Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Au-Взаимодействие SLP1 Полимеры и монослоя от Published: January 19, 2016 doi: 10.3791/53572
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

Introduction

В связи с увеличением использования золота в течение нескольких приложений, таких как электроника, катализаторы, биосенсоров, или медицинских инструментов, спрос этого драгоценного металла выросла за время последних нескольких лет 6-9. Золото, а также многие другие драгоценные и тяжелые металлы попадают в окружающую среду с помощью промышленных стоков в разбавленных концентрациях, через горнодобывающей деятельности и утилизации отходов 7,8,10, хотя большинство загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами или драгоценными это непрерывный процесс в основном обусловлено технической деятельности. Это приводит к значительному вмешательству природных экосистем и потенциально может угрожать здоровью человека 9. Зная эти негативные последствия способствует поиск новых методов для удаления металлов из загрязненных экосистем и улучшения в переработке металлов из промышленных сточных вод. Налаженные физико-химические методы, такие как осаждение или ионного обмена, не так эффективны, особенно в высокийLY разбавляют решения 7,8,11. Биосорбция, либо с живых или мертвых биомассы, является привлекательной альтернативой для очистки сточных вод 10,12. Использование таких биологических материалов может уменьшить потребление токсичных химических веществ. Многие микроорганизмы были описаны накапливать или иммобилизации металлов. Например, клетки Lysinibacillus sphaericus (Л. sphaericus) JG-A12 показали высокие обязательные потенциала на драгоценные металлы, например, Pd (II), Pt (II) Au (III) и другие токсичные металлы, такие как Pb (II) или U (VI), 4,13, клетки Bacillus megaterium для Cr (VI) 14, клетки Saccharomyces CEREVISIAE для Pt (II) и Pd (II) 15, и хлореллы вульгарным для Au (III) и U (VI), 16 17. Связывание предыдущих металлов, таких как Au (III), Pd (II) и Pt (II), также сообщалось для Desulfovibrio desulfuricans 18 и для L. sphaericus JG-B53 19,20. Тем не менее, не альл микробы связать большое количество металлов и их применение в качестве материала сорбционной ограничено 12,21. Кроме того, связывающая способность металла зависит от различных параметров, например, состав ячейки, используется био-компонентов, или окружающей среды и экспериментальных условиях (рН, ионной силы, температуры и т.д.). Изучение отдельных фрагментов клеточной стенки 22,23, как мембранных липидов, белков пептидогликана, или других компонентов, помогает понять процессы комплекс, построенный целых клеток 8,21 связывания металла.

Компоненты клеточных сосредоточены на в этом исследовании, S-слой белков. S-слоя белков являются частями внешней клеточной оболочки многих бактерий и архебактерий, и они составляют около 15 - 20% от общей массы белка этих организмов. В качестве первого интерфейса для окружающей среды, эти клеточные соединения сильно влияют на бактериальные сорбционными свойствами 3. S-слоя белков с молекулярными массами в пределах от сорокадо сотен кДа производятся внутри клетки, но собраны пределами, где они способны образовывать слои на липидные мембраны или полимерных компонентов клеточной стенки. После выделения, почти все S-слой белки имеют внутреннее свойство спонтанно самоорганизуются в суспензии, на границах или на поверхностях, образующих плоские или трубчатые структуры, подобные 3. Толщина белка монослоя зависит от бактерий и находится в пределах диапазона от 5 - 25 нм 24. В общем, образованные белковые структуры S-слой может иметь косой (Р1, Р2), квадрат (Р4), или шестиугольной (P3 и P6) симметрии с постоянной решетки от 2,5 до 35 нм 3,24. Формирование решетки, кажется, во многих случаях в зависимости от двухвалентных катионов и в основном на Ca 2+ 25,26, Рафф, J. и др. S-слой на основе нанокомпозитов для промышленного применения в основе белка Engineered наноструктур. (ред Тияна З. Роща & Aitziber Л. Cortajarena) (Спрингер, 2016 (представлен)). Тем не менее, полное реакция каскад мономера складывания, мономер-мономер взаимодействия, формирование решетки, и роли различных металлов, особенно двухвалентных катионов, таких как Са 2+ и Mg 2+, до сих пор полностью не поняты.

Грамм-положительные штамм L. sphaericus JG-B53 (переименован из Bacillus sphaericus после нового филогенетического классификации) 27 был выделен из уранового отвал "Хаберланд" (Johanngeorgenstadt, Саксония, Германия) 4,28,29. Его функциональное S-слоя белков (SLP1) обладает квадратную решетку, молекулярную массу 116 кДа, 30 и толщину ≈ 10 нм на живые клетки бактерий 31. В предыдущих исследованиях, формирование в пробирке закрытом и стабильного слоя белка с толщиной приблизительно 10 нм было достигнуто менее чем за 10 мин 19. Соответствующее штамма L. sphaericus JG-А12, также изолят от "Хаберланд" кучи, обладает высокой металлические обязательные потенциала и его изолированный белок S-слой показал высокую химическую и механическую стабильность и хорошие темпы сорбции на драгоценные металлы, как Au (III) Pt (II) и Pd (II) 4,32,33. Эта привязка драгоценных металлов является более или менее специфичные для некоторых металлов и зависит от наличия функциональных групп на наружной и внутренней поверхности белка полимера и в его поры, ионной силы и рН. Соответствующие функциональные группы для обработки металлов взаимодействия по белков являются COOH-, NH 2 -, ОН, ПО 4 -, SO 4 - и SO-. В принципе, связывание металлов мощности открыть широкий спектр применений, Рафф, J. и др. S-слой на основе нанокомпозитов для промышленного применения в основе белка Engineered наноструктур. (ред Тияна З. Роща & Aitziber Л. Cortajarena) (Спрингер, 2016 (представлен)). например, как biosorptive компоненты для удаления или восстановлениярастворенных токсичных или ценных металлов, шаблоны для синтеза или определенной осаждения регулярно структурированных металлических наночастиц (NPS) для катализа и других био-инженерии материалов, таких как био-сенсорная слоев 3,5,18,33. Регулярно расположенные массивы NP как Au (0) -NPs могут быть использованы для основных приложений, начиная от молекулярной электроники и биосенсоров, сверхвысоких устройств хранения плотность, и катализаторов для окисления СО-34-37. Разработка таких приложений и смарт-дизайн этих материалов требует глубокого понимания основных металлических обязательных механизмов.

Необходимым условием для развития таких био-материалов на основе является надежным реализация интерфейса слой между биомолекулы и технического поверхности 38,39. Например, полиэлектролиты собран с слой за слоем (LBL) 40,41 техники были использованы в качестве интерфейса слоя для перекристаллизации S-слоя белков 39 19,42, Рафф, J. и др. S-слой на основе нанокомпозитов для промышленного применения в основе белка Engineered наноструктур. (ред Тияна З. Роща & Aitziber Л. Cortajarena) (Спрингер, 2016 (представлен)). Тем не менее, сложный механизм адсорбции белка и белка поверхности взаимодействия не изучены. Особенно информация о конформации, ориентации потоков, и плотности покрытия по-прежнему отсутствует.

Пьезокварцевые с мониторингом диссипации (QCM-D) техника привлекла внимание в последние годы в качестве инструмента для изучения адсорбции белка, покрытие кинетики и взаимодействия PROпроцессов на нанометровом масштабе 19,43-45. Этот метод позволяет для детального обнаружения массового адсорбции в режиме реального времени, и может быть использовано в качестве индикатора белка самосборки процесса и сочетания функциональных молекул белка на решетках 19,20,42,46-48. Кроме того, QCM-D измерения открыть возможность для изучения процессов взаимодействия металла с белковым слоем в естественных биологических условиях. В недавнем исследовании, взаимодействие белка S-слоя с выбранными металлов, таких как Eu (III), Аи (III), Pd (II) и Pt (II), был изучен с МККМ-D 19,20. Слой адсорбированный белок может служить в качестве упрощенной модели клеточной стенки грамположительных бактерий. Изучение этого одного компонента может способствовать более глубокому пониманию взаимодействия металл. Тем не менее, исключительно QCM-D эксперименты не позволяют заявления о поверхностных структур и влияния металлов в белок. Другие методы, необходимые для получения такой информации. Один посность для визуализации биологических наноструктур и получения информации о структурных свойств атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Целью представленной работы было изучение сорбции золота (Au (III) и Au (0) -NPs) для S-слоя белков, в частности SLP1 Л. sphaericus JG-B53. Эксперименты проводились со взвешенными белков на пакетном масштабе в диапазоне рН от 2,0 - 5,0 с помощью ICP-MS и с иммобилизованными S-слоев с помощью QCM-D. Кроме того, влияние раствора соли металла на устойчивость решетки была исследована с последующими исследованиями АСМ. Сочетание этих методов способствует лучшему пониманию процессов пробирке взаимодействия металл в качестве инструмента для получения дополнительной информации о связывании события на целых бактериальных клеток в отношении конкретных металлических сродства. Это знание не только решающее значение для развития действующих фильтрующих материалов для восстановления металлов для защиты окружающей среды и сохранения реисточники 49, но также для развития массивов высоко упорядоченных металлических наночастиц для различных технических приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. микроорганизма и условий выращивания

Примечание:. Все эксперименты были проведены в стерильных условиях Л. sphaericus JG-B53 была получена из крио сохранились культуры 29,30.

  1. Передача крио-сохраняется культуры (1,5 мл) под чистом столе до 300 мл стерильной питательный бульон (NB) сред (3 г / л экстракта мяса, 5 г / л пептона, 10 г / л NaCl). Затем Раствор перемешивают в течение по крайней мере 6 ч при 30 ° С для получения предварительной культуры для выращивания.
  2. Развивайте бактерии в аэробных условиях в NB СМИ при рН = 7,0, 30 ° C в 70 л масштабируется пара в месте биореактор. Поэтому, заполните реактор ≈ 57 л деионизированной воды. Добавить и растворить твердую NB медиа непосредственно в биореакторе (концентрации см. Выше)
    1. Кроме того добавьте пеногаситель (30 мкл / л NB-медиа) в средствах массовой информации, чтобы подавить образование пены во время выращивания, то автоклав (122 ° С, температура время выдержки 30 мин) СМИвнутри реакторной установки.
  3. Охладить СМИ и выполнять полное насыщение кислородом. Доводят рН до 7,0 с использованием 1 (H 2 SO 4 и 2 M NaOH) и начать автоматическое инокуляции 300 мл предварительной культуры. Начало записи данных параметров культивирования в точке прививки. Вход через Интернет параметры например, уровень растворенного кислорода (DO 2) присоединения кислот и оснований и рН-значения в пределах культивирования.
    1. Монитор бактериального роста в Интернете, неинвазивных измерений мутности.
  4. Выполнение дополнительных проб после каждого часа культивирования и определит дальнейшее параметр, например, био сухого веса (BDW) и в автономном режиме оптической плотности (OD). Таким образом, собирают 20 мл бульона культивирования в каждой точке отбора проб в стерильных условиях.
    1. Определить форума OD по фотометрических измерений адсорбции при 600 нм. Используйте стерильную отфильтрованный NB-среду как пустое значение. Кормовойэ достижения адсорбции под> 0.4 развести клеточной суспензии следующий линейности закона Ламберта-Бера.
    2. Для определения BDW центрифуги 1 до 5 мл бактериальной суспензии (в зависимости от плотности клеток) при 5000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Сушат полученный осадок клеток при 105 ° С в нагревательной печи до массового стабильности и измерения массы гранул.
  5. Возьмите микроскопические изображения с оптическим фазовым контрастом исследования микроскопом в 400 и 1000 кратном увеличении (фазовый контраст конденсатора 2 и 3, соответственно) для проверки бактериального роста и в качестве контроля перекрестного загрязнения.
  6. После достижения экспоненциальной фазе роста, обнаруженного в Интернете сделать 2 и онлайн мутность, урожай биомассы с помощью проточной центрифугированием при 15000 х г, 4 ° С и мыть биомассу дважды стандартном буфере (50 мМ Трис, 10 мМ MgCl 2, 3 мМ NaN 3, рН = 7,5).
    Примечание: Полученный осадок биомассы можно хранить при -18 & #176; С до дальнейшего использования для изоляции.

2. S-слой белка Выделение и очистка

Примечание: Очищают SLP1 полимеров в соответствии с адаптированной методике, описанной ранее 2,19,30,32,50,51.

  1. Однородный промытый и размороженный сырой биомассы, полученной из культуры в стандартном буфере (1: 1 (вес / объем)), чтобы удалить жгутики с помощью диспергатора (уровень 3, 10 мин) при охлаждении на ледяной бане при температуре 4 ° С.
  2. Центрифуга суспензии (8000 XG, 4 ° C в течение 20 мин) и промывают осадок дважды полученный с помощью стандартного буфера (1: 1 (вес / объем)). После промывки и центрифугирования (8000 х г, 4 ° С в течение 20 мин), ресуспендируют осадок в стандартном буфере (1: 1 (вес / объем)), добавьте ДНКазы II и РНКазы (0.4 ед / г биомассы) к суспензии и распадаются клетки при 1000 бар в гомогенизаторе высокого давления. Затем центрифугируют при 27500 подвеску мкг, 4 ° С в течение 1 часа.
    Примечание: управления клеточной суспензии с научно-исследовательскими миcroscope. Разрыв завершается, когда менее чем за 2 - видны в поле зрения микроскопа в 400 кратном увеличении 3 неповрежденные клетки.
  3. Промыть гранулу дважды стандартном буфере (1: 1 (вес / объем)) и выполнять центрифугирование снова. После ресуспендируют осадок в стандартном буфере (2: 1 (вес / объем)), смешанный с 1% Тритон Х-100 и инкубируют ее 20 мин при последовательном встряхивании (100 оборотов в минуту), чтобы растворить липидных отложений.
  4. Центрифуга раствор (27500 мкг, 4 ° С в течение 1 ч) и мыть Полученный осадок три раза стандартном буфере (1: 1 (вес / объем)).
  5. Инкубируйте Осадок, полученный после дополнительной центрифугированием (27500 х г, 4 ° С в течение 1 ч) в течение 6 ч в стандартном буфере (1: 1 (вес / объем)) в смеси с 0,2 г / л лизоцима, чтобы гидролизовать связи в пептидогликана 50. Кроме того добавьте ДНКазы II и РНКазы (каждый 0,4 единиц / г биомассы) в суспензии.
  6. После центрифугирования (45500 х г, 4 ° C, 1 час), ресуспендируют верхнюю белую белковую фазу с низким объемом тон центрифугирования супернатант (<30 мл), содержащие субъединицы. белка
  7. Солюбилизации белую суспензию путем смешивания 1: 1 с 6 М гидрохлорида гуанидина (6 М GuHCl, 50 мМ Трис, рН = 7,2). Решение становится ярким.
  8. Выполнение стерильной фильтрации (0,2 мкм) GuHCl обработанного раствора с последующим дополнительным высокоскоростным центрифугированием (45500 х г, 4 ° C в течение 1 часа).
  9. Передача супернатант к диализной мембраны трубок (MWCO 50000 Дальтон) и диализовали против его рекристаллизации буфера (1,5 мМ Трис, 10 мМ CaCl 2, рН = 8,0) в течение 48 ч.
  10. Передача белого рекристаллизованную белок полимерного раствора в пробирки и центрифуге при 45,500 мкг, 4 ° С в течение 1 часа. Ресуспендируют осадок в небольшом объеме сверхчистой воды (<30 мл).
  11. Впоследствии, передать суспензии в диализных мембран труб и выполнить диализ против сверхчистой воды в течение 24 часов, чтобы удалить содержимое буфера.
    Примечание: Некоторые изменения буфера или сверхчистой воды Dтором диализа не обойтись.
  12. Лиофилизировать очищенный SLP1 в сублимационная сушилка.

3. Характеристика и Количественная SLP1 для экспериментов

Примечание: концентрация SLP1 для сорбции и покрытий экспериментов количественно UV-VIS спектрометрии.

  1. Внесите 2 мкл образца, растворенного в SLP1 непосредственно на нижнюю измерения пьедестала фотометр. Определить концентрацию белка в адсорбционном максимум при длине волны 280 нм, характерной для белков. Используйте коэффициент экстинкции 0,61 для определения концентрации SLP1. Используйте SLP1 бесплатное решение для справочных измерений.
  2. Развести белка буфером (для сорбции экспериментов в периодическом режиме используют 0,9% NaCl, рН = 6,0 и для QCM-D Эксперименты использовать рекристаллизации буфера, рН = 8,0) до требуемой концентрации для экспериментов (1 г / л и 0,2 г / л соответственно).
  3. Анализ SLP1 качество и молекулярную массу от стандартной bioanalytical электрофореза метод додецилсульфат натрия полиакриламидном (SDS-PAGE) описывается Laemmli, UK 52.
    1. Выполните SDS-PAGE перед использованием SLP1 в экспериментах и, например, после Аи (0) -np Инкубационный с использованием 10% гели разделения в полиакриламидном.
    2. Для SDS-образцов смеси ≈10 мкл выращивания или белка образца с буфером для образцов (1,97 г Трис, 5 мг бромфенола синий, 5,8 мл глицерина, 1 г SDS, 2,5 мл -меркаптоэтанол, заполните сверхчистой водой до 50 мл) в отношение 1: 1 (объем / объем) и пипетку смеси после 4 мин инкубации при 95 ° С в карманы геля.
    3. Выполнить SDS-PAGE 30 мин при напряжении 60 В до образцов пройти коллекция геля и изменения напряжения до 120 V, проходящий раз гель разделения.
    4. Удалить гели из системы гель, промыть водой и сверхчистой месте в течение 1 ч в фиксирующем растворе (10% уксусная кислота, 50% абсолютного этанола). Впоследствии, ополосните гели с особо чистой воды.
    5. Пятно гелис помощью адаптированного неспецифическую коллоидный Кумасси бриллиантовый синий метод 53,54. После Обесцвечивание 72,73, снимать, SDS-PAGE системой гель документации в соответствии с протоколом производителя.

4. Сорбционные Эксперименты в пакетном режиме и количественной Metal

  1. Для партии сорбционные эксперименты подготовить Au (III) маточного раствора из HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O, разбавленной соли металла и смешать его с раствором SLP1 / NaCl в начальной концентрации металла 1 мм, а конечной концентрации SLP1 1 г / л , Выполнение экспериментов в триплетов с дополнительным отрицательным контролем без SLP1. Использование общего объема 5 мл для сорбции экспериментов.
  2. Встряхните приостановления непрерывно РТ в различных заранее отрегулировать рН между 2,0 до 5,0 в течение 24 ч (отрегулируйте рН с низкой концентрации HCl и NaOH раствора).
  3. После сорбции, Центрифуга образцов при 15000 х г, 4 ° C в течение 20 мин), чтобы Separели SLP1 из супернатанта.
  4. Передача супернатант в ультрафильтрационных трубок (MWCO 50000 Да) и центрифуги при 15000 этот мкг, 4 ° C в течение 20 мин для удаления растворенных мономеров белка.
  5. Определить концентрацию металла в результате фильтрата ICP-MS 19,20 и использовать результаты для задней расчета сорбированного металла в сухой массе SLP1. Измерение принципы, возможности метода и компонентов используемого ICP-MS были описаны в литературе 55.
    1. Подготовка образцов и ссылки для измерений ICP-MS с использованием 1% HNO 3 в качестве матрицы и родия в качестве внутреннего стандарта (1 мг / мл).

5. Синтез Au-НП и определение размера частиц

Примечание: цитрат стабилизировалась Au (0) -np были синтезированы в соответствии с адаптированной методике, описанной ранее Mühlpfordt H. и др. (1982), чтобы получить сферические частицы с диаметром 10 - 15 нм 56,57

  1. Подготовка стабилизируется 25 мМ HAuCl 4 ∙ 3 H 2 O акции для формирования НП.
  2. Развести 250 мкл исходного раствора этом в 19,75 мл сверхчистой воды и инкубируют их на 61 ° С в течение 15 мин при последовательном встряхивании.
  3. Подготовьте 5 мл второго раствора (12 мм дубильные кислоты, 7 мМ цитрата натрия ди-гидрата, 0,05 мМ K 2 CO 3) и инкубировать 2-й решение отдельно в 61 ° С в течение 15 мин.
  4. Добавить при постоянном перемешивании 2-й маточного раствора в раствор одного. Реакционную смесь перемешивают в течение по крайней мере 10 мин при 61 ° С. После охлаждения раствор и использовать его для НП покрытия на SLP1 решетки в QCM-D экспериментов.
    Примечание: в результате Au (0) -np характеризовались UV-VIS-спектроскопии на оптической плотности не более 520 нм, обычно используемый для обнаружения образованного Au (0) -NPs 58. Раствор можно хранить при температуре 4 ° С.
  5. Анализ размер образовавшийсяAu (0) -np по фотонной корреляционной спектроскопии (PCS), который также известен как динамического светорассеяния.
    1. Для определения размера НП, передать 1,5 мл синтезированного Au (0) -np раствора в кюветах в условиях без пыли в коробке потока ламинарного и проанализировать его с размером и дзета-потенциала частиц классификатор. Подробное описание PCS и пробоподготовки дано в Schurtenberger P. и др. (1993) 59 и Джейн, R. и др. (2015) 60.

6. QCM-D Эксперименты - SLP1 покрытие на поверхностях и Аи-НП Адсорбция на SLP1 решеткой

Примечание: Измерения проводились с МККМ-D, оснащенного до четырех модулей потока. Все QCM-D были проведены эксперименты с постоянной скоростью потока 125 мкл / мин при 25 ° С. SLP1 покрытия и металл / НП Инкубационный были сделаны на SiO 2 пьезоэлектрических АТ-среза кварца датчиков (Ø 14 мм) с основной частотой ≈ 5 МГц. Промывка шаги и добавитьition решения обозначены на рисунках представительного результатов части. В QCM-D эксперименты могут быть описаны как шаг за шагом образом, начиная с очистки и модификации поверхности, используемых датчиков с последующим SLP1 перекристаллизации, а затем на металла и металлопродукции НП взаимодействия.

  1. Очистка процедуры:
    1. Одета в жидкости клетки с датчиков манекенов. Насос по крайней мере, 20 мл (каждый на модуль) щелочного жидкого моющего средства (2% моющего средства в сверхчистой воде (объем / объем)) через QCM-D и трубки системы. Впоследствии насос пятикратный объем (каждый на модуль) в особо чистой воды через систему (расход до 300 мкл / мин). Выполните очистку в соответствии с протоколом производителя.
    2. Очистите SiO 2 датчиков вне модулей потока путем инкубации (по крайней мере, 20 мин) в 2% -ном растворе SDS и промойте датчики впоследствии несколько раз сверхчистой водой 61,62.
    3. Высушите кристаллы с фильтрованной компеволосы погладила воздух и поместите их в камеру очистки озоном в течение 20 мин 63,64.
    4. Повторите процедуру очистки в два раза, чтобы удалить все органические содержимое.
    5. Чтобы удалить связанные металлы из поверхности датчика ополосните датчики с 1 М HNO 3. Впоследствии, выполнять все действия с промывки сверхчистой воды.
  2. Датчик модификацию поверхности полиэлектролитов:
    Примечание: Модификация поверхности может быть сделано либо в (течь через процедуру) или вне модуля потока (Lbl метод). В этих экспериментах была использована следующая способ модификации поверхностей.
    1. Измените датчики с 3 г / л чередующихся слоев ПЭ полиэтиленимином (PEI, МВт 25,000) и полистиролсульфоната (PSS, МВт 70,000) через окунанием с помощью LBL технику 40,41 описанной ранее для специальной используемой системой в статье Зур, М. и др. (2014) 19.
    2. Поместите датчики внутри соответствующей PE-решения в глубоком WELL пластины и инкубировать их в течение 10 мин при комнатной температуре.
    3. Возьмите датчики из PE-решения и промойте датчики между каждой стадии нанесения покрытия погружением интенсивно с особо чистой воды.
      Примечание: Новая модификация поверхность состоит из, по меньшей мере три слоя полиэтиленовой завершающий с положительно заряженным PEI.
    4. После этого внешнего модификации разместить датчики внутри модуля потока и уравновешивают датчиков путем промывки сверхчистой водой перед началом экспериментов.
  3. SLP1 однослойная перекристаллизации:
    1. Растворите SLP1 в 4 М мочевины для преобразования полимеров на мономеры.
    2. Центрифуга monomerized белки при 15000 х г, 4 ° С в течение 1 часа, чтобы удалить крупные белковые агломераты.
    3. Смешайте солюбилизированного и центрифугировали супернатант SLP1 с рекристаллизации буфере до конечной концентрации белка 0,2 г / л.
      Примечание: в зависимости кальция рекристаллизации SLP1 (самосборки) начинается с того РЭЦrystallization буфера. Таким образом, насос смешанного раствора с расходом 125 мкл / мин до датчиков (помещенной внутри модулей потока) немедленно. Перекристаллизацию сделано после стабильных значений были обнаружены в QCM-D экспериментов частоты и рассеивания сдвигов.
    4. После успешного перекристаллизации белка в верхней части ПЭ-модифицированных датчиков внутри модулей потока промыть покрытием датчики с буфером перекристаллизации или сверхчистых waterintensively с расходом 125 мкл / мин до стабильных значений частоты и диссипации сдвигов были обнаружены.
      Примечание: модификация поверхности SiO 2 с PE для более поздних сорбции экспериментов на SLP1 монослойных и АСМ исследований визуализируется на рисунке 1.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема Дизайн PE модификации поверхности и SLP1 монослояПокрытие; Эта цифра была изменена с Suhr, М. и др. (2015) 19 с разрешения Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Металлов и НП Взаимодействие:
    Примечание: сорбции с раствором соли металла Au (HAuCl 4 ∙ 3 Н 2 О) проводили в концентрации 1 мМ или 5 мМ при рН = 6,0 в 0,9% NaCl решений. Au-НП адсорбции было сделано с неразбавленным Au-парков в 1,6 мм три-натрия цитрат буфера при рН ≈ 5,0.
    1. После успешного SLP1 покрытия в модулях потока, промыть, полученный слой SLP1 интенсивно 0,9% раствора NaCl, пока не были обнаружены устойчивые значения частоты и рассеивания сдвигов.
    2. Насос приготовленный раствор металла (1 мм) и раствор NP к модулям потока с расходом 125 мкл / мин и отслеживать массовое адсорбции на SlP1 слой. Масс-адсорбции могут быть обнаружены непосредственно путем отслеживания сдвиги частоты, относящиеся к уравнению (Сауэрбрей уравнение 1).
    3. После завершения металлов и NP взаимодействие, промыть слой металла / NP свободного буфера для удаления слабых связанные или слабые приложенные металлов или наночастиц.
      Примечание: иллюстрации экспериментальной установки показана на рисунке 2.

фигура 2
Рисунок 2. Схематическое Дизайн QCM-D Flow установки с использованием модуля Qfm 401 * 66. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Запись данных и оценка:
    1. Запишите изменения в частоте в Гц (; F н) и диссипации (ΔD п) В QCM-D экспериментов с использованием МККМ-D специальное программное обеспечение.
    2. Используйте для оценки адсорбированного массовой чувствительности (Δm) Сауэрбрей уравнение / модели (уравнение 1) 65 66, которая действует для тонких и жестких пленок в сочетании без трения на поверхности датчика, приложенного к п-й обертон. Термин С (Сауэрбрей постоянная) для используемого 5 МГц при кварцевого датчика вырезать 17,7 нг ∙ Гц -1 ∙ см -2 68. Для жесткой, равномерно распределяется, и достаточно тонкие слои адсорбированных использовать уравнение 1 в хорошем приближении.
      Уравнение 1
    3. Выполните дополнительного моделирования в зависимости от модели Кельвина-Фойгта действительный для вязкоупругих молекул 68-71 с производителем специального программного обеспечения и сравнить результаты с тем модели Сауэрбрей.
    4. Для расчета толщины слоя и массового использования адсорбциикак важный параметр моделирования плотности слой адсорбированного слоя 1,35 г ∙ см -3 соответствующие значениям, описанных ранее для S-слоя белков 72-75. Используйте то же для расчета металлической взаимодействия с белковым слоем.

7. АСМ измерения

  1. Выполните исследования с полностью способным АСМ на перевернутом оптического микроскопа.
    1. Запись АСМ-изображения в жидкости, используя буфер рекристаллизации или особо чистой воды непосредственно на покрытых QCM-D датчиков.
    2. Промыть датчики с особо чистой воды после QCM-D экспериментов и поместить их внутрь жидкости клетки АСМ. Таким образом, применять закрытую жидкости клетки с общим объемом около 1,5 мл. Поддерживать температуру постоянной жидкости клеток при 30 ° С.
    3. Использование консоли с резонансной частотой ≈ 25 кГц в воде и жесткости <0,1 Н / м. Отрегулируйте скорость сканирования между 2,5 и 10 мкм / сек.
      4. 76.
      Примечание: Высота изображения показаны г-масштабе, а Z-значения представляют собой точную топографию поверхности. Амплитуда (Псевдо 3D) изображения показаны без г-масштабе, потому что амплитуда Z-значения зависят от параметров сканирования и несут ограниченную информацию. Анализ изображений проводили с помощью трех различных программное обеспечение для оценки о 77.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выращивание микроорганизмов и SLP1 Характеристика

Записанные данные роста бактерий указывает на конец экспоненциальной фазе роста на уровне около 5 ч. Предыдущие исследования показали, что SLP1 может быть выделен из этой точки сбора (4,36 г / л влажной биомассы (≈ 1,45 г / л (BDW)) с максимальным выходом 19. Тем не менее, оптимизация культивирования с помощью определенных компонентов, так и феде- стратегии выращивание партия приведет к повышению урожайности биомассы. Это неотъемлемое для использования большого количества биомассы для промышленных применений. Значения от онлайн и оффлайн, записанные параметры культивирования приведены на рис 3А. микроскопическим контролем (рис 3B) в то время, урожая шоу без спорулированных клетки Л. sphaericus JG-B53.


Рисунок 3: (А) онлайн и оффлайн измеряемых параметров выращивания L. sphaericus JG-B53 и (Б) микроскопическое изображение жизненных бактерий клеток L. sphaericus JG-B53 во время сбора урожая в 400 кратном увеличении; Эта цифра была изменена с Suhr, М. и др. (2014) 19 с разрешения Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Также, дополнительно сделано белковый профиль SDS-PAGE (4А) указывает максимальное количество SLP1 во время 5 ч культивирования. Группа белок, соответствующий SLP1 (≈ 150 кДа) толще, но здесь на потери в интенсивности наблюдалось accompanIED увеличением белков с низкой молекулярной массой, вызванного возможной фрагментации белка или сегрегации других белков. Полосы выделены и очищены белки, полученные указанным выше способом (фиг.4В) соответствуют молекулярной массой приблизительно 150 кДа, который тяжелее, чем рассчитанное весу в расчете на секвенирования данных SLP1 (116 кДа) 30. Это, вероятно, из-за пост-трансляционных модификаций. Другие причины несоответствия между теоретической молекулярной массой и молекулярной массой наблюдается в SDS гелей, возможно зарядить зависимых артефактов в SDS гель 30.

Рисунок 4
Рисунок 4. Белковые профили Сделано SDS-PAGE (А) распадается бактерий клетки, полученные из образцов выращивания и (В) очищенного SLP1 после успешного выделения; Это фантастическиефигура была изменена с Suhr, М. и др. (2014) 19 с разрешения Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Пакетная сорбционные эксперименты и определение Au с ICP-MS

Максимальная металлические связующие мощности (Q макс) Аи (III) по приостановлено SLP1 показаны на рисунке 5. Результаты показывают, что Au (III), стабильно связаны SLP1 течение 24 ч инкубации в исследуемом диапазоне рН. Результаты показывают, ц макс в интервале от примерно 80 - 100 мг Au (III) / г SLP1. Обобщенные значения (Таблица 1), по сравнению с сорбционной емкостью около 75 мг Au (III) / г SLP1 ранее сообщал Зур, М. и др. (2014), полученные из экспериментов с саморегулирующиесяPH-значения путем добавления раствора соли металла (рН ≈ 4,3) 19. Подводя итог, SLP1 показал способность связывать большое количество изначально добавленной Au (III) доказывая свои высокие обязательные потенциала для этого элемента.

Рисунок 5
Рисунок 5. Схема Максимальная Metal Связывание потенциала (Q макс) из Au (III), чтобы SLP1 полимеров в рН-скорректированы экспериментов по сравнению с результатами сорбционных использовании собственных регулировать рН-значения (≈ 4,3), сообщенные Зур, М. и др. (2014) 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Эффективности, вычисленные удаления металла (RE) в пределах исследуемого диапазона рН было между 50 - 60%, таким образом, подтверждая Reтаты, сделанные Suhr М. и др. (2014), где были достигнуты значения около 40%. В ранее проведенных экспериментов, сильные взаимодействия Au (III) с функциональными группами, например,, carboxylic-, гидроксил-, и аминогрупп, наблюдается уже S-слоя белков, таких как SLP1 и для сравнительного белка SlfB Л. sphaericus JG-A12 1,78. Янковский, У. и др. (2010) обнаружили спектрально сильное взаимодействие Au (III), в основном с карбоксильными группами SlfB, которые также могут быть выведены на SLP1 Л. sphaericus JG-B53 20,79,80. Кроме того, внутренние белковые свойства, которые уменьшили бы Au (III), чтобы Au (0) в отсутствие восстановителей могут быть причиной сильного взаимодействия 79. Кроме того, результаты данного исследования показывают тенденцию предпочтительного связывания SLP1 при более низких значениях рН. С другой стороны, связывание при более низких значениях рН также может привести к денатурации SLP1. Исследования на SLP1 доказали стабильность белка вплоть до рН =3.0 (неопубликованные результаты). Из экспериментов десорбции в кислой среде, с использованием, например, азотная кислота или с использованием других комплексообразующих агентов, таких как EDTA или цитрат (данные не показаны), подтверждает, что золото было стабильно связан и не может быть освобожден от SLP1 полимеров.

Au (III), на SLP1 Л. sphaericus JG-B53
С начальной (мг / л) 196,97
pH 5 4.5 ≈ 4.3 23 4 3.5 3 2.5 2
стоимость
д макс 88,3 85,3 74,7 102.5 94,1 81 101,9 96,9
(мг Au (III) / г SLP1)
RE 47,1 47,8 37,9 57,1 54,1 44,8 58,7 56,5
(%)

Таблица 1: Максимальная Металл Связывание потенциала (Q макс) и металла по удалению эффективности (RE) пакетной-сорбционных экспериментов с Au (III), и SLP1 Полимеры в решении анализировали с помощью ICP-MS. Данных по сравнению с ранее опубликованными результатами Suhr М. и др. (2014) 19.

SLP1 однослойная перекристаллизации отслеживаемых QCM-D

Непосредственным уменьшение частоты (5; F, 7; F, 9; F, 11; F) указывает на быстрое адсорбции и высокое сродство белков к защитному модифицированной поверхностью (фиг.6А). Равно быстрого изменения частоты, диссипации (ΔD ΔD 5 7,, SD 9, SD 11) также увеличивает сразу. Этот факт указывает на адсорбцию молекул вязкоупругих на поверхность из-за быстрого затухания в результате увеличения значения рассеиваемой. Максимальный сдвиг частоты достигается через 5 мин со значением ≈ 95 Гц и ΔD 4,2. На более позднем этапе только перестановки перекристаллизованного SLP1 произойти. SLP1 адсорбции константы выглядит осуществляется в течение 60 мин, чтобы обеспечить тон образование почти полностью покрытой поверхности и регулярно приказал решетки белок. Эксперимент показывает, что положительно заряженный слой РЕ неотъемлемым для достижения стабильных покрытий, отрицательное изменение окончание приводит к слабому адсорбции и кинетики длинных покрытия (данные не показаны) 38. Слабо присоединены белки и агломераты удалить промывкой SLP1 свободной рекристаллизации буфера. Небольшие изменения; F п подтвердить низкий десорбции белка и стабильную адсорбции SLP1. Несмотря на это рассеивание падает до ≈ 2,8 указывает, что большие упругие молекулы удаляются.

Рисунок 6
Рисунок 6. перекристаллизации SLP1 на модифицированных SiO 2 датчиков анализируют с помощью QCM-D; (А); F в / ΔD участка и (B) толщиной поверхности Profilе; Эта цифра была изменена с Suhr, М. и др. (2014) 19 с разрешения Springer и Зур, М. (2015) 20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Профиль поверхности рассчитывается с помощью предыдущие упомянутые модели показывают толщину монослоя SLP1 из ≈ 11,2 нм (Кельвина-Фойгта модель для упругих фильмов) и 10,0 нм (Сауэрбрей модели жесткого слоя) (рис 6В). Эти значения ниже, чем те, сообщили Suhr М. и др. (2014). Различия могут быть объяснены другим использованное значение плотности белок слоя в моделировании. Значения тока должны быть ближе к реальности толщины слоя S-слоя белков на клеточной поверхности живых клеток L. sphaericus JG-B53 31,42. Это моделирование показывает, что отношение я СауэрбрейS подходит для акустической тонкой белковым слоем, из-за распространения акустической волны сдвига в вязко-упругих жидких пленок 81,82, что приводит к недооценке адсорбированного массы SLP1 и толщины. Это может быть объяснено упругих свойств S-слоя белков и его связывания молекул воды в процессе адсорбции. Взаимодействие воды с белками может быть легко описано формирование гидратных оболочек, вязким сопротивлением или захвата в полостях в адсорбированного слоя 83. Это влияет на более высокую толщину слоя, измеренную с помощью модели Кельвина-Фойгта, а также может уточнить различия в толщине слоя, полученного двух различных моделей. В предыдущих исследованиях АСМ, были измерены слой толщины SLP1 решеток вокруг 8-12 нм. Вычислив массовой адсорбции SLP1, вместо толщины слоя, общая Δm из 1506.6 нг ∙ см -2 (Кельвина-Фойгта модели) была рассчитана. Данные массового адсорбции на прибойтузы суммируются в таблице 2 и показывают высокую массовую адсорбции с использованием значений модели Кельвина-Фойгта.

м макс Δm макс толщина толщина
(нг / см 2) (нг / см 2) (нм) (нм)
(Кельвина-Фойгта) (Сауэрбрей) (Кельвина-Фойгта) (Сауэрбрей)
SLP1 после покрытия и промывка 1,505.6 1,351.6 11.2 10

Таблица 2: адсорбированная масса SLP1 на модифицированных Полиэлектролитные SiO 2 кристаллов анализировали с помощью QCM-D после промывки перекристаллизации буфера (рН = 8,0) и расчетные толщины слоя.

QCM-D, как инструмент для обнаружения металла и металла НП взаимодействия с белковыми SLP1 монослоя

Исследовано взаимодействие перекристаллизованного SLP1 монослоя с 1 до 5 мм, растворенного Au (III). Результаты общей массы адсорбированной полученной из расчетов и моделирования данных, записанных изменений в частоте и рассеиваемой приведены в таблице 3. Исследования QCM-D АС (III) взаимодействием с монослои обеспечить более глубокое понимание металл-биомолекулы взаимодействие. Впервые, связывающая способность, кинетика сорбции, и как метал влияет на стабильность белков изучались в нано-диапазоне. После добавления раствора соли металла в монослое SLP1 частота снизилась в течение первых 5 мин, указывающий быстрый массовый адсорбции. Тем не менее, адсорбция Au не была завершена через 60 мин, как описано для других металлов, таких как Pd (II) в предыдущих исследованиях 19. Увеличение массы происходит до 18 часов. По истечении этого времени, полоскание стадии проводили с металлическим свободного буфера, показывающий, что адсорбированный металлом почти стабильно связан с перекристаллизовывают слоя SLP1. Наконец, общее поглощение металла 955,0 ± 2,7 нг ∙ см -2 (Кельвина-Фойгта модели) было получено в случае (III) раствором 1 мМ Au и 4,534.4 ± 5,5 нг ∙ см -2 (Кельвина-Фойгта модели) в Случай 5 мМ Au (III). Более высокие значения, полученные 5 мм Au (III) растворов можно объяснить внутренними свойствами восстановительных SLP1, где маленький металлический Au (0) -np были сформированы из этого раствора. Эти сокращения собственноузы SLP1 уже сообщалось в предыдущих исследованиях для Pd (II) и Au (III), 32,33,79,84. Данные также показали, что взаимодействие с раствором золота не приводит к дестабилизации белка слоев. Это указывает на то конкретный и стабильный связывания Au (III) в SLP1, который был также подтверждается измерениями ICP-MS, использующих полимеры белка.

Формирование Au (0) -np в процессе синтеза может быть визуализированы изменению цвета от исходного желтого раствора в одной красноватой. Это изменение цвета связано с возбуждением поверхностных плазмонов колебаний металлических наночастиц и доказывает образование Au (0) -NPs 1,78. Кроме мелкие наночастицы могут быть синтезированы изменения концентрации восстанавливающего агента (более высокая концентрация дубильной кислоты) 85 видимой в другом окраски раствора и проверен по результатам измерений PCS (данные не показаны). НаС другой стороны, увеличение концентрации дубильной кислоты приводит к потере устойчивости и НП НЧ имеют тенденцию к агломерации 20. В качестве доказательства принципе, предварительно синтезированного Au (0) (гранулометрический состав 10 - 18 нм измеряли PCS видно на фиг.7А) -NPs инкубировали с загущенным SLP1 в течение 48 ч и анализировали с помощью SDS-PAGE. Профиль белка показано на рисунке 7B проверяет вывод из QCM-D данных, что Аи (0) -NPs не беспокоить структуру SLP1. Наблюдаемые полосы белка в 150 кДа доказать наличие неповрежденной SLP1.

Рисунок 7
Рисунок 7. (а) количество взвешенных распределение по размерам перед синтезом Au (0) -NPs измеряется PCS и (В) профиль белка в ДСН-ПААГ SLP1; дорожка 1: 2 мкг SLP1, прежде чем Au (0) -NPs взаимодействие и дорожка 2: 1 мкг SLP1 полимеры в суспензии после 48 ч Инкубаторы ции с предварительно синтезированного Au (0) -NPs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

После NP-синтеза и характеристики, QCM-D эксперименты проводились. Адсорбция перед синтезом металлических Au (0) -NPs иллюстративно показано QCM-D; F экспериментов в / ΔD участков (рисунок 8 А) и, как толщина и масс-профилей (рис 8B).

Рисунок 8
Рисунок 8. Адсорбция Предварительно синтезированного Au (0) -NPs на перекристаллизовывают SLP1 решетки, проанализированных QCM-D (А); F в / ΔD участка и (B) поверхности слоя и массового профиля.пустым "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Это может быть подтверждено, что QCM-D может быть использован для обнаружения адсорбцию 10 - 18 нм сферической Au (0) -NPs. После добавления раствора неразбавленной Au-NP (A 520 нм = 1) получают путем синтеза описанным, частота уменьшается, что является прямым показателем массового адсорбции, описанной предсказания уравнения Сауэрбрей (уравнение 1). Адсорбция Au (0) -NPs был почти завершен в течение менее чем 60 мин. По истечении этого времени не более НЧ наносились на верхней части решетки SLP1, так что можно предположить, что все реакционноспособные участки или поры занимают Au (0) -NPs. Показанная снижение рассеивания могут быть связаны с ужесточением SLP1 решетки причины по взаимодействию НП. Значения общей массы адсорбции суммируются в таблице 3. Даже интенсивная промывка с НП-свободной цитрат буфера приводит Нэйдругой, чтобы десорбции наночастиц, ни в отряд монослоя SLP1. Таким образом, стабильная и сильное взаимодействие может быть предсказано для Au (0) -np взаимодействия в том же отношении, как с Au (III).

Металл С металлической Δm макс Δm макс толщина толщина
(нг / см 2) (нг / см 2) (нм) (нм)
(Кельвина-Фойгта) (Сауэрбрей) (Кельвина-Фойгта) (Сауэрбрей)
1 мм 955 932,6 --- ---
5 мм 4,534.4 4,687.9 --- ---
Au (0) - --- 1,382.9 1,382.7 10.2 10.2
ИГ

Таблица 3: адсорбированная масса на перекристаллизовывают SLP1 решеткой после Au (III) Взаимодействие (рН = 6,0) и Au-НП адсорбции (рН = 4,7) анализировали с помощью QCM-D и расчета толщины слоя после Au (0) -np покрытия. Данных по сравнению с ранее опубликованными результатами Suhr М. и др. (2014) 19.

АСМ для визуализации нанометровых структур Scaled

На рисунке 9, белок решетка SLP1 перекристаллизовывают на PE модифицированного датчиков показана с типичным квадратной решетки (P4) в качестве амплитудных изображений. Постоянная решетки может быть определена как 13 - 14 нм, что сравнимо с результатами предыдущих экспериментов 30. Толщина слоя 10 нм ± 2.0 нм измеряли с помощью АСМ проверяется предсказанный толщину слоя QCM-D измерений ≈ 11,2 нм (Кельвина-Фойгта моделирования). Небольшое различие в высоте поверхности можно объяснить тем, что Расчитатьованные QCM-D подходят считает всю площадь датчика, а АСМ исследования высокого разрешения показывает только частичную область. Учитывая это, белковые агломераты, которые были прикреплены к поверхности датчика были включены в расчет адсорбированного массы соответственно к толщине слоя и привело к более высоким, чем толщина слоя, определяемой АСМ.

Рисунок 9
Рисунок 9. АСМ Амплитуда Изображение перекристаллизовывают SLP1 решетке L. sphaericus JG-B53 на QCM-D кристаллов Непосредственно после покрытия и Промывка буфером и увеличения отмеченных области; Эта цифра была изменена с Suhr, М. и др. (2014) 19 с разрешения Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 10 показывает нетронутыми SLP1 решетки после инкубации с раствором Au (III). Можно показать, что после инкубации решетка белок Полностью сохранился. Это подтверждает результаты экспериментов QCM-D, что предсказанные стабильность покрытия. На рисунке 11А и В адсорбированная предварительно синтезированный Au (0) -NPs (размер варьируется от 10 - 18 нм, определяемой PCS) на решетке SLP1 показаны. Из-за размера частиц Au (0) -NPs адсорбируются в порах SLP1 и не следовать p4 -симметрии SLP1. Au (0) -NPs статистические распространяется на решетке белка. Измеряя размеры частиц по высоте изображений АСМ (данные не показаны) размер наночастиц находится в интервале 16 - 23 нм и даже меньше, а именно в диапазоне от приблизительно 10 нм 19,20. Это веркуда летит определенная размер НП измеряется ранее PCS (показано на рисунке 8).

Рисунок 10
Рисунок 10. АСМ Амплитуда Изображение перекристаллизовывают и неповрежденном SLP1 решетки на кристаллах QCM-D датчик после инкубации 5 мМ Au (III), Решение и увеличение выраженных региона; Эта цифра была изменена с Suhr, М. и др. (2014) 19 с разрешения Springer и Зур, М. (2015) 20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 11
Рисунок 11. (А) АСМ изображение амплитуда адсорбированного Au (0) -NPs на перекристаллизованного SLP1 решетки на QCM-D кристаллов датчиков (слева) И (Б) 3D реконструкция профиль поверхности (справа); Эта цифра была изменена с Зур, М. (2015) 20 с разрешения Springer и Рафф, J. и др. (2016) Рафф, J. и др. S-слой на основе нанокомпозитов для промышленного применения в основе белка Engineered наноструктур. (ред Тияна З. Роща & Aitziber Л. Cortajarena) (Спрингер, 2016 (представлен)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой работе изучали связывание АС S-слоя белков была исследована с использованием комбинации различных аналитических методов. В частности, связывание Au является очень привлекательным не только для восстановления золота из шахтных вод или технологических решений, но и для строительства материалов, например, сенсорных поверхностей. Для изучения взаимодействия Au (Au (III) и Аи (0) -NPs) с приостановлено и перекристаллизовывают монослой SLP1, белок должен быть изолирован. Таким образом, это исследование показало, успешное культивирование грамположительных бактериальных штаммов L. sphaericus JG-B53 и изоляция поверхностного слоя белка SLP1. Тем не менее, выращивание и изоляция белок остается сложной и должна быть оптимизирована. Крупномасштабная добыча биомассы и S-слоя белков является предпосылкой для промышленного применения и, например, для производства металлических селективных фильтрующих материалов. Их потенциал приложение undoubtedlу высокой для удаления токсичных металлов или извлечения ценных металлов, растворенных в воде, процесс сточных вод, или дренажных вод. Кроме того, потенциальное применение для S-слоев еще больше, учитывая их дополнительный потенциал в других биологических стиле материалов, таких как биосенсоры и катализаторов.

В пакетном сорбционные эксперименты взвешенных полимеров SLP1 указано высокой и стабильной связывания Au (III) в исследуемой рН-диапазоне от 2,0 до 5,0. Таким образом, эффективность удаления металла до 60% может быть достигнута. Этот замечательный связывания поведение может быть объяснено сильным взаимодействием Au (III) с SLP1 вероятно, индуцированного через взаимодействие карбоксильных групп и азота, к которому групп, присутствующих на поверхности белка. Это аргументы могут быть укреплению методом ИК-Фурье и EXAFS расследования аналогичного штамма L. sphaericus JG-A12 32,79. Кроме того, внутренние восстановительные свойства SLP1 может объяснить высокую RE Аи (III) по РедуCing его nanoparticular Au (0). Можно предположить, что S-слоя, а первый интерфейс бактерий к окружающей среде, должны быть в основном участвуют в связывании металла. В исследованном диапазоне рН, высокая связывающая способность с 102,5 мг Au (III) металл / г SLP1 была достигнута при рН 4,0. Это способность связывания выше, чем сообщалось для других био-компонентов, например, для изолированной клеточной стенки Сенная палочка (71,5 мг Au (III) / г) 86 или биомассы хлореллы обыкновенной (98,5 мг Au (III) / г) 8 ,

ИСП-МС используется для определения связанного металла по SLP1 полимеров очень чувствительным методом и позволяет обнаруживать мельчайшие количества золота в этом исследовании. ИСП-МС предлагает много преимуществ для выполнения трассировки металлических определения, например, простую систему обработки и низких пределов обнаружения; В случае золота до 0,1 - 1 п.п.. Это делает этот метод универсальным инструментом для исследования процессов в biosorptive низких концентрацийс. Тем не менее, результаты в этом расследовании были получены со взвешенными полимеров S-слоя и не может быть легко переведены в S-слоя решеток рекристаллизованных на поверхностях, и, следовательно, показать ограничение ICP-MS. Например, существует прямой связи изолированных белковых полимеров не может быть сделано, чтобы тех S-слоистых структур по жизненно важным бактериальных клеток. Кроме того, измерения ICP-MS не позволяют определить кинетики сорбции металлов. Таким образом, необходимо найти способы больше подходят для исследования связывания тонкими пленками иммобилизованным белком металла.

В настоящем исследовании, QCM-D анализ были применены для обнаружения на месте образование S-слоя решеток на поверхностях, а также осаждение Au на белки. Таким образом, QCM-D является надежным и воспроизводимым методом для признания молекулы адсорбции и взаимодействия процессов. Кроме того QCM-D является относительно простым, экономически эффективным, и опасной метод контроля Sуч-процессов в Интернете. Метод имеет преимущество для обнаружения изменения массы с максимальной массы чувствительности в жидкостях ≈ 0,5 нг ∙ см -2. Это позволяет возможность обнаружить даже слабое взаимодействие, например, белка с растворенными металлов или для измерения адсорб- в низких диапазонах концентраций. Недостатком QCM-D является то, что это не метод визуализации структура, которая позволяет визуализировать например, белковых структур. Таким образом, другие методы необходимы.

QCM-D анализ в данном исследовании были последующим АСМ. Сочетание этих методов позволило изучение кинетики сорбции и последствий Au сорбции для покрытия, тем самым доказав, что они универсальные инструменты для исследования взаимодействия металл тонких белковых пленок. Кроме того, было показано, что надежный перекристаллизации из S-слоя белков на технической поддержки имеет важное значение для последующих исследований взаимодействия белка. Тампередняя, ​​модификации поверхностей, используя адгезионные промоторы представляют интерес. Описанный реализация полиэлектролитов (заканчивающихся с положительно заряженными РЕ) в качестве промежуточного слоя между SiO 2 и белок поверхностей слоя приводит к улучшенному способу быстрого покрытия белка. Положительный эффект положительно зарядить полиэлектролитного слоя было описано ранее для иммобилизации, например жизненных бактерий клеток L. sphaericus JG-B53 31. Реализация представленных ПЭ слоев являются наиболее важным и критическим шагом для последующего успешного и воспроизводимого перекристаллизации S-слоя белков.

Это может быть продемонстрировано, что для расследования тонких слоев SLP1, QCM-D является хорошим способом, чтобы показать массовую адсорбции соответствующего белка в перекристаллизации, как однослойных пленок в режиме реального времени. Это также можно было наблюдать ранее для повторной сборки S-слоя белков SbpA из L. sphaericus </ EM> CCM2177 47. При использовании последующее высокого разрешения АСМ анализ изменения структуры белковых самостоятельной сборки решетки могут быть визуализированы. АСМ показали p4 симметрию SLP1 и подтвердить смоделированной толщину слоя SLP1 около 10 нм. Кроме того, прямое взаимодействие ионов растворенных металлов со слоем белка может контролироваться QCM-D доказывая хорошо связывания Au (III), в подстилающего слоя белка. Вероятной образование мельчайших Au (0) -NPs из Au (III), решение внутри белковых порах, вызванных внутренними восстановительными свойствами решетки SLP1 в QCM-D измерений может не обнаружено последующими АСМ. Это может быть связано с пределом разрешения АСМ и экспериментальной установки в данном исследовании. Это показывает, ограничение этого метода и необходимости визуализации с высоким разрешением для биомолекул в суб нанометровом масштабе. Тем не менее, высокая стабильность рекристаллизованном слоя SLP1 может быть выведена из-йе получены МККМ-результаты и было подтверждено АСМ исследования.

В заключение, можно показать, что SLP1 полимеры имеют высокий потенциал связывания металлов для золота в исследуемом диапазоне рН. Кроме того, расследование показало, что решетка SLP1 является ион металла хорошо матрица связывания и иммобилизации металлических наночастиц. Это может быть показано, что каждый метод, используемый в этой статье имеет возможность обнаруживать даже небольшие металлические взаимодействий, или в случае АСМ может визуализировать структуры в нанометровом диапазоне в. Хотя, это только комбинации этих методов, показанных, что позволило улучшить знание и понимание исследуемых белков на молекулярном уровне.

В основном, QCM-D и АСМ являются предпочтительными методами выбора для будущего изучения белок монослоя адсорбции и их взаимодействия с металлами и функциональных молекул. Комбинируя эти два метода, обнаружение белка объявлением S-слоясорбционных процессов и поверхность изображения дает представление молекулярных процессов, которые могут быть в состоянии быть переданы для повышения знаний о живых бактерий и взаимодействие с окружающей средой. Это исследование показало, отрывок из возможных методов, полезных для понимания белка и металла взаимодействия. Другие полезные методы, которые могли бы повысить знания таких процессов в деталях, начиная от разнообразных спектрометрических и хроматографических методов спектроскопических расследование биомолекул и должны быть включены в будущих исследованиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Настоящая работа была частично финансируется IGF-проекта «С-Сито" (490 ZBG / 1), финансируемой BMWi и BMBF-проекта "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Особая благодарность Тобиас Дж Гюнтер для его ценную помощь во время АСМ исследований и Эрик Джонстон В. за чтение рукописи, как носителем английского языка. Кроме того, автор этой статьи хотелось бы поблагодарить Алине Риттер и Sabrina Gurlit (от Института экологии ресурсов для помощи в измерениях ICP-MS), Маня Фогель, Нэнси Унгер, Карен Е. Viacava и группа биотехнологии Гельмгольца-Института Фрайберг для Технология ресурсов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System Applikon Biotechnology, Netherlands Z6X Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 BugLab, Concord (CA), USA Z9X ---
Spectrometer Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain 80-2109-10 Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge VWR, Germany 521-2844 For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61 Olympus Germany LLC, Germany 037006 Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1) Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany --- together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S Carr Centritech, Florida, USA 9010PLT For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax IKA Labortechnik, Germany 431-2601 For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA 728411 Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot Microfluidics, Massachusetts, USA M110EH30K Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany 102041 ---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) Thermo Fisher Scientific, USA 91-ND-2000C-L For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 165-3322 For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany 1708030 Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000 PerkinElmer, Waltham (MA), USA N8120536 For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom ZEN3600 For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-E4 ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401  Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QFM401 ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden QS-QSX303 ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA QS-ESA006 ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA MFP-3DBio AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software WaveMetrics, Inc., USA --- imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA Bioheater Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2 Olympus Germany LLC, Germany  BL-AC40TS-C2 Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) Nanotec Electronica S.L. , Spain freeware Software for AFM analysis
Name Company Catalog Number Comments
Detergents and other equiment
acidic acid, 100 %, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3738.5 Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204 Sigma-Aldrich Co. LLC. A6426 For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt Sigma-Aldrich Co. LLC. B5525 ---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3862.1 ---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen Sigma-Aldrich Co. LLC. D4138 Typ IV , 2,000 - 6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95% VWR, Germany 20827.467 Danger, flammable
glycerine, p.A. CARL ROTH GmbH+CO.KG 3783.1 ---
Guanidine hydrochloride (GuHCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 0037.1 ---
Hellmanex III Hellma GmbH & Co. KG 9-307-011-4-507 ---
Hydrochloric acid (HCl) (37%) CARL ROTH GmbH+CO.KG 4625.2 Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich Co. LLC. L6876  Lyophilized powder, protein = 90 %, = 40,000 units/mg protein (Sigma) 
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany 504.10100.00 Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180 Mast Diagnostica GmbH 121800 ---
Nitric acid (HNO3) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN50.1 Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder ThermoScientific-Pierce 26614 ---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) Sigma-Aldrich Co. LLC. 243051 Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched Sigma-Aldrich Co. LLC. 408727 Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) Sigma-Aldrich Co. LLC. 60108 Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas  Sigma-Aldrich Co. LLC. R5503 Type I-AS, 50 - 100 Kunitz units/mg protein 
Sodium azide (NaN3) Merck KGaA 106688 Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 3957.2 ---
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich Co. LLC. L-5750 Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH) CARL ROTH GmbH+CO.KG 6771.1 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000  CARL ROTH GmbH+CO.KG 1893.1 ---
Sulfuric acid (H2SO4) CARL ROTH GmbH+CO.KG HN52.2 Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46) Sigma-Aldrich Co. LLC. 16201 ---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) CARL ROTH GmbH+CO.KG 9090.2 ---
Triton X-100 CARL ROTH GmbH+CO.KG 3051.3 Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50,000 MWCO Ultrafiltration tubes Sartorius AG VS0132 ---
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich Co. LLC. M6250 Danger, toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merroun, M. L., Rossberg, A., Hennig, C., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. Spectroscopic characterization of gold nanoparticles formed by cells and S-layer protein of Bacillus sphaericus JG-A12. Mater. Sci. Eng. C. 27 (1), 188-192 (2007).
  2. Raff, J., Soltmann, U., Matys, S., Selenska-Pobell, S., Bottcher, H., Pompe, W. Biosorption of uranium and copper by biocers. Chem. Mat. 15 (1), 240-244 (2003).
  3. Sleytr, U. B., Schuster, B., Egelseer, E. M., Pum, D. S-Layers: Principles and Applications. FEMS Microbiol. Rev. , (2014).
  4. Pollmann, K., Raff, J., Merroun, M., Fahmy, K., Selenska-Pobell, S. Metal binding by bacteria from uranium mining waste piles and its technological applications. Biotechnol. Adv. 24 (1), 58-68 (2006).
  5. Raff, J., Selenska-Pobell, S. Toxic avengers. Nucl. Eng. Int. 51, 34-36 (2006).
  6. Tsuruta, T. Biosorption and recycling of gold using various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 50 (4), 221-228 (2004).
  7. Sathishkumar, M., Mahadevan, A., Vijayaraghavan, K., Pavagadhi, S., Balasubramanian, R. Green Recovery of Gold through Biosorption, Biocrystallization, and Crystallization. Ind. Eng. Chem. Res. 49 (16), 7129-7135 (2010).
  8. Das, N. Recovery of precious metals through biosorption - A review. Hydrometallurgy. 103 (1-4), 180-189 (2010).
  9. Volesky, B. Biosorption and me. Water Res. 41 (18), 4017-4029 (2007).
  10. Vilar, V. J. P., Botelho, C. M. S., Boaventura, R. A. R. Environmental Friendly Technologies for Wastewater Treatment: Biosorption of Heavy Metals Using Low Cost Materials and Solar Photocatalysis. Security of Industrial Water Supply and Management.NATO Science for Peace and Security Series C-Environmental Security. Atimtay, T. A., Sikdar, S. K. , Springer. 159-173 (2010).
  11. Lovley, D. R., Lloyd, J. R. Microbes with a mettle for bioremediation. Nat. Biotechnol. 18 (6), 600-601 (2000).
  12. Schiewer, S., Volesky, B. Environmental Microbe-Metal Interactions. Lovely, D. R. , ASM Press. Washington. 329-362 (2000).
  13. Raff, J., Berger, S., Selenska-Pobell, S. Uranium binding by S-layer carrying isolates of the genus Bacillus. Annual Report 2006 Institute of Radiochemistry. , Forschungszentrum Rossendorf. Dresden. (2006).
  14. Srinath, T., Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Chromium (VI) biosorption and bioaccumulation by chromate resistant bacteria. Chemosphere. 48 (4), 427-435 (2002).
  15. Godlewska-Zylkiewicz, B. Biosorption of platinum and palladium for their separation/preconcentration prior to graphite furnace atomic absorption spectrometric determination. Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr. 58 (8), 1531-1540 (2003).
  16. Hosea, M., et al. Accumulation of elemental gold on the alga Chlorella-vulgaris. Inorg. Chim. A-Bioinor. 123 (3), 161-165 (1986).
  17. Vogel, M., et al. Biosorption of U(VI) by the green algae Chlorella vulgaris. in dependence of pH value and cell activity. Sci. Total Environ. 409 (2), 384-395 (2010).
  18. Creamer, N., Baxter-Plant, V., Henderson, J., Potter, M., Macaskie, L. Palladium and gold removal and recovery from precious metal solutions and electronic scrap leachates by Desulfovibrio desulfuricans. Biotechnol Lett. 28 (18), 1475-1484 (2006).
  19. Suhr, M., et al. Investigation of metal sorption behavior of Slp1 from Lysinibacillus sphaericus. JG-B53 - A combined study using QCM-D, ICP-MS and AFM. Biometals. 27 (6), 1337-1349 (2014).
  20. Suhr, M. Isolierung und Charakterisierung von Zellwandkomponenten der gram-positiven Bakterienstämme Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und JG-B53 und deren Wechselwirkungen mit ausgewählten relevanten Metallen und Metalloiden. , Technische Universität Dresden. (2015).
  21. Spain, A., Alm, E. Implications of Microbial Heavy Metal Tolerance in the Environment. Reviews in Undergraduate Research. 2, Rice University . Houston. 1-6 (2003).
  22. Ledin, M. Accumulation of metals by microorganisms - processes and importance for soil systems. Earth-Sci. Rev. 51 (1-4), 1-31 (2000).
  23. Maruyama, T., et al. Proteins and Protein-Rich Biomass as Environmentally Friendly Adsorbents Selective for Precious Metal Ions. Environ. Sci. Technol. 41 (4), 1359-1364 (2007).
  24. Sara, M., Sleytr, U. B. S-layer proteins. J. Bacteriol. 182 (4), 859-868 (2000).
  25. Baranova, E., et al. SbsB structure and lattice reconstruction unveil Ca2+ triggered S-layer assembly. Nature. 487 (7405), 119-122 (2012).
  26. Teixeira, L. M., et al. Entropically Driven Self-Assembly of Lysinibacillus sphaericus S-Layer Proteins Analyzed Under Various Environmental Conditions. Macromol. Biosci. 10 (2), 147-155 (2010).
  27. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (5), 1117-1125 (2007).
  28. Panak, P., et al. Bacteria from uranium mining waste pile: interactions with U(VI). J. Alloy. Compd. 271, 262-266 (1998).
  29. Selenska-Pobell, S., Kampf, G., Flemming, K., Radeva, G., Satchanska, G. Bacterial diversity in soil samples from two uranium waste piles as determined by rep-APD, RISA and 16S rDNA retrieval. Antonie Van Leeuwenhoek. 79 (2), 149-161 (2001).
  30. Lederer, F. L., et al. Identification of multiple putative S-layer genes partly expressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology. 159 ( Pt 6), 1097-1108 (2013).
  31. Günther, T. J., Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Immobilization of microorganisms for AFM studies in liquids. RSC Advances. 4, 51156-51164 (2014).
  32. Fahmy, K., et al. Secondary Structure and Pd(II) Coordination in S-Layer Proteins from Bacillus sphaericus. Studied by Infrared and X-Ray Absorption Spectroscopy. Biophys. J. 91 (3), 996-1007 (2006).
  33. Pollmann, K., Merroun, M., Raff, J., Hennig, C., Selenska-Pobell, S. Manufacturing and characterization of Pd nanoparticles formed on immobilized bacterial cells. Lett. Appl. Microbiol. 43 (1), 39-45 (2006).
  34. Corti, C., Holliday, R. Gold : science and applications. , CRC Press - Taylor&Francis Group. (2010).
  35. Daniel, M. C., Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chem. Rev. 104 (1), 293-346 (2004).
  36. Tang, J., et al. Fabrication of Highly Ordered Gold Nanoparticle Arrays Templated by Crystalline Lattices of Bacterial S-Layer Protein. Chem. Phys. Chem. 9 (16), 2317-2320 (2008).
  37. Haruta, M. Size- and support-dependency in the catalysis of gold. Catal. Today. 36 (1), 153-166 (1997).
  38. Habibi, N., et al. Nanoengineered polymeric S-layers based capsules with targeting activity. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 88 (1), 366-372 (2011).
  39. Toca-Herrera, J. L., et al. Recrystallization of Bacterial S-Layers on Flat Polyelectrolyte Surfaces and Hollow Polyelectrolyte Capsules. Small. 1 (3), 339-348 (2005).
  40. Decher, G., Lehr, B., Lowack, K., Lvov, Y., Schmitt, J. New nanocomposite films for biosensors - Layer-by-Layer adsorbed films of polyelectrolytes, proteins or DNA. Biosens. Bioelectron. 9 (9-10), 677-684 (1994).
  41. Decher, G., Schmitt, J. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer films composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolytes. Progress in Colloid & Polymer Science. 89 Trends in Colloid and Interface Science VI, Dr Dietrich Steinkopff Verlag. (1992).
  42. Günther, T. J. S-Layer als Technologieplattform - Selbstorganisierende Proteine zur Herstellung funktionaler Beschichtungen. , Technische Universität Dresden. (2015).
  43. Delcea, M., et al. Thermal stability, mechanical properties and water content of bacterial protein layers recrystallized on polyelectrolyte multilayers. Soft Matter. 4 (7), 1414-1421 (2008).
  44. Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. Interpretation of Protein Adsorption: Surface-Induced Conformational Changes. J. Am. Chem. Soc. 127 (22), 8168-8173 (2005).
  45. Zeng, R., Zhang, Y., Tu, M., Zhou, C. R., et al. Protein Adsorption Behaviors on PLLA Surface Studied by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Monitoring (QCM-D). Materials Science Forum. 610-613, 1219-1223 (2009).
  46. Bonroy, K., et al. Realization and Characterization of Porous Gold for Increased Protein Coverage on Acoustic Sensors. Anal. Chem. 76 (15), 4299-4306 (2004).
  47. Pum, D., Toca-Herrera, J. L., Sleytr, U. B. S-layer protein self-assembly. Int. J. Mol. Sci. 14 (2), 2484-2501 (2013).
  48. Weinert, U., et al. S-layer proteins as an immobilization matrix for aptamers on different sensor surfaces. Eng. Life Sci. , (2015).
  49. Umeda, H., et al. Recovery and Concentration of Precious Metals from Strong Acidic Wastewater. Mater. Trans. 52 (7), 1462-1470 (2011).
  50. Engelhardt, H., Saxton, W. O., Baumeister, W. 3-Dimensional structure of the tetragonal surface-layer of Sporosarcina-urea. J. Bacteriol. 168 (1), 309-317 (1986).
  51. Sprott, G. D., Koval, S. F., Schnaitman, C. A. Methods for general and molecular bacteriology. , American Society for Microbiology. 72-103 (1994).
  52. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during Assembly of Head Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  53. Stoscheck, C. [6] Quantitation of protein. Methods in Enzymology. Deutscher, M. P. 182, Academic Press. 50-68 (1990).
  54. Sleytr, U. B., Messner, P., Pum, D. Analysis of Crystalline Bacterial Surface-Layers by Freeze-Etching Metal Shadowing, Negative Staining and Ultra-Thin Sectioning. Method Microbiol. 20, 29-60 (1988).
  55. PerkinElmer. ICP Mass Spectrometry - The 30-Min to ICP-MS. , PerkinElmer. USA. (2001).
  56. Mühlpfordt, H. The preparation of colloidal Gold Nanoparticles using tannic-acid as an additional reducing agent. Experientia. 38 (9), 1127-1128 (1982).
  57. Hayat, M. A. Colloidal Gold - Principles, Methods and Applications. , Academic Press. (1989).
  58. Amendola, V., Meneghetti, M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 113 (11), 4277-4285 (2009).
  59. Schurtenberger, P., Newman, M. E. Characterization of biological and environmental particles using static and dynamic light scattering in Environmental Particles. Buffle, J., van Leeuwen, H. P. 2, Lewis Publishers. 37-115 (1993).
  60. Jain, R., et al. Extracellular Polymeric Substances Govern the Surface Charge of Biogenic Elemental Selenium Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 49 (3), 1713-1720 (2015).
  61. Harewood, K., Wolff, J. S. Rapid electrophoretic procedure for detection of SDS-released oncorna-viral RNA using polyacrylamide-agarose gels. Anal. Biochem. 55 (2), 573-581 (1973).
  62. Penfold, J., Staples, E., Tucker, I., Thomas, R. K. Adsorption of mixed anionic and nonionic surfactants at the hydrophilic silicon surface. Langmuir. 18 (15), 5755-5760 (2002).
  63. Krozer, A., Rodahl, M. X-ray photoemission spectroscopy study of UV/ozone oxidation of Au under ultrahigh vacuum conditions. J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films. 15 (3), 1704-1709 (1997).
  64. Vig, J. R. UV ozone cleaning of surfaces. J. Vac. Sci. Technol. 3 (3), 1027-1034 (1985).
  65. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift Fur Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  66. Q-Sense - Biolin Scientific. Introduction and QCM-D Theory - Q-Sense Basic Training. , (2006).
  67. Edvardsson, M., Rodahl, M., Kasemo, B., Höök, F. A dual-frequency QCM-D setup operating at elevated oscillation amplitudes. Anal. Chem. 77 (15), 4918-4926 (2005).
  68. Hovgaard, M. B., Dong, M. D., Otzen, D. E., Besenbacher, F. Quartz crystal microbalance studies of multilayer glucagon fibrillation at the solid-liquid interface. Biophys. J. 93 (6), 2162-2169 (2007).
  69. Liu, S. X., Kim, J. T. Application of Kelvin-Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Jala. 14 (4), 213-220 (2009).
  70. Reviakine, I., Rossetti, F. F., Morozov, A. N., Textor, M. Investigating the properties of supported vesicular layers on titanium dioxide by quartz crystal microbalance with dissipation measurements. J. Chem. Phys. 122 (20), (2005).
  71. Voinova, M. V., Rodahl, M., Jonson, M., Kasemo, B. Viscoelastic acoustic response of layered polymer films at fluid-solid interfaces: Continuum mechanics approach. Phys. Scr. 59 (5), 391-396 (1999).
  72. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13 (10), 2825-2828 (2004).
  73. Schuster, B., Pum, D., Sleytr, U. B. S-layer stabilized lipid membranes (Review). Biointerphases. 3 (2), FA3-FA11 (2008).
  74. Malmström, J., Agheli, H., Kingshott, P., Sutherland, D. S. Viscoelastic Modeling of Highly Hydrated Laminin Layers at Homogeneous and Nanostructured Surfaces: Quantification of Protein Layer Properties Using QCM-D and SPR. Langmuir. 23 (19), 9760-9768 (2007).
  75. Vörös, J. The Density and Refractive Index of Adsorbing Protein Layers. Biophys. J. 87 (1), 553-561 (2004).
  76. Hillier, A. C., Bard, A. J. ac-mode atomic force microscope imaging in air and solutions with a thermally driven bimetallic cantilever probe. Rev. Sci. Instrum. 68 (5), 2082-2090 (1997).
  77. Horcas, I., et al. WSXM: A software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev. Sci. Instrum. 78 (1), 013705 (2007).
  78. Merroun, M. L., Rossberg, A., Scheinost, A. C., Selenska-Pobell, S. XAS characterization of gold nanoclusters formed by cells and S-layer sheets of B. sphaericus JG-A12. Annual Report Forschungszentrum Rossendorf - Institute for Radiochemistry. , (2005).
  79. Jankowski, U., Merroun, M. L., Selenska-Pobell, S., Fahmy, K. S-Layer protein from Lysinibacillus sphaericus. JG-A12 as matrix for Au III sorption and Au-nanoparticle formation. Spectroscopy. 24 (1), 177-181 (2010).
  80. Selenska-Pobell, S., et al. Magnetic Au nanoparticles on archaeal S-Layer ghosts as templates. Nanomater. nanotechnol. 1 (2), 8-16 (2011).
  81. Caruso, F., Furlong, D. N., Kingshott, P. Characterization of ferritin adsorption onto gold. J. Colloid Interface Sci. 186 (1), 129-140 (1997).
  82. Ward, M. D., Buttry, D. A. In situ interfacial mass detection with piezoelectric transducers. Science. 249 (4972), 1000-1007 (1990).
  83. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: A quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73 (24), 5796-5804 (2001).
  84. Wahl, R. Reguläre bakterielle Zellhüllenproteine als biomolekulares Templat. , Technische Universität Dresden. (2003).
  85. Jennings, T., Strouse, G. Past, present, and future of gold nanoparticles in Bio-Applications of Nanoparticles. , Springer. 34-47 (2007).
  86. Beveridge, T., Fyfe, W. Metal fixation by bacterial cell walls. Can. J. Earth Sci. 22 (12), 1893-1898 (1985).

Tags

Химия выпуск 107 биосорбции металлы S-слой бактерии наночастицы QCM-D АСМ ICP-MS золото
Au-Взаимодействие SLP1 Полимеры и монослоя от<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ИСП-МС и АСМ, как инструменты для биомолекулы металлов исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K.… More

Suhr, M., Raff, J., Pollmann, K. Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies. J. Vis. Exp. (107), e53572, doi:10.3791/53572 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter