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Medicine

Espectroscopia óptica difusa para la evaluación cuantitativa de la radiación ionizante aguda La toxicidad cutánea inducida utilizando un modelo de ratón

doi: 10.3791/53573 Published: May 27, 2016

Introduction

Las mejoras tecnológicas en la planificación de la radioterapia (RT) y la entrega permiten ahora a las dosis terapéuticas altamente conformables que se entregarán a la región del tumor, salvando al mismo tiempo estructuras circundantes normales. Sin embargo, las toxicidades agudas y a veces graves son inevitables cuando el objetivo de alta dosis está en estrecha proximidad a la piel. Si lo suficientemente grave, el daño del tejido normal resultante puede afectar negativamente el resultado del tratamiento RT y la calidad de vida del paciente 1,2.

A pesar de las consecuencias perjudiciales, actual gestión de eritema de la piel queda radiación no específica, empleando cremas o ungüentos que ignoran los mecanismos biológicos subyacentes que conducen a daños. Estos enfoques se basan en minimizar los síntomas y no la causa. Por otra parte, la sincronización y la administración de terapias de intervención se complica por la naturaleza cualitativa y subjetiva de la evaluación de lesiones en la piel por radiación. Aunque varios reconocidosorganizaciones (RTOG, EORTC) proporcionar recomendaciones de clasificación visual, instituciones varían en su opción de dar un resultado preferido, oscureciendo así la comparación de las toxicidades de tejido normal a los efectos de los meta-análisis. Además, tales sistemas de clasificación son crudas y con tendencia a la variabilidad entre observadores, de tal manera que las diferencias en la gravedad de las lesiones por radiación pueden ser imperceptibles en los estudios que evalúan las estrategias de reducción de la toxicidad.

En lugar de describir visualmente el grado de eritema en la piel irradiada, un enfoque alternativo es medir parámetros que describen cuantitativamente los cambios fisiológicos subyacentes que se producen en el órgano. La hemoglobina de la sangre (Hb), la saturación de oxígeno del tejido (STO 2) o los niveles de hemoglobina oxigenada (oxiHb) se han utilizado como sustitutos de eritema inducida por irradiación en ratones 3-6. Después de la irradiación, los niveles totales de Hb se someten a las fluctuaciones, pero oxiHb o StO 2 se someten a un fuerte aumento temprano característica, seguido de unacaer y otro 3,6 subida más persistente. Cuando se utilizan irritantes para inducir eritema de la piel, los niveles de oxiHb vasculares se correlacionan directamente con la gravedad de la eritema local y la inflamación 7.

Espectroscopia óptica difusa (DOS) emplea luz infrarroja cercana para proporcionar información funcional de los componentes bioquímicos y microestructurales de los componentes de los tejidos vitales. Esta tecnología óptica cuantitativa y no invasiva ofrece un método para medir la vasodilatación inducida por citoquinas en los vasos sanguíneos que se producen durante el eritema a través de sustitutos funcionales de la concentración de Hb y StO 2. Estudios recientes que comparan los parámetros medidos DOS con métodos de calificación clínicos controlados 8-11 indican el potencial de la técnica para superar las limitaciones inherentes a la clasificación actual sistemas.

A continuación se describe un sistema en casa, portátil, DOS que emplea sustitutos funcionales para cuantitativamente detenexión diferencias en toxicidad de la piel inducido por la radiación en un modelo de ratón pre-clínica 5. La plataforma descrita puede proporcionar un medio de la puntuación de eritema estandarizado con una alta sensibilidad para la detección temprana y la diferenciación sutil de la respuesta al fármaco intervencionista. Además, con sólo pequeñas adaptaciones, la instrumentación puede eventualmente ser empleado clínicamente para la supervisión de cabecera en tiempo real.

Protocol

Los métodos siguientes están en conformidad con las directrices del Comité de Ética Animal Care Research Institute Sunnybrook.

1. Sistema de espectroscopía de reflectancia difusa

  1. Recoger los espectros de reflectancia difusa utilizando un dispositivo de mano, una sonda de fibra óptica y sistema de adquisición de espectroscópica portátil que se ha descrito previamente (Kim et al. 2010) y se revisa brevemente en la Figura 1 (y los títulos relacionados) para la integridad 1,2.

2. Preparación del modelo de ratón de radiación aguda daños de la piel

  1. Orden de 6 semanas de edad, los ratones sin pelo (de preferencia, como atímicos o SKH-1) y dejar que se aclimaten en las instalaciones de animales durante una semana antes de comenzar los experimentos. Reserva al menos 3 ratones para un grupo de control no irradiado y 5 ratones para un grupo irradiado.
  2. Antes de las mediciones de línea de base y la irradiación de DOS, etiquetar los ratones utilizando troqueles para los oídos o marcador permanente markings en la cola. Si los ratones no son desnudos, quitar el pelo en unos 2 cm por 2 cm parche de piel del flanco, pero esto puede causar irritación de la piel.

3. difusa espectroscopia óptica de Adquisición de Datos

  1. Encienda la fuente de alimentación a la electrónica.
  2. Para la piel del ratón, configurar los parámetros de la señal para el software de adquisición escribiendo en 25 milisegundos en cuanto al tiempo de recolección, 25 para los promedios de señal y 1 de ancho del filtro vagón. Estos parámetros ofrecen un equilibrio razonable entre el tiempo de adquisición y de señal a ruido.
  3. El uso de software de adquisición programada de encargo, adquieren automáticamente una lectura de fondo, R bg (LED apagado) y la reflectancia difusa a dos distancias de separación de fuente-detector, meas R (260 m, 520 m) haciendo clic en el botón "Adquirir". El tiempo total de adquisición es ~ 2 seg.
  4. Apagar todas las luces de la habitación fluorescentes pulsando el interruptor de luz de la habitación antes de realizar mediciones.
    NOTA: FLUORESCluz de la habitación ent interfiere con la señal detectada (estas luces producen una intensidad de luz variable en el tiempo y por lo tanto es difícil de restar como una señal de fondo). Aunque las bombillas incandescentes se pueden emplear mantienen las luces a una distancia de la sonda DOS para evitar niveles de fondo de alta (y la mala señal a ruido).

4. Medidas de anestesia de los animales y de línea de base DOS

  1. Preparar la máquina de anestesia, garantizando que todas las conexiones están intactas y nivel de isoflurano líquido es adecuada. Utilizar una cámara de inducción de anestesia con un tubo unido y el cono de la nariz que puede ser pegado con cinta adhesiva a una superficie esterilizada, suavemente acolchado dentro del alcance de la sonda DOS.
  2. Anestesiar una jaula de los ratones a la vez en la cámara de inducción mediante la inducción con 4% de isoflurano para 30 seg. Disminuir la cantidad de isoflurano al 2% para el próximo 2 min. Compruebe que el ratón se anestesió al observar ninguna respuesta de pellizcar un dedo del pie de la extremidad posterior.
  3. Con rapidezmover un ratón en la zona de sondeo DOS esterilizada, colocarlo en su lado, abroche su hocico en el cono de la nariz y abrir el tubo de cono de la nariz con el flujo de la anestesia (isoflurano al 2%).
    NOTA: Si el procedimiento tarda más de 1 - 2 minutos, aplique una pomada veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
  4. Antes de la adquisición de las mediciones de la piel del ratón, esterilizar la sonda limpiando con 70% de etanol. No esterilizar la piel.
  5. Coloque la sonda suavemente sobre la piel del flanco asegurándose de evitar la dispersión de la vasculatura local. Mantenga la sonda con la mano durante la duración de la medición.
  6. Adquirir datos de reflectancia mediante el sondeo de un área de la piel del flanco de aproximadamente 2 cm por 2 cm (el área a ser irradiada) siguiendo la formación 5-punto sobre una matriz. Mantenga este sondeo patrón, el área, la presión de la sonda y del lado del cuerpo (izquierda o derecha) consistente para todas las mediciones posteriores.
    NOTA: La exploración completa tarda aproximadamente 60 segundos. presión de la sonda debe ser suficiente para obtener una imagen sin dispersar lvasculatura vecinal.
  7. Mover el ratón en una jaula de recuperación, y mover el puntero del ratón sobre la próxima a la zona de sondeo DOS. Repita los pasos 4.2 a 4.6 hasta que todos los ratones que se han medido. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.

5. irradiación Animal

NOTA: Este protocolo requiere el uso de un irradiador, y puede ser necesario ajustar para satisfacer las necesidades del dispositivo irradiador preparación animal. Durante la irradiación, sólo el área pequeña de la piel del flanco debe ser expuesto al haz de radiación. El irradiador debe estar ubicado en un centro de estériles y esterilización jaula apropiada debe ser observado cuando se entreguen los ratones a su área de vivienda estéril.

  1. Preparar la máquina de anestesia (como en los pasos 4.1 - 4.2) y anestesiar a un ratón a la vez en la cámara de inducción antes de su preparación para la irradiación.
  2. Retire el ratón desde la cámara de inducción, gently pellizcar la cinta de la piel y el lugar sobre el flanco y por debajo de la piel estirada, formando una solapa.
  3. Coloque el ratón en una etapa de plexiglás y cubre el cuerpo con una plantilla del plomo a medida (un diseño de trabajo es una caja rectangular con la parte inferior y al menos un extremo abierto, junto con una ventana lateral para permitir que la piel del flanco a pasar a través). Tire de la solapa de la piel a través de la ventana de la plantilla y la cinta suavemente el colgajo en el escenario.
    NOTA: La plantilla de encargo del plomo es lo suficientemente pequeño como para inmovilizar el ratón. Si la plantilla personalizada no inmovilizar completamente el ratón, a continuación, utilizar restrainers adicionales y / o administrar la ketamina (80 - 100 mg / kg) y xilazina (10 a 12,5 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal de mantener el ratón inmovilizada a través de toda la irradiación procedimiento.
  4. Coloque la etapa de plexiglás con la plantilla y el ratón en el irradiador. Determinar la configuración (distancia de la piel de la fuente de rayos x, el voltaje, la duración y amperaje) y entregar la dosis deseada (por ejemplo, 11 cm de un kVp x- 160fuente de rayos durante 2,5 minutos con 6,3 mA).
    NOTA: Tenga cuidado con la fuente de rayos X, siguiendo las directrices de uso de la máquina para evitar quemaduras y daños en el ADN.
    NOTA: ratones desnudos atímicos desarrollan descamación húmeda alrededor de 14 días después de la irradiación en respuesta a 35 Gy, pero sólo descamación irregular menor con 17 Gy.
  5. Tome el aparato y el ratón fuera del irradiador, retire el blindaje, retire la cinta y colocarla en una jaula de recuperación individual. Vuelva a colocar el puntero del ratón a su jaula compartida normal después de que se ha recuperado de la anestesia. Repita los pasos 5.2 a 5.4 para todos los ratones, y llevar a cabo un simulacro de operación en los ratones de control.
  6. Después de la irradiación, alojar a los animales en sus condiciones normales. Si se desarrolla un comportamiento anormal (por ejemplo, postura encorvada, lo que puede significar el dolor), consulte a un veterinario para diagnosticar el problema. alivio del dolor puede incluir la administración de 0,1 mg / kg por vía subcutánea buprenorfina o como lo indique el veterinario. Si la pérdida de peso no supere el 20% de lo normal body masa, casa por separado en su propia jaula y proporcionar alimentos de alto contenido de nutrientes.

6. Mediciones DOS de seguimiento

  1. Monitorear y medir la intensidad de la reacción de la piel mediante la técnica cuantitativa de DOS. La inspección visual de los cambios en la piel y los trabajos previos sugieren que los grandes cambios en los parámetros de DOS se puede esperar (en relación a la línea de base) alrededor de 6 - 12 días después de la irradiación de 3,4. Sin embargo, ya que los cambios apreciables pueden tener lugar incluso antes o después, dependiendo del modelo, otros puntos de tiempo de medición pueden ser útiles para investigar.
  2. Configurar equipos DOS y calibraciones que se describen en la sección 3.Prepare la máquina de anestesia y adquirir mediciones de DOS como se describe en la sección 4.

7. Post-Procesamiento de adquisición

NOTA: Todos los pasos de la siguiente sección se realizan usando un programa personalizado creado en un entorno de software de alto rendimiento. convento de nomenclatura estándariones para cada archivo de adquisición espectral se emplean para permitir el procesamiento por lotes. Todas las etapas se ilustran en la Figura 2.

  1. Reste la línea de fondo (ruido de fondo) de todos los espectros medidos incluyendo la lectura de fondo.
  2. Restar la lectura de fondo, R bg (LED apagado), obtenido en el paso 3.3 a partir del espectro de medición, R meas.
    NOTA: Para el resto de este artículo todos los espectros se asume que es ruido de fondo y el fondo se restan y se utilizarán para R corr.
  3. Convertir R corr a la reflectancia absoluta, R abs, como se describe en las referencias 1,2 en la Sección 1.
    1. Obtener mediciones de reflectancia relativos, Rrel, en Intralipid 20%-fantasmas (Fresenius Kabi, Suecia) fantasmas con el aumento de 3% fracciones alícuotas de hasta 48% (es decir, 3%, 6%, 9%, ..., 48%) y crear la trama de Rrel frente a la concentración Intralipid.
    2. Generar una trama absoluta de R abdominales y frente# 956; s 'usando la ecuación de difusión de reflectancia 14.
    3. Coinciden con el pico de ambas curvas y ajustar el eje x Rrel para que coincida con el eje x R abs.
    4. En una longitud de onda y la fuente-detector separación dada, la escala del eje y usando:
      Figura 1
      NOTA: En la siguiente sección, todo apropiado de las mediciones se referirá a R abs.

Fitting 8. Datos espectrales

NOTA: La siguiente sección describe la teoría y algoritmo de ajuste utilizado para la extracción de los parámetros funcionales de la piel de ratones. Para toda la teoría empleada, consulte los siguientes artículos 14-18 y las referencias en él. Todas las ecuaciones se supone que ser programado en un entorno de software científico de gama alta (que contiene módulos preprogramados) comúnmente utilizado en física o ingeniería laboratorios.

  1. Programar una función que describe la unaespectro bsorption, mu a (λ) de la piel como la suma de cromóforos individuales relevantes en el rango espectral de interés utilizando la ecuación:
    Figura 1
    Aquí, H b es la concentración total de hemoglobina (g / L), mientras que StO 2 es la saturación de oxígeno sin unidades que van de 0 a 1.
  2. Obtener oxi, Figura 1 Y desoxi, Figura 1 , Los espectros de hemoglobina (almacenados como archivos de texto) de la colección en línea de Prahl 19.
  3. Programar una función que describe el espectro de dispersión de la piel, Figura 1 , Utilizando una dependencia de ley de potencia, en donde A (cm-1) es el valor de μ s 'en λ o = 1 nm y k es un factor de potencia dependiente medio16.
  4. Programar una función matemática para el modelo directo de reflectancia difusa basado en las ecuaciones de referencia 14 que incorporan las ecuaciones espectrales de los Pasos 8.2 a 8.3 en la función de modelo directo (es decir, R (r, mu un (λ), mu s '(λ )) = R (r, H b, StO 2, A, k).
    NOTA: Si bien existen varios modelos, la ecuación de la teoría de difusión en estado estacionario ofrece una descripción sencilla y precisa de la distribución de la luz en el tejido.
  5. Programar una función que los cuadrados de la diferencia entre el delantero modelado espectros de reflectancia de la Sección 8.4 y los espectros de reflectancia medido.
  6. Iterativa cambiar H b, STO 2, A y K hasta que la función menor diferencia cuadrados en la sección 8.5 es más pequeño. lsqcurvefit de MatLab se puede utilizar para realizar automáticamente este paso.
  7. REPEAt pasos 8/5 a 8/6 para obtener parámetros de DOS (H b, StO 2, A, y k) para todos los conjuntos de datos de reflectancia medidos.
  8. Trazar el cambio relativo en el parámetro DOS con el correspondiente medida de referencia único utilizando el promedio de un conjunto de 3 de cada ratón - 5 mediciones puntuales sonda normalizados. Estas parcelas se crean con el comando de MATLAB parcela.

9. Período de puntuación visual de la radiación Dermatitis

  1. Vigilar y anotar la intensidad de la reacción de la piel usando una escala de calificación cualitativa (véase Douglas y Fowler escala de clasificación 20) después de la irradiación cada 48 horas (también se puede observar los cambios 3 - 24 horas después de la irradiación). Dos investigadores ciegos son ideales. La adquisición de fotografías con una cámara y referencia escala de mano (es decir, una regla) puede ayudar con las evaluaciones.
  2. NOTA: Clasificación de la piel cada dos días después de la irradiación puede ayudar a determinar los momentos óptimos de medición DOS FOr el modelo. Más de puntuación frecuente puede producir datos importantes dependiendo del modelo y el problema de investigación.
  3. Trazar la mediana de cada grupo en cada punto de tiempo. Comparar los grupos en momentos específicos o las áreas globales medias debajo de cada curva.
  4. Después los ratones se han seguido hasta el punto de cicatrización de la piel que se desea (por ejemplo, 4 semanas), la eutanasia a los ratones mediante un método apropiado (aprobado).

Representative Results

La técnica de reflectancia DOS ofrece una alternativa a los métodos cualitativos objetivo tradicionales de evaluación de la toxicidad inducida por la radiación de la piel. Los cambios visuales en la apariencia de la piel siguientes dosis tóxicas de radiación presente como alteraciones en tanto la magnitud y la forma de los espectros de reflectancia medidos. Ambos están relacionados con los cambios funcionales en la microestructura celular subyacente y estado del tejido fisiológico. En esta sección, los resultados representativos de los trabajos publicados anteriormente por Yohan et al. 2014 5 son revisados.

La figura 3 (a la izquierda) muestran los espectros (líneas azules finas) representativos se mide a una fuente micras de separación de 260 en un modelo de ratón sin timo de eritema cutáneo 6 días después de 40 Gy de irradiación. En comparación con antes de la irradiación (Figura 3, panel derecho), se observan diferencias en la forma espectral en ~ 550-650 nm, likEly debido a un aumento en la hemoglobina oxigenada. Un pequeño aumento en la reflectancia absoluta también se ve que se correlaciona con un aumento del poder de dispersión de los tejidos. Los espectros observados en el día 6 después de la irradiación correlacionada con una puntuación visual de la piel 0,75.

Una evaluación de los cambios de reflectancia posterior irradiación en ciertas longitudes de onda no hace uso del espectro de reflectancia completo y también conlleva el problema potencial de la sensibilidad al ruido. Sin embargo, el montaje del espectro completo permite que los datos de todo el conjunto para ser convertido en biomarcadores ópticos intuitivos (H b, STO 2). La figura 3 muestran los ajustes resultantes (línea verde fijo) de los datos medidos (delgada línea ruidosa) usando las ecuaciones presentadas en la Sección se observa 4. Excelente acuerdo, lo que confirma que la elección de los cromóforos de base y la forma de dispersión describen adecuadamente el modelo de piel de ratón.

La figura 4 muestra los cambios relativos en la piel StO 2 para varios puntos de tiempo (6, 9, 12 días) en una cohorte de ratón irradiados (n = 8), mientras que la figura 5 muestra los correspondientes resultados de la reacción de la piel cualitativos. Un aumento progresivo de StO 2 se observa que es estadísticamente diferente en comparación con los valores pre-irradiación más de los 3 días (p <0,05). Estas tendencias reflejan los aumentos observados visualmente en la gravedad de los daños de la piel que pico en el día 12 (puntuación media de ~ 3) que demuestra el potencial de StO 2 como un sustituto de puntuación visual (Figura 5).

Cabe señalar que no se observaron cambios estadísticamente significativos para cualquiera de los biomarcadores ópticos devueltos para elno irradiado grupo de control (n = 3) en los 12 días medidos (datos no mostrados). Los cambios en A y k también pueden ser monitorizados con el tiempo (Figura 6), y estos indican que las propiedades de dispersión de la piel están cambiando en respuesta a la radiación.

Figura 1
Figura 1. instrumentación DOS. (A) Representación esquemática de la geometría de medición de reflectancia difusa (B) sonda de fibra óptica:. La sonda óptica se compone de una serie lineal de 200 micras fibras ópticas centrales que están agrupados en una aguja de metal 18 G y espaciados 260 m de distancia. Dos fibras de origen están acoplados a dos diodos emisores de luz de banda ancha, mientras que una fibra de detección está conectado a un espectrómetro óptico. Al girar secuencialmente en cada una de las fuentes, el espectrómetro puede recoger de reflectancia difusa a distancias de 260 micras y520 micras de cada una de las fibras de origen (C) sistema DOS completo incluyendo portátil, que se adjunta sonda y óptica caja de fibra óptica:. Un programa de adquisición de datos automatizado se utiliza para conducir la recogida secuencial de espectros. Los componentes electrónicos están alojados en una caja de adquisición que se conecta a la sonda de fibra óptica a través de conectores SMA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
.. Figura 2 procesamiento espectral Todas las escalas del eje x están en nm: (A) los espectros relativa Raw, la línea de base es la lectura de aproximadamente entre 900 - 1000 nm y aproximadamente igual a la señal de fondo (B) la lectura de fondo relativa (C.. ) de fondo y la línea base restan s relativos PECTRA. (D) Absolutamente calibrado espectro después del raspado de espectros procesados ​​se muestra en (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Los espectros de reflectancia de luz blanca típica de (derecha) de piel de ratón 6 días no irradiadas (izquierda) y irradiados publicar irradiación. Excelente concordancia entre la medida (azul ruidoso) y convulsiones (verde intenso) suelen fueron observados. Se observaron dos diferencias clave entre los dos grupos: 1) un aumento global de la reflectancia absoluta y 2) un cambio notable en su forma espectral entre 550 - 600 nm. Con el permiso de Yohan et al. 2014 5.> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Cambio en la fracción de la oxigenación de la piel del ratón después de 40 Gy de irradiación. La diferencia media de referencia normalizada entre los dos grupos (por ratón) es significativa para el Days 6 (Cuadro 1), 9 (Recuadro 2) y 12 (Cuadro 3 ). Con el permiso de Yohan et al. 2014 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Promedio de la piel cualitativa reacciones puntuaciones (n = 8) como una función de los días siguientes 40 Gy irradiados piel ratones. Adaptado de Yohan et al. 2014 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Los cambios relativos en A y K de la piel del ratón siguientes 40 Gy de irradiación en los días 6 (Cuadro 1), 9 (Recuadro 2) y 12 (Cuadro 3). El cambio de A (lado izquierdo) y K (lado derecho) el día 6 (recuadro 1, lados izquierdo y derecho) se encontró que era significativa (p <0,026). Con el permiso de Yohan et al. 2014 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Se ha presentado un enfoque para evaluar cuantitativamente DOS toxicidades cutáneas de radiación utilizando biomarcadores ópticos. sistemas de puntuación visuales de toxicidad de la piel requieren la formación de expertos e incluso entonces son propensos a la variabilidad entre observadores y la subjetividad. El sistema y el software de análisis de DOS es sencillo de usar, requiere una formación mínima y devuelve los parámetros funcionales objetivas para interpretar los cambios fisiológicos en la piel. Además, en lugar de describir la aparición de una lesión de la piel como un único parámetro, DOS ofrece una gran cantidad de información en forma espectral, propiedades ópticas y los parámetros funcionales / microestructurales que ofrecen un mayor grado de sensibilidad y especificidad no está disponible en los métodos actuales de puntuación cualitativos. Las secciones 1 y 7 ponen de relieve las principales etapas de procesamiento para la obtención de datos espectrales absolutos que pueden ser utilizados para el montaje cuantitativo de biomarcadores ópticos. Antecedentes y sustracción de línea de base son esenciales para permitir al usuario realizarlas mediciones DOS bajo condiciones normales de luz. Sección 8 proporciona los modelos y ecuaciones necesarias para describir ratones atímicos antes y después de la irradiación de rayos x necesarios. Aquí, la elección de absorbentes adecuados es vital para una descripción exacta de los espectros medidos. Se aconseja que el usuario investigar a fondo en la literatura los absorbedores clave que dominan la gama y el tejido de interés utilizado en un estudio dado antes de la construcción de un modelo de ajuste biomarcador óptica de longitud de onda. Por último, las secciones 3-5 describen el manejo de los ratones atímicos durante la adquisición de DOS. Para evitar la interrupción de la vasculatura local, utilice una fuerza suave para colocar la sonda de DOS en la superficie de la piel del ratón.

Aunque es relativamente barato en comparación con los sistemas de cámaras hiperespectrales 3,4, una clara limitación del enfoque DOS se describe es el uso de una sonda de punto de medición de la reflectancia difusa. Esta geometría necesidades reflectancia suave contacto con la piel ytiene el potencial de introducir incertidumbre en la medición por dispersión de la vasculatura si no se emplea presión de la sonda-piel consistente. futuros diseños de la sonda DOS pueden incorporar un sensor de presión para mantener resultados consistentes. Además, mientras que el uso de una estrecha separación fuente-detector (<2-3 mm) permite profundidades de sondaje ópticas específicas a la superficie de la piel, la especificidad mejorada se produce en una pérdida de resolución espacial en comparación con imágenes hiperespectrales 2D. Para minimizar esta limitación, una exploración del cuadrante de 5 puntos que captura se empleó el volumen irradiado en general. A pesar de la falta de resolución espacial, el trabajo previo en ratones 5 ha demostrado la capacidad de los biomarcadores óptica promediada sobre un área de escasa diferenciar no sólo la piel irradiada y no irradiada, sino también el impacto de la piel fármacos ahorradores intervencionistas como la Vasculotide 6.

Debe tenerse en cuenta que mientras que el diseño general del sistema puede ser modificado para diferentes piel modelos, pueden necesitar ser optimizado de forma que subyace espectros de base y la dispersión. Específicamente, mientras que oxi y desoxi-Hb así describen un modelo de ratón atímicos, la aplicación del mismo modelo para la piel más oscura puede requerir la adición de melanina para el montaje óptimo. Además, la extensión del ancho de banda para DOS longitudes de onda más altas> 950 nm harían necesario la adición de agua, que domina a longitudes de onda más altas. Además, los modelos animales con diferentes espesores de la piel pueden requerir una separación fuente-detector diferente para optimizar la sensibilidad de profundidad. Por último, la característica sin pelo hace que algoritmos más simple. A pesar de que los modelos no sin pelo pueden ser óptimas para ciertas cuestiones de investigación, ellos requieren la eliminación del vello antes de las mediciones de DOS, y la irritación de la piel de este proceso puede afectar los resultados. Para la investigación, donde la función inmune total es fundamental, un ratón sin pelo inmunocompetentes (por ejemplo, SKH-1) puede servir como un modelo mejor debido a su naturaleza eutímicos.

ent "> Las consideraciones importantes para las mediciones de la sonda DOS son consistentes RT y la estimación del área irradiada. Las fluctuaciones de temperatura pueden afectar al tejido de Hb y STO 2 niveles. La medición de un grupo de 3 animales no irradiados en cada momento de la recolección de datos puede servir como punto de partida para que las fluctuaciones ambientales no deseados en valores de los parámetros se pueden normalizar. Además, el área irradiada puede ser difícil de estimar (si las preparaciones de la aleta de la piel no fueron consistentes) antes de daño comienza a manifestarse visualmente alrededor del día 5 (40 Gy). Si se utiliza un marcador permanente negro para dot los límites de la piel por radiación expuesta, evitar el uso excesivo de tinta para evitar que se corra la tinta, lo que puede comprometer lecturas.

Una característica adicional del sistema es la capacidad de separar la absorción de las propiedades de dispersión. Mientras que los sistemas de imágenes hiperespectrales alternativas también ofrecen la posibilidad de monitorear oxiHb y la concentración de Hb, la geometría en el espacio libre de i imágenes hiperespectrales s no puede resolver cambios de dispersión. Esta limitación puede dar lugar a imprecisiones en el vuelto oxiHb, Hb y STO 2 parámetros si los cambios significativos en la dispersión se producen debido a eritema (enrojecimiento). Además, el seguimiento de los cambios de dispersión utilizando DOS puede proporcionar biomarcadores ópticos adicionales para la evaluación del eritema. Como se muestra en la Figura 6, los resultados iniciales de Yohan et al. (2014) indican que A y k demostrar una tendencia temporal después de la radiación ionizante que no se correlaciona con las tendencias observadas de otros métodos alternativos, tales como sistemas de puntuación visual. Esto indica que los cambios de dispersión no se manifiestan de una manera visualmente descriptivo y puede ser de hecho la descripción de un proceso biológico independiente. Por lo tanto, en comparación con métodos alternativos, DOS proporciona una alta resolución para la dispersión de los cambios superficiales, una vía para la investigación de nuevos biomarcadores de daño de la piel que pueden ser separadas de las mediciones basadas en la Hb habituales.

jove_content "> Aunque nuestro modelo emplea una sola dosis grande de radiación (en vez de múltiples pequeñas dosis fraccionadas que se utilizan en el ámbito clínico), Esto imita la fisiopatología de la aguda radiotoxicidad piel humana 21. Se prevé que con una mayor optimización, DOS puede proporcionar un enfoque cuantitativo para la puntuación automatizada y estandarizada de reacciones en la piel inducidos por la radiación. Después de dominar esta técnica, las aplicaciones futuras pueden incluir la supervisión de las diferencias entre la piel terapéutica ahorradores (por ejemplo, la comparación de los niveles de oxiHb entre un control y tratamiento experimental para la protección radiológica de la piel, o para la promoción de la cicatrización de heridas ). Mientras ideal para la detección de drogas de alto rendimiento en modelos animales, el sistema DOS es potencialmente adaptable al entorno clínico debido a la facilidad de uso y la capacidad de medir en condiciones de iluminación normales. en este caso, el diseño de la sonda puede requerir modificaciones menores con un poco más grandes separaciones optodos para tener en cuentael aumento del grosor de la piel humana. Un sistema DOS clínico permitiría para la evaluación en línea de terapias de intervención que puedan minimizar reacciones dolorosas en la piel y mejorar la comodidad del paciente y el cumplimiento. En el futuro, puede ser interesante para ampliar la cuantificación basada en DOS para las características de daño en la piel inducido por radiación crónica (por ejemplo, fibrosis).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nude mice e.g., Charles River Athymic nude Crl:NU(NCr)-Foxn1nu, or immunocompetent nude Crl:SKH1-Hrhr
Small animal irradiator  e.g., Faxitron X-Ray Corp. Faxitron CP160
Animal anaesthesia  If using isoflurane vaporizer machine with induction chamber, need tube and nose cone.
Lead jig and plexiglass stage Custom made If irradiator device exposes whole animal body to radiation, lead shielding must be used to expose only the skin flap.
Medical tape 
Permanent marker/ear puncher
Matlab Mathworks Inc., Natick, MA With StatisticsToolbox 
Labview National Instruments, Vaudreuil-Dorian, QB
DOS system
Optical multiplexer Ocean Optics, Dunedin, FL Model MPM-2000
Spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL Model S200
White light source Ocean Optics, Dunedin, FL Model LS-1
Intralipid-20% Kabi Pharmacia, New York, NY
Reflectance standard INO, Quebec City, QB

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References

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Espectroscopia óptica difusa para la evaluación cuantitativa de la radiación ionizante aguda La toxicidad cutánea inducida utilizando un modelo de ratón
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Chin, L., Korpela, E., Kim, A., Yohan, D., Niu, C., Wilson, B. C., Liu, S. K. Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (111), e53573, doi:10.3791/53573 (2016).More

Chin, L., Korpela, E., Kim, A., Yohan, D., Niu, C., Wilson, B. C., Liu, S. K. Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (111), e53573, doi:10.3791/53573 (2016).

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