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Chemistry

Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

Published: March 14, 2016 doi: 10.3791/53575

Introduction

Ein umfassendes Verständnis der Signalwege erfordert detailliertes Wissen über die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung. Die meisten Methoden zur Beurteilung der Wechselwirkung eines bestimmten Liganden mit seinem spezifischen Rezeptor sind teuer, zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordern eine spezielle Ausrüstung und Know - how 1.

Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und zuverlässige Punkt-für-Punkt-Protokolle den Liganden-Rezeptor-Interaktion an ein Enzym linked immunosorbent assay (ELISA) basieren, zu untersuchen: den direkten Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung-Assay (LRA) und den Wettbewerb LRA. ELISA ist ein sehr empfindlich, spezifisch und leicht verfügbare Technik routinemäßig in fast jedem Labor eingesetzt. ELISA kann in verschiedener Weise durchgeführt und angepasst werden. Die vorgestellten Protokolle werden für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen verschiedenen lambda Interferone (INFLs) und deren Rezeptor optimiert.

Die direkte LRA ermöglicht eine quantificatiauf der Ligand-Rezeptor in Bezug auf Ligandenkonzentration Bindung und somit eine Bindungskurve ergibt. Verwendung eines geeigneten Modells für den Liganden-Rezeptor - Interaktion können die Daten analysiert werden , weiter die Dissoziationskonstante (K D) zu schätzen.

In dem vorgestellten Protokoll wird die allgemein verwendete Hill-Gleichung, die Ligand-Rezeptor-Bindung an Modell angewendet. Obwohl andere Verfahren wie beispielsweise die Oberflächenplasmonresonanz - Technologie 2,3 die Bestimmung der Bindungsaffinitäten zwischen zwei Proteinen zu ermöglichen, ist diese Technik oft arbeitsintensiv, teuer und erfordert eine spezielle Laborausrüstung.

Der Wettbewerb LRA ermöglicht das Screening von inhibitorischen Peptide: Die Ligand-Rezeptor-Bindung wird in Bezug auf Peptidkonzentration quantifiziert. Dies ergibt eine Dosis-Wirkungs-Kurve, die die hemmende Wirkung des Peptids beschreibt. Die Daten können weitere 50 die Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC abzuschätzen analysiert werden

Beide ELISA-Protokolle sind einfach zu bedienen und kann auf ein breites Spektrum an Forschungsfragen angepasst werden. Rekombinante Proteine ​​jeglicher Art verwendet werden, um zuverlässig und schnell die Wechselwirkungsteile bestimmen. Darüber hinaus kann der Wettbewerb LRA verwendet werden, um kritische Interaktionsstellen von Liganden und Rezeptoren zu bestimmen durch Verwendung von blockierenden Peptiden, die ausgelegt sind, entweder den Liganden oder den Rezeptor zu imitieren. Wenn das Blockierungspeptid effiziente und spezifische Hemmung zeigt, nimmt das Peptid eine kritische Interaktionsstelle des Liganden (wenn das Peptid-Mimetika der Rezeptor) oder des Liganden (wenn das Peptid-Mimetika der Ligand).

Das erste Protokoll der K D -Wert Bestimmung verschiedener INFLs beschreibt und die alpha - Untereinheit von ihrer Rezeptor, dh der Interleukin-28 - Rezeptor (IL28RA) die direkte LRA verwenden. Als nächstes zeigt das zweite Protokoll, wie die Fähigkeit eines langen Peptid 20 Aminosäuren zu bestimmen,die INFL-IL28RA Wechselwirkungen hemmen. Das Peptid wurde entwickelt mit IFNLs an ihren Rezeptor-Bindungsstelle konkurrieren, und ermöglicht somit ein Molekular Verständnis der Wechselwirkung. Darüber hinaus kann dieses Peptid verwendet werden IL28RA in in vitro - Experimenten zu blockieren , die Auswirkungen auf nachgeschalteten Signaleffekte 4 zu bestimmen.

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Protocol

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Zur Herstellung von Karbonat Beschichtungspuffer, lösen sich 0,36 g Na 2 CO 3 und 0,84 g NaHCO 3 in 100 ml destilliertem Wasser; Sterilfilter der Puffer durch ein Vakuum von 0,22 um Polyethersulfon (PES) Membranfilter und lagern bei RT bis zur Verwendung angetrieben werden.
  2. Bereiten Waschlösung durch Zugabe von 0,05% v / v Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  3. Bereiten Sie eine 5% Rinderserumalbumin (BSA) (Blocking-Lösung) in PBS-Lösung durch Auflösen von 5 g BSA (≥98%) in 100 ml PBS und lagern bei 4 ° C.
  4. Rekombinante Rezeptor, Liganden und Blocking Peptide
    1. Reconstitutethe rekombinanten humanen Interleukin-Rezeptor-alpha-Untereinheit (IL28RA) und rekombinante His-markierten Liganden des menschlichen IFN (IFNL1-3) gemäß den Anweisungen des Herstellers und bei -80 ° C. Blockierende Peptide synthetisieren und verwendet wie zuvor 4 beschrieben. Verwenden PBS auf verschiedene Konzentrationen von Ligand vorbereitens und Peptide zur Verwendung in den Assays.
  5. An den primären Antikörper herzustellen, verdünnte 6x His monoklonalen Maus-Antikörper in PBS mit 0,1% BSA auf 1: 1.000-Verdünnung. Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG (H + L) in PBS mit 0,1% BSA in 1 an den sekundären Antikörper herzustellen, verdünnter: 10.000-Verdünnung.
  6. Bereiten Sie TMB-Lösung durch die Reagenzien A und B Mischen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  7. Bereiten Sie Stop - Lösung durch Zugabe von 5 N Schwefelsäure (H 2 SO 4) in destilliertem Wasser und lagern bei RT.

2. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs)

HINWEIS: Die direkte Ligand-Rezeptor - Wechselwirkung ELISA (direct LRA, 1) können die Rezeptor-Ligand - Dissoziationskonstante (K D), als Maß für die Rezeptor-Liganden - Bindungsaffinität zu messen , verwendet werden. Der Wettbewerb Ligand-Rezeptor - Wechselwirkung ELISA (Wettbewerb LRA, Abbildung 2) alleOWS Screening von Peptiden (und andere blockierende Verbindungen), die mit der Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor zu interferieren handeln. Das Basisprotokoll , die zuvor 5 veröffentlicht wurde , wurde weiter optimiert.
Hinweis: In beiden ELISA Methoden Mehrkanalpipette nach Lösungen zu den Vertiefungen von 96-Well-Platte in jedem Schritt hinzugefügt wird. In Lösung dekantieren oder Waschschritte, werfen die Lösungen direkt in die Spüle.

  1. Direkter Ligand-Rezeptor-Interaktion Assay (direkte LRA)
    HINWEIS: Eine Abbildung des Workflows (siehe Abbildung 1).
    1. Lackplatte mit rekombinanten Rezeptor
      1. Verdünne den rekombinanten Rezeptor in Carbonat-Puffer auf eine Endkonzentration von 100 ng / & mgr; l. Coat Wells von 96-Well-Mikrotiterplatte mit festen Rezeptor-Konzentration (100 ng / ul) durch Pipettieren von 100 ul in jede Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit. Ausschließen Außenwände der Platte gut Kante Artefakt zu vermeiden. Decken Sie die Platte mit einem Deckel und brüten diebei 4 ° CO / N Platte.
    2. Sperren und Zusatz von Liganden
      1. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Beschichtungslösung durch die Platte gegen das Waschbecken kippen und die Platte 3-mal mit Waschlösung (PBS + 0,05% v / v Tween 20) waschen.
      2. Blockieren Sie die freien Rezeptor-Bindungsstellen in der beschichteten Platte unter Verwendung von 200 ul 5% BSA-Lösung in jede Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei RT.
      3. Entsorgen Sie die Blockierungslösung (siehe Schritt 2.1.2.1.) Und waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung.
      4. Bereiten Sie die rekombinante His-markierte Liganden bei verschiedenen Konzentrationen (beispielsweise 8 & mgr; g / ml, 4 ug / ml, 2 ug / ml, 1 & mgr; g / ml, 0,5 ug / ml, 0,25 & mgr; g / ml, 0,125 & mgr; g / ml, 0,063 & mgr; g / ml, 0,031 & mgr; g / ml, 0,0 ug / ml) in PBS. In nur PBS in den leeren Brunnen.
      5. Füge 100 ul jeder Ligandenkonzentration in die Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung und inkubiere die Platte für 2 h bei RT ermöglicht Rezeptor-LigandenInteraktion.
    3. Inkubation mit Antikörper
      1. Nach der Inkubation mit den Liganden, waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung.
      2. Je 100 & mgr; l der primären anti-His monoklonalen Maus-Antikörperlösung (1: 1000) in jede Vertiefung.
      3. Die Platte bei RT für 2 h; nach der Inkubation, entsorgen Sie die Antikörperlösung (siehe Schritt 2.1.2.1.) und waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung.
      4. Füge 100 & mgr; l HRP gekoppelten Ziege-anti-Maus-IgG-sekundärem Antikörper-Lösung (1: 10.000) in jede Vertiefung. Die Platte 45 min bei RT.
      5. Entsorgen Sie die Antikörperlösung (siehe Schritt 2.1.2.1.) Und waschen Sie die Platte 3-mal mit Waschlösung.
    4. Zugabe von Substrat und Entwicklung
      1. Bringen Sie die TMB Substratlösungen auf RT und bereiten TMB Substratlösung A und B in 1: 1-Verhältnis. 100 l frisch hergestellte Substrat in jede Vertiefung und halten die Platte bei RT für 15-30 min. Nach ausreichender col oder Entwicklung werden 50 & mgr; l Stopplösung.
    5. Das Lesen der Platte und Datenanalyse
      HINWEIS: Die beschriebene Protokoll wird auf der Annahme basiert, dass das gemessene Signal von spezifischen Bindungs ​​ansteigt. Es könnte erforderlich sein, den Beitrag der unspezifischen Bindung an das Signal zu schätzen, aber dies ist aus dem Geltungsbereich dieses Protokolls.
      1. Die Absorption (optische Dichte, OD) direkt bei 450 nm.
      2. Ziehen Sie das Hintergrundsignal aus den gemessenen OD-Werte und normalisieren. Wandeln Sie alle Werte der Ligandenkonzentration auf logarithmische Skala (Basis 10, log 10).
      3. Plot der normierten und Hintergrund korrigierten OD - Werte (Y-Achse entspricht dem Anteil der besetzten Rezeptor - Bindungsstellen) gegen den Logarithmus der Ligandenkonzentration (X-Achse, 10 Skala log).
      4. Um den K D - Wert zu schätzen, passen die Daten an die folgende Form der Hill - Gleichung:
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        HINWEIS: Hier Y bezeichnet den Anteil der besetzten Rezeptor - Bindungsstellen und Y max die maximale Bindung; [L] die Konzentration an freiem Liganden und der Hill-Koeffizient. Wenn es nur eine Bindungsstelle für den Liganden ist, ist der Hill-Koeffizient n = 1. Bei Systemen mit mehr als einem Ligandenbindungsstelle, die Bindungs ​​weist positive Kooperativität, wenn n> 1 ist, negativen Kooperativität wenn n <1 und keine Kooperativität wenn n = 1. die mikroskopische Dissoziationskonstante wird bezeichnet und entspricht der Hälfte der maximalen wirksamen Konzentration EC 50 6. Die scheinbare Dissoziationskonstante K d = (K D) n. Im einfachsten Fall , in dem n = 1, die Dissoziationskonstante entspricht dem Ligandenkonzentration , bei der die Hälfte der Rezeptorbindungsstellen besetzt sind , und K d = K D. Dieses Modell geht davon aus Massenaktion unter Gleichgewichtsbedingungen verbindlich, sowie, dass nur ein kleiner Bruchteildie zugegebene Liganden an den Rezeptor gebunden, das heißt, [L] >> [RL].

Abbildung 1
Abbildung 1. Direkte Ligand-Rezeptor-Interaktion Assay (direkte LRA). Schritt- für -Schritt - Protokoll für die direkte LRA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Wettbewerb Ligand-Rezeptor-Interaktion Assay (Wettbewerbs LRA)
    HINWEIS:. Für eine Darstellung des Workflows siehe Abbildung 2 Der Wettbewerb LRA Verfahren folgt die gleichen Schritte wie die direkte LRA (Beschichtung der Platte, Antikörperinkubation, Entwicklung Platte) , mit Ausnahme wichtige Veränderungen in den Liganden und Peptiden Additionsschritt. Die richtige Negativkontrollen sind für diesen Test von wesentlicher Bedeutung. In einer früheren Screening-Studie <sup> 4, das verschlüsselte Blockierung Peptid zeigte keine antagonistische Wirkungen.
    1. Blocking - Zusatz von Liganden und Blocking Peptide
      1. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Beschichtungslösung und waschen Sie die Platte (siehe 2.1.2.1).
      2. Blockieren Sie die beschichtete Platte durch Zugabe von 200 ul 5% BSA-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei RT.
      3. Bereiten Sie die rekombinante His-markierte Liganden (IFNL1-3) bei einer festen Konzentration (2x-20 ng / ml) in PBS.
      4. Bereiten Sie die blockierende Peptid (siehe Tabelle 3) mit unterschiedlichen Konzentrationen von 10 nM bis 100 uM in PBS Bereich eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu gewährleisten.
        ANMERKUNG: Dies ermöglicht die anschließende Bestimmung des IC 50 -Wertes für das Blockierungspeptid. In Kontrollvertiefungen, fügen Sie nur feste Ligand-Konzentration ohne Peptid das Maximum (100%) Bindung abzuleiten. In dem leeren, fügen Sie nur PBS ohne Ligand oder Peptid.
      5. Je 50 ul der Liganden (IFNL1-3) und 50 ul jeder peptide Konzentration auf die Vertiefungen in Duplikaten.
      6. Inkubieren der Platte für 2 h bei RT.
    2. Das Lesen der Platte und Datenanalyse
      HINWEIS: Die beschriebene Protokoll wird auf der Annahme basiert, dass das gemessene Signal von spezifischen Bindungs ​​ansteigt. Es könnte erforderlich sein, den Beitrag der unspezifischen Bindung an das Signal zu schätzen, aber dies ist aus dem Geltungsbereich dieses Protokolls.
      1. Die Absorption (optische Dichte, OD) direkt bei 450 nm.
      2. Ziehen Sie das Hintergrundsignal aus den gemessenen OD-Werte und normalisieren. Wandeln Sie alle Werte der Peptidkonzentration auf logarithmische Skala (Basis 10, log 10).
      3. Plot der normierten und Hintergrund korrigierten OD - Werte (Y-Achse entspricht dem Anteil der besetzten Rezeptor - Bindungsstellen) gegen den Logarithmus der Ligandenkonzentration (X-Achse, 10 Skala log).
      4. Um die IC - 50 - Wert zu schätzen, passen die Daten an die folgende Gleichung:
        Gleichung 2
        HINWEIS: Hier [P] ist die Peptidkonzentration und der Hill-Anstieg. Der Hügel Steigung beschreibt die Steilheit der Dosis-Wirkungs-Kurve. Der IC 50 entspricht der Inhibitorkonzentration , bei der 50% Inhibierung der Bindung zwischen Ligand und Rezeptor beobachtet wird.

Figur 2
Abbildung 2. Wettbewerb Ligand-Rezeptor-Interaktion Test (Wettbewerb LRA). Schritt- für -Schritt - Protokoll für den Wettbewerb LRA. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Representative Results

Die Dissoziationskonstanten zwischen INFL1-3 und deren Rezeptor alpha-Untereinheit IL28RA wurden unter Verwendung des direkten LRA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3: Der Anteil an besetzten Bindungsstellen aufgetragen gegen den Logarithmus der jeweiligen IFN - Konzentration. Die Scatchard-Plot der Daten wird in der rechten unteren Ecke des Bildschirms angezeigt. Die Ergebnisse zeigen , dass die direkte LRA eine Bindungskurve ergibt, was die K D -Wert analysiert werden kann abzuschätzen. Der Wert K D wurde durch Anpassen der Daten an die Hill - Gleichung (Gleichung 1) bestimmt.

IFNL1 hat die höchste Bindungsaffinität, gefolgt von IFNL2 und IFNL3. Der Hill-Koeffizient n> 1 schlägt Affinität erhöht für zusätzlichen Liganden nach dem ersten Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung (siehe Diskussion). Die geschätzten Dissoziationskonstanten und Hill - Koeffizienten sind in der Tabelle zusammengefasst 1.

Competitive LRA wurde verwendet , um die Auswirkungen eines Blockierungspeptid auf der Wechselwirkung zwischen IFNL1-3 und dem IL28RA (Figur 4) zu quantifizieren. Die Fraktion von besetzten Bindungsstellen für Liganden-Konzentration von 10 ng / ml wird gegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. Um die IC 50 -Werte abzuschätzen, werden die Daten an die Gleichung 2 ausgestattet.

Das Blockierungs Peptid inhibierte die Interaktion zwischen IFNL3 und IL28RA (IC 50 = 0,26 & mgr; M) zu den größten Umfang. Der IC 50 ist doppelt so hoch für die IFNL2-IL28RA Wechselwirkung (IC 50 = 0,50 & mgr; M) und eine Größenordnung höher für die IFNL1-IL28RA Interaktion anzeigend das Peptid war weniger wirksam bei IFNL1-IL28RA Wechselwirkungen stören. Die ermittelten IC 50 -Werte und Hill Pisten sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Die richtige Datenanalyse ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis der Ligand-Rezeptor - Wechselwirkung Die gezeigten Ergebnisse wurden eine wissenschaftliche Grafik - Software wie GraphPad PRISM erzeugt unter Verwendung Für die K D - Wert - Bestimmung.. wurden die Daten an die Einbau 'Ein Standort - spezifische mit Hill - Anstieg Bindung ". (. 1 entspricht , in Sec auf Gleichung 2.2.1) Für den IC 50 - Wert - Bestimmung werden die Daten an die Funktion' log (Inhibitor) ausgestattet vs . normiert Antwort -. variable Steigung '(s. Gleichung 2 in Abschnitt 2.2.2) kann jedoch jede Software für nicht-lineare Regressionsanalyse verwendet werden.

Figur 3
Abbildung 3. Ergebnisse der direkten Ligand-Rezeptor - Assay (direkte LRA). Bindungskurven für die Bindung von IFNL1 (grün), IFNL2 (rot) und IFNL3 (blau) auf IL28RA. Die jeweilige Scatchard-Plot in der rechten unteren EckeEcke schlägt positive Kooperativität der Bindung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Ergebnisse des kompetitiven Ligand-Rezeptor - Assay (kompetitive LRA). Dosis-Wirkungs-Kurven zeigen die Hemmung der Bindung von IFNL1 (10 ng / ml, grün), IFNL2 (10 ng / ml, rot) und IFNL3 (10 ng / ml, blau) zu IL28RA durch die 20 - AS - Peptid. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: Geschätzte Dissoziationskonstanten (K D) Und Hill - Koeffizienten von IFNL1-3 zu IL28RA Bindung. Der Standardfehler (SE) für eine Stichprobengröße von vier Wiederholungen pro Datenpunkt gegeben.

Tabelle 2
Tabelle 2:. Geschätzte halbmaximale Hemmkonzentration (IC 50) der blockierenden Peptide und der Hill Steigung der Dosis-Wirkungskurve für die Bindung von IFNL1-3 zu IL28RA Die IFN - Konzentration beträgt 10 ng / ml. Die Anzahl der Wiederholungen ist drei.

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Discussion

ELISA ist ein Standard und gut etablierte Methode für viele Laboratorien. Wir haben weiter modifiziert und verbessert eine zuvor Methode 5,7 veröffentlicht. Die aufgezeigte Schritt- für -Schritt - Protokoll zeigt , wie es in einfacher Weise verwendet werden können , um die K d -Werte von Ligand-Rezeptor - Wechselwirkungen zu bestimmen. Darüber hinaus ist die IC50 eines Blockierungspeptid, das bestimmt werden kann, mit dem Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung stört.

Wesentliche Vorteile sind die schnelle Einrichtung, einfache Zubereitung von Reagenzien und vertraute Handhabung, da die meisten Forscher vor einem ELISA-Protokoll verwendet haben. Die direkte LRA-Protokoll ist sehr flexibel und kann angepasst werden, um viele Protein-Protein-Wechselwirkungen zu messen. Rekombinante Proteine ​​mit His6- oder alternative Tag sollte als Bindungspartner an einen immobilisierten Partner verwendet werden. Der Wettbewerb LRA kann (i) als ein Screening-Werkzeug genutzt werden, bestimmen die inhibitorische Potential Verbindungen der Blockierung (Peptide, Antikörper oder kleine molküle) und (ii) Bestimmung der kritischen Wechselwirkungsstellen durch Blockieren Peptiden entwickelt, die den Rezeptor oder den Liganden nachzuahmen.

Negative Kontrollen sind unerlässlich für eine korrekte Interpretation der dargestellten Assays. In einer früheren Screening - Studie 4, das verschlüsselte Sequenz des verwendeten blockierenden Peptid zeigten keine antagonistische Wirkungen. Jedoch können auch andere Peptide zeigten auch eine Sperrfähigkeit nach der Verwürfelung, wahrscheinlich durch unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen.

Eine potenzielle Einschränkung ist , dass dieser Assay eine in vitro Situation widerspiegelt. Insbesondere bilden heterodimere Rezeptoren oft eine komplexere Struktur. Es ist nicht möglich zu unterscheiden, ob der Ligand bindet nur an den Rezeptor oder ob der Ligand aktiviert auch den Rezeptor durch eine Konformationsänderung oder eine Dimerisierung Triggerung, was wiederum zu einem intrazellulären Signal führt. Im dargestellten Test verwendeten wir einen rekombinanten Rezeptor, der immobili istzed an eine feste Phase. Diese Einrichtung funktioniert nicht die Aktivierung zu testen oder die Wechselwirkung von Rezeptoren zu untersuchen, die die Membranumgebung oder Membrancholesterin wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) erfordern. Auch die Verwendung von rekombinantem Protein erhöht Vorbehalte. Zum Beispiel kann das Falten und Tertiärstruktur eines rekombinanten Proteins unterschiedlich sein im Vergleich zu einer in vivo - Situation. Die Bindung von Ligand und Rezeptor erfolgt in der Regel bei RT jedoch beim Menschen die optimale Temperatur 37 ° C sein würde. Schließlich kann die Verwendung von handelsüblichen rekombinanten Ligand und Rezeptor teuer erweisen. Trotz dieser Einschränkungen ist, zeigen diese beiden ELISA Protokollen Potential, um schnell die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung zu erkunden.

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass IFNL1 eine etwas höhere Affinität für IL28RA Vergleich zu IFNL2 aufweist und die Affinität von IFNL3 ist dreifach niedriger als IFNL2. Dies ist bemerkenswert, die Ähnlichkeit zwischen IFNLs Berücksichtigung. IFNL1 und IFNL2 differ in 33 Aminosäuren während IFNL2 und IFNL3 unterscheiden sich nur in sieben Aminosäuren 8. Die Interaktion zwischen IL28RA und IFNLs beinhaltet Helix A und der AB-Schleife von IFNL 9. Die Angleichung der IFNL Sequenzen zeigt vier signifikante Unterschiede in Helix A und der AB-Schleife zwischen IFNL1 und IFNL3 (5A). Man wirkt sich auf die Salzbrücke Arg54-Glu119. Die Aminosäurereste in diesem Abschnitt aufgezählt nach dem UniProt Einträge Q8IU54 (IFNL1) Q8IZI9 (IFNL3) Q8IZJ0 (IFNL2) und Q8IU57 (IL28RA), die in der Kristallstruktur des IFNL1-IL28R1 Komplex (Abbildung gefunden wurde 5B). Strukturausrichtung zeigt , dass Arg57 in IFNL1 von Lys57 in INFL3 ersetzt wird, die auch in der Lage ist , eine Salzbrücke mit Glu118 (5C) zu bilden. In Übereinstimmung mit der verringerten Affinität von IFNL3 und IL28RA, Computational 10,11 und Mutations - 12 - Analysen zeigen, dass Lys-Glu Salzbrücken im Allgemeinen weniger stabil sind als Arg-Glu salt Brücken.

Allerdings sind die Unterschiede in Helix A nicht zufriedenstellend, die eine geringere Affinität von IFNL3 erklären, da die Aminosäuresequenz von Helix A identisch für IFNL2 und IFNL3 ist. Es wird angenommen , dass der Hauptunterschied ergibt sich aus den Mutationen in der AB-Schleife, wo Arg74 His76 und in IFNL2 ersetzt werden durch Lys70 und Arg72 in IFNL3 8.

Außerdem können Unterschiede in der Stabilität und der Löslichkeit zwischen IFNLs kann auch das Ergebnis des Assays beeinflussen. Da die direkten Assay LRA Konzentrationen von nM bis M verwendet und die physiologische Konzentration der Zytokine im Serum liegt im pM bis nM-Bereich, die Aggregation von IFNL kann nicht ausgeschlossen werden. Man kann davon ausgehen , dass die beobachtete positive Kooperativität des IFN - Bindung durch eine spezifische oder nicht-spezifische Erhöhung in Ligand-Rezeptor verursacht wird Bindung, beispielsweise eine Dimerisierung des rekombinanten IL28RA Rezeptor in Lösung oder eine Bindung eines zweiten Liganden oder Ligandenfragment mit höherer Affinität. However sind weitere Studien erforderlich, um dies zu überprüfen.

Die Blockierungspeptid in den Wettbewerbs imitiert die LRA AB-Schleife von IFNL3 (Abbildung 6) verwendet. Wie zuvor beschrieben wurde , spielt der AB-Schleife eine wesentliche Rolle bei der Wechselwirkung zwischen IFNLs und IL28RA 9, besonders IFNL2 und IFNL3. Homologie - Modellierung von IFNL3 mit dem IL28RA / IFNL1 Kristallstruktur zeigt , dass die Region, die an die blockierende Peptid entspricht , liegt in enger räumlicher Nähe zu dem Interaktionsschnittstelle mit IL28RA (Abbildung 6). Angenommen, daß das Peptid blockiert die Wechselwirkung der AB-Schleife von IFNL und IL28RA. Die Ergebnisse des Wettbewerbs LRA Unterstützung dieser: Das Peptid hat eine hemmende Wirkung auf die Bindung aller IFNLs jedoch das Peptid ein wirksamer Inhibitor der Wechselwirkung zwischen IL28RA und entweder IFNL3 oder IFNL2 als der Wechselwirkung von IFNL1 und IL28A. Wie erwartet, da sie die Bindung der Peptidblöcke IFNL3 am effektivstennimmt genau die gleiche Bindungstasche als AB-Schleife von IFNL3.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, ausgerichtet sind die AB-loops of IFNL1 und IFNL2 an die blockierende Peptid unterscheiden. In Übereinstimmung mit dem unteren IC 50 -Wert des Peptids zur Hemmung der IFNL1 / IL28RA Wechselwirkung, zwölf Aminosäuren unterscheiden zwischen IFNL1 und dem Peptid während und nur zwei Aminosäuren zwischen IFNL2 und dem Peptid unterscheiden. Dies zeigt an, dass zwischen den AB-Schleifen der IFNLs und IL28RA leicht unterschiedliche Bindungsarten für die Interaktion und sagt voraus, dass Peptide, die IFNL1 nachahmen wäre effektiver bei der Interaktion zwischen IFNl1 und IL28RA als die Wechselwirkung zwischen IFNL3 und IL28RA blockieren.

Ferner wird das Peptid insgesamt positiv geladen (vier Arginin und zwei Lysinreste aber nur zwei Aspartatreste) und Computeranalyse zeigt, dass das Peptid keine definierte Sekundär Motive aufweist. Aufgrund ihrer aufgewickelten, flexiblen structure das Peptid könnte binden auch an anderen Regionen des Rezeptors. Dies könnte möglicherweise Glutamat und Aspartat - Reste blockieren wie D118, die eine Salzbrücke bildet den Ligand-Rezeptor - Komplex (5B und 5C) zu stabilisieren.

Abbildung 5
Abbildung 5. Strukturvergleich von IFNL1 (grün) und IFNL3 (blau). Sauerstoffatome in rot dargestellt sind, Stickstoffatome sind in blau dargestellt. (A) Überlagerung der IL28RA gebundenen IFNL1 und IFNL3 (IL28RA nicht gezeigt). Die mittlere quadratische Abweichung (RMSD) aller ausgerichteten Atome ist 0.672 Å. Seitenketten von IFNL3, die von IFNL1 unterscheiden, sind in hellrosa hervorgehoben. (B) Salzbrücke zwischen Arg54 und D118. (C) IFNL3 Abgestimmt auf IL28RA gebundenen IFNL1 (IL28RA wird in grau dargestellt). Die Ausrichtung zeigt, dass die Arg-Glu Salz bridge wird wahrscheinlich von einem weniger stabilen Lys-Glu, einer Salzbrücke zwischen Lys57 und D118 ersetzt. PyMol wurde für die Herstellung von Figuren verwendet und für die Ausrichtung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Ausrichtung der IFNL3 und die IFNL1-IL28RA - Komplex (IFNL1 nicht gezeigt). IFNL3 ist blau und die IL28RA grau dargestellt. Die Regionen mit den blockierenden Peptid entsprechen , sind in lila markiert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 3
Tabelle 3:

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) Thermo Scientific 442404 ELISA plate
Sodium carbonate (Na2CO3) Merck 497-19-8 For ELISA plate coating buffer
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) Merck 144-55-8 For ELISA plate coating buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030-100G 5% BSA in PBS for Blocking
rhIL-28Rα/IFNλR1 R&D systems 5260-MR Recombinant human interlukin-28 Receptor alpha
rhIL-29/IFNλ1 R&D systems 1598-IL/CF Recombinant human interlukin-29/Carrier free/C-terminal 10-His tag
rhIL-28A/IFNλ2 R&D systems 1587-IL/CF Recombinant human interlukin-28A/Carrier free/C-terminal 6-His tag
rhIL-28B/IFNλ3 R&D systems 5259-IL/CF Recombinant human interlukin-28B/Carrier free/C-terminal 6-His tag
6x His Monoclonal antibody (Mouse) Clontech 631212 Primary antiboy to capture His tagged Ligands
Goat anti-Mouse igG (H+L) Jackson Immuno Research 115-035-166 Horseradish Peroxidase conjucated secondary antibody
BDoptEIA TMB reagent set BD Biosciences 555214 ELISA - TMB substrate solution
Sulfuric acid (H2SO4) Fulka 84720 5 N H2SO4 (Enzyme reaction stop solution)
Synergy/H1 - Microplate reader BioTeK ELISA plate reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
  2. Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
  3. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
  4. Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556 (2014).
  5. Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
  6. Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
  7. Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155 (2009).
  8. Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51 (2014).
  9. Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
  10. Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
  11. Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
  12. Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).

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Chemie Heft 109 ELISA Screening Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung die Dissoziationskonstante die Bindungsaffinität Sperrung
Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen
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Syedbasha, M., Linnik, J., Santer,More

Syedbasha, M., Linnik, J., Santer, D., O'Shea, D., Barakat, K., Joyce, M., Khanna, N., Tyrrell, D. L., Houghton, M., Egli, A. An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions. J. Vis. Exp. (109), e53575, doi:10.3791/53575 (2016).

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