD 7, AD 9, AD 11) øker også umiddelbart. Dette faktum indikerer en adsorpsjon av viskoelastiske molekyler til overflaten på grunn av rask dempning som resulterer i økende tapsverdier. Den maksimale frekvensforskyvning oppnås etter 5 min med en verdi på ≈ 95 Hz og AD på 4,2. På et senere tidspunkt oppstår bare rearrangements av krystallisert Slp1. Slp1 adsorpsjon ble thusly gjennomført i over 60 min for å sikre than dannelsen av en nesten helt dekket overflaten og jevnlig bestilt protein gitteret. Forsøket viser at den positivt ladede PE-laget er ufravikelig for å oppnå bestandige belegg, fører negativ avslutning modifikasjon til en svak adsorpsjon og lengre beleggkinetikk (data ikke vist) 38. Svakt festet proteiner og agglomerater ble fjernet ved skylling med Slp1 fritt omkrystallisering buffer. De små endringene av Af n bekrefte lavt protein desorpsjon og stabil adsorpsjon av Slp1. På tross av dette er bortledning synker ned til ≈ 2,8 indikerer at større elastiske molekylene blir fjernet.

Figur 6
Figur 6. Rekrystallisering av Slp1 på modifiserte SiO 2 sensorer analysert av QCM-D; (A) i Af / DD plott og (B) overflaten tykkelse profile; Dette tallet har blitt forandret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillatelse fra Springer og Suhr, M. (2015) 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Overflateprofilen beregnet ved hjelp av de tidligere nevnte modeller viser et Slp1 monolag tykkelse ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt modell for elastiske filmer) og 10,0 nm (Sauerbrey modell for stivt lag) (figur 6B). Disse verdier er lavere enn dem rapportert av Suhr, M. et al. (2014). Forskjellene kan forklares ved en annen verdi av protein brukte lag tettheten i modelleringen. Strømverdiene skal være nærmere realiteter sjikttykkelse på S-lag protein på celleoverflaten av levende celler av L. sphaericus JG-B53 31,42. Dette modellering viser at Sauerbrey forhold jegs upassende for akustisk tynt proteinholdig lag, på grunn av forplantning av skjær akustiske bølgen i viskoelastiske flytende filmer 81,82 som resulterer i en undervurdering av den adsorberte Slp1 masse og tykkelse. Dette kan forklares ved de elastiske egenskaper hos S-lag protein og dens kobling av vannmolekyler i løpet av adsorpsjonsprosessen. Interaksjonen mellom vann med proteiner kan lett beskrives ved dannelse av hydrering skjell, viskøst drag eller fanget i hulrom i det adsorberte sjiktet 83. Dette bevirker et høyere sjikttykkelse målt ved Kelvin-Voigt modellen, og kan også klargjøre forskjeller i sjikttykkelsen oppnådd ved de to forskjellige modeller. I tidligere AFM studier ble tykkelser på Slp1 rister på rundt 8-12 nm lag målt. Ved beregning av masse adsorpsjonen av Slp1, i stedet for sjikttykkelse, en total Δm av 1506,6 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt modell) ble beregnet. Dataene i masse adsorpsjon på Surfess er summert opp i tabell 2 og viser en høy masse adsorpsjon ved hjelp av verdiene av Kelvin-Voigt modell.

m max Δm max tykkelse tykkelse
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
Slp1 etter belegg og skylling 1,505.6 1,351.6 11.2 10

Tabell 2: Adsorbed Masse av Slp1 på Modifiserte Polyelektrolytt SiO 2 Crystals analysert av QCM-D etter Skylling med Rekrystallisering Buffer (pH = 8,0) og Beregnet Layer tykkelse.

QCM-D som verktøy for deteksjon av metaller og NP Interaksjon med proteinholdige Slp1 med ett lag

Samspillet av krystallisert Slp1 enkeltlag med 1 mm og 5 mm oppløst Au (III) ble undersøkt. Resultatene av total adsorbert masse oppnådd fra beregninger og modellering av de registrerte data til endringer i frekvens og utladning er oppsummert i tabell 3. De QCM-D-studier av Au (III) interaksjon med monolagene gi en dypere forståelse av metall-biomolekyl interaksjon. For første gang, bindingskapasitet, absorpsjon kinetikk, og hvor den metal påvirker proteinstabilitet ble studert i en nano-range. Etter tilsetningen av metallsaltet løsning på Slp1 monolaget frekvensen redusert innen de første 5 min indikerer en rask masse adsorpsjon. Ikke desto mindre adsorpsjon av Au ikke ble fullført etter 60 min som beskrevet for andre metaller som Pd (II) i tidligere studier 19. Masseøkningen finner sted opp til 18 timer. Etter denne tid, ble skylletrinn utført med metall fri buffer som viser at det adsorberte metallet nesten stabilt bundet til det omkrystalliserte Slp1 lag. Til slutt ble en total metall absorpsjon av 955.0 ± 2,7 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt modellen) oppnådd i tilfelle av en mM Au (III) løsning og 4,534.4 ± 5,5 ng ∙ cm -2 (Kelvin-Voigt modellen) i Ved 5 mM Au (III). De høyere verdier oppnådd ved 5 mM Au (III) løsninger kan forklares med iboende reduserende egenskaper av Slp1 hvor minst metallisk Au (0) np ble dannet fra denne løsningen. Disse reduserer riktigbånd Slp1 allerede er rapportert i tidligere studier for Pd (II) og Au (III) 32,33,79,84. Dataene viste også at interaksjonen med gull løsningen ikke fører til en destabilisering av protein lag. Dette indikerer den spesifikke og stabil binding av Au (III) for å Slp1, som er blitt bekreftet også av ICP-MS-målinger ved hjelp av protein polymerer.

Dannelsen av Au (0) np under syntesen kan bli visualisert ved fargeendring fra start gule løsning til en rødlig en. Denne fargeendring forårsaket av magnetisering av overflate plasmon svingninger av metallnanopartikler, og viser dannelsen av Au (0) -NPs 1,78. Videre mindre NPs kan bli syntetisert ved variasjon av konsentrasjonen av reduksjonsmiddel (høyere garvesyre konsentrasjon) 85 synlig i en annen farging av oppløsning og bekreftet ved resultatene av målinger PCS (data ikke vist). PåDerimot øker garvesyre-konsentrasjonen fører til et tap av NP stabilitet og NPs en tendens til å agglomerere 20. Som bevis på prinsippet pre-syntetisert Au (0) -NPs (størrelsesfordeling på 10 til 18 nm målt med PCS sett i figur 7A) ble inkubert med suspendert Slp1 i 48 timer og analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Proteinet profil som er vist i figur 7B bekrefter konklusjonen som trekkes fra QCM-D data, som Au (0) -NPs ikke forstyrrer Slp1 strukturen. De observerte proteinbånd på 150 kDa påvise intakt Slp1.

Figur 7
Figur 7. (A) Antall vektet størrelsesfordeling av pre-syntetisert Au (0) -NPs målt med PCS og (B) SDS-PAGE proteinprofilen til Slp1; lane 1: 2 mikrogram Slp1 før Au (0) -NPs samhandling og lane 2: 1 mikrogram Slp1 polymerer i suspensjon etter 48 timers incuba sjon med pre-syntetisert Au (0) -NPs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Når NP-syntese og karakterisering, ble QCM-D-eksperimenter utført. Adsorpsjonen av pre-syntetisert metallisk Au (0) -NPs er som eksempel vist for QCM-D-eksperimenter i Af / DD-plott (figur 8 A) og som tykkelse og masse-profilene (figur 8B).

Figur 8
Figur 8. Adsorpsjon av pre-syntetisert Au (0) -NPs på rekrystallisert Slp1 Lattice Analysert ved QCM-D, (A) i Af / AD plott og (B) overflatesjikt og masse profil.blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Det kunne fastslås at QCM-D kan benyttes for å detektere adsorpsjon av 10-18 nm sfærisk Au (0) -NPs. Etter tilsetning av den ufortynnede Au-NP-løsning (A 520 nm = 1) oppnådd ved den beskrevne syntese, frekvensen avtar, noe som er en direkte indikator på masse adsorpsjon beskrevet av prediksjon av Sauerbrey ligning (ligning 1). Adsorpsjonen av Au (0) -NPs var nesten avsluttet i løpet av mindre enn 60 min. Etter denne tid ikke mer NPS ble avsatt på toppen av Slp1 gitter, slik at det kan antas at alle reaktive seter eller porer var okkupert av Au (0) -NPs. Den viste nedgang i spredning kan være tilknyttet til avstivning av Slp1 gitter årsaken ved NP interaksjon. Verdiene for total masse adsorpsjon er oppsummert i tabell 3. Selv intensiv rensing med NP-frie citratbuffer fører neither til en desorpsjon av NPs heller til en løsrivelse av Slp1 monolaget. Derfor kan en stabil og sterk samhandling forutsies for Au (0) np samhandling i samme respekt som med Au (III).

Metall c metall Δm max Δm max tykkelse tykkelse
(ng / cm 2) (ng / cm 2) (nm) (nm)
(Kelvin-Voigt) (Sauerbrey) (Kelvin-Voigt) (Sauerbrey)
1 mm 955 932,6 --- ---
5 mm 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
NPs

Tabell 3: Adsorbed Mass på Rekrystallisert Slp1 Lattice etter Au (III) Interaksjon (pH = 6,0) og Au-NP Adsorbsjon (pH = 4,7) analyserte ved QCM-D og Beregning av Layer Tykkelse etter Au (0) np Coating. Data forandret i forhold til tidligere publiserte resultater fra Suhr, M. et al. (2014) 19.

AFM for Visualisering av nanometer skalert Structures

I figur 9, protein gitter av Slp1 omkrystallisert på modifisert PE-sensorer er vist med sine typiske kvadratisk gitter (p4) i amplitude bilder. Den gitterkonstant kunne bestemmes som 13 - 14 Nm, som er sammenlignbare med resultatene fra tidligere forsøk 30. Den lagtykkelse på 10 nm ± 2,0 nm målt ved hjelp av AFM bekreftet den antatte sjikttykkelsen av de QCM-D-målinger av ≈ 11,2 nm (Kelvin-Voigt modellering). Den lille forskjell i overflatehøyden kan forklares ved det faktum at calculrerte QCM-D fit anser hele sensoren området mens den høye oppløsningen AFM studie viser bare en delvis området. Gitt dette ble protein agglomerater som var festet til sensoroverflaten som inngår i beregningen av den adsorberte massen henholdsvis til lagtykkelsen, og førte til en høyere sjikttykkelse enn bestemt av AFM.

Figur 9
Figur 9. AFM Amplitude Bilde av krystallisert Slp1 Lattice av L. sphaericus JG-B53 på QCM-D Crystals Rett etter Coating og Skylling med Buffer og Forstørrelse av Merket Region; Dette tallet har blitt forandret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillatelse fra Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10 viser den intakte Slp1 gitter etter inkubering med Au (III) oppløsningen. Det kan vises at etter inkubasjonen proteingitteret forble helt intakt. Dette bekrefter resultatene fra de QCM-D-eksperimenter som predikerte stabiliteten av belegget. I figur 11A og B adsorbert forhånds syntetisert Au (0) -NPs (størrelsen varierer 10-18 nm bestemt av PCS) på de Slp1 gitteret vises. På grunn av partikkelstørrelsen, Au (0) -NPs absorberes i Slp1 porene og ikke følger den p4 -symmetry av Slp1. Au (0) -NPs er statistisk fordelt på protein gitteret. Ved å måle partikkel-størrelser i AFM høydebilder (data ikke vist) størrelsen av NPS er i området fra 16 til 23 nm, og enda mindre, nemlig i størrelsesorden på omtrent 10 nm 19,20. Dette verifies det bestemt NP størrelse målt tidligere av PCS (sett i Figur 8).

Figur 10
Figur 10. AFM Amplitude Bilde av krystallisert og Intakt Slp1 Lattice på QCM-D Sensor Crystals etter Inkubasjon av 5 mM Au (III) Solution og Forstørrelse av Merket Region; Dette tallet har blitt forandret fra Suhr, M. et al. (2014) 19 med tillatelse fra Springer og Suhr, M. (2015) 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 11
Figur 11. (A) AFM amplitude bilde av adsorbert Au (0) -NPs på krystallisert Slp1 gitter på QCM-D sensor krystaller (til venstre) Og (B) 3D rekonstruerte overflateprofil (til høyre); Dette tallet har blitt forandret fra Suhr, M. (2015) 20 med tillatelse fra Springer og Raff, J. et al. (2 016) Raff, J. et al. S-lag basert nanocomposites for industrielle applikasjoner i Protein-baserte Engineered nanostrukturer. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (innsendt)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet studert binding av Au til S-lag protein ble undersøkt ved hjelp av en kombinasjon av forskjellige analytiske metoder. Spesielt binding av Au er meget attraktivt, ikke bare for utvinning av Au fra gruvedrift farvann eller prosessløsninger, men også for bygging av materialer, f.eks sensoriske overflater. For undersøkelser av Au interaksjons (Au (III) og Au (0) -NPs) med suspenderte og omkrystallisert monolag av Slp1, hadde proteinet som skal isoleres. Derfor, har denne undersøkelsen viste den vellykkede dyrking av gram-positive bakteriestamme L. sphaericus JG-B53 og isolering av overflatelaget protein Slp1. Ikke desto mindre, er dyrking og proteinet isolert fortsatt utfordrende og bør optimaliseres. En storskala produksjon av biomasse og S-lag protein er en forutsetning for en industriell anvendelse av begge, for eksempel for produksjon av metall selektive filtermaterialer. Deres søknad potensialet er undoubtedly høy for fjerning av giftige metaller, eller utvinning av verdifulle metallene oppløst i prosessvann, avfallsvann eller drensvann. Videre er programmet potensial for S-lag enda større med tanke på deres ytterligere potensial i andre bio-inspirert materiale, slik som biosensorer og katalysatorer.

De batch-absorpsjon eksperimenter av suspenderte Slp1 polymerer indikerte en høy og stabil binding av Au (III) i løpet av det undersøkte pH-område fra 2,0 til 5,0. Derved kan metallfjerningseffektivitet på opp til 60% oppnås. Denne bemerkelsesverdige binding oppførsel kan forklares med en sterk interaksjon mellom Au (III) med Slp1 sannsynligvis indusert ved interaksjon av karboksylgrupper og nitrogenbærende grupper som er tilstede på overflaten av proteinet. Dette argumenter kan styrke ved FTIR og EXAFS undersøkelse av lik belastning L. sphaericus JG-A12 32,79. Dessuten kan iboende reduserende egenskaper Slp1 forklare den høye RE av Au (III) ved å reducing det til nanoparticular Au (0). Det kan antas at S-lag, som første grensesnitt av bakterier i miljøet, bør være hovedsakelig involvert i metall-binding. Innenfor det undersøkte pH-område, det høyeste metallbindende kapasitet på 102,5 mg Au (III) / g Slp1 ble oppnådd ved pH 4,0. Dette bindingsevnen er høyere enn rapportert for andre bio-komponenter, for eksempel, for isolerte cellevegg av Bacillus subtilis (71,5 mg Au (III) / g) 86 eller for biomasse av Chlorella vulgaris (98,5 mg Au (III) / g) 8 .

ICP-MS anvendt for å bestemme det bundne metall ved Slp1 polymerer er meget følsom metode og muliggjør påvisning av minste mengder gull i denne studien. ICP-MS gir mange fordeler for å utføre spormetall bestemmelser, f.eks enkel håndtering system og lave deteksjonsgrenser; i tilfelle av gull ned til 0,1 til 1 ppt. Dette gjør denne metoden et allsidig verktøy for å undersøke biosorptive prosesser i lav konsentrasjonsområdes. Imidlertid ble resultatene i denne undersøkelsen fått med senkede S-lags polymerer og kan ikke enkelt overføres til S-lags gittere omkrystalliserte på overflater, og derfor viser begrensning av ICP-MS. For eksempel kan noen direkte forbindelse av isolerte protein polymerer gjøres til de S-lagsstrukturer på vitale bakterieceller. I tillegg trenger ICP-MS-målinger ikke tillater bestemmelse av den kinetiske metall sorpsjon. Derfor er det nødvendig å finne fremgangsmåter mer egnet for undersøkelse av metall-binding ved tynne immobiliserte protein filmer.

I den foreliggende studien ble QCM-D-analyser anvendes for å påvise in situ dannelse av S-lags gittere på overflater så vel som avsetningen av Au på proteinene. Derfor er QCM-D et robust og reproduserbar metode for godkjenning av molekylet adsorpsjon og samhandlingsprosesser. I tillegg QCM-D er en relativt enkel og kostnadseffektiv, og ufarlig fremgangsmåte for å overvåke such behandler online. Fremgangsmåten har den fordel å detektere masseendring med en totalvekt følsomhet i væsker med ≈ 0,5 ng ∙ cm -2. Dette gir mulighet for å oppdage selv svake interaksjon, for eksempel, protein med oppløste metaller eller for å måle adsorpsjoner i lave konsentrasjonsområder. Ulempen med QCM-D, er at dette ikke er en struktur avbildningsmetode som tillater visualisering av for eksempel protein gitre. Derfor er andre teknikker er nødvendig.

Den QCM-D-analyser i denne studien ble fulgt av AFM imaging. Kombinasjonen av disse fremgangsmåter tillot undersøkelse av sorpsjon kinetikk og konsekvenser av Au sorpsjon for belegget, og dermed beviser at de er allsidig verktøy for å undersøke interaksjonen av tynne metallproteinholdige filmer. Videre ble det vist at en pålitelig omkrystallisering av de S-lags proteiner på teknisk støtte er nødvendig for etterfølgende protein interaksjonsstudier. Derforgrunnen, modifikasjoner av overflatene med vedheft promo er av interesse. Den beskrevne gjennomføring av polyelektrolytter (slutter med positivt ladede PE) som mellomliggende lag mellom SiO 2 flater og proteinlaget fører til en forbedret fremgangsmåte for en rask protein belegg. Den positive effekt av en positivt lade polyelektrolytt lag er blitt beskrevet tidligere for eksempel, immobilisering av bakterie vitale celler av L. sphaericus JG-B53 31. Gjennomføringen av de presenterte PE-lag er den viktigste og mest kritiske trinn for senere vellykket og reproduserbar omkrystallisering av S-lag protein.

Det kan påvises at for undersøkelse av tynne lag av Slp1, er QCM-D en god metode for å vise massen adsorpsjon respektive til proteinet omkrystallisering som monolagsfilmer i sanntid. Det kan også bli observert tidligere for montering av S-lag protein SBPA av L. sphaericus </ em> CCM2177 47. Ved hjelp av etterfølgende høy oppløsning AFM analyserer endringer i gitterstrukturen av proteinet selv-sammenstillinger kan visualiseres. AFM målinger avslørte p4 symmetrien Slp1 og bekrefte modellert tykkelse på Slp1 på ca 10 nm. Dessuten kan den direkte interaksjon av oppløste metallioner med proteinet lag overvåkes ved QCM-D vist seg god binding av Au (III) av den underliggende protein laget. Den sannsynlige dannelsen av de minste Au (0) -NPs fra Au (III) oppløsning inne protein porer forårsaket av iboende reduserende egenskaper ved Slp1 gitter innenfor QCM-D-målinger ble ikke påvist ved etterfølgende AFM målinger. Dette kan ha sammenheng med oppløsning grensen av AFM og den eksperimentelle satt opp i denne studien. Dette viser begrensningen av denne teknikken, og nødvendigheten av oppløsning avbildning høy for biomolekyler i sub nanometerskala. Imidlertid kan en høy stabilitet av det omkrystalliserte Slp1 lag utledes fra the innhentet QCM-resultater og ble bekreftet av AFM etterforskning.

Som konklusjon, kan det vises at Slp1 polymerer har høy metall bindende kapasiteter for gull innenfor det undersøkte pH-range. Videre viser undersøkelsen at den Slp1 gitteret er en god metallmatrise ion binding og for immobilisering av metallnanopartikler. Det kan vises at hver metode som brukes i denne artikkelen har mulighet til å oppdage selv små metall interaksjoner, eller i tilfelle av AFM kan visualisere strukturer i nanoskala rekkevidde. Selv om det er bare ved en kombinasjon av disse fremgangsmåter er vist, som har gjort det mulig å forbedre kunnskap og forståelse av de undersøkte proteiner på et molekylært nivå.

Hovedsakelig, QCM-D og AFM er de foretrukne metoder for valg for fremtidig undersøkelse av protein mono adsorpsjon og deres samspill med metaller og funksjonelle molekyler. Ved å kombinere disse to metodene, påvisning av S-lag protein adsorpsjonsprosesser og overflate-bildedannende gir et innblikk i molekylære prosesser som kan være i stand til å bli overført for å forbedre kunnskap om levende bakterier og interaksjon med omgivelsene. Denne studien viste et utdrag av mulige metoder nyttige for forståelse protein og metall samhandling. Andre nyttige teknikker som kan styrke kunnskapen om slike prosesser i detalj, fra ulike spektrometriske og kromatografiske metoder for å spektroskopiske undersøkelser av biomolekyler og bør inkluderes i fremtidige studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis finansiert av IGF-prosjektet "S-Sieve" (490 ZBG / 1) finansiert av BMWi og BMBF-prosjektet "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Spesiell takk til Tobias J. Günther for hans verdifull hjelp under AFM studier og til Erik V. Johnstone for å lese manuskriptet som har engelsk som morsmål. Videre vil forfatteren av denne artikkelen takke Aline Ritter og Sabrina Gurlit (fra Institutt for Resource Ecology for bistand i ICP-MS-målinger), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava og gruppen bioteknologi av Helmholtz-instituttet Freiberg for Resource Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

Kjemi Biosorption metaller S-lag bakterier nanopartikler QCM-D AFM ICP-MS gull
Au-Samspill Slp1 Polymers og ett lag fra<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS og AFM som Verktøy for biomolekyl-metall Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter