Introduction
הבנה מקיפה של מסלולי איתות דורשת ידע מפורט על האינטראקציה ליגנד לרצפטור. רוב השיטות להערכת האינטראקציה של ליגנד מסוים עם קולטן המסוים שלה הם יקרים, זמן רב, עבודה אינטנסיביות דורשות ציוד ספציפי ומומחיות 1.
מאמר זה מתאר שני מהירים ואמין, נקודה אחר נקודת פרוטוקולים לחקור את אינטראקצית הקולטן ליגנד המבוססת על אנזים מקושר assay immunosorbent (ELISA): את assay האינטראקציה ליגנד לרצפטור הישירה (LRA) ואת LRA התחרות. ELISA היא טכניקה רגישה, מאוד ספציפית וזמינה, בשימוש שגרתי כמעט בכל מעבדה. ELISA יכול להתבצע ומותאם באופנה שונה. הפרוטוקולים שהוצגו ממוטבים עבור חקירת האינטראקציה בין אינטרפרונים למבדה שונים (INFLs) והקולטן שלהם.
לצבא LRA הישיר מאפשר quantificatiעל של קולטן ליגנד מחייב ביחס ריכוז ליגנד ובכך מניב עקום מחייב. באמצעות מודל מתאים האינטראקציה ליגנד לרצפטור, הנתונים ניתן לנתח עוד יותר להעריך את קבוע דיסוציאציה (K D).
בפרוטוקול שהוצג, משוואת היל הנפוצה מוחל מודל קולטן ליגנד מחייב. למרות שיטות אחרות כגון טכנולוגיית תהודת plasmon המשטח 2,3 לאפשר קביעת הזיקות המחייבות בין שני חלבונים, טכנולוגיה זו היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, יקרה, ודורשת ציוד מעבדה מיוחד.
לצבא LRA התחרות מאפשר הקרנת פפטידים מעכבים: קולטן ליגנד המחייב הוא לכימות ביחס ריכוז הפפטיד. זה מניב עקומת מנה-תגובה המתאר את ההשפעה המעכבת של הפפטיד. הנתונים ניתן לנתח עוד יותר להעריך את ריכוז מעכבות מקסימלי וחצי (IC 50
שני פרוטוקולי ELISA קלים לשימוש וניתן להתאים למגוון רחב של שאלות מחקר. חלבונים רקומביננטי מכל סוג שהוא יכול לשמש באופן מהימן ומהיר לקבוע מהם חלקי אינטראקציה. בנוסף, LRA התחרות יכול לשמש כדי לקבוע אתרי אינטראקציה קריטיים של הליגנדים ואת הקולטנים באמצעות פפטידים חסימה, אשר נועדו לחקות או ליגנד או הקולטן. אם הפפטיד חסימת מראה עיכוב יעיל וספציפי, הפפטיד תופסת אתר אינטראקציה קריטי של ליגנד (אם הפפטיד מחקה הקולטן) או של ליגנד (אם הפפטיד מחקה ליגנד).
הפרוטוקול הראשון מתאר את נחישות ערך D K של INFLs השונה למקטע אלפא של הקולטן שלהם, כלומר, הקולטן interleukin-28 (IL28RA) באמצעות LRA הישיר. לאחר מכן, בפרוטוקול השני מראה כיצד לקבוע את היכולת של פפטיד ארוך חומצה 20 אמינולעכב את האינטראקציות INFL-IL28RA. הפפטיד נועד להתחרות עם IFNLs באתר מחייב הקולטן שלהם ובכך מאפשר הבנה מולקולרית של האינטראקציה. יתר על כן, פפטיד זה יכול לשמש כדי לחסום IL28RA בניסויים במבחנה כדי לקבוע את ההשפעה על במורד איתות אפקטים 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מגיב
- כדי להכין חיץ ציפוי קרבונט, לפזר 0.36 g Na 2 CO 3 ו 0.84 גרם NaHCO 3 ב 100 מ"ל מים מזוקקים; סינון סטרילי למאגר באמצעות ואקום מונע 0.22 מיקרומטר polyethersulfone (PES) מסנן הממברנה ולאחסן ב RT עד השימוש.
- כן פתרון כביסה ידי הוספת 0.05% v / v Tween 20 בופר פוספט (PBS).
- הכן אלבומין 5% שור (BSA) (פתרון חסימה) בתמיסה PBS על ידי המסת 5 גרם BSA (≥98%) ב 100 מ"ל PBS ולאחסן ב 4 ° C..
- קולטן רקומביננטי, הליגנדים פפטידים חסימת
- Reconstitutethe למקטע אלפא קולטן interleukin אנושי רקומביננטי (IL28RA) ו ligands שלו מתויג רקומביננטי של האדם IFN (IFNL1-3) בהתאם להוראות וחנות של היצרן ב -80 מעלות צלזיוס. Synthetize חסימת פפטידים ומשומשים כפי שתואר לעיל 4. השתמש PBS להכין ריכוזים שונים של ליגנדים ופפטידים לשימוש המבחנים.
- כדי להכין את הנוגדן הראשוני, לדלל נוגדן חד שבטי עכבר 6x שלו ב- PBS עם 0.1% BSA ב 1: 1,000 דילול. כדי להכין את נוגדנים משני, לדלל peroxidase חזרת (HRP) מצומדות עז נגד העכבר IgG (H + L) ב- PBS עם 0.1% BSA ב 1: 10,000 דילול.
- כן פתרון TMB ידי ערבוב א ריאגנטים ו- B על פי הוראות היצרן.
- הכן להפסיק פתרון על ידי הוספת 5 N חומצה גופרתית (H 2 SO 4) במים מזוקקים חנות ב RT.
2. Enzyme-linked immunosorbent מבחנים (ELISAs)
הערה: האינטראקציה ליגנד לרצפטור ישירה ELISA (LRA ישירה, איור 1) ניתן להשתמש כדי למדוד את דיסוציאציה ליגנד לרצפטור קבוע (K D), כאמצעי של הזיקה מחייב ליגנד רצפטור. האינטראקציה ליגנד לרצפטור תחרות ELISA (LRA תחרות, איור 2) כלOWS הקרנת פפטידים (ותרכובות חסימה אחרות), אשר פועלים כדי להפריע את האינטראקציה בין ליגנד רצפטור. הפרוטוקול הבסיסי שפורסם בעבר 5 היה מותאם יותר.
הערה: בשני ELISA שיטות להשתמש פיפטה רבה להוספת פתרונות הבארות של צלחת 96-היטב בכל שלב. בשינה למזוג פתרון או צעדי כביסה, לזרוק פתרונות ישירות לתוך הכיור.
- ליגנד-קולטן אינטראקציה ישירה Assay (LRA ישיר)
הערה: לצורך המחשה של העבודה (ראה איור 1).- פלייט ציפוי עם קולטן רקומביננטי
- לדלל את הקולטן רקומביננטי חיץ קרבונט לריכוז סופי של 100 ng / μl. בארות מעיילות של צלחת microtitre 96-היטב עם ריכוז קולטני קבוע (100 ng / μl) על ידי pipetting 100 μl היטב כל באמצעות פיפטה רבה. אל תכלול קירות חיצוניים של הצלחת להימנע חפץ קצה היטב. מכסים את הצלחת עם מכסה דגירהצלחת ב 4 ° CO / N.
- חסימה והוספת הליגנדים
- למחרת, להסיר את פתרון הציפוי ידי הטיית הצליחה נגד לכיור לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם פתרון כביסה (PBS + 0.05% v / v Tween 20).
- חסום באתרי מחייב הקולטן חינם בצלחת המצופית באמצעות 200 μl של פתרון BSA 5% לכל גם באמצעות פיפטה רבה דגירת הצלחת עבור שעה 2 ב RT.
- מחק את פתרון החסימה (ראה שלב 2.1.2.1.) ולשטוף את הצלחת 3 פעמים עם פתרון כביסה.
- הכן את רקומביננטי הליגנדים שלו מתויג בריכוזים שונים (למשל, 8 מיקרוגרם / מ"ל, 4 מיקרוגרם / מ"ל, 2 מיקרוגרם / מ"ל, 1 מיקרוגרם / מ"ל, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל, 0.125 מיקרוגרם / מ"ל, 0.063 מיקרוגרם / מ"ל, 0.031 מיקרוגרם / מ"ל, 0.0 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS. הוסף רק PBS בבארות הריקות.
- הוספת 100 μl של ריכוז כל ליגנד אל הבארות כפולות דגירת הצלחת עבור שעה 2 ב RT המאפשר ליגנד רצפטוראינטראקציה.
- דגירה עם נוגדנים
- לאחר דגירה עם ליגנדים, לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם פתרון כביסה.
- פיפטה 100 μl של פתרון נוגדן חד שבטי העכבר אנטי הראשוני שלו (1: 1,000) זה טוב.
- דגירה את הצלחת על RT עבור 2 שעות; לאחר דגירה, להשליך את פתרון הנוגדן (ראה שלב 2.1.2.1.) ולשטוף את הצלחת 3 פעמים עם פתרון כביסה.
- הוספת 100 μl של HRP מצמידים עז נגד העכבר פתרון נוגדנים משני IgG (1: 10,000) זה טוב. הדגירה הצליחה במשך 45 דקות ב RT.
- מחק את פתרון הנוגדן (ראה שלב 2.1.2.1.) ולשטוף את הצלחת 3 פעמים עם פתרון כביסה.
- תוספת של מצע ופיתוח
- תביא פתרונות מצע TMB כדי RT ולהכין TMB פתרון מצע ו- B ב 1: 1. הוספת 100 μl מוכנים טרי מצע זה טוב לשמור את הצלחת ב RT במשך 15-30 דקות. לאחר col מספיק או פיתוח להוסיף להפסיק פתרון 50 μl.
- קריאת ניתוח פלייט ונתונים
הערה: הפרוטוקול המתואר מבוסס על ההנחה כי האות הנמדד עולה מן ספציפי מחייב. זה עשוי להיות נחוץ כדי להעריך את התרומה של מחייב נוקבים לאות אבל זה מחוץ לתחום של פרוטוקול זה.- קראו את הספיגה (צפיפות אופטית, OD) ישירות ב -450 nm.
- הפחת את אות רקע מערכיה OD נמדדו לנרמל אותם. Transform כל הערכים של ריכוז ליגנד כדי סולם לוגריתמי (בסיס 10, להיכנס 10).
- מגרש את המנורמל ורקע תיקן ערכי OD (ציר ה- Y, תואם את השבריר של אתרי קישור לקולטן כבוש) נגד הלוגריתם של הריכוז ליגנד (ציר ה- X, יומן 10 בקנה מידה).
- לשם הערכת שווי D K, להתאים את הנתונים אל הטופס הבא של המשוואה היל:
tp_upload / 53,575 / 53575eq1.jpg "/>
הערה: כאן Y מציין את החלק היחסי של אתרי קישור לקולטן כבושים ו- Y מקסימום המקסימאלי שניתן מחייב; [יב] מציין את ריכוז ליגנד חופשי מקדם היל. אם יש רק אתר אחד מחייב ליגנד, מקדם היל הוא n = 1. עבור מערכות עם יותר מ מחייב אתר ליגנד אחד, cooperativity מחייבים המייצגים החיובי אם n> 1, cooperativity שלילי אם n <1 ולא cooperativity אם n = 1. קבוע דיסוציאציה המיקרוסקופי נקרא ומתאים לריכוז המקסימאלי חצי יעיל EC 50 6. קבוע דיסוציאציה לכאורה הוא K d = (K D) n. במקרה הפשוט ביותר כאשר n = 1, המקבילה הקבועה דיסוציאציה לריכוז ליגנד שבה המחצית של הקולטן אתרי קישור תפוס ו- K d = K D. מודל זה מניח המסות מחייב לפי תנאי שיווי משקל, כמו גם כי רק חלק קטן שלליגנד המוסף מאוגד הקולטן, כלומר, [יב] >> [RL].
- פלייט ציפוי עם קולטן רקומביננטי
איור 1. assay-קולטן אינטראקציה ליגנד ישיר (LRA ישירה). צעד אחר צעד פרוטוקול LRA ישירה. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- תחרות ליגנד-קולטן אינטראקציה Assay (LRA התחרות)
הערה:. כהדגמה של זרימת העבודה ראתה איור 2 הליך LRA התחרות כדלקמן את אותם צעדים כמו LRA הישירה (ציפוי הצלחת, דגירת נוגדן, פיתוח צלחת) למעט שינויים חשובים ליגנד ופפטידים צעד נוסף. שולט שלילי נכון חיוניים assay זה. במחקר הקרנה קודם <sup> 4, הפפטיד החסימה המקושקש לא הראה השפעות מנוגדות.- חסימה - תוספת של הליגנדים פפטידים חסימה
- למחרת, להסיר את פתרון הציפוי ולשטוף את הצלחת (ראה 2.1.2.1).
- חסום את הצלחת המצופית על ידי הוספת 200 μl של פתרון BSA 5% זה טוב הדגירה הצליחה במשך שעה 2 ב RT.
- הכן את הליגנדים שלו מתויג רקומביננטי (IFNL1-3) בריכוז קבוע (2x-20 ng / ml) ב PBS.
- הכן את הפפטיד החסימה (השווה לוח 3) עם ריכוזים שונים הנעים בין 10 ננומטר עד 100 מיקרומטר PBS להבטיח עקומת מנת תגובה.
הערה: זו מאפשרת קביעה בדיעבד של הערך 50 IC עבור הפפטיד החסימה. בשנת בארות שליטה, להוסיף ריכוז ליגנד קבוע בלבד ללא פפטיד לגזור מקסימאלי (100%) מחייב. את החסר, להוסיף PBS בלבד ללא ליגנד או הפפטיד. - הוסף 50 μl של ליגנדים (IFNL1-3) ו -50 μl של כל PEריכוז ptide אל בארות כפילויות.
- הדגירה הצליחה במשך שעה 2 ב RT.
- קריאת ניתוח פלייט ונתונים
הערה: הפרוטוקול המתואר מבוסס על ההנחה כי האות הנמדד עולה מן ספציפי מחייב. זה עשוי להיות נחוץ כדי להעריך את התרומה של מחייב נוקבים לאות אבל זה מחוץ לתחום של פרוטוקול זה.- קראו את הספיגה (צפיפות אופטית, OD) ישירות ב -450 nm.
- הפחת את אות רקע מערכיה OD נמדדו לנרמל אותם. Transform כל הערכים של ריכוז הפפטיד כדי סולם לוגריתמי (בסיס 10, להיכנס 10).
- מגרש את המנורמל ורקע תיקן ערכי OD (ציר ה- Y, תואם את השבריר של אתרי קישור לקולטן כבוש) נגד הלוגריתם של הריכוז ליגנד (ציר ה- X, יומן 10 בקנה מידה).
- לשם הערכה שווה 50 IC, להתאים את נתוני המשוואה הבאה:
הערה: כאן [טז] הוא ריכוז הפפטיד והשיפוע היל. השיפוע היל מתאר את תלילות העקום מנה-תגובה. IC 50 תואם את הריכוז המעכב שבו 50 עיכובי% של מחייב בין ליגנד רצפטור הוא ציין.
- חסימה - תוספת של הליגנדים פפטידים חסימה
איור 2. תחרות ליגנד לרצפטור אינטראקציה assay (LRA תחרות). צעד אחר צעד פרוטוקול LRA תחרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קבועי דיסוציאציה בין INFL1-3 ו למקטע אלפא קולטן שלהם IL28RA נקבעו באמצעות LRA ישיר. התוצאות מוצגות באיור 3: את החלק היחסי של אתרי קישור כבושים זמם נגד הלוגריתם של ריכוז IFN בהתאמה. עלילת Scatchard של הנתונים מוצגת בפינה הימנית התחתונה. התוצאות ממחישות כי LRA הישירה מניבות עקומת מחייב, אשר ניתן לנתח עוד יותר להעריך את ערך D K. ערך D K נקבע על ידי התאמת הנתונים למשוואה היל (משוואת 1).
IFNL1 יש זיקה מחייבת הגבוהה ביותר, ואחריו IFNL2 ו IFNL3. מקדם היל n> 1 מציע מוגברת זיקת ligands נוסף לאחר האינטראקציה ליגנד לרצפטור הראשונית (ראה דיון). קבוע דיסוציאציה מוערך ומקדמי היל מסוכמים בטבלה 1.
LRA התחרותי שמש לכמת את ההשפעה של פפטיד חסימה על האינטראקציה בין IFNL1-3 ואת IL28RA (איור 4). את החלק היחסי של אתרי קישור כבושים ריכוז ליגנד של מיליליטר 10 ng / זמם נגד הלוגריתם של הריכוז הפפטיד. כדי להעריך את ערכי 50 IC, הנתונים מצוידים משוואה 2.
הפפטיד חסימת עיכב את האינטראקציה בין IFNL3 ו IL28RA (IC 50 = 0.26 מיקרומטר) במידה הרבה ביותר. IC 50 הוא גבוה פי שניים עבור האינטראקציה IFNL2-IL28RA (IC 50 = 0.50 מיקרומטר) וסדר גודל אחד גבוה יותר עבור האינטראקציה IFNL1-IL28RA, מעיד הפפטיד היה פחות יעיל לשבש אינטראקציות IFNL1-IL28RA. הערכים 50 IC נקבעו והמדרונות היל מסוכמים בטבלה 2.
_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> ניתוח נתונים נכון הוא חיוני להבנת אינטראקצית הקולטן ליגנד התוצאות הראו נוצרו באמצעות תוכנת גרפים מדעית כגון GraphPad פריזמה לקביעת ערך K D.. , הנתונים התאימו את 'אחד האתרים - ספציפית מחייב עם היל מדרון'. (. מתאים למשוואה 1 Sec 2.2.1) לקביעת ערך 50 IC, הנתונים מצויד ביומן 'פונקציה (מעכב) לעומת . תגובה מנורמלת -. שיפוע משתנה '(. ראה משוואה 2 Sec 2.2.2) עם זאת, כל תוכנה לניתוח רגרסיה שאינו ליניארי יכולה לשמש.
איור 3. תוצאות של assay ליגנד לרצפטור הישיר (LRA הישירה). עקומות עקידה עבור עקידת IFNL1 (ירוק), IFNL2 (אדום) ו IFNL3 (כחול) כדי IL28RA. עלילת Scatchard בהתאמה בפינה הימנית התחתונהבפינה מרמזת חיובי שיתוף operativity של הכריכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תוצאות של assay ליגנד לרצפטור התחרותי (LRA התחרותי). מנה-תגובה עקומה המראה עיכוב של עקידת IFNL1 (10 ng / ml, ירוק), IFNL2 (10 ng / ml, אדום) ואת IFNL3 (10 ng / מ"ל, כחול) כדי IL28RA ידי הפפטיד 20 aa. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1: משוער קבוע דיסוציאציה (K Dמקדמי היל) של IFNL1-3 מחייב IL28RA. סטיית התקן (SE) ניתנה לגבי גודל המדגם של ארבע חזרות לכל נקודת נתונים.
טבלת 2:. משוערת חצי מקסימאלי ריכוזים מעכבים (IC 50) של פפטידים חסימת המדרון היל של עקומת מנת התגובה עבור עקידת IFNL1-3 כדי IL28RA ריכוז IFN הוא 10 ng / ml. מספר המשכפל הוא שלוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ELISA הוא תקן ושיטה ומבוססת למעבדות רבות. יש לנו שונה נוספים ושיפרנו 5,7 שיטה שפורסמו בעבר. צעד אחר צעד הפגין הפרוטוקול מראה כיצד ניתן להשתמש בו בצורה פשוטה כדי לקבוע את ערכי D K של אינטראקציות ליגנד לרצפטור. בנוסף, IC50 של פפטיד חסימת מפריע האינטראקציה ליגנד לרצפטור ניתן לקבוע.
היתרונות העיקריים הם ההתקנה המהירה, הכנה פשוטה של ריאגנטים וטיפול מוכר, כמו רוב החוקרים השתמשו פרוטוקול ELISA לפני. פרוטוקול LRA הישיר הוא גמיש מאוד יכול להיות מותאם כדי למדוד אינטראקציות בין חלבונים רבים. חלבונים רקומביננטי עם His6- או תג האלטרנטיבה אמורים לשמש כשותפת מחייב שותף משותק. לצבא LRA התחרות יכול להיות מנוצל ככלי מיון (i) לקבוע את הפוטנציאל המעכב של חסימת תרכובות (פפטידים, נוגדנים, או mol הקטןמולקולות) וכדי (ii) לקבוע באתרי האינטראקציה הקריטיים באמצעות פפטידים חסימה שנועדו לחקות את הקולטן או ליגנד.
בקרות שליליות חיוניות פרשנות נכונה של המבחנים שהוצגו. במחקר הקרנה קודם 4, הרצף המקושקש של הפפטיד החסימה בשימוש לא הראה השפעות מנוגדות. עם זאת, פפטידים אחרים הראו יכולת חסימה גם לאחר הערבול, כנראה עקב אינטראקציות אלקטרוסטטיות נוקבות.
מגבלה היא כי פוטנציאל assay זה משקף מצב חוץ גופית. בפרט, קולטנים heterodimeric לעתים קרובות ליצור מבנה מורכב יותר. לא ניתן להבחין אם ליגנד רק נקשר לקולטן או אם ליגנד גם מפעיל את הקולטן על ידי מפעיל שינוי קונפורמציה או dimerization, אשר בתורו מוביל אות תאית. ב assay הציג, השתמשנו קולטן רקומביננטי, שהוא Immobilized לשלב מוצק. התקנה זו אינה פועלת על מנת לבחון את ההפעלה או כדי לחקור את האינטראקציה של קולטנים, אשר דורשים הסביבה הממברנה או כולסטרול קרום כגון קולטנים חלבון בשילוב G (GPCRs). גם השימוש של חלבון רקומביננטי מעלה אזהרות. לדוגמה, מבנה קיפול שלישוני של חלבון רקומביננטי עשוי להיות שונה לעומת המצב vivo. העקידה ליגנד רצפטור מתרחשת בדרך כלל ב RT, אולם בבני אדם הטמפרטורה האופטימלית תהיה 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, השימוש ליגנד מסחרי רקומביננטי הקולטן יכול להוכיח יקר. למרות מגבלות אלה, אלה שני פרוטוקולים ELISA להראות פוטנציאל לחקור את האינטראקציה ליגנד לרצפטור במהירות.
התוצאות המוצגות מראות כי IFNL1 יש זיקה גבוהה במקצת עבור IL28RA לעומת IFNL2, ואת הזיקה של IFNL3 היא פי שלוש נמוכים יותר IFNL2. זה ראוי לציון בהתחשב הדמיון בין IFNLs. DIF IFNL1 ו IFNL2fer ב -33 חומצות אמינו בזמן IFNL2 ו IFNL3 נבדלים זה מזה רק שבע חומצות אמינו 8. האינטראקציה בין IL28RA ו IFNLs כרוך Helix A ו- AB-לולאה של IFNL 9. המערך של רצפי IFNL מגלה ארבעה הבדלים משמעותיים Helix A ו- AB-לולאה בין IFNL1 ו IFNL3 (איור 5 א). אחת משפיע על מלח גשר Arg54-Glu119. שאריות חומצת אמינו בסעיף זה הם המנויים על פי UniProt ערכים Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) ו Q8IU57 (IL28RA), אשר כבר נמצא המבנה הגבישי של איור (מורכבים IFNL1-IL28R1 5B). יישור מבני מראה כי Arg57 ב IFNL1 מוחלף Lys57 ב INFL3, שהוא גם מסוגל ליצור גשר מלח עם Glu118 (איור 5 ג). בקנה אחד עם זיקת הירידה של IFNL3 ו IL28RA, חישובית 10,11 ו מוטציוני 12 מנתח מופע, כי ליס-Glu גשרי מלח הם בכלל פחות יציב מאשר Arg-Glu סאלגשרי t.
עם זאת, הבדלי Helix א לא באופן משביע רצון להסביר את הזיקה הנמוכה של IFNL3, מאז רצף החומצות האמיניות של Helix A הוא זהה עבור IFNL2 ו IFNL3. הוא חשב כי ההבדל העיקרי נובע מוטציות לולאת AB, שבו Arg74 ו His76 ב IFNL2 מוחלפים Lys70 ו Arg72 ב IFNL3 8.
יתר על כן, הבדלים ביציבות מסיסה בין IFNLs עשויים גם להשפיע על התוצאה של assay. מאז assay LRA הישיר משתמש ריכוזים מ ננומטר ל M ואת הריכוז הפיזיולוגי של ציטוקינים בסרום נמצא בטווח בערב עד ננומטר, הצבירה של IFNL לא ניתן לשלול. אנו יכולים להניח כי cooperativity החיובית נצפתה של IFN כריכה נגרמת על ידי עלייה מסוימת או שאינה ספציפית קולטן ליגנד המחייב, למשל, dimerization של הקולטן IL28RA רקומביננטי בתמיסה, או מחייב של שבר ליגנד או ליגנד שני עם זיקה חזקה יותר. הוwever, נדרשים מחקרים נוספים כדי לאמת את זה.
הפפטיד חסימת המשמשים מחקה LRA התחרות AB-לולאה של IFNL3 (איור 6). כפי שתואר לעיל, AB-הלולאה ממלאת תפקיד חיוני באינטראקציה בין IFNLs ו IL28RA 9, במיוחד IFNL2 ו IFNL3. דוגמנות הומולוגיה של IFNL3 עם המבנה הגבישי IL28RA / IFNL1 מראה כי האזור, אשר תואמת את הפפטיד חסימת טמונה הקרבה מרחבית קרוב ממשק אינטראקציה עם IL28RA (איור 6). אמור כי בלוקי פפטיד האינטראקציה של AB-הלולאה של IFNL ו IL28RA. התוצאות של תמיכה תחרות LRA זה: יש הפפטיד השפעה מעכבת על כריכת כל IFNLs, אולם הפפטיד הוא מעכב יעיל יותר של האינטראקציה בין IL28RA ואו IFNL3 או IFNL2 מאשר של האינטראקציה של IFNL1 ו IL28A. כצפוי, אבני פפטיד עקידת IFNL3 בצורה היעילה ביותר שכן הואתופס בדיוק את אותו בכיס מחייב כמו לולאת AB של IFNL3.
כפי שניתן לראות בטבלה 3, AB-הלולאות של IFNL1 ו IFNL2 מיושר הפפטיד החסימה שונה. עקבי עם שווי IC 50 התחתון של פפטיד עבור עיכוב של האינטראקציה IFNL1 / IL28RA, שתים עשרה חומצות אמינו שונות בין IFNL1 ואת פפטיד ואילו ורק שתי חומצות אמינו שונות בין IFNL2 ואת פפטיד. זה עולה כי ישנם מצבי מחייב שונים במקצת לאינטראקציה בין AB-הלולאות של IFNLs ו IL28RA והוא צופה כי פפטידים אשר לחקות IFNL1 יהיו יעילים יותר לחסום את האינטראקציה בין IFNl1 ו IL28RA מאשר האינטראקציה בין IFNL3 ו IL28RA.
יתר על כן, הפפטיד הכוללת מטען חשמלי חיובי (ארבעה ארגינין ושתי שאריות ליזין אבל רק שתי שאריות aspartate) וניתוח חישובית מראה כי הפפטיד אין מוטיבים משניים מוגדרים. בשל רח הגמישה המפותלת, שלהructure הפפטיד יכול גם להיקשר לאזורים אחרים של הקולטן. זו עלולה לחסום שאריות גלוטמט ו aspartate כגון D118, המהווה גשר מלח כדי לייצב את מורכבות קולטן ליגנד (איור 5 ב ו -5 ג).
איור 5. השוואה מבנית של IFNL1 (ירוק) IFNL3 (כחול). אטומי חמצן מוצגים באדום, אטומי חנקן מוצגים בכחול. (א) סופרפוזיציה של IFNL1 הנכנס IL28RA ו IFNL3 (לא IL28RA מוצג). השורש מתכוון סטייה מרובעת (RMSD) של כל האטומים המיושרים הוא 0.672 Å. שרשראות צד של IFNL3 השונים IFNL1 מודגשים-ורוד בהיר. (ב) גשר מלח בין Arg54 ו D118. (C) IFNL3 מיושר IFNL1 הנכנס IL28RA (IL28RA מוצג באפור). יישור עולה כי BRI מלח Arg-Gludge מוחלף ככל הנראה על ידי פחות יציבה ליס-Glu, א-גשר מלח בין Lys57 ו D118. PyMOL שימש להכנת דמויות עבור יישור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. יישור IFNL3 ואת IFNL1-IL28RA המורכב (IFNL1 לא מוצג). IFNL3 מוצג בכחול ואת IL28RA באפור. האזורים המתאימים הפפטיד החסימה מודגשים בסגול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 3:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
