Introduction
Een beter begrip van signaalwegen vereist gedetailleerde kennis over de ligand-receptor interactie. De meeste werkwijzen voor het beoordelen van de interactie van een bepaalde ligand met zijn specifiek receptor zijn duur, tijdrovend, arbeidsintensief en vereist speciale uitrusting en deskundigheid 1.
In dit artikel worden twee snelle en betrouwbare punt-punt protocollen bij de ligand-receptor interactie op basis van een enzym onderzoeken linked immunosorbent assay (ELISA): de directe ligand-receptor interactie assay (LRA) en de concurrentie LRA. ELISA is een zeer gevoelig, specifiek en gemakkelijk beschikbare techniek routinematig gebruikt in bijna elk laboratorium. ELISA kan worden uitgevoerd en aangepast in verschillende modes. De gepresenteerde protocollen zijn geoptimaliseerd voor het onderzoek naar de interactie tussen verschillende lambda interferonen (INFLs) en hun receptor.
De directe LRA zorgt voor een quantificatieen van ligand-receptor binding ten opzichte van ligand concentratie en derhalve een bindende curve oplevert. Gebruikmaking van een geschikt model voor de ligand-receptor interactie, kunnen de gegevens verder worden geanalyseerd om de dissociatieconstante (KD) te schatten.
In de gepresenteerde protocol, wordt de gebruikte Hill-vergelijking toegepast op de ligand-receptor binding te modelleren. Hoewel andere methoden zoals de oppervlakte plasmon resonantie technologie 2,3 maken de bepaling van bindingsaffiniteiten tussen twee eiwitten, deze technologie is vaak arbeidsintensief, duur, en vereist speciale laboratoriumapparatuur.
De competitie LRA maakt de screening van remmende peptiden: de ligand-receptor binding wordt gekwantificeerd ten opzichte peptideconcentratie. Dit levert een dosis-response curve beschrijft het remmende effect van het peptide. De gegevens kunnen verder worden geanalyseerd om de halve maximale remmende concentratie te schatten (IC 50
Beide ELISA-protocollen zijn gemakkelijk te gebruiken en kan worden aangepast aan een breed scala van onderzoek vragen. Recombinante eiwitten van elke soort kan worden gebruikt om snel en betrouwbaar bepalen van de interactie delen. Bovendien kan de concurrentie LRA worden gebruikt om kritische interactieplaatsen van liganden en receptoren bepalen via blokkerende peptiden, die zijn ontworpen om ofwel het ligand of de receptor nabootsen. Wanneer de blokkerende peptide toont efficiënte en specifieke remming, het peptide heeft een kritische interactieplaats van de ligand (indien het peptide bootst de receptor) of de ligand (indien het peptide bootst de ligand).
Het eerste protocol beschrijft de K-D-waarde bepalen van verschillende INFLs en de alfa-subunit van hun receptor, dat wil zeggen, de interleukine-28 receptor (IL28RA) met behulp van de directe LRA. Vervolgens wordt het tweede protocol laat zien hoe het vermogen van een 20 aminozuren lang peptide te bepalenremmen de INFL-IL28RA interacties. Het peptide is ontworpen om te concurreren met IFNLs hun receptorbindingsplaats en maakt daarmee een moleculair begrip van de interactie. Verder kan dit peptide worden gebruikt om IL28RA in vitro experimenten blokkeren de effecten op downstream signaaleffecten 4 bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagens Voorbereiding
- Om carbonaatcoatingbuffer buffer voor te bereiden, te ontbinden 0,36 g Na 2 CO 3 en 0,84 g NaHCO3 in 100 ml gedestilleerd water; steriele filter de buffer met behulp van een vacuüm gedreven 0,22 pm polyethersulfon (PES) membraan filter en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik.
- Bereid wasoplossing door toevoeging van 0,05% v / v Tween 20 in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Bereid een 5% runderserumalbumine (BSA) (blokkeeroplossing) in PBS-oplossing door het oplossen van 5 g BSA (≥98%) in 100 ml PBS en bewaar bij 4 ° C.
- Recombinante receptor, liganden en blokkeren Peptiden
- Reconstitutethe recombinant humaan interleukine-alfa-subeenheid (IL28RA) en recombinant aangemaakt liganden van humane IFN (IFNL1-3) volgens de instructies van de fabrikant en bewaar bij -80 ° C. Synthetiseren blokkerende peptiden en gebruikt zoals hiervoor beschreven 4. Met PBS verschillende concentraties ligand bereidens en peptiden voor gebruik in de testen.
- Aan het primaire antilichaam te bereiden, verdun 6x His muis monoklonaal antilichaam in PBS met 0,1% BSA in 1: 1000 verdunning. Om het tweede antilichaam te bereiden, verdunde mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd geit anti-muis IgG (H + L) in PBS met 0,1% BSA in 1: 10.000 verdunning.
- Bereid TMB oplossing door het mengen van reagentia A en B volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid stoppen door toevoeging van 5 N zwavelzuur (H 2 SO 4) in gedestilleerd water en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Enzym-gekoppelde immunosorbent assays (ELISA's)
OPMERKING: De directe ligand-receptor interactie ELISA (directe LRA figuur 1) kan worden gebruikt om de receptor-ligand dissociatieconstante (KD) te meten, als een maat voor de receptor ligand bindingsaffiniteit. De competitie ligand-receptor interactie ELISA (concurrentie LRA, figuur 2) Alleows screening van peptiden (en andere verbindingen te blokkeren), die werken om de interactie tussen ligand en receptor. Het basisprotocol dat eerder werd gepubliceerd 5 werd verder geoptimaliseerd.
Opmerking: in beide ELISA- methoden multichannel pipet voor het toevoegen van oplossingen aan de putjes van 96-putjes plaat bij elke stap. In oplossing decant of wasstappen, gooien de oplossingen direct in de gootsteen.
- Direct Ligand-receptor-interactie Assay (direct LRA)
OPMERKING: Voor een illustratie van de werkstroom (zie figuur 1).- Coating Plaat met recombinante receptor
- Verdun de recombinante receptor in carbonaatbuffer bij een eindconcentratie van 100 ng / ul. Coat putjes van 96-well microtiterplaat met vaste receptor concentratie (100 ng / ul) pipetteren 100 pi aan elk putje met een multichannel pipet. Uitsluiten buitenwanden van de plaat goed edge artefact te vermijden. Bedek de plaat met een deksel en incubeer deplaat bij 4 ° CO / N.
- Blokkering en toevoeging van liganden
- De volgende dag, verwijder de bekledingsoplossing door het kantelen van de plaat tegen de gootsteen en was de plaat 3 maal met wasoplossing (PBS + 0,05% v / v Tween 20).
- Blokkeert de vrije receptor bindingsplaatsen in de beklede plaat met behulp van 200 ui 5% BSA oplossing in elk putje met een multichannel pipet en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT.
- Gooi de blokkerende oplossing (zie stap 2.1.2.1.) En was de plaat 3 maal met wasoplossing.
- Bereid de recombinant-His gemerkte liganden in verschillende concentraties (bijvoorbeeld 8 ug / ml, 4 ug / ml, 2 ug / ml, 1 ug / ml, 0,5 ug / ml, 0,25 ug / ml, 0,125 pg / ml, 0,063 pg / ml, 0,031 pg / ml, 0,0 ug / ml) in PBS. Voeg alleen PBS in het lege putten.
- Voeg 100 ul van elk ligand concentratie aan de putjes in duplo en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT zodat receptor-ligandinteractie.
- Incubatie met Antilichamen
- Na incubatie met de liganden, was de plaat 3 maal met wasoplossing.
- Pipetteer 100 ul van primair anti-His monoklonaal antilichaam (1: 1000) aan elk putje.
- Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur; na incubatie, gooi het antilichaam-oplossing (zie stap 2.1.2.1.) en was de plaat 3 maal met wasoplossing.
- Voeg 100 gl HRP gekoppelde geit anti-muis IgG secundair antilichaam (1: 10.000) aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het antilichaam-oplossing (zie stap 2.1.2.1.) En was de plaat 3 maal met wasoplossing.
- Toevoeging van de ondergrond en Ontwikkeling
- Breng de TMB substraat oplossing tot KT en bereid TMB substraatoplossing A en B in 1: 1 verhouding. Voeg 100 ul vers bereide substraat aan elk putje en houdt de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15-30 min. Na voldoende col of de ontwikkeling voeg 50 ul stop oplossing.
- Het lezen van de plaat en Data-analyse
Opmerking: De beschreven protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemeten signaal stijgt van specifieke binding. Het kan nodig om de bijdrage van niet-specifieke binding aan de signaalschatting maar dit is buiten het bereik van dit protocol.- Lees de absorptie (optische dichtheid, OD) direct bij 450 nm.
- Trek het achtergrondsignaal van de gemeten OD-waarden en normaliseren hen. Transformatie waarden van de ligand concentratie logaritmische schaal (grondtal 10, log 10).
- Plot de genormaliseerde en achtergrond gecorrigeerde OD-waarden (y-as overeenkomt met de fractie van bezette receptorbindingsplaatsen) tegen de logaritme van de concentratie ligand (X-as, log 10 schaal).
- Om de K D-waarde te schatten, past de gegevens naar de volgende vorm van de Hill vergelijking:
tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg "/>
LET OP: Hier geeft Y de fractie van bezette receptor binding sites en Y max de maximale binding; [L] duidt de concentratie van vrije ligand en de Hill-coëfficiënt. Als er slechts één bindingsplaats voor het ligand, de Hill coëfficiënt n = 1. Voor systemen met meer dan één ligand bindingsplaats, de binding vertoont positieve coöperativiteit als n> 1, negatieve coöperatief als n <1 en als n geen coöperativiteit = 1. de microscopische dissociatieconstante wordt genoemd en komt overeen met de helft van de maximale effectieve concentratie 50 EC 6. De schijnbare dissociatieconstante is Kd = (KD) n. In het eenvoudigste geval waarin n = 1, de dissociatieconstante overeen met de ligand concentratie waarbij de helft van de receptor bindingsplaatsen bezet en Kd = KD. Dit model gaat uit van massa-actie bindend onder evenwicht omstandigheden, evenals dat slechts een klein deel van dehet toegevoegde ligand is gebonden aan de receptor, dat wil zeggen, [L] >> [RL].
- Coating Plaat met recombinante receptor
Figuur 1. Direct ligand-receptor-interactie assay (direct LRA). Stap-voor-stap protocol voor directe LRA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Concurrentie Ligand-receptor-interactie Assay (concurrentie LRA)
LET OP:. Voor een afbeelding van de workflow zie figuur 2 De wedstrijd LRA procedure volgt dezelfde stappen als de directe LRA (het bekleden van de plaat, antilichaam incubatie plaat ontwikkeling), behalve voor belangrijke veranderingen in het ligand en peptiden aanvulling stap. Juiste negatieve controles zijn essentieel voor deze test. In een eerdere screening <sup> 4, de gecodeerde blokkerende peptide niet antagonistische effecten laten zien.- Het blokkeren - Toevoeging van liganden en het blokkeren van Peptiden
- De volgende dag, verwijder de coating-oplossing en was de plaat (zie 2.1.2.1).
- Blokkeer de beklede plaat door toevoeging van 200 ui 5% BSA-oplossing aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT.
- Bereid de recombinant His gemerkte liganden (IFNL1-3) met een vaste concentratie (2x-20 ng / ml) in PBS.
- Bereid de blokkerende peptide (zie Tabel 3) met verschillende concentraties variërend van 10 nM tot 100 uM in PBS om een dosis-responscurve te garanderen.
LET OP: Dit maakt de daaropvolgende bepaling van de IC 50 waarde voor de blokkering peptide. In controleputjes, voeg concentratie alleen vaste ligand zonder peptide aan het maximum (100%) binding leiden. In de lege alleen PBS toevoegen zonder ligand of peptide. - Voeg 50 ul van de liganden (IFNL1-3) en 50 pi van elke peptide concentratie aan de putjes in duplo.
- Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij KT.
- Het lezen van de plaat en data-analyse
Opmerking: De beschreven protocol is gebaseerd op de veronderstelling dat het gemeten signaal stijgt van specifieke binding. Het kan nodig om de bijdrage van niet-specifieke binding aan de signaalschatting maar dit is buiten het bereik van dit protocol.- Lees de absorptie (optische dichtheid, OD) direct bij 450 nm.
- Trek het achtergrondsignaal van de gemeten OD-waarden en normaliseren hen. Transformatie waarden van de peptide concentratie logaritmische schaal (grondtal 10, log 10).
- Plot de genormaliseerde en achtergrond gecorrigeerde OD-waarden (y-as overeenkomt met de fractie van bezette receptorbindingsplaatsen) tegen de logaritme van de concentratie ligand (X-as, log 10 schaal).
- Om de IC50 waarde te schatten, past de gegevens aan de volgende vergelijking:
LET OP: Hier [P] is de peptide concentratie en de Hill helling. De helling wordt de steilheid van de dosis-responscurve. De IC 50 komt overeen met de inhibitor concentratie waarbij 50% remming van binding tussen ligand en receptor waargenomen.
- Het blokkeren - Toevoeging van liganden en het blokkeren van Peptiden
Figuur 2. Competition ligand-receptor-interactie assay (concurrentie LRA). Stap-voor-stap protocol voor de concurrentie LRA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De dissociatieconstanten tussen INFL1-3 en hun receptor alpha subunit IL28RA werden bepaald met behulp van de directe LRA. De resultaten worden getoond in Figuur 3: De fractie bezette bindingsplaatsen uitgezet tegen de logaritme van de respectievelijke IFN concentratie. De Scatchard plot van de gegevens wordt weergegeven in de rechter benedenhoek. De resultaten illustreren dat de directe LRA levert een binding curve, die verder kan worden geanalyseerd om de KD waarde schatten. De KD-waarde werd bepaald door het aanbrengen van de gegevens naar de Hill-vergelijking (Vergelijking 1).
IFNL1 heeft de hoogste bindingsaffiniteit, gevolgd door IFNL2 en IFNL3. De Hill-coëfficiënt n> 1 suggereert verhoogde affiniteit voor extra liganden na de eerste ligand-receptor interactie (zie Discussie). De geschatte dissociatieconstanten en Hill coëfficiënten worden samengevat in Tabel 1.
Concurrerende LRA werd gebruikt om het effect van een blokkerend peptide de interactie tussen IFNL1-3 en IL28RA (figuur 4) te kwantificeren. De fractie bezette bindingsplaatsen voor een ligand concentratie van 10 ng / ml uitgezet tegen de logaritme van de peptideconcentratie. De IC 50 te schatten, wordt de data voorzien van Vergelijking 2.
De blokkerende peptide remde de interactie tussen IFNL3 en IL28RA (IC50 = 0,26 uM) in de mate. De IC 50 is twee keer zo hoog voor de IFNL2-IL28RA interactie (IC50 = 0,50 uM) en een orde van grootte hoger voor de IFNL1-IL28RA interactie indicatieve het peptide was minder effectief bij het verstoren IFNL1-IL28RA interacties. De vastgestelde IC50 waarden en hellingen zijn samengevat in Tabel 2.
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Proper hierbij zijn essentieel voor het begrijpen van de ligand-receptor interactie De getoonde resultaten werden gegenereerd met een wetenschappelijke grafische software zoals GraphPad PRISM Voor de KD waardebepaling.. de gegevens werden gemonteerd op de 'One site - specific binding met Hill helling'. (. overeen met vergelijking 1 in het hoofdstuk 2.2.1) voor de IC 50 waardebepaling, de data wordt gemonteerd op log de functie '(remmer) versus . genormaliseerde reactietijd -. variable vlak '(. zie vergelijking 2 in hoofdstuk 2.2.2) echter, software voor niet-lineaire regressieanalyse kan worden gebruikt.
Figuur 3. De resultaten van de directe ligand-receptor assay (direct LRA). Bindende curves voor de binding van IFNL1 (groen), IFNL2 (rood) en IFNL3 (blauw) naar IL28RA. De respectievelijke Scatchard plot in de rechterbenedenhoekhoek suggereert positieve co-operationele maatregelen van de binding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. De resultaten van de competitieve ligand-receptor-assay (concurrerende LRA). Dosisresponscurves toont inhibitie van de binding van IFNL1 (10 ng / ml, groen), IFNL2 (10 ng / ml, rood) en IFNL3 (10 ng / ml, blauw) aan IL28RA door de 20 aa peptide. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Geschatte dissociatieconstanten (Kd) En Hill coëfficiënten van IFNL1-3 binding aan IL28RA. De standaardfout (SE) wordt gegeven voor een steekproef van vier herhalingen per data punt.
Tabel 2:. Geschatte half-maximale remmende concentratie (IC 50) van de blokkerende peptiden en de helling van de dosis-responscurve voor de binding van IFNL1-3 tot IL28RA De IFN concentratie 10 ng / ml. Het aantal herhalingen is drie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ELISA is een standaard en gevestigde methode voor vele laboratoria. We hebben verder gemodificeerd en verbeterd eerder gepubliceerde werkwijze 5,7. De aangetoonde stap-voor-stap protocol duidelijk dat het kan worden gebruikt op een eenvoudige manier de KD-waarden van ligand-receptor-interacties te bepalen. Bovendien kan de IC50 van een blokkerend peptide dat interfereert met de ligand-receptor interactie te bepalen.
Belangrijke voordelen zijn de snelle installatie, eenvoudige bereiding van de reagentia en vertrouwd hanteren, zoals de meeste onderzoekers een ELISA-protocol eerder hebt gebruikt. De directe LRA protocol is zeer flexibel en kan worden aangepast aan vele eiwit-eiwit interacties te meten. Recombinante eiwitten met His6- of alternatieve tag te gebruiken als de bindingspartner een geïmmobiliseerde partner. De concurrentie LRA kan worden benut als screeningsmethode om (i) te bepalen de remmende werking van blokkerende verbindingen (peptiden, antilichamen of kleine molecules) en (ii) bepaal de kritische interactie-sites met blokkerende peptiden ontworpen om de receptor of het ligand nabootsen.
Negatieve controles zijn essentieel voor een juiste interpretatie van de gepresenteerde analyses. In een eerdere screening studie 4, heeft de gecodeerde sequentie van de gebruikte blokkerende peptide niet antagonistische effecten laten zien. Echter, andere peptiden toonde blokkeringsmacht ook na scrambling, waarschijnlijk te wijten aan onspecifieke elektrostatische interacties.
Een mogelijke beperking is dat deze test geeft een in vitro situatie. Vooral heterodimere receptoren vormen vaak een complexe structuur. Het is niet mogelijk om te onderscheiden of het ligand alleen bindt aan de receptor of het ligand of de receptor activeert door een conformationele verandering triggering of dimerisatie, wat leidt tot een intracellulair signaal. In de gepresenteerde assay, gebruikten we een recombinante receptor, die Immobilized aan een vaste fase. Deze opstelling werkt niet om de activering te testen of de interactie van receptoren, waarvan het membraan milieu of membraan cholesterol vereisen, zoals G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) onderzocht. Ook het gebruik van recombinant eiwit verhoogt restricties. Bijvoorbeeld kan het vouwen en tertiaire structuur van een recombinant eiwit anders dan een in vivo situatie. De binding van ligand en receptor gebeurt meestal bij kamertemperatuur, maar bij de mens de optimale temperatuur zou 37 ° C. Tenslotte kan het gebruik van commerciële recombinante ligand en receptor dure oplossingen. Ondanks deze beperkingen beide ELISA protocollen tonen potentieel om de ligand-receptor interactie snel verkennen.
De gepresenteerde resultaten tonen aan dat IFNL1 een iets hogere affiniteit voor IL28RA opzichte IFNL2 en de affiniteit van IFNL3 drie maal lager dan IFNL2. Dit is opmerkelijk gezien de gelijkenis tussen IFNLs. IFNL1 en IFNL2 differ in 33 aminozuren, terwijl IFNL2 en IFNL3 verschillen alleen in zeven aminozuren 8. De interactie tussen IL28RA en IFNLs impliceert Helix A en de AB-lus van IFNL 9. Uitlijning van IFNL sequenties onthult vier significante verschillen in Helix A en de AB-loop tussen IFNL1 en IFNL3 (Figuur 5A). Eén van invloed op de zoutbrug Arg54-Glu119. De aminozuurresten in dit gedeelte worden opgesomd volgens de UniProt entries Q8IU54 (IFNL1), Q8IZI9 (IFNL3), Q8IZJ0 (IFNL2) en Q8IU57 (IL28RA), die is gevonden in de kristalstructuur van de IFNL1-IL28R1 complex (fig 5B). Structurele aanpassing blijkt dat Arg57 in IFNL1 vervangen door Lys57 in INFL3, die ook in staat om een zoutbrug met Glu118 (figuur 5C) vormen. In overeenstemming met de verminderde affiniteit van IFNL3 en IL28RA, computational 10,11 en mutatie-12 analyses tonen aan, dat Lys-Glu zout bruggen zijn over het algemeen minder stabiel dan Arg-Glu salt bruggen.
De verschillen in Helix A geen bevredigende verklaring voor de lage affiniteit van IFNL3, aangezien de aminozuursequentie van Helix A is identiek voor IFNL2 en IFNL3. Men denkt dat het belangrijkste verschil ontstaat omdat de mutaties in de AB-lus, waarbij Arg74 en His76 in IFNL2 vervangen door Lys70 en Arg72 in IFNL3 8.
Bovendien kunnen verschillen in stabiliteit en oplosbaarheid tussen IFNLs ook invloed op de uitkomst van de test. Aangezien de directe LRA assay gebruikt nM concentraties aan M en de fysiologische concentratie van cytokinen in serum ligt in het pM tot nM, kan aggregatie van IFNL niet uitgesloten. We kunnen aannemen dat de waargenomen positieve coöperativiteit van de IFN binding wordt veroorzaakt door een specifieke of niet-specifieke verhoging van ligand-receptor binding, bijvoorbeeld een dimerisatie van de recombinante IL28RA receptor in oplossing, of binding van een tweede ligand of ligand fragment met hogere affiniteit. However, zijn verdere studies nodig om dit te verifiëren.
De blokkerende peptide gebruikt in de competitie LRA bootst de AB-lus van IFNL3 (figuur 6). Zoals eerder beschreven, de AB-lus speelt een essentiële rol in de interactie tussen IFNLs IL28RA en 9, en met name IFNL2 IFNL3. Homologie modellering van IFNL3 de IL28RA / IFNL1 kristalstructuur laat zien dat het gebied, dat overeenkomt met de blokkerende peptide ligt in dichte ruimtelijke nabijheid van de interactie interface IL28RA (figuur 6). Verondersteld dat het peptide de interactie blokkeert van de AB-lus van IFNL en IL28RA. De resultaten van het vergelijkend onderzoek ondersteunen deze LRA: Het peptide heeft een remmend effect op de binding van alle IFNLs, maar het peptide een effectievere remmer van de interactie tussen IL28RA en ofwel IFNL3 of IFNL2 dan van de interactie van IFNL1 en IL28A. Zoals verwacht, het peptide de binding van IFNL3 meest effectief aangezienbeslaat precies dezelfde bindende pocket als de AB-lus van IFNL3.
Zoals getoond in Tabel 3, de AB-lussen van IFNL1 en IFNL2 afgestemd op de blokkerende peptide verschillen. Consistent met de lagere IC50 waarde van het peptide voor het remmen van de IFNL1 / IL28RA interactie, twaalf aminozuren verschillen IFNL1 en het peptide dat slechts twee aminozuren verschillen IFNL2 en het peptide. Dit geeft aan dat er iets anders inbindmethodes interactie tussen de AB-lussen van de IFNLs en IL28RA en voorspelt dat peptiden die IFNL1 nabootsen effectiever bij het blokkeren van de interactie tussen IFNl1 en IL28RA dan de interactie tussen IFNL3 en IL28RA zou zijn.
Verder wordt de algemene peptide positief geladen (vier arginine en twee lysineresiduen maar slechts twee asparaginezuurresidu) en geautomatiseerde analyse toont aan dat het peptide geen gedefinieerde secundaire motieven. Vanwege de gewikkelde flexibele structure het peptide kan ook binden aan andere gebieden van de receptor. Dit zou kunnen blokkeren glutamaat en aspartaat resten zoals D118, die een zoutbrug met het ligand-receptorcomplex (Figuur 5B en 5C) stabiliseren vormt.
Figuur 5. Structurele vergelijking van IFNL1 (groen) en IFNL3 (blauw). Zuurstofatomen worden weergegeven in het rood, zijn stikstofatomen verschijnen in blauw. (A) Superpositie van de IL28RA gebonden IFNL1 en IFNL3 (IL28RA niet getoond). De kwadratisch gemiddelde afwijking (RMSD) van alle uitgelijnd atomen is 0,672 Å. Zijketens van IFNL3 die verschillen van IFNL1 zijn gemarkeerd in lichtroze. (B) Salt brug tussen Arg54 en D118. (C) IFNL3 uitgelijnd aan IL28RA-gebonden IFNL1 (IL28RA wordt grijs weergegeven). De uitlijning toont aan dat de Arg-Glu zout bridge wordt waarschijnlijk vervangen door een minder stabiele Lys-Glu, een zout-brug tussen Lys57 en D118. PyMol werd gebruikt voor de voorbereiding van de figuren en de uitlijning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Afstemming van IFNL3 en de IFNL1-IL28RA complex (IFNL1 niet getoond). IFNL3 wordt weergegeven in het blauw en de IL28RA in het grijs. De gebieden die overeenkomen met de blokkerende peptide worden paars gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 3:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA plate |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | For ELISA plate coating buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS for Blocking |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Primary antiboy to capture His tagged Ligands |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB substrate solution |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | ELISA plate reader |
References
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
- van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
- Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
- Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
- Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
- Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
- Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
- Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
- Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
- Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
- Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).
